一種甲基化dna的測序方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種甲基化DNA的測序方法及其應(yīng)用?；谀壳俺墒斓母咄繙y序(Next Generation Sequencing)技術(shù)，首次引入羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭，將DNA甲基化免疫共沉淀測序技術(shù)與亞硫酸氫鹽處理測序技術(shù)相結(jié)合，從而將不含有甲基化修飾的DNA片段去除，即只對含有甲基化修飾的DNA片段進(jìn)行亞硫酸鹽處理，最終精確測定這些DNA片段上的甲基化修飾位點(diǎn)；該方法能夠使測定全基因組水平的DNA甲基化修飾位點(diǎn)所需的數(shù)據(jù)量降至常規(guī)方法的1/10，從而降低測序成本和信息處理量，更高效地對全基因組DNA甲基化進(jìn)行高通量測序。
【專利說明】一種甲基化DNA的測序方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種甲基化DNA的測序方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控中的重要修飾之一，被稱之為哺乳動(dòng)物DNA中除ATCG 四種堿基以外的"第五種堿基"。在哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞和大腦中它主要發(fā)生在CpG二核苷 酸中胞嘧啶苯環(huán)第五位碳原子上，少部分發(fā)生在CHG和CHH(H = A，T，C)上。作為一種共價(jià) 修飾，DNA甲基化在正常的分化發(fā)育和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，同時(shí)在更高等真核生物器 官的細(xì)胞分化中可以穩(wěn)定遺傳，并且在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)它可以通過精子傳給下一代。在細(xì)胞 分化、疾病和環(huán)境影響下，DAN甲基化狀態(tài)會(huì)發(fā)生巨大變化。因此，5mC位點(diǎn)的檢測以及DNA 甲基化水平的評估對發(fā)育和疾病發(fā)生中DNA甲基化狀態(tài)的揭示顯得尤為重要。
[0003] 由于2007年高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，一些基因組DNA甲基化檢測技術(shù)也得到發(fā) 展。在單分子水平定量檢測5mC方面，甲基化測序無疑是最強(qiáng)大和全面的一種方法。然而， 甲基化測序需要測到至少整個(gè)基因組30倍的測序深度，并且對于大樣本大基因組的DNA甲 基化組的測定，是極其昂貴的。簡化的代表性的重亞硫酸鹽測序（RRBS)實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率 方案，但是只描繪了覆蓋整個(gè)基因組的5%并且局限于CpG島（CGIs)的甲基化圖譜。然而， 不同樣本間的甲基化組分析表明大部分組織和癌癥特定的差異甲基化區(qū)域發(fā)生在CpG島 附近。甲基化DNA免疫共沉淀測序（MeDIP-seq)實(shí)現(xiàn)了高達(dá)67 %的CpG的覆蓋度，而RRBS 只覆蓋了最少的基因組水平的CpGs (12% )。但是，MeDIP-seq不能實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率，同 時(shí)也不能檢測非CpG的甲基化狀。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服MeDIP-Seq和MethylC-Seq的缺陷但又綜合兩者的優(yōu)勢，我們將亞硫 酸鹽處理整合到MeDIP-seq的方法中，組成定義為甲基化DNA免疫沉淀亞硫酸鹽測序 (MB-seq)。
[0005] 由于在MeDIP方法中連接了甲基化接頭的未甲基化的片段會(huì)被非特異的拉下，另 外未甲基化的11 Iumina測序接頭中的胞啼陡在亞硫酸鹽處理后也會(huì)被轉(zhuǎn)化為尿啼陡，這 將導(dǎo)致接頭連接的DNA片段不能匹配Illumina測序，因此在MB-seq中這些接頭是不適用 的。基于羥甲基化的DNA片段不能被5mC抗體富集并且在亞硫酸處理過程中羥甲基化的胞 嘧啶與甲基化的胞嘧啶有同樣的效果，我們創(chuàng)造性地將羥甲基化的接頭（接頭中所有的胞 嘧啶都是羥甲基化的）引入MB-seq中。
[0006] 具體而言，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容：
[0007] -種甲基化DNA的測序方法，包括建庫步驟和測序步驟：
[0008] 其中建庫步驟是指獲得待檢測的甲基化DNA文庫的步驟，所述建庫步驟包括：
[0009] 1)基因組DNA的片段化及雙鏈DNA片段末端修復(fù)；
[0010] 2)將1)中得到的DNA片段與羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭連接；
[0011] 3)富集步驟2)中的甲基化DNA片段；
[0012] 4)將步驟3)中得到的產(chǎn)物中未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基；
[0013] 5)將4)中的單鏈DNA通過引物進(jìn)行擴(kuò)增以獲得雙鏈DNA ;
[0014] 6)去除接頭回收純化DNA。
[0015] 其中測序步驟是指對前述建庫步驟獲得的文庫進(jìn)行序列測定，還包括如下步驟：
[0016] 7)對步驟6)中獲得的雙鏈DNA進(jìn)行測序。
[0017] 其中建庫步驟和測序步驟中，步驟1)包括：
[0018] a)將基因組DNA片段化成為DNA片段；
[0019] b)將所述DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)以獲得具有平末端的DNA片段；
[0020] c)將2)中得到的DNA片段的3'末端加上A堿基；
[0021] 本發(fā)明中，所述羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭中所有的堿基胞嘧啶都是羥甲基化 的。
[0022] 本發(fā)明中，步驟3)中的富集羥甲基化DNA通過MeDIP技術(shù)進(jìn)行的。
[0023] 本發(fā)明中，步驟4)中通過亞硫酸鹽處理試劑盒將DNA中未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn) 化為尿嘧啶堿基。
[0024] 本發(fā)明中，步驟5)中通過高保真DNA聚合酶將單鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增以獲得雙鏈DNA。
[0025] 本發(fā)明中，步驟6)中用膠回收試劑盒通過凝膠電泳回收純化的DNA。
[0026] 本發(fā)明還提供了所述方法構(gòu)建得到的DNA測序文庫。
[0027] 本發(fā)明中還提供了一種試劑盒，其中至少包含用于DNA末端修復(fù)的試劑，DNA 3' 端加 A的試劑，羥甲基化修飾的接頭試劑、通過MeDIP技術(shù)富集甲基化DNA的試劑，用于將 未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的亞硫酸氫鹽試劑，用于擴(kuò)增的試劑，用于膠回收的試劑。 其中，所述擴(kuò)增的試劑包括引物。
[0028] 本發(fā)明還包括所述試劑盒用于甲基化DNA文庫建庫或者用于甲基化DNA測序的用 途。
[0029] 本發(fā)明MB-seq能夠精確地檢測到單個(gè)5mC位點(diǎn)的甲基化水平并且基因組覆蓋度 高。相對于甲基化DNA免疫共沉淀測序（MeDIP-seq)準(zhǔn)確性提高，無論是在測序深度還是 在測序質(zhì)量評估方面，本技術(shù)都表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。同時(shí)，本技術(shù)在靈敏度與專一性方面 都能達(dá)到與全基因組亞硫酸鹽測序技術(shù)相近的效果。相對于全基因組亞硫酸鹽測序技術(shù) (MethylC-seq)，所需數(shù)據(jù)量減少，僅需BS的1/10,成本下降。相對于簡化的具有代表性的 亞硫酸鹽測序（RRBS)，對基因組的覆蓋度大幅提高。MB-seq的技術(shù)對于不同起始量的DNA 重復(fù)性好。在技術(shù)成本上，在功能區(qū)甲基化測序數(shù)據(jù)飽和的情況下可比全基因組亞硫酸氫 鹽測序的數(shù)據(jù)量少90% -95%，節(jié)約每個(gè)樣本檢測成本80% -90%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0031] 圖1是各種DNA甲基化測序方法檢測靈敏度的比較，包含MB-seq、MeDIP-seq、RRBS 及 MethylC-seq、；
[0032] 圖 2 是 MB-seq 與 MeDIP-seq 建庫流程；
[0033] 圖3是MB-seq技術(shù)1微克DNA起始量與500納克DNA起始量之間的技術(shù)重復(fù)性 相關(guān)系數(shù)；
[0034] 圖4是MB-seq技術(shù)200納克DNA起始量與50納克DNA起始量之間的技術(shù)重復(fù)性 相關(guān)系數(shù)；
[0035] 圖5是不同DNA甲基化測序方法（MB_seq、RRBS、MethylC_seq)不同測序深度下可 以覆蓋的全基因組CpG的百分?jǐn)?shù)；
[0036] 圖6是不同DNA甲基化測序方法不同測序深度下可以覆蓋的重復(fù)序列元件中CpG 的百分?jǐn)?shù)；
[0037] 圖7是三種亞硫酸鹽測序（MB_seq、RRBS、MethylC_seq)檢測到的mCpG重疊分析。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、 完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其 他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0039] 實(shí)施例1 :
[0040] 試驗(yàn)用DNA來自通過SV40T/t抗原和人類端粒酶催化后永生化的人類卵巢上皮細(xì) 胞系（T29)。具體操作過程如下：
[0041] 1.獲取基因組DNA
[0042] 取1'29細(xì)胞系，用0^^1^0嫩81〇〇(1&1188脫1(^(0丨38611公司）提取樣品0嫩。 將提取得到的DNA編號(hào)為MB，取其中200納克DNA樣品作為起始材料，參照圖2中MB-seq 的流程構(gòu)建文庫，本實(shí)施例中構(gòu)建的是Illumina Hiseq 2000Paired End文庫。
[0043] 2.片段化基因組DNA
[0044] 采用Covaris system(AB公司）將前述步驟1中的DNA樣品進(jìn)行斷裂，樣品斷裂 結(jié)束后，將斷裂后的樣品在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行IXTAE電泳檢測，從所述電泳凝膠回收 待測DNA片段。為將樣品DNA片段控制在100?250bp范圍內(nèi)，Covaris system斷裂具體 操作為：
[0045] 1)雙擊打開 Covaris 主程序"SonoLAB S-Series V2. 54，'后點(diǎn)擊"Start [Enter]，'， 待儀器排氣30分鐘，且水溫降為TC左右后方可使用。打開主程序之前須先確定打碎儀和 冷卻儀的電源開關(guān)是否打開，否則主程序會(huì)提示錯(cuò)誤并重試。
[0046] 2)將樣品加入待用的130ul的covaris micro Tube中，樣品加入量5 μ g，最后將 終體積用TE緩沖液補(bǔ)至130μ 1，用移液器將樣品溶液吹打混勻。點(diǎn)擊"Configure"，設(shè)置參 數(shù)見表1 :
[0047] 表1片段化基因組DNA在Covaris system中的設(shè)置參數(shù)
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種甲基化DNA的測序方法，其特征在于，包括如下步驟： 1. DNA樣品的片段化； 2) 將1)中得到的DNA片段與羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭連接； 3) 富集步驟2)中的甲基化DNA片段； 4) 將步驟3)中得到的產(chǎn)物中未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基； 5) 將4)中的單鏈DNA通過引物進(jìn)行擴(kuò)增以獲得雙鏈DNA ; 6) 去除接頭回收純化DNA ; 7) 對步驟6)中獲得的雙鏈DNA進(jìn)行測序。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)包括： a) 將基因組DNA片段化成為DNA片段； b) 將所述DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)以獲得具有平末端的DNA片段； c) 將b)中得到的DNA片段的3'末端加上A堿基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述羥甲基化修飾的寡核苷酸接頭中所 有的堿基胞嘧啶都是羥甲基化的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中的富集羥甲基化DNA通過MeDIP 技術(shù)進(jìn)行。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中通過亞硫酸鹽處理試劑盒將 DNA中未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶堿基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中通過高保真DNA聚合酶將單鏈 DNA進(jìn)行擴(kuò)增以獲得雙鏈DNA。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建得到的DNA測序文庫。
8. -種試劑盒，其中至少包含所述用于DNA末端修復(fù)的試劑、DNA 3'端加A的試劑、羥 甲基化修飾的接頭試劑、通過MeDIP技術(shù)富集甲基化DNA的試劑、用于將未甲基化的胞嘧啶 轉(zhuǎn)化為尿嘧啶的亞硫酸氫鹽試劑、用于擴(kuò)增的試劑、用于膠回收的試劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述擴(kuò)增的試劑包括引物。
10. 權(quán)利要求8的試劑盒用于建立甲基化DNA文庫或者用于甲基化DNA測序的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372079SQ201410578592
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】蔡萬世, 伍鴻鵠, 王康利, 孫中生 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所