專利名稱：選擇甲基化標記的方法
選擇甲基化標記的方法本發(fā)明要求2010年5月12日提交的英國專利申請?zhí)?007944.0的優(yōu)先權。英國專利申請?zhí)?007944.0的內容通過引入全文納入本文。本發(fā)明涉及匯編和使用位于生物基因組DNA中靶標DNA序列組的方法，用于診斷和鑒定生物樣品經(jīng)歷的暴露和/或涉及組織或細胞的種類或來源。所有生物組織(從單個細胞到復雜的多細胞真核植物和動物生物)持續(xù)暴露于影響細胞過程的環(huán)境因子。這些環(huán)境因子能采用很多不同的暴露形式，包含物理、化學、生物(如害蟲和疾病)、病毒和放射暴露。當這些暴露降低生物組織的有效功能時，稱為惹激(stress)。在其最廣泛意義，惹激能定義為從對生物組織或個體有效功能最優(yōu)的生物和非生物條件的任何偏離。因此，當用于本發(fā)明的上下文時，一種或多種惹激包含非生物惹激、和生物和發(fā)育惹激(示例包括但不限于暴露于病原體介導的疾病和內源“系統(tǒng)分解”疾病例如癌癥和衰老)O 例如，幾個作者列舉了大量影響植物的非生物惹激，并且也描述了暴露于這些惹激誘導的生理反應(如Orcutt和Nilsen2000) ;Padmanabh2005)。類似地，由Bijlsma和Loeschcke (1997)編寫的工作描述了廣泛范圍的環(huán)境惹激和研究了其對進化過程的影響。Goh等(2007)列舉了大量人疾病惹激，和報道了其對基因表達的影響。Hruz等(2008)在Genevestigator 網(wǎng)站(https://www.genevestigator.com)提供了數(shù)種動物和植物物種(包含人、小鼠和擬南芥(Arabidopsis))中惹激的廣泛列表。非生物惹激的示例包括但不限于熱、滲透、物理創(chuàng)傷、營養(yǎng)缺乏、化學誘導惹激和生理惹激如毒素、預防、化肥和治療或娛樂性藥物。生物和發(fā)育惹激的示例包括但不限于暴露于病原體介導的疾病，寄生蟲侵擾，內源“系統(tǒng)分解”疾病，例如癌癥和衰老。也有傳統(tǒng)惹激賦予生物某些健康或其他益處的示例，如陽性惹激。很多陽性惹激的示例包含Callaway等(2002)的研究，所述研究顯示了在阿爾卑斯山植物群落中，一個個體毗鄰另一個賦予健康優(yōu)勢，而不是與植物-植物競爭惹激更常相關的成本。Dhabhar和McEWen(1998)顯示了持續(xù)時間短的抑制物顯著增強人皮膚中的遲發(fā)型超敏反應，并且假定所述惹激誘導的白細胞向皮膚運輸可以介導研究中觀察到的免疫增強。Poss和Tonegawa (1997)研究了小鼠血紅素加氧酶I (Hmoxl)的調節(jié)和活性；Hmoxl是在惹激的哺乳動物細胞中經(jīng)典上調的基因。提供了證據(jù)顯示此基因上調給予細胞對氧化惹激的保護并因此賦予來自惹激暴露的正效益。鑒于影響任何生物系統(tǒng)最優(yōu)表現(xiàn)的大量參數(shù)和幾乎存在所有生物的環(huán)境的先天可變性質，每個生物個體在其生命中遇到一種或另一種形式的惹激是不可避免的。通過組合耐受(用于能生存的次最優(yōu)惹激)和/或避免(用于不能耐受的所有惹激和也用于很多降低操作效率的惹激)，單個生物能適應惹激的影響。當生物遇到不能避免的惹激時，其克服所述惹激的機制涉及生物適應，通常視為代謝通路的改變(Madlung等，2004)，一般使用系統(tǒng)冗余性和引入/增強在新條件下表現(xiàn)更好的通路。這種改變能以多種方式實現(xiàn)，包含通過在調節(jié)區(qū)上游以及基因本身內部的差異胞B密唳甲基化來調節(jié)基因的轉錄控制(如Aceituno等,2008)。任何給定惹激引起的生理改變不限于影響一種或多種起始受體基因(檢測所述惹激的那些)的調節(jié)改變，也包含作為受體改變結果而變化的其他基因(應激反應基因和應激反應基因通路)的級聯(lián)反應。由不同的惹激誘導子引入的應激反應基因/通路中有相當大的冗余性。例如，茉莉酸通路參與擬南芥對生物和非生物惹激的反應(此作用的綜述參見Devoto和Turner2005 和 Wasternack, 2007)。DNA甲基化似乎廣泛跨越很多真核組，包含植物、哺乳動物、鳥和無脊椎動物如線蟲(Finnegan 等，1998; Suzuki S 等，2007; Gupta S 等，2006; delGaudio R 等，1997)。植物中，DNA甲基化與基因沉默相連，例如，擬南芥(Arabidopsis thaliana)中基因SUP、PAI和AG 的高甲基化等位基因(Jacobson 和 Meyerowitz, 1997;Melquist 等，1999; Jacobson 等，2000)和柳穿魚屬(Linaria)中的LCYC (Cubas等，1999)。然而，在擬南芥中等位基因AP3和FWA的高甲基化顯示了異位表達(Kinoshita等，2004)。數(shù)個報道提示DNA甲基化在植物發(fā)育和細胞類型調節(jié)中的作用(Finnegan等,2000)。也已知DNA甲基化在包括人在內的哺乳動物的表觀遺傳控制基因表達中起作用，并且可以與某些組織類型相連。測定感興趣特定基因組DNA靶標區(qū)域的甲基化程度在研究領域中有用。在人和其他哺乳動物中，發(fā)現(xiàn)甲基胞嘧啶在胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG) 二核苷酸中幾乎占主導?；蚪MDNA甲基化在基因調節(jié)中起重要作用。在人惡性腫瘤如癌癥中觀察到的最早和最常見的基因改變中，所謂的CpG島(特別是位于基因5’調節(jié)區(qū)內的CpG島)的非典型性甲基化造成這種基因表達的改變。DNA甲基化和基因調節(jié)之間的聯(lián)系引起相當大的研究興趣，通過使用基因組中定義位點的DNA甲基化的出現(xiàn)和程度作為診斷工具以診斷發(fā)育進展的特異性狀態(tài)，細胞、組織或器官的種類，疾病和其他惹激形式的開始或暴露。所述應激反應通路本身影響基因的甲基化，并且與維持或持家通路中運轉的調節(jié)區(qū)有關。與任何這些基因表達有關的甲基化改變不太可能單獨診斷引起其活化的精確惹激，因為很多不同惹激能激活相同的應激反應基因。如本文可見，這種位點在對反應(甲基化或去甲基化的誘導)直接分配原因(單個惹激)中幾乎沒有價值，因為數(shù)個不同的惹激能引起DNA甲基化中相同的改變。出于這個原因，使用DNA甲基化診斷疾病或其他惹激形式的努力集中到從頭查詢單獨或共同診斷特定疾病或惹激的位點，有對每個疾病或惹激集合的新位點。有很多建立了基因或相關調節(jié)區(qū)內單個或多個位點DNA甲基化和特定人疾病間聯(lián)系的研究示例。這些包含白血??；頭頸癌；霍奇金??；胃癌；前列腺癌；腎癌；膀胱癌；乳腺癌；伯基特淋巴瘤；維爾姆斯瘤；帕-魏二氏(Prader-Willi) /安格爾曼(Angelman)綜合征；ICF綜合征；皮膚纖維瘤；高血壓；兒科神經(jīng)生物學；孤獨癥；潰瘍性結腸炎；脆性X綜合征和亨廷頓病。參見例如: HliILfiAoki E 等，(2000); Nosaka IL 等，(2000);
Asimakopoiilos F A 等》(1999) ; Fajkusova L 等，
(2000); LitzCE 等,(1992)
頭頸癌S細ehez-Cespedes M 等(2000)
祐命金病GardaJF U;, (1999)
lNlJsv Yanagisawl Y 等.(2000)
It列腺瘍RenniePS 等,(1998-99)
Iff*CliffordSC.等.《I998)
1 JttiSSardi I (1998)
乳腺癌Mancini DN 等.(1998); Zrlhan-Llcht S.等.{1995);
Kass DH (1993)
們Jl特淋巴痛:TaoQ等.(1998)
維爾姆斯痛KJeymenovaEV等.(〗998>
帕-魏:......:氏Zeschnigh 等.(1997); Faang P (1999)
安格爾綜合征
ICF 綜合征Tuck-Muller 等.(2000)
皮膚纖維瘤ChenTC等.(2000)
高血!..KLeeSD 等.(1998)
Λ科神經(jīng)牛物學Campos-Castd〗o J等.《1999)
孤獨疝Klauck SM *$.(1997)
潰瘍tt結腸炎GioriaL等.《1996)
脆性X綜合怔Homstra IK等.(1993)· 廷頓病Ferluga J 等.(1989)還在其他(非人)高等生物基因組中鑒定了與特定惹激和疾病相關的特異位點的甲基化。示例包含:

煙草植物(煙草(Nicotiana tabacum))中，I型甲基轉移酶NtMETl的沉默造成基 因組中甲基化的降低。Wada等(2004)顯示約30個基因上調，超過一半直接參與對生物或 非生物惹激的響應。另外，Choi等(2007)也顯示煙草植物中，病原體響應基因NtGPDL的 甲基化模式在人工接種煙草花葉病毒(TMV) 24小時內改變，并且這個改變與植物的超敏反應(HR)有關。玉米(玉米(Zeamays))中，低溫惹激似乎減少甲基轉移酶的轉錄，并且也隱含地降低DNA甲基化(Stewart等,(2000))。在后者研究中，(Stewart等,(2002)相同組使用HPLC分析以確證低溫度惹激造成總甲基化下降超過10%，但是似乎局限在Ac/Ds轉座子。甲基化也參與高濃度重金屬惹激的耐受。比如，Lee等(1998)顯示表現(xiàn)出甲基轉移酶活性增加(和因此更多甲基化)的倉鼠細胞系顯示了對重金屬抗性提高。在生物范圍內與惹激有關的甲基化基因座的綜述參見Peng和Zhang(2009)和Hruz 等,(2008)，以及 Genevestigator 網(wǎng)站(https://www.genevestigator.com)?，F(xiàn)有技術中就診斷目的而言使用DNA甲基化模式的方法是當前高度靶向鑒定和使用基因座以診斷個體環(huán)境暴露，即特異性疾病、發(fā)育進展或具體惹激的特定狀態(tài)。W02007/132166描述了以下發(fā)現(xiàn):在懷孕婦女中，源自胎兒的某些基因(例如RASSF1A、APC、CASP8、RARB、SCGB3A1、DAB21P、PTPN6、THY1、TMEFF2 和 PYCARD)高度甲基化，而母體來源的相同基因未甲基化。所述研究描述了如何在來自懷孕婦女的生物樣品中檢測一種或多種這些甲基化的胎兒基因，作為所述樣品中出現(xiàn)胎兒DNA的通用指示物。這些胎兒甲基化標記描述為就非侵入性分析過程而言特別有用的陽性對照，所述過程中監(jiān)控胎兒DNA的質量和數(shù)量。

US2006-0183128(也公開為W02005/019477)描述了鑒定分化組織表觀遺傳標記的全基因組表觀遺傳圖；所述方案包含甲基化可變的CpG位點(MVP)和基因組DNA樣品類型之間的相關性。表觀遺傳圖在例如鑒定樣品類型或區(qū)分兩種或多種樣品類型中有廣泛用途。在表觀遺傳圖背景中分析一個或一組核酸序列的表觀遺傳特性僅能測定所述核酸的來源，而不是環(huán)境暴露/惹激的概況。US2007-0292866涉及檢測人基因組DNA甲基化總體改變以及人基因組中特定區(qū)域甲基化改變的方法。所述方法能診斷、預后和監(jiān)控疾病的治療處理，以及檢測飲食和/或食品補充劑引起的甲基化改變。所述惹激僅能分開鑒定。US2004-0029117描述了能鑒定差異甲基化DNA基因座的通用發(fā)明，可用作測定生物效果和/或藥物活性、化學物質和/或藥物組合物的標記。所述藥物、化學物質和/或藥物組合物僅能分別使用各自表觀遺傳標記單獨研究。因此，迄今為止使用DNA甲基化鑒定特定惹激局限于在一次一個的單獨惹激研究中使用的標記，或其他所述的源材料(例如，組織/器官/細胞類型)或建立生理狀態(tài)。因此需要研究惹激范圍的更有效系統(tǒng)，并且特別是單個分析中多個惹激的研究。理想地，所述相同分析也應該能區(qū)分源材料和生理狀態(tài)。本發(fā)明提供能鑒定基因組DNA內標記組的系統(tǒng)，能用于共同和重復地鑒定個體、組織、器官或細胞處于一定范圍的惹激，和/或診斷樣品所接觸惹激的廣泛或特定性質，和/或診斷生物樣品的生理狀態(tài)或來源(例如細胞類型或器官)。本發(fā)明的標記DNA序列在下文稱為(可互換)‘DNA基因座’、‘前哨(Sentinel)’和‘惹激前哨(Sentinel)’，并且能鑒定生物樣品經(jīng)歷的一種或多種惹激(包含單個生物、器官、組織或細胞)。惹激前哨各包含序列基序，所述基序改變其DNA甲基化狀態(tài)(通常但不必定限于胞嘧啶殘基)，例如在生物經(jīng)歷某些惹激后但不是經(jīng)歷其他惹激；和/或細胞分化成某些細胞類型但不是其他；和/或根據(jù)獲取樣品的器官或組織，和/或細胞類型、組織、器官或個體的發(fā)育的生理年齡或狀態(tài)。這個方式中，當考慮全組惹激前哨時，DNA甲基化的共同模式能鑒定是否在一種或多種惹激下操作生物樣品，或生物樣品處于一種或多種惹激，和/或能用于診斷樣品的來源或源材料的生理狀態(tài)。樣品接觸的惹激可以是已知的(如前面由惹激前哨鑒定的)或者未知的(惹激前哨沒有鑒定的)惹激。通過與標準參照樣品的比較正常推斷出樣品(組織、器官或細胞類型)來源的生理狀態(tài)或來源(例如，與來自肝細胞DNA相關的DNA甲基化概況匹配暗示樣品來自肝樣品)。惹激前哨的關鍵屬性是沒有一個前哨單獨診斷任何一個惹激、源材料或生理狀態(tài)，并且前哨能使用一種惹激(或源材料或生理狀態(tài))來鑒定，但是當應用于處于不同惹激的樣品(或源材料或生理狀態(tài))時，仍然保留了診斷屬性。此屬性提供了與尋求鑒定甲基化標記的現(xiàn)有系統(tǒng)相比顯著的提高，所述標記根據(jù)針對一定范圍對照比較器狀態(tài)判斷的靶標狀態(tài)的調查，單獨診斷惹激/組織/發(fā)育狀態(tài)。現(xiàn)有方案的缺點是所述方案在更廣泛取樣時容易受損，導致發(fā)現(xiàn)不同的狀態(tài)/組織/細胞類型共有前面認為診斷靶標狀態(tài)的相同甲基化狀態(tài)。相反，前哨標記包含這個可能性并且因此很不太可能受到更廣泛取樣的影響，并且(不像現(xiàn)有系統(tǒng))能診斷前面未鑒定的反應為不同。前哨本身可以來自或不來自與編碼區(qū)、調節(jié)區(qū)或內含子有關的DNA，和可以與基因表達中的已知改變有關或無關。而且，前哨位點可以位于與基因表達無關的非編碼區(qū)，前提是所述位點的惹激之間甲基化狀態(tài)的改變是一致和可靠的。本發(fā)明通過參照擬南芥、小鼠和人中的前哨DNA甲基化標記組(或可以發(fā)生的證據(jù))示例這個屬性，所述標 記基于響應一組惹激的差異甲基化來選擇(或根據(jù)已知對甲基化改變敏感的差異基因表達而推測的差異甲基化)，并且顯示能鑒定暴露于惹激而不用于標記選擇過程的樣品(或組織類型)。根據(jù)由這些標記生成的二元概況測定相關性或聚類的已確立方法能用于提供對新惹激(如未訓練的惹激)所屬廣泛分類的一些指南。這些包括但不限于多變量分析，例如主坐標分析或診斷決策樹或決策樹(見例如AnalysingEcologicalData (分析生態(tài)數(shù)據(jù))(2007)，紐約州施普林格公司(Springer)，第15章，第259-264頁，ISBN978-0-387-45967-7)。還描述了衍生自擬南芥的甲基化控制應激反應基因調節(jié)區(qū)的前哨標記組，其表達模式(和因此甲基化狀態(tài))能區(qū)分至少78種不同的惹激類型。通過數(shù)個非常溫和的惹激(誘導所調查78個基因中〈5個的改變)提供關于所述方案潛在靈敏度的一些指示。還通過訓練擬南芥基因座來示例前哨原理，使用來自78個起始組的40個基因標記亞組系列和使用這些標記以定量頻率，其中鑒定新的惹激為獨特(即與訓練組不同)，與對照不同但是與現(xiàn)有惹激相同(即在訓練組中發(fā)現(xiàn))或與對照相同(假陰性)。也顯示了前哨使用一組已知在不同組織中差異甲基化的人基因座來鑒定組織類型的能力。顯示了針對有限組織組選擇和使用前哨，仍然能診斷組織，而不用于鑒定所述前哨。在上下文中，診斷指鑒定細胞、組織、器官或生物內生理和表型狀態(tài)或其改變。在此說明書中，以能編寫清晰和準確說明書的方式描述了實施方式，但是旨在并且應理解，實施方式可采用多種組合或分開而不偏離本發(fā)明。在此說明書中，術語“約”指加或減20%,更優(yōu)選加或減10%，甚至更優(yōu)選加或減5%，最優(yōu)選加或減2%。
在此說明書中，使用術語“生長”指發(fā)現(xiàn)或放置或培養(yǎng)細胞或組織或生物的生活環(huán)境。例如，所述術語可涉及生長、生活、環(huán)境和/或發(fā)育狀態(tài)。術語“生長的”和“生長”指感興趣階段或研究中細胞或組織或生物的存活和/或增殖。在本發(fā)明的第一方面，提供了就鑒定非典型生長條件(惹激)而言鑒定一組DNA基因座(惹激前哨)的方法，包含步驟:1.在對照生長條件下培養(yǎng)感興趣的細胞樣品；ii在存在至少一種非典型生長條件的環(huán)境中，培養(yǎng)與步驟(i)所述相同的感興趣細胞樣品；ii1.從⑴和(ii)的各細胞樣品中分離DNA ；iv.鑒定步驟(iii)中分離的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)；V.比較來自步驟⑴和(ii)中分離的DNA的甲基化狀態(tài)。v1.選擇具有以下特征的基因座亞組，其中所述亞組的特征在于:步驟(ii)中分離的DNA中這些基因座的甲基化狀態(tài)不同于步驟(i)中分離的DNA。vi1.鑒定步驟(vi)中選擇的基因座亞組。vii1.將選定亞組基因座的甲基化狀態(tài)與非典型生長條件和/或感興趣細胞樣品相關聯(lián)?？蛇x地，所述方法包含步驟:ix.將選定基因座亞組的甲基化狀態(tài)與圭用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合相關聯(lián)。在本發(fā)明的第二方面，提供了就鑒定特定非典型生長條件(惹激)而言鑒定多組DNA基因座(惹激前哨)的方法，包含步驟:1.在對照生長條件下培養(yǎng)多種感興趣的細胞樣品，其中感興趣的多種細胞有不同的基因型；ii在存在至少一種非典型生長條件的環(huán)境中，培養(yǎng)步驟(i)中所述多種感興趣細胞樣品；ii1.從⑴和(ii)的各細胞樣品中分離DNA ；iv.鑒定步驟(iii)中分離的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)；V.比較步驟⑴與(ii)、或⑴和(iii)、或(ii)和(iii)中分離的DNA的甲基化狀態(tài)。v1.選擇具有以下特征的基因座亞組，其中所述亞組的特征在于:步驟(ii)中分離的DNA中這些基因座的甲基化狀態(tài)不同于步驟⑴和/或(iii)中分離的DNA;和/或其中步驟(iii)中分離的DNA中這些基因座的甲基化狀態(tài)與(i)相比不同。vii鑒定步驟(vi)中選擇的基因座亞組。vii1.將基因座亞組和其甲基化狀態(tài)與用于選擇基因座的非典型生長條件和/或感興趣細胞樣品相關聯(lián)。可選地，還有步驟:
ix.將選定基因座亞組的甲基化狀態(tài)與圭用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合相關聯(lián)。在本發(fā)明的第三方面，提供了就鑒定多種非典型生長條件而言鑒定一組DNA基因座的方法，包含步驟:1.在對照生長條件下培養(yǎng)感興趣的細胞樣品；ii在存在至少一種非典型生長條件的環(huán)境中培養(yǎng)與步驟(i)相同的多種感興趣細胞樣品，其中各個樣品分別在不同的非典型生長條件下生長；ii1.從⑴和(ii)的各細胞/樣品中分離DNA ;iv.鑒定步驟(iii)中分離的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)；V.比較來自步驟⑴和(ii)中分離的DNA的甲基化狀態(tài)；v1.選擇具有以下特征的基因座亞組，其中所述亞組的特征在于:各樣品步驟
(ii)中分離的DNA中這些基因座的甲基化狀態(tài)不同于步驟(i)中分離的DNA;vii鑒定步驟(vi)中 選擇的基因座亞組；vii1.將基因座亞組和其甲基化狀態(tài)與(ii)的不同非典型生長條件相關聯(lián)?？蛇x地，有其他步驟:ix.將選定基因座亞組的甲基化狀態(tài)與圭用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合相關聯(lián)。優(yōu)選地，所述基因座亞組中的各基因座不診斷單一病癥。優(yōu)選地，選定基因座亞組的甲基化狀態(tài)診斷未用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合。優(yōu)選地，選定基因座亞組的甲基化狀態(tài)診斷用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合。優(yōu)選地，選定基因座亞組的甲基化狀態(tài)診斷(i)l用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合；和(ii)選擇基因座所用的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合。本發(fā)明所有方面的方法的中心是用于鑒定和選擇甲基化位點(前哨)的標準，所述位點能用于診斷超出選擇過程所用的惹激、源材料和/或生理狀態(tài)。為此，優(yōu)選選擇通常在條件和/或來源樣品之間不同，但是理想地不是僅對單一條件診斷的標記。在這個方式中，跨前哨的差異甲基化模式產(chǎn)生診斷而不是某些條件特異性基因座的狀態(tài)。下表顯示這個原理。因此，應理解本發(fā)明的方法中，優(yōu)選所選基因座亞組由在條件和/或來源樣品之間不同的基因座組成，但不是僅對單個條件和/或來源樣品的診斷。在假設情況中，有6種惹激(A-F)和8個基因座(1_8)，其中響應不同惹激的甲基化狀態(tài)評分為甲基化(+)或未甲基化(_)。下表1(a)顯示一種可能的結果。表Ι-a惹激類型(A-F)
ABCDEF
(1-X)
1+*φ.+.2- + + - J + 爾 ■響礫兩
4兩爾巻■専*4*. _μ楊.._
8 - + + -+*
在所含的8個基因座中，基因座6和7作為潛在前哨而消除，因為其在惹激的訓練組中沒有變化(即基因座6全部甲基化而基因座7全部未甲基化)?；蜃?和4沒有變化，并且各是一種惹激的診斷(分別為A和F)。這些可以考慮為前哨候選物，但不是理想的，因為其似乎指示一種惹激/基因座，并且不太可能在很多其他惹激(若有)的概況中起重要作用。剩余的基因座不是任何一種特定惹激的診斷,但是能共同分開(separation)訓練組中的所有惹激(見下表I (b))。表Ι-b惹激類型(A-F)
權利要求
1.一種匯編位于生物基因組DNA內的靶標DNA序列組以診斷和鑒定生物樣品曾經(jīng)歷的事件和/或與組織和/或細胞種類或來源相關聯(lián)的方法，所述方法包含選擇具有甲基化狀態(tài)的DNA序列，所述甲基化狀態(tài)在某些樣品中根據(jù)樣品不同而變化但是不僅僅確診生物樣品曾經(jīng)歷的單個事件或組織和/或細胞種類或來源。
2.一種匯編位于生物基因組DNA內的靶標DNA序列組以診斷和鑒定組織和/或細胞種類或來源的方法，所述方法包含 (i)從兩種或多種已知不同種類或來源的細胞樣品中分離DNA； (ii)鑒定從各樣品分尚的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)； (iii)比較來自各樣品分離的DNA的甲基化狀態(tài)；和 (iv)選擇具有以下特征的基因座亞組，所述亞組的特征在于:具有在某些樣品中隨樣品不同但不僅僅確診單個種類或來源的基因座甲基化狀態(tài)。
3.一種鑒定DNA基因座組(惹激前哨)以鑒別非典型生長條件(惹激)的方法，所述方法包含步驟: (i)在對照生長條件下培養(yǎng)感興趣的細胞 樣品； ( )存在至少一種非典型生長條件的環(huán)境中，培養(yǎng)至少一種與步驟(i)所述相同的感興趣細胞樣品； (iii)從步驟⑴和(ii)的各細胞樣品中分離DNA; (iv)鑒定步驟(iii)中分離的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)； (v)比較來自步驟⑴和(ii)中分離的DNA的甲基化狀態(tài)； (vi)選擇具有以下特征的基因座亞組，所述亞組的特征在于:步驟(ii)中分離的DNA中這些基因座的甲基化狀態(tài)不同于步驟(i)中分離的DNA，并且所述亞組中每個基因座響應某些非典型生長條件而不響應其他條件而改變甲基化狀態(tài)。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所選基因座亞組的甲基化狀態(tài)共同診斷(i)未用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合；和(ii)選擇基因座所用的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或其組合。
5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包含使用至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約30、至少約40、至少約50、或更多種不同的惹激、組織類型或細胞類型來選擇基因座亞組。
6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述基因座亞組中的每個基因座或每個選定DNA序列有一個或多個，例如兩個或多個，三個或多個，四個或多個，五個或多個，六個或多個，七個或八個下列特性， (i)對相同惹激再現(xiàn)性地以相同方式或以與相同來源生物相同組織類型相關聯(lián)的方式改變甲基化狀態(tài)； (ii)在相同時間取自相同個體相同組織的重復樣品之間，甲基化的狀態(tài)沒有變化或優(yōu)選小于約20%的變化； (iii)產(chǎn)生易檢測的與不同的惹激狀態(tài)或細胞和/或組織種類或來源相關聯(lián)的定性甲基化改變； (iv)產(chǎn)生易檢測的與不同的惹激狀態(tài)或細胞和/或組織種類或來源相關聯(lián)的顯著定量甲基化改變； (V)響應某些惹激而不響應其他惹激而改變甲基化狀態(tài)(優(yōu)選對15-85%惹激改變，更優(yōu)選25-75%惹激和最優(yōu)選40-60%惹激)； (vi)包括優(yōu)選代表大部分或最好全部(a)生物應激反應通路或(b)細胞和/或組織類型的基于甲基化的基因座； (vii)根據(jù)生物的各個組織/器官類型分別組合； (viii)在不同組織/發(fā)育階段之間不變或優(yōu)選小于約10%變化，除非僅僅意在用于特定的組織、器官或發(fā)育階段。
7.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述基因座亞組中的每個基因座或每個選定DNA序列互補地區(qū)別性存在于大致一半的用于選擇基因座的惹激或樣品來源中。
8.一種鑒定DNA基因座組以鑒別一種或多種非典型生長條件的方法，所述方法包含步驟: (i)在對照生長條件下培養(yǎng)感興趣的細胞樣品； (ii)在存在至少一種非典型生長條件的環(huán)境中，培養(yǎng)與步驟(i)所述相同的感興趣細胞樣品； (iii)從步驟⑴和(ii)的各細胞樣品中分離DNA; (iv)鑒定步驟(iii)中分離的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)； (v)比較來自步驟⑴和(ii)中分離的DNA的甲基化狀態(tài)； (vi)選擇具有以下特征的基因座亞組，所述亞組的特征在于:步驟(ii)中分離的DNA中的這些基因座的甲基化狀態(tài)不同于步驟(i)中分離的DNA，優(yōu)選所述亞組中每個基因座響應某些非典型生長條件而不響應其他條件而改變甲基化狀態(tài)； (vii)鑒定步驟(vi)中選擇的基因座亞組； (viii)將選定亞組基因座的甲基化狀態(tài)與非典型生長條件和/或感興趣細胞樣品相關聯(lián)。
9.一種鑒定多組DNA基因座以鑒別非典型生長條件的方法，所述方法包含步驟: (i)在對照生長條件下培養(yǎng)多種細胞樣品，其中感興趣的多種細胞有不同的基因型； (ii)在存在至少一種非典型生長條件的環(huán)境中，培養(yǎng)步驟(i)中所述多種感興趣細胞樣品； (iii)從步驟⑴和(ii)的各細胞樣品中分離DNA; (iv)鑒定步驟(iii)分離的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)； (v)比較步驟⑴與(ii)、或⑴和(iii)、或(ii)和(iii)中分離DNA的甲基化狀態(tài)； (vi)選擇具有以下特征的基因座亞組，所述亞組的特征在于:步驟(ii)中分離的DNA中這些基因座的甲基化狀態(tài)不同于步驟(i)和/或(iii)中分離的DNA;和/或步驟(iii)中分離的DNA中基因座甲基化狀態(tài)與從⑴相比不同，優(yōu)選所述亞組中每個基因座響應某些非典型生長條件而不響應其他條件而改變甲基化狀態(tài)； (vii)鑒定步驟(vii)中選擇的基因座亞組； (viii)將基因座亞組和其甲基化狀態(tài)與用于選擇基因座的非典型生長條件和/或感興趣細胞樣品相關聯(lián)。
10.一種鑒定DNA基因座組以鑒別多種非典型生長條件的方法，所述方法包含步驟: (i)在對照生長條件下培養(yǎng)感興趣的細胞樣品； (ii)在存在至少一種非典型生長條件的環(huán)境中培養(yǎng)與步驟(i)相同的多種感興趣細胞樣品，其中各個樣品分別在不同的非典型生長條件下生長； (iii)從步驟⑴和(ii)的各細胞樣品中分離DNA; (iv)鑒定步驟(iii)中分離的DNA內能甲基化的基因座的甲基化狀態(tài)； (v)比較來自步驟⑴和(ii)中分離的DNA的甲基化狀態(tài)； (vi)選擇具有以下特征的基因座亞組，所述亞組的特征在于:步驟(ii)中分離的DNA中這些基因座的甲基化狀態(tài)不同于步驟(i)中分離的DNA，優(yōu)選所述亞組中每個基因座響應某些非典型生長條件而不響應其他條件而改變甲基化狀態(tài)； (vii)鑒定步驟(vi)中選擇的基因座亞組； (viii)將基因座亞組和其甲基化狀態(tài)與(ii)中不同非典型生長條件相關聯(lián)。
11.如權利要求8-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包含以下可選步驟: (ix)將選定基因座亞組的甲基化狀態(tài)與未用于選擇基因座的非典型生長條件和/或組織/細胞類型和/或 其組合相關聯(lián)。
12.如權利要求8-11中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包含以下可選步驟: (ix)將基因座亞組和其甲基化狀態(tài)與細胞樣品或組織、器官或獲得所述細胞樣品的生物中的表型和/或生理反應相關聯(lián)。
13.如權利要求8-12中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(ii)中多個樣品是1-10，000種惹激，包括10-500種惹激和/或30-100種惹激。
14.如權利要求8-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包含以下可選步驟: (xi)從細胞樣品中分離DNA，其中所述細胞的生長條件未知； (xii)鑒定步驟(xi)中分離的DNA中步驟(vii)所鑒定的基因座亞組的甲基化狀態(tài)； (xiii)將(xii)中鑒定的基因座的甲基化狀態(tài)和步驟(viii)的結果相比較，從而確定(xi)的細胞樣品是否曾經(jīng)歷非典型生長條件。
15.如權利要求8-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包含以下可選步驟: (xi)從細胞樣品中分離DNA，其中，當處于一種或多種非典型生長條件時所述細胞(或其來源組織/生物)的表型和/或生理反應未知； (xii)鑒定步驟(xi)中分離的DNA中步驟(vii)所鑒定基因座亞組的甲基化狀態(tài)； (xiii)將(vi)中鑒定的基因座甲基化狀態(tài)與步驟(X)的結果相比較，從而確定所述細胞(或其來源組織/生物)是否應已知或未知非典型生長條件而發(fā)生表型和/或生理反應。
16.如權利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述步驟(xiii)還鑒定細胞曾經(jīng)歷的非典型生長條件的類型。
17.如權利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述步驟(xiii)鑒定了細胞曾經(jīng)歷步驟(ii)未曾測試過的非典型生長條件。
18.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述DNA基因座亞組包含1- 5000個基因座，包括10-1000個基因座和/或20-100個基因座。
19.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述對照生長條件與感興趣細胞的生物學正常體內生長條件相同。
20.如權利要求8-18中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(ii)中的不同非典型生長條件為非收斂性差異。
21.如前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述非典型生長條件選自:溫度、物理惹激(包含增加或降低的大氣壓、對對象的方向惹激、攪拌、重力、物理張力)、物理損傷、營養(yǎng)物可用性、暴露于化學毒素、激素或信號分子、暴露于其他化學試劑、可見光惹激(光譜質量或強度)、暴露于背景水平之上的不可見光輻射(例如X射線、Y射線、紅外光或紫外光、微波等)、暴露于病原體或寄生蟲、暴露于其他生物或相同種的其他成員、暴露于其他生物、個體的滲出物，食草性(herbivory)或另一生物以靶標生物為食、水惹激惹激(太多或太少)、暴露于刺激所述對象進入休止階段的信號或條件、氧惹激或暴露于過量或次優(yōu)量的自由基。
22.如權利要求8-21中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(vii)中將選擇的基因座亞組與細胞應激反應通路成分的基因或其調節(jié)區(qū)域相關聯(lián)。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述基因座存在于感興趣細胞內每個應激反應通路中至少一種成分的基因。
24.如權利要求8-23中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(vi)中基因座亞組的選擇通過計算機程序自動進行。
25.一種鑒定一組或多組DNA基因座以鑒定一種或多種非典型生長條件的方法，所述方法包含步驟: (a)同時按照前述權利要求中任一項所述的方法將一組或多組DNA基因座與一種或多種非典型生長條件相關聯(lián)；或 (b)合并前述權利要求中任一項中步驟(viii)和(ix)的結果以鑒定與一種或多種非典型生長條件相關的一組或多組DNA基因座。
26.一組用于鑒定一種或多種非典型生長條件的DNA基因座，其中所述DNA基因座組如前述權利要求中任一項所述來確定。
27.一種鑒定感興趣細胞曾經(jīng)歷的一種或多種非典型生長條件的方法，所述方法包含步驟: (i)從感興趣細胞中分離DNA，其中所述細胞的生長條件未知； (ii)鑒定步驟(i)中分離DNA中能甲基化的基因座組的甲基化狀態(tài)； (iii)將步驟(ii)鑒定的基因座甲基化狀態(tài)與相同基因座組的已知甲基化狀態(tài)組相比較，其中，所述已知甲基化狀態(tài)組表征一種或多種惹激； (iv)確定感興趣細胞是否曾經(jīng)歷非典型生長條件。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述步驟(iv)還鑒定細胞曾經(jīng)歷的非典型生長條件的類型。
29.如權利要求25所述的或如權利要求27或28所鑒定DNA基因座組在鑒定細胞曾經(jīng)歷的非典型生長條件中的應用。
30.如權利要求29所述的應用，其特征在于，所述細胞仍處于所述非典型生長條件。
31.如權利要求29所述的應用，其特征在于，所述非典型生長條件是過去經(jīng)歷的。
32.如權利要求29-31中任一項所述的應用，其特征在于，所述非典型生長條件是癥狀或無癥狀疾病、獲得性感染易感性、過敏、衰老、暴露于醫(yī)療藥物或毒藥、暴露于性能增強藥物、暴露于農(nóng)用化學品、市售細胞系的狀態(tài)檢查、測試用于生物醫(yī)學目的的細胞系生理狀態(tài)(包含評估合成或分離干細胞的活力、效能和/或全能性；評價用于移植的皮膚細胞系的活力和能力；確保標準細胞系培養(yǎng)物相對于參照標準的均一生理狀態(tài))和臨床前藥物試驗。
33.如權利要求29-31中任一項所述的應用，是用在疾病診斷中，其特征在于，所述疾病包含癌癥、代謝疾病、病毒或細菌感染、惹激相關的疾病/紊亂、寄生蟲感染或侵襲、帕-魏二氏安格爾曼綜合征、ICF綜合征、皮膚纖維瘤、高血壓、兒科神經(jīng)生物學。
34.一種用于選擇不同甲基化狀態(tài)的基因座亞組以鑒定和區(qū)分非典型生長條件的計算機程序。
35.一組用于鑒定擬南芥細胞樣品曾經(jīng)歷的一種或多種非典型生長條件的DNA基因座，其中不同甲基化狀態(tài)和/或不同表達的基因座位于下面一個或多個(如全部)擬南芥基因內部或其上游/下游多至5kb處:AT2G15800AT2G38240AT5G54720 AT1G76650AT3G31540AT3G28820AT5G02580AT1G07120AT1G61800AT1G48110AT5G28235AT5G28430AT5G28760AT3G53300AT5G46200AT3G57260AT4G02330AT3G05400AT5G25110AT3G28770AT5G62750
36.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述基因座組如權利要求35所定義，所述基因座用于鑒定來自擬南芥的感興趣細胞中非典型生長條件或生理/表型反應。
37.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述基因座組如權利要求35所定義，所述基因座用于鑒定來自非擬南芥植物的感興趣細胞中非典型生長條件或生理/表型反應。
38.一組用于鑒定人細胞樣品曾經(jīng)歷的一種或多種非典型生長條件的DNA基因座，其中不同甲基化狀態(tài)和/或不同表達的基因座位于下面一個或多個(如全部)人基因或染色體位置的內部或其上游/下游多至5kb處:ZNRF3SLC7A4 肌球蛋白_18B(MY018B) 糖蛋白Ib(血小板)，β多肽 RP1-47A17.8 制瘤素M (OSM)CTA-299D3.6CTA-941F9.6 細胞附著蛋白(Cytohesin) 4ΡΙΒ5ΡΑSUSD2chr22:35，256，7 96-35，277，053，NCB136RP3-43804.2RP4-756G23.1 促生長素抑制素受體3型(SSTR3) Bcl-2相互作用殺傷蛋白(BIK)GAS2L1RP3-355C18.2Y -小細胞蛋白(parvin)CARMA3TMPRSS6 血小板衍生生長因子B鏈前體(PDGFB) CELSRl鈣粘蛋白 T-盒轉錄因子(TBXl)Q6ZRW2_HUMANNKG2DL4(RAETlE)DAAM2RP1-47M23.1RP11-397G17.1Nesprin-1(Syne-1) 肌原性抑制子Inf (MDFI)RP11-174C7.4CMAHPKHDl谷胱甘肽過氧化物酶5GRIK2SLC22A1RP11-235G24.1TBX18TGM3RIN2SLC24A3Q9ULE8_HUMANC20orfll7乳腺癌擴增序列4(BCAS4)活化T細胞核因子(NFATC2)SCUBElJAGl
39.一種基本上如本文中結合實施例和附圖
所述的方法。
40.一種基本上如本文中結合實施例和附圖所述的應用。
41.一組基本上如本文中結合實施例和附圖所述的DNA基因座。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定DNA基因座組的方法以用于鑒定非典型生長條件和鑒定感興趣細胞種類或來源。所述方法能包含鑒定多組DNA基因座，所述基因座可以鑒定不同來源和/或基因型的細胞中的多個非典型生長條件。也提供了DNA基因座組及其應用。
文檔編號C12Q1/68GK103080335SQ201180034459
公開日2013年5月1日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權日2010年5月12日
發(fā)明者A·P·米德, M·J·威爾金森, C·M·R·羅佩茨 申請人:阿伯里斯特維斯大學