專利名稱：Dna單分子有序化測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA測序方法，特別是一種基于原子力顯微鏡納米操縱的在單個DNA分子水平上進行有序化測序的方法。
背景技術(shù)：
目前DNA測序方法大都以Sanger(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.745463-55467)與Maxam和Gilbert(Maxam&Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74560-564)的方法為基礎(chǔ)，在試劑和方法等方面加以改進和完善。多路測序(multiplexsequencing)、毛細管凝膠電泳和自動凝膠電泳技術(shù)的引進，使基于Sanger方法的測序效率大大提高。但這些方法都只能測定短的DNA片段，因此DNA首先內(nèi)切酶或超聲波隨機打斷成小片段，然后對每個片段的堿基序列進行分析。很顯然，DNA小片段在其原始位置信息的喪失導致了DNA序列測定是十分困難的。
也有一些與Sanger方法完全不同的新方法，如掃描探針顯微術(shù)(Minne etal.(1998)Appl.Phys.Lett.722340-2342)、納米孔(Vercoutere at al.(2001)Nature Biotechnol19248；Deamer&Akeson.(2000)TIBTECH APRIL 18147-151)、時間飛行質(zhì)譜(Wu et al.(1994)Anal.Chem.661637-45)、焦磷酸檢測分析(Ronaghi et al.(1996)Anal.Biochem.24284-89；Ronaghi et al.(1996)Science 281363-365)、外切酶測序(Sauer et al.(1999)Phys.Chem.Chem.Phys.12472-77)、雜交測序(Service(1998)Science 282396-399&399-401)等。這些方法能較快速的對較少量的DNA樣品進行測序，但在核苷酸的讀出長度、分辨相鄰核苷酸的鑒別能力以及操作的實用性上存在局限性。(Marziali&Akeson(2001)Annu.Rev.Biomed.Eng 3195-223；Meldrum(2001)Science 292515-517)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是克服上述已有方法的困難和局限，提供一種可對單個分子數(shù)量的樣品進行較為簡單快速地獲得DNA序列的方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種DNA單分子有序化測序方法就是對DNA單分子按次序進行測序，本方法是通過分子梳技術(shù)將DNA分子拉直并固定在基底上，再利用原子力顯微鏡依次進行切割和分離DNA片段，然后進行PCR擴增和測序。
該方法包括下列步驟(1)將DNA樣品溶液滴加在基底表面，利用分子梳技術(shù)將DNA單分子拉直并固定；(2)利用原子力顯微鏡(AFM)對樣品分子進行成像；(3)利用AFM的“逐線反饋納米操縱技術(shù)”將DNA分子依次切隔成小片段；(4)利用“單個生物大分子的分離方法”依次對DNA小片段進行分離；(5)利用PCR技術(shù)分別對所分離的DNA分子進行擴增；(6)對放大后的DNA樣品進行測序。
所說的基底可以是云母，也可以是硅，也可以是化學修飾后云母。
所說的化學修飾后的云母，即新剝離的云母表面用0.5～1％的APTES水溶液處理2分鐘，用雙蒸水洗滌后，在80℃～200℃環(huán)境下烘烤1～4小時，然后放在干燥器中備用。
所說的DNA單分子可以為質(zhì)粒DNA、基因組DNA、BAC、YAC、cDNA、染色體以及克隆了的或經(jīng)PCR技術(shù)擴增得到的DNA片段，可以是各種方法制備的DNA片段包括機械打斷的片段、直接提純的片段。
所說的原子力顯微鏡探針可在空氣、液體或真空環(huán)境中進行操作。
所說原子力顯微鏡的探針的針尖可以是針尖陣列，可以進行并行分離、拾取和測序。


圖1是DNA單分子有序化測序的流程示意圖。
圖2是利用AFM的“逐線反饋納米操縱技術(shù)”將拉直固定在云母表面的DNA分子依次切隔形成小片段的AFM探測所獲得的圖像。
圖3是利用“單個生物大分子分離方法”對切割制備的DNA分子片段進行分離前后的AFM探測結(jié)果。
具體實施例方式
下面著重以λDNA分子為例來說明本發(fā)明的方法本發(fā)明對DNA分子進行有序化測序方法，包括下列步驟
1、將DNA樣品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技術(shù)將DNA單分子拉直并固定。
為了使DNA分子在基底表面的有適中的吸附力以同時滿足AFM成像和可以分離的需要，我們采用了用0.5～1％的APTES水溶液處理基底2分鐘，然后在80℃～200℃環(huán)境下烘烤的過程，最后用“分子梳”技術(shù)將DNA拉直固定在基底上(關(guān)于基底處理以適合于DNA拉直的要求，請參見我們的專利胡鈞，黃一波，張益，歐陽振乾，李民乾。一種用于DNA操縱的云母襯底的制造方法。發(fā)明專利，申請?zhí)?0116715.4，申請日20000623)。
2、利用原子力顯微鏡(AFM)對樣品分子進行成像。
3、利用AFM的“逐線反饋納米操縱”技術(shù)將DNA分子依次切隔成小片段。
“逐線反饋納米操縱”技術(shù)的具體過程為先用AFM輕敲模式(tapping)掃描一條線，獲得這條線的信息(力，或者它所轉(zhuǎn)換成的高度)，然后對同一條線進行第二次接觸模式(contact)掃描時進行監(jiān)視和調(diào)整(改變掃描力的大小)從而實現(xiàn)對這條線的操縱。整個成像和操縱過程不用退出AFM的反饋系統(tǒng)而連續(xù)進行。在實行“切割”的納米操縱時，先獲得一幅圖像，選定感興趣的區(qū)域；接下來，通過增加力來驅(qū)動AFM針尖與選定區(qū)域接觸，從而利用AFM針尖的移動(來回移動的次數(shù)與所用力的大小有關(guān))將DNA切斷。這樣的操縱可以獲得很高的精確性，切割DNA時的空間精確度達到＜5nm，而這主要是受針尖尺度的限制。
4、利用“單個生物大分子的分離方法”依次對DNA小片段進行分離。
利用“單個生物大分子的分離方法”依次對DNA小片段進行分離的操作類似于“逐線反饋納米操縱”技術(shù)中的“切割”過程，不同的是所用的力要小于切割時的域值，通常要小10nN(隨針尖的不同而變化)，并且掃描的區(qū)域要盡量小(比要分離的目標物體稍大即可)，然后執(zhí)行二維掃描過程，在此掃描過程中通過改變探針針尖對樣品分子所施力的大小，克服基底對樣品的吸附使樣品轉(zhuǎn)移吸附到針尖上，從而完成DNA小片段的分離。
5、利用PCR技術(shù)分別對所分離的DNA分子進行放大。
6、對放大后的DNA樣品進行測序。
下面再具體詳細地說明DNA單分子有序化測序的方法。
1、基底的選擇與處理采用了硅烷化的云母作為基底。新剝離的云母表面用0.5-1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)水溶液處理，時間為2分鐘。處理過的APTES-云母表面用雙蒸水洗滌后，在80℃～200℃環(huán)境下烘烤1～4小時(優(yōu)選120℃干燥2小時)，然后放在干燥器中備用。
2、DNA樣品準備和拉直操縱λDNA購自Sigma公司(美國)；DNA用TE緩沖液(40mM tris-Hcl，1mM EDTA)稀釋至1～5ng/μl，取4μl上述DNA溶液滴加于潔凈的蓋玻片一端，接下來用“分子疏”將DNA拉直。具體做法是，首先將該蓋玻片反轉(zhuǎn)，先使帶有溶液的一端輕輕地接觸處理好的APTES一云母表面，然后慢慢地將整個蓋玻片蓋在云母表面上，在此過程中，水流彎液面將溶液中的DNA拉直，APTES對DNA的吸附力使DNA得以固定在基底上。樣品表面在空氣或液氮中干燥后，用AFM進行探測和操縱。
3、DNA單分子的AFM成像、切割與分離DNA單分子的AFM成像、切割與分離都是在NANOScope IIIa AFM系統(tǒng)(DigitalInstrument，美國)上完成的。掃描頭為E或J型。AFM針尖為硅針尖(Silicon-MDT Ltd.，俄羅斯)或Force modulation針尖(Digital Instrument，美國)。成像時，采用AFM輕敲模式(tapping mode)，在相對濕度為30～40％下的大氣條件下獲取。切割和分離過程都是通過“逐線反饋納米操縱”技術(shù)完成的。兩種不同的是，切割時的AFM針尖在一維方向上來回移動，且用的力較大；而分離DNA小片段時，AFM針尖在二維方向上運動，用的力也比切割時要小。
對其他DNA也可以采用上述基于原子力顯微鏡納米操縱的方法進行單分子有序化測序，在此不在贅述。
權(quán)利要求
1.一種DNA單分子有序化測序的方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將DNA樣品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技術(shù)將DNA單分子拉直并固定；(2)利用原子力顯微鏡(AFM)對樣品分子進行成像；(3)利用AFM的“逐線反饋納米操縱技術(shù)”將DNA分子依次切隔成小片段；(4)利用“單個生物大分子的分離方法”依次對DNA小片段進行分離；(5)利用PCR技術(shù)分別對所分離到的DNA分子進行擴增；(6)對擴增后的DNA樣品進行測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA單分子有序化測序方法，其特征在于所說的基底可以是云母，也可以是硅，也可以是化學修飾后云母，可以是平整的玻璃表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA單分子有序化測序方法，其特征在于所說的化學修飾后的云母，即新剝離的云母表面用0.5～1％的3一氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)水溶液處理2分鐘，用雙蒸水洗滌后，在80℃～200℃環(huán)境下烘烤1～4小時，然后放在干燥器中備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA單分子有序化測序方法，其特征在于所說的DNA單分子可以為質(zhì)粒DNA、基因組DNA、BAC、YAC、cDNA、染色體以及克隆了的或經(jīng)PCR技術(shù)擴增得到的DNA片段，可以是各種方法制備的DNA片段包括機械打斷的片段、直接提純的片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA單分子有序化測序方法，其特征在于所說原子力顯微鏡探針可在空氣、液體或真空環(huán)境中進行操作；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA單分子有序化測序方法，其特征在于所述的單個生物大分子的分離方法中，所說原子力顯微鏡的探針的針尖可以是針尖陣列，可以進行并行分離、拾取和測序。
全文摘要
一種DNA單分子有序化測序的方法，該方法包括下列步驟(1)將DNA樣品溶液滴加在基底表面，利用“分子梳”技術(shù)將DNA單分子拉直并固定；(2)利用原子力顯微鏡(AFM)對樣品分子進行成像；(3)利用AFM的“逐線反饋納米操縱技術(shù)”將DNA分子依次切隔成小片段；(4)利用“單個生物大分子的分離方法”依次對DNA小片段進行拾?。?5)利用PCR技術(shù)分別對所分離到的DNA分子進行擴增；(6)對擴增后的DNA樣品進行測序。
文檔編號C12Q1/68GK1521273SQ03115428
公開日2004年8月18日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者胡鈞, 李民乾, 呂軍鴻, 胡 鈞 申請人:中國科學院上海原子核研究所