專利名稱：纖維素酶的兩階段共水解方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物技術領域的水解方法，具體地，涉及一種纖維素酶的兩 階段共水解方法。
背景技術：
利用纖維素酶水解木質纖維素生成還原糖，繼而利用酵母等發(fā)酵生產燃料酒 精等能源物質一直是近年來人們研究的熱點。而纖維素酶的失活是影響纖維素酶 水解順利進行的瓶頸之一。部分纖維素酶在纖維素表面的不可逆性吸附被認為是 纖維素酶失活的主要機制。許多研究者發(fā)現，添加鼠李糖脂類生物表面活性劑能 夠改善纖維素的表面特性并且減少纖維素酶的不可逆性吸附，從而有利于提高纖 維素酶的有效利用率，進而提高木質纖維素酶水解的效率。
銅綠假單胞菌是產生鼠李糖脂類生物表面活性劑的主要菌種。但是在其添加 至稻草水解過程中時，往往與纖維素酶產生菌的生長條件不具備兼容性，如生長 周期、溫度、pH值均各不相同。由于真菌具備相對完整的纖維素酶酶系，因而 被廣泛用于纖維素酶的生產中。但是，真菌的生長周期一般為96 h，而銅綠假 單胞菌這種細菌的生長周期一般在48 h左右。且真菌與細菌對溫度及的pH值的 要求各不相同，因此使得銅綠假單胞菌與纖維素酶產生菌的共水解變得十分困 難。經文獻檢索，至今并無纖維素酶兩階段共水解新工藝的研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種纖維素酶的兩階段共水解 方法。本發(fā)明的共水解方法是將里氏木霉ZM4-F3與銅綠假單胞菌BSZ-07分別用 于纖維素酶的生產與鼠李糖脂類生物表面活性劑的生產。由于這兩株菌的生長周 期與生長條件各不相同，因此本發(fā)明采用兩階段共水解新工藝，有效解決了銅綠 假單胞菌BSZ-07與里氏木霉ZM4-F3進行共水解時難以相互兼容的關鍵問題，有 效的提高了纖維素酶的水解效率，同時與常規(guī)水解方法相比較，水解的時間縮短
了 10%以上，有效地節(jié)約了成本。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的
第一步、生物質沖洗去除雜質，切成1到2厘米的小段，置于69到71 °C
烘箱中干燥至恒重，然后將剪切好的生物質用堿進行預處理，具體方法為將剪 好的生物質置于指質量體積比為2%的氫氧化鈉溶液中，其中氫氧化鈉溶液的體
積數值為放入的生物質的質量數值的3. 8到4. 2倍；在84到86 'C水浴58到62 分鐘，然后用蒸餾水洗至PH至7，置于烘箱中干燥至質量不再增加；
第二步、用預處理后的生物質制備里氏木霉ZM4-F3水解產糖培養(yǎng)基，然后 將里氏木霉ZM4-F3置于該水解產糖培養(yǎng)基中，在29到31 。C、 195到205 rpm 搖床的水解條件下水解47到49小時；
第三步、將銅綠假單胞菌BSZ-07接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期；
第四步、將培養(yǎng)至對數生長期的銅綠假單胞菌BSZ-07接種至發(fā)酵產劑培養(yǎng) 基中，接種濃度為里氏木霉ZM4-F3接種濃度的4y。；然后在溫度為32"C、 pH值 為5. 5的條件下進行兩株菌的共水解。
所述第一步中的生物質是指稻草、玉米皮、麥麩、玉米芯、稻殼等植物纖維。
所述第二步中的水解產糖培養(yǎng)基各組分的質量百分比為生物質為2.9%， 麩皮為0. 97%， Mandels微量元素鹽溶液為0. 48%，磷酸二氫鉀為0. 04%，硫酸銨 為O. 16%，硫酸鎂為0.01%，蛋白胨為O. 1%，蒸餾水為85.9%。
所述第三步中的種子培養(yǎng)基各組分的質量百分比為牛肉膏為0.3%， NaN03 為0. 1%，(鵬"04為0. 1%， N&HP04為0. 12%， KH2P04為0. 1%， MgS04 7H20為 0.001%， CaCl2為0. 0002%，蒸餾水為99. 3%。
所述第四步中的發(fā)酵產劑培養(yǎng)基各組分的質量百分比為葡萄糖為0.2%， 酵母膏為0, 01%， ,03為0. 05%，機油為0. 2%， KH2P04為0. 1%， Na2HP04為0. 1%， MgS04 7H20為0. 002%，微量元素溶液為0. 05%，蒸餾水為92. 3%。
本發(fā)明利用共水解過程需要兩種微生物具有水解條件的兼容性，優(yōu)化了兩株 菌在后續(xù)48 h中協(xié)同作用時的最優(yōu)溫度、最優(yōu)pH值及兩株菌的最優(yōu)接種比例。 使用本發(fā)明的兩階段共水解方法可以使樣品在84 h時還原糖量達2.571 g/1， 比對照樣的還原糖最大值時間提前了 12h，還原糖最大值提高了 15. 20%。同時，
兩階段共水解新工藝降解稻草96 h時的生物質降解率可提高至71. 21%，比對照 樣達生物質降解率最大值時的時間提前了 24 h，生物質降解率的最大值也提高 了 3%。
本發(fā)明所使用的菌株為ZM4-F3和BSZ-07。經鑒定，ZM4-F3屬于里氏木霉 (Trichoderma reesei)， BSZ-07屬于銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 保藏單位名稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。保藏號分別為CCTCC 40360 (里氏木霉)與CCTCC AB93066 (銅綠假單孢菌)。


圖l纖維素酶兩階段共水解工藝對還原糖產量的影響圖。 圖2纖維素酶兩階段共水解工藝對稻草降解率的影響圖。
具體實施例方式
以下結合附圖對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案 為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于 下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1
將收割后的稻草用自來水沖洗4一5遍以去除雜質以及莖結，并切至l-2cra 的小段。切好的稻草置于7(TC烘箱中千燥至恒重，在室溫下儲存以備后續(xù)使用。 在酶水解前，將剪切好的稻草用堿進行預處理，具體方法為將10g剪好的稻 草置于裝有40ml 2%的氫氧化鈉的錐形瓶中，保持固液比為1:4， 85 'C水浴1 h。用蒸餾水洗至中性，置于70 。C烘箱中干燥至恒重。
將預處理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30 。C、 200 rpm搖床中水解48 h， 然后將培養(yǎng)至對數生長期的銅綠假單胞菌BSZ-07接種到其中，接種濃度為里氏 木霉ZM4-F3的4%。后續(xù)的48 h，在溫度32 °C、 pH值5. 5實現這兩株菌的共水 解。測定還原糖產量隨水解時間的變化值，并與未添加鼠李糖脂的對照樣進行比 較。
研究發(fā)現，銅綠假單胞菌BSZ-07與里氏木霉ZM4-F3共水解時，自第48 h 起其還原糖產量迅速增加。在對照樣中，96 h是里氏木霉ZM4-F3的最優(yōu)產糖時 間，其產還原糖量達最大值，為2.231g/1。而在兩階段共水解樣品中，產糖84
h時就可使還原糖量達2. 321 g/l。因此，此種兩階段共水解新工藝不僅能增加 還原糖的產量，還能明顯縮短最優(yōu)產糖時間，從而降低纖維素酶的生產成本。 實施例2
將收割后的玉米皮用自來水沖洗4一5遍以去除雜質以及莖結，置于70 °C 烘箱中干燥至恒重，在室溫下儲存以備后續(xù)使用。在酶水解前，將玉米皮用堿進 行預處理，具體方法為將10 g玉米皮置于裝有40 ml 2%的氫氧化鈉的錐形 瓶中，保持固液比為1:4， 85'C水浴lh。用蒸餾水洗至中性，置于7(TC烘箱 中干燥至恒重。
將玉米皮用里氏木霉ZM4-F3在30 。C、 200 rpm搖床中水解48 h，然后將 培養(yǎng)至對數生長期的銅綠假單胞菌BSZ-07接種到其中，接種濃度為里氏木霉 ZM4-F3的4%。后續(xù)的48 h，在溫度34 °C、 pH值5. 0實現這兩株菌的共水解。 測定還原糖產量隨水解時間的變化值，并與未添加鼠李糖脂的對照樣進行比較。
研究發(fā)現，銅綠假單胞菌BSZ-07與里氏木霉ZM4-F3共水解時，自第48 h 起其還原糖產量迅速增加。在對照樣中，96h是里氏木霉ZM4-F3的最優(yōu)產糖時 間，其產還原糖量達最大值，為2.231g/1。而在兩階段共水解樣品中，產糖84 h時就可使還原糖量達2. 427 g/1。因此，此種兩階段共水解新工藝不僅能增加 還原糖的產量，還能明顯縮短最優(yōu)產糖時間，從而降低纖維素酶的生產成本。
實施例3
將收割后的麥麩用自來水沖洗4一5遍以去除雜質以及莖結置于70 'C烘箱 中干燥至恒重，在室溫下儲存以備后續(xù)使用。在酶水解前，將麥麩用堿進行預處 理，具體方法為將10 g麥麩置于裝有40 ml 2%的氫氧化鈉的錐形瓶中，保 持固液比為1:4， 85 。C水浴1 h。用蒸餾水洗至中性，置于70 'C烘箱中干燥至 恒重。
將預處理后的麥麩用里氏木霉ZM4-F3在30 °C、 200 rpm搖床中水解48 h， 然后將培養(yǎng)至對數生長期的銅綠假單胞菌BSZ-07接種到其中，接種濃度為里氏 木霉ZM4-F3的4%。后續(xù)的48 h，在溫度34 'C、 pH值5. 5實現這兩株菌的共水 解。測定還原糖產量隨水解時間的變化值，并與未添加鼠李糖脂的對照樣進行比 較。
研究發(fā)現，銅綠假單胞菌BSZ-07與里氏木霉ZM4-F3共水解時，自第48 h
起其還原糖產量迅速增加。在對照樣中，96h是里氏木霉ZM4-F3的最優(yōu)產糖時 間，其產還原糖量達最大值，為2.231g/1。而在兩階段共水解樣品中，產糖84 h時就可使還原糖量達2. 571 g/1。因此，此種兩階段共水解新工藝不僅能增加 還原糖的產量，還能明顯縮短最優(yōu)產糖時間，從而降低纖維素酶的生產成本。 實施例4
將收割后的玉米芯用自來水沖洗4_5遍以去除雜質以及莖結，并切至l-2cm 的小段。切好的玉米芯置于70 。C烘箱中干燥至恒重，在室溫下儲存以備后續(xù)使 用。在酶水解前，將剪切好的玉米芯用堿進行預處理，具體方法為將IO g剪 好的玉米芯置于裝有40 ml 2%的氫氧化鈉的錐形瓶中，保持固液比為1 : 4， 85 °。水浴1 h。用蒸餾水洗至中性，置于70 。C烘箱中干燥至恒重。
將預處理后的玉米芯用里氏木霉ZM4-F3在30 。C、 200 rpm搖床中水解48 h， 然后將培養(yǎng)至對數生長期的銅綠假單胞菌BSZ-07接種到其中，接種濃度為里氏 木霉ZM4-F3的4%。后續(xù)的48 h，在溫度34 °C、 pH值5. 5實現這兩株菌的共水 解。測定玉米芯降解率隨水解時間的變化值，并與未添加鼠李糖脂的對照樣進行 比較。
研究發(fā)現，銅綠假單胞菌BSZ-07與里氏木霉ZM4-F3共水解的樣品自48 h 起其玉米芯降解率優(yōu)于對照樣。兩階段共水解樣品可以使玉米芯降解率在96 h 時達到71.21%，比對照樣達玉米芯最大降解率的時間提前了 24 h，且最大降解 率提高了 3%。
由于纖維素酶兩階段共水解新工藝有效解決了銅綠假單胞菌BSZ-07與里氏 木霉ZM4-F3進行共水解時難以相互兼容的關鍵問題，因此可有效提高纖維素酶 的水解效率。
權利要求
1、一種纖維素酶的兩階段共水解方法，其特征在于，包括如下步驟第一步、生物質沖洗去除雜質，切成1到2厘米的小段，置于69℃到71℃烘箱中干燥至恒重，然后將剪切好的生物質用堿進行預處理，具體方法為將剪好的生物質置于指質量體積比為2％的氫氧化鈉溶液中，其中氫氧化鈉溶液的體積數值為放入的生物質的質量數值的3.8到4.2倍；在84℃到86℃水浴58到62分鐘，然后用蒸餾水洗至pH至7，置于烘箱中干燥至質量不再增加；第二步、用預處理后的生物質制備里氏木霉ZM4-F3水解產糖培養(yǎng)基，然后將里氏木霉ZM4-F3置于該水解產糖培養(yǎng)基中，在29℃到31℃、195到205rpm搖床的水解條件下水解47到49小時；第三步、將銅綠假單胞菌BSZ-07接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期；第四步、將培養(yǎng)至對數生長期的銅綠假單胞菌BSZ-07接種至發(fā)酵產劑培養(yǎng)基中，接種濃度為里氏木霉ZM4-F3接種濃度的4％；然后在溫度為32℃、pH值為5.5的條件下進行兩株菌的共水解。
2、 根據權利要求1所述的纖維素酶的兩階段共水解方法，其特征是，第一 步中所述的生物質是指稻草、玉米皮、麥麩、玉米芯、稻殼等植物纖維。
3、 根據權利要求1所述的纖維素酶的兩階段共水解方法，其特征是，第二 步中所述的水解產糖培養(yǎng)基各組分的質量百分比為生物質為2.9%，麩皮為 0. 97%， Mandels微量元素鹽溶液為0. 48%，磷酸二氫鉀為0. 04%，硫酸銨為0. 16%， 硫酸鎂為0.01%，蛋白胨為O. 1%，蒸餾水為85.9%。
4、 根據權利要求1所述的纖維素酶的兩階段共水解方法，其特征是，第三 歩中所述的種子培養(yǎng)基各組分的質量百分比為牛肉膏為0.3%， NaN03為0. 1%， (NH4)2S。4為0. 1%， Na2HP04A 0. 12%， ,04為0, 1%， MgS04 7H20為0. 001%， CaCl2 為0. 0002%，蒸餾水為99. 3%。
5、 根據權利要求1所述的纖維素酶的兩階段共水解方法，其特征是，第四 歩中所述的發(fā)酵產劑培養(yǎng)基各組分的質量百分比為葡萄糖為0.2%，酵母膏為 0.01%， NH4N03為0.05%，機油為0.2%， KH2P04為0.1%， Na2HP04為0.1%， MgS04 7H20為0. 002%， 1斂量元素溶液為0. 05%，蒸餾水為92. 3%。
全文摘要
一種生物技術領域的纖維素酶的兩階段共水解方法，本發(fā)明的方法包括如下步驟將里氏木霉ZM4-F3在水解產糖培養(yǎng)基中水解48h，然后將培養(yǎng)至對數生長期的銅綠假單胞菌BSZ-07接種到其中，接種量為里氏木霉ZM4-F3的4％。銅綠假單胞菌BSZ-07可產生鼠李糖脂生物表面活性劑，以促進稻草酶解的進行。在后續(xù)的48h兩株菌共水解階段中，采用溫度32-35℃、pH值5.5。由于纖維素酶兩階段共水解新工藝有效解決了銅綠假單胞菌BSZ-07與里氏木霉ZM4-F3進行共水解時難以相互兼容的關鍵問題，因而可有效提高纖維素酶的水解效率。
文檔編號C12P39/00GK101358226SQ20081004277
公開日2009年2月4日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權日2008年9月11日
發(fā)明者張秋卓, 蔡偉民 申請人:上海交通大學