專利名稱：一種快速檢測dna甲基化的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學生物學檢測技術領域，具體是一種快速檢測DNA 甲基化的方法。
背景技術：
基因的異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，在脊椎動物 中，CpG二核苷酸是DNA甲基化發(fā)生的主要位點。CpG常成簇存在，人們 將基因組中富含CpG的一段DNA稱為CpG島(CpGisland) 。 CpG島常位T 轉錄調控區(qū)附近，DNA甲基化的研究與CpG島的研究密不可分。甲基化 異常在W期癌、癌前病變，甚至'些良性病變中即已出現(xiàn)，在許多惡 性腫瘤的癌前病變中都發(fā)現(xiàn)了多個抑癌基因的啟動子區(qū)域CpG島卨甲 基化。據(jù)報道，胰腺癌組織中檢測出多個與胰腺癌相關的基因發(fā)生異 常甲基化，如pl6基因的^常甲基化(Virmani AK， et al. Clin Cancer Res 2001; 7: 584-9 ) 、 MUC2 ( Ho JJ， et al. Int J Oncol 2003; 22: 273-9 )、 NPTX2 (SatoN， etal.CancerRes, 2003， 63: 3735-3742)等，因此 有關DNA甲基化與腫瘤發(fā)生的關系口益受到人們的重視，成為腫瘤分 子生物學研究熱點之。
基因甲基化的研究有很多方法，其中敁常月:I的檢測方法是Hennari 節(jié)1996年建化的甲基化特計性P(:R(meUivLaUori—specific PCR， MSP)，其基木原理足通過樸:硫酸^鈉對DNA樣品的修飾，使未甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基反應，最后在氫氧化鈉作用下變?yōu)槟蜞奏?，而?基化的胞嘧啶卻不能發(fā)生脫氨基反應，堿基不發(fā)生轉變，這樣兩者的
堿基序列就不一樣，然后進行引物特異性的PCR。 MSP中需設計兩對引 物，并要求1、引物末端均設訃至檢測位點結束；2、兩對引物分別 只能與經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后的序列互補配對，其中一對結合處理后的 甲基化DNA鏈，另一對結合處理后的未甲基化DNA鏈。通過凝膠電 泳或DNA測序進一步分析PCR產物，如果使用針對處理后的甲基化 DNA鏈的引物能擴增出片段，說明該被檢測的位點存在甲基化；如 果使用針對處理后的未甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，說明被 檢測的位點不存在甲基化。
MSP法包括如下步驟.-
1、 制備待測DNA:
按常規(guī)方法取組織勻漿，用酚氯仿法(詳見F.M.奧斯伯等，精編 分子生物學實驗指南，北京科學出版社，2005: 46)或基因組DNA 抽提試劑盒提取DNA。
2、 DNA亞硫酸氫鈉修飾
將DNA變性，成為單鏈DNA，使堿基充分暴露；加入終濃度為 lmol—6mo1的亞硫酸氫鈉，使DNA單鏈上未甲基化的胞嘧啶與亞硫 酸氫鈉進行修飾反應生成磺化胞嘧啶，磺化胞嘧啶在水的作用下脫氨 基生成磺化尿嘧啶;而5'-甲基化胞嘧啶不能被修飾;將修飾后的DNA 產物經(jīng)過透析脫鹽，用氫氧化鈉脫磺化，使得磺化尿嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぁNA經(jīng)修飾后，未甲基化的胞嘧啶堿基變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的?嘧啶則不變。
3、 純化
將經(jīng)修飾后的DNA用乙醇沉淀、洗滌，再溶解后作PCR模板。
4、 PCR擴增和檢測分析
由于待測基因的正常核苷酸序列、胞嘧啶的數(shù)量和所在位點是明 確的，因此可設計相應的正、反向甲基化特異性引物和未甲基化特異 性引物，以修飾后的DNA為模板，進行PCR擴增，甲基化特異性的引 物只能擴增甲基化的序列，未甲基化特異性引物只能擴增未甲基化的 序列；最后將PCR產物通過凝膠電泳或DNA測序分析，就可確定所測組 織中該基因中CpG島的胞嘧啶甲基化程度。
具體步驟主要為
1、 制備待測DNA:按常規(guī)方法如酚氯仿法從組織中抽提DNA。
2、 DNA亞硫酸氫鈉修飾
1) 、取1嗎DNA，溶于20nl水中，95。C水浴10分鐘，立即放于 冰浴；加入2nllOM氫氧化鈉，使DNA變性，成為單鏈DNA;
2) 、加入亞硫酸氫鈉修飾液230ul (3M亞硫酸氫鈉，10mM氫 醌，PH5.0);置于55"C避光修飾16小時，DNA被修飾，未甲基化 的胞嘧啶被修飾為磺化尿嘧啶。
3、 DNA修飾產物的純化
1)、將上述DNA修飾產物在4X:下用雙蒸水透析過夜，去除多余的亞硫酸氫鈉；
2) 、脫磺化加入10MNaOH使其終濃度為0.3M，室溫20分鐘; 再加入等當量的1M鹽酸中和NaOH，磺化尿嘧啶脫磺化后成尿嘧啶；
3) 、沉淀加入四分之一體積的10M醋酸銨和2倍體積乙醇，將 DNA修飾產物置于-2(TC沉淀過夜；
4) 、洗滌13000rpm離心10分鐘，棄上清，用70%酒精洗滌2 次；干燥IO分鐘，加入20plTE使其溶解，得純化的DNA修飾產物， 亦即PCR模板。
4、 PCR擴增和檢測分析用設計的待測基因的正、反向甲基化特異
性引物和未甲基化特異性引物進行PCR擴增。
PCR反應體系如下
10x PCR buffer (without MgCb)2.5pl
MgCl2 (25mM)2nl
dNTP(2-5mM)2pl
正向引物(20jiM)0.5^1
反向引物(20pM)0.5^1
H20
模板IW
Taq酶(5u4d)0.5nl
總體積25jd反應條件如下
94匸3分鐘 9420秒*
58"C 20秒35循環(huán) 72°C 15秒 72°C 5分鐘
檢測分析將PCR擴增產物與標準品進行凝膠電泳檢測或DNA測 序分析，就可確定該基因的胞嘧啶甲基化程度。如果其中多數(shù)基因發(fā) 生異常甲基化，則就提示該患者可能得相應的癌癥。
這種傳統(tǒng)的檢測方法存在如下缺點1、操作繁瑣，特別是在亞 硫酸氫鈉修飾過程中，修飾反應慢，時間長，通常需要16—18小時； 2、 DNA變性成為單鏈后，單鏈上的堿基還會互相配對，有可能使 堿基暴露不充分，從而導致亞硫酸氫鈉修飾不完全，實驗重復性不高， 影響結果的可靠性；3、亞硫酸氫鈉修飾后，透析脫鹽時間也很長， 工作量大，因此制約了 MS-PCR的研究。但若采用Zymo公司生產的 DNA甲基化檢測試劑盒(EZDNAMethylation-Gold Kit)，雖然操 作方便，檢測時間短，但價格昂貴，且每次得到的PCR模板只能用 于2個基因的甲基化檢測，限制了多基因檢測的進行，不能滿足多數(shù) 實驗的需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種成本低廉、檢測時間短、重復性好的DNA甲基 化的檢測方法。本發(fā)明的操作步驟也主要包括制備待測DNA、 DNA亞硫酸氫 鈉修飾、純化以及PCR擴增和檢測分析等四步，但本發(fā)明針對傳統(tǒng) 方法的不足做了以下三方面的改進
1、 針對亞硫酸氫鈉DNA修飾時間長的不足，采用添加催化劑 TAC和鹽酸胍加速修飾反應，使DNA在催化劑的作用下加快與亞硫 酸氫鈉反應；
2、 修飾反應中采用多次短時間高溫解鏈，以充分暴露DNA的 堿基，使未甲基化的胞嘧啶轉化為磺化尿嘧啶，從而提高實驗的重復 性；
，3、針對修飾后DNA純化時繁瑣的透析脫鹽步驟，采用純化柱 進行純化，先將修飾后的DNA產物吸附于玻璃纖維膜或硅藻土或硅 膠膜制成的純化柱il，再依次進行洗滌脫鹽、去磺化處理、洗滌和 DNA洗脫，從而得到純化的檢測DNA基因甲基化的PCR模板，可 以直接用于PCR擴增，大大節(jié)省了脫鹽時間。
具體步驟主要為
1、 制備待測DNA:按常規(guī)方法。
2、 DNA亞硫酸氫鈉修飾
1) 、取ljigDNA，溶于20nl水中，95"C水浴10分鐘；立即放于 冰浴；加入2nllOM氫氧化鈉，使DNA變性，成為單鏈DNA;
2) 、加入亞硫酸氫鈉修飾液(5M亞硫酸氫鈉，10mM氫 醌，lmMTAC ，0.3M鹽酸胍，PH5.0) 230u l，混勻后分裝到三個PCR管，95*€ 10秒 58"C 20分鐘
每管約80—90nl;
3)、三個PCR管放入PCR儀，運行下列程序進行亞硫酸氫鈉修飾
反應(約2，5小時) 95 。C 20秒
t] 7循環(huán) Holdat4"C
由于修飾反應中的多次短時間高溫解鏈，使堿基暴露充分，因此 DNA修飾更完全，未甲基化的胞嘧啶被修飾為磺化尿嘧啶。
3、 DNA修飾產物的純化
(1) 、采用UNIQ-10柱進行純化合并上述各管DNA修飾溶液， 加入lml6M鹽酸胍溶液作為結合劑以利于吸附，混勻后將溶液轉移 到套放在2ml收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2分鐘。8，000rpm 室溫離心30秒，棄收集管中的廢液，DNA被結合到柱子上；
(2) 、洗滌用洗漆緩沖液(lOmMTris， PH=6.8， 80%乙醇)洗 滌2次，每次500ji1 ， 8，000rpm室溫離心30秒，棄洗滌液；
(3) 、脫磺化
1) 、脫磺化反應加入250^1脫磺化液(含30%乙醇，5%甘 油，200mMNaOH， 100mM NaCl)，進行脫磺化反應，室溫放置10 分鐘。8，000rpm室溫離心30秒，棄收集管中的廢液；
2) 、洗滌用洗滌緩沖液(同上)洗滌2次，每次500nl ， 8，000rpm 室溫離心30秒，棄洗滌液；
4、 洗脫把UNIQ-IO柱放入一個新的1.5mlEP管中，加入30。C-80匸預 熱的TE (lOmMTris ， PH-8.0; lmM EDTA) 35^1室溫離心，收 集洗脫液，此為修飾后的DNA溶液，即PCR模板，可直接用于PCR， 也可暫時保存于-20匸備用。 5、 PCR擴增和檢測分析
將純化好的DNA修飾產物用待測基因的正、反向甲基化特異性 引物和未甲基化特異性引物進行PCR擴增。然后進行凝膠電泳分析 PCR擴增產物。
本發(fā)明與傳統(tǒng)的方法相比檢測時間短、重復性好；與劑盒相比， 成本低廉，亞硫酸氫鈉修飾也更加完全，結果更加可靠，而且得到的 修飾后的DNA產量遠多于試劑盒的方法，本發(fā)明可以檢測不少于15 個基因，而試劑盒的DNA產量僅夠檢測2個基因。


圖1為木發(fā)明檢測肝癌標本pl6基因甲基化的凝膠電泳圖譜； 圖2為用本發(fā)明方法和傳統(tǒng)方法、Zymo公司甲基化試劑盒方法 檢測肝癌GSTP1基因甲基化的凝膠電泳對比圖譜。
具體實施例方式
下面以檢測肝癌標本中pl6基因和GSTPl基因為例對本發(fā)明作詳 細說明，但本實施例僅用于i;圍。
主要儀器及試劑來源
Eppendorf Model 5415R， CentrifUges低溫微高速離心機，英國 TECHNE公司產品；TC-512梯度PCR儀，英國Techne公司產品； FR-200A全自動紫外與可見分析裝置，上海復日科技有限公司公司產 品；亞硫酸氫鈉購自國藥集團，鹽酸胍購自國藥集團，氫醌購自上海 生工生物工程技術服務有限公司。
實施例l用本發(fā)明方法檢測肝癌標本中pl6基因的甲基化情況
待測樣品取自上海東方肝膽醫(yī)院3位肝癌患者的個體樣本。p16 基因在肝癌中已被證明發(fā)生高甲基化(Naoyuki Umetani， Michiel F.G. de Maat， Eiji Sunami， Suzanne Hiramatsu， Steve Martinez, and Dave S. B. Hoon Methylation of pl6 and Ras Association Domain
但并非由一個基因的高甲基化就能確診為肝癌，也不是所有的肝癌患 者pl6基因都會出現(xiàn)高甲基化，pl6基因的甲基化僅為參考指標之一。 操作步驟如下(3個樣品方法相同)
1、 制備待測DNA:
取新鮮肝組織50mg，用基因組DNA抽提試劑盒(上海二醫(yī)新生 基因科技有限公司)提取DNA，按說明書操作。
2、 DNA亞硫酸氫鈉修飾
1)、取1嗎DNA，溶于20nl水中，95"C水浴10分鐘；立即放于冰?。患尤?nllOM氫氧化鈉，使DNA變性，成為單鏈DNA;
2) 、加入亞硫酸氫鈉修飾液(5M亞硫酸氫鈉，10mM氫 醌，lmMTAC ，0.3M鹽酸胍,PH5.0) 230^1，混勻后分裝到3個PCR管，
每管約80—卯^;
3) 、將3個PCR管放入PCR儀，運行下列程序進行亞硫酸氫鈉修 飾反應
95 。C 20秒
95°C 10秒 ，
58。C20分鐘」7循環(huán)
Holdat4"C
3、 DNA修飾產物的純化
1 )、純化:合并上述三管DNA修飾溶液，加入lml PH為5.0的6M 鹽酸胍溶液作為結合劑以利于吸附，混勻后將溶液轉移到套放在2ml 收集管內的UNIQ-10柱中，室溫放置2分鐘，8，000rpm室溫離心30 秒，棄收集管中的廢液；
2) 、洗滌加入500nl洗滌緩沖液OOmMTris， PH=6.8， 80%乙 醇)，8，000rpm室溫離心30秒，棄洗滌液，再次加入500pl洗滌緩沖 液清洗一次；
3) 、脫磺化在上述UNIQ-10柱中加入250Ml脫磺化液(含30% 乙醇，5%甘油，200mMNaOH， lOOmMNaCl),室溫放置10分鐘， 8,000rpm室溫離心30秒，棄收集管中的廢液；
4) 、洗滌加入500nl洗滌緩沖液(10mMTris， PH=6.8， 80%乙 醇)，8，000rpm室溫離心30秒，棄洗滌液，再次加入50(^1洗滌緩沖液清洗一次。
5)、洗脫把UNIQ-10柱放入一個新的1.5mlEP管中，加入70t: 預熱的TE (lOmMTris ， PH=8.0; lmM EDTA) 35jil， 12，000rpm 室溫離心2分鐘，收集洗脫液，此為修飾后的DNA溶液，即PCR模 板。
4、 PCR擴增和檢測分析 1)、 PCR擴增
根據(jù)P16基因設計并合成甲基化特異性引物和未甲基化特異性引 物，包括正向引物和反向引物(由上海博彩生物科技有限公司合成) 甲基化正向引物(MF): TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC 甲基化反向引物(MR): GACCCCGAACCGCGACCGTAA 擴增片段長度150bp
未甲基化正向引物(UF): TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT 未甲基化反向引物(UR): CAACCCCAAACCACAACCATAA 擴增片段長度151bp PCR分為2管進行擴增， 一管用甲基化特異性引物，另一管用未
甲基化特異性引物擴增，PCR反應體系如下(其中正向引物用P1表
示，反向引物用P2表示)
10xPCR buffer (without MgCb) 2.5^1
MgCl2 (25mM) 2^1
dNTP(2,5mM) 2fi1
Pl(pl6， 20mM) 0.5^1P2(pl6， 20nM)
H20
模板
Taq酶(5u/nl) 總體積
反應條件如下
94t: 3分鐘
0,5jtl
l(il
25jil
9化20秒 58*C 20秒 72"C 15秒
35循環(huán)
72匸5分鐘
甲基化修飾和未修飾的DNA分別被甲基化引物和未甲基化引物 擴增。
2)、檢測分析
分別取擴增產物8^1按常規(guī)進行凝膠電泳，電泳結果見圖l。其 中Marker大小為100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、卯0、 1000、 1200、 1500bp; M為甲基化引物擴增產物；U為未甲基化引物 擴增產物；1、 2、 3號樣品分別為未甲基化引物擴增條帶。由圖1 可見，1、 2號樣品用甲基化引物未擴增出條帶，只有3號樣品能用 甲基化引物擴增出條帶，說明只有3號樣品的pl6基因被部分甲基化。
實施例2:本發(fā)明方法和傳統(tǒng)方法、試劑盒方法檢測GSTP1基因甲 基化的對比實驗根據(jù)GSTP1基因設計并合成甲基化特異性引物和未甲基化特異 性引物，包括正向引物和反向引物(由上海博彩生物科技有限公司合 成)
甲基化正向引物(MF): TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC 甲基化反向引物(MR): GCCCCAATACTAAATCACGACG 擴增片段長度101 bp
未甲基化正向引物(UF) : GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT 未甲基化反向引物(UR): CCACCCCAATACTAAATCACAACA 擴增片段長度101 bp
PCR分為2管進行擴增，--管用甲基化特異性引物，另一管用未 甲基化特異性引物擴增，PCR反應體系和條件同實施例1 (其中正向 引物用P1表示，反向引物用P2表示)。
一、 本發(fā)明的實驗方法同實施例1。
二、 傳統(tǒng)的方法 主要步驟如下
1、 DNA亞硫酸氫鈉修飾
1) 、取1嗎dna，溶于20m1水中，dna變性，成為單鏈dna， 方法同實施例1;
2) 、 DNA亞硫酸氫鈉修飾加入DNA亞硫酸氫鈉修飾液(3M亞 硫酸氫鈉，10mM氫醌，PH5.0) 230ul;置于55"C避光修飾16小時；
3) 、 DNA修飾產物的純化(1) 、 DNA修飾產物在4X:下對雙蒸水透析過夜；
(2) 、脫磺化加入10M NaOH使其濃度為0.3M;室溫20分鐘， 加1M鹽酸中和NaOH;加占總體積四分之一的醋酸銨(10M)和2 倍體積的乙醇，置-20t;沉淀DNA過夜；13000rpm離心10分鐘，棄 廢液，再用70%酒精洗滌2次，干燥10分鐘，加20pJTE，使修飾 好的DNA溶解。
4)、 PCR擴增 方法同實施例1。 三、試劑盒方法
用Zymo公司生產的甲基化試劑盒，操作步驟按說明書。 (--)、DNA的修飾
1、 取500ng DNA樣品(20 到PCR管中，添加130 pl的CT (Conversion Reagent),將樣品管放到PCR儀并按以下步驟操作
(1) 、 98。C放置IO分鐘;
(2) 、 64"C放置2.5小時。
2、 DNA修飾產物的純化添加600 nl的M-Binding Buffer到柱子 中，并將柱放入試劑盒所提供的Collection Tube中，裝填DNA樣品 到含有M-Binding Buffer的柱子中，蓋緊蓋子將柱顛倒數(shù)次來混合樣 品，全速(>10，000 x g)離心30秒。去除廢液，添加100 nl的 M-Wash Buffer到柱中。全速離心30秒，去除廢液。
3、 脫磺化加200 nlM-DesulphonationBuffer到柱中并且在室溫(20 匸一30X:)下放置15-20分鐘后全速離心30秒，棄廢液；加200jUM-Wash Buffer到柱中，全速離心30秒，棄廢液，再加200 pi M-Wash Buffer,離心30秒，棄廢液；
4、 洗脫直接加10 nl M-Elution Buffer到柱基質中，將柱放置在1.5 ml的收集管中，全速離心，收集DNA洗脫液。
5、 PCR擴增取2jU DNA洗脫液做模板進行PCR擴增，方法同實 施例1。
(二)、電泳檢測對比分析各取8pl PCR擴增產物分別按常規(guī)進行 凝膠電泳，電泳結果見圖2。其中Marker大小為100、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、卯O、 1000、 1200、 1500bp。 M為甲基化引物 擴增產物;U為未甲基化引物擴增產物。A為本發(fā)明方法的電泳圖譜， B為傳統(tǒng)方法的電泳圖譜，C為Zymo公司甲基化試劑盒方法的電泳 圖譜。從圖2可見，樣品1、 2、 3既能用未甲基化特異性引物擴增出 DNA片段(101bp)，又能用甲基化特異性引物擴增出DNA片段，表 明1、 2、 3號樣品均有一部分GSTP1基因被甲基化。3種方法電泳 圖譜一致，說明本發(fā)明方法是切實可行的。
權利要求
1. 一種快速檢測DNA甲基化的方法，包括如下步驟制備待測DNA、DNA的亞硫酸氫鈉修飾、DNA修飾產物的純化以及PCR擴增和檢測，其特征在于亞硫酸氫鈉修飾液中添加了催化劑TAC和鹽酸胍，以加速DNA的亞硫酸氫鈉修飾反應。
2、 按權利要求1所述的快速檢測DNA甲基化的方法，其特征 在于亞硫酸氫鈉修飾反應過程中采用多次短時間高溫解鏈，以充分暴 露DNA鏈上的堿基，使DNA修飾更完全。
3、 按權利要求1所述的快速檢測DNA甲基化的方法，包括如 下步驟1)、制備待測DNA;2) 、 DNA亞硫酸氫鈉修飾(1) 、使DNA變性，成為單鏈DNA;(2) 、加入亞硫酸氫鈉修飾液，進行DNA亞硫酸氫鈉修飾反應3) 、 DNA修飾產物的純化；4) 、 PCR擴增和檢測分析； 其特征在于(1) 、所述DNA亞硫酸氫鈉修飾液中含有終濃度為1mM催化 劑TAC，和終濃度為0.3M鹽酸胍；(2) 、 DNA亞硫酸氫鈉修飾時，在PCR上按下列程序進行多次短時間高溫解鏈反應95 。C 20秒 95°C 10秒 " 58°C 20分鐘」7循環(huán)Holdat4。C(3)、修飾產物的純化時，采用UNIQ-10柱進行純化，DNA修 飾溶液中加入lmlPH為5.0的6M鹽酸胍溶液作為結合劑以利于吸 附，DNA吸附于UNIQ-10柱后，依次用洗滌緩沖液清洗，洗滌緩沖 液為10mMTris， PH-6.8, 80%乙醇；用脫磺化液脫磺化，脫磺化 液為30%乙醇，5°/。甘油，200mMNaOH， 100mM NaCl;再用上 述洗滌緩沖液洗滌;最后用TE洗脫液洗脫，從而得到檢測基因甲基 化的PCR模板。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學生物學檢測技術領域，是一種快速檢測DNA甲基化的方法。針對傳統(tǒng)方法的不足做了以下三方面的改進1.采用添加催化劑TAC、鹽酸胍加速修飾反應；2.修飾反應過程中多次短時間高溫解鏈，以充分暴露堿基，將未甲基化修飾的胞嘧啶轉化為磺化尿嘧啶；3.針對修飾后繁瑣的透析脫鹽步驟，DNA修飾產物純化時，將修飾后的DNA產物結合到玻璃纖維膜或硅藻土或硅膠膜或者其他柱子上進行洗滌脫鹽，再用去磺化試劑處理后洗脫，從而得到檢測基因的甲基化PCR模板，可以直接用于PCR擴增，大大節(jié)省了脫鹽時間。本發(fā)明方法成本低廉、檢測時間短、重復性好。
文檔編號C12Q1/68GK101285096SQ20081003845
公開日2008年10月15日 申請日期2008年6月3日 優(yōu)先權日2008年6月3日
發(fā)明者衛(wèi)立辛, 吳孟超, 黎 張, 張春東, 赟 徐, 蔣國成 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學