專利名稱：：D-1,2,4-丁三醇的微生物合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開內(nèi)容涉及1,2，4-丁三醇生物合成的方法和材料及由其產(chǎn)生1，2,4-丁三醇三硝酸酯的方法和材料，以及被確認為本發(fā)明的1，2,4-丁三醇生物合成系統(tǒng)的副產(chǎn)物的化合物的生物合成方法和材料。
背景技術(shù)：
：本節(jié)中的陳述只提供與本公開內(nèi)容相關(guān)的背景信息且可能并不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。1，2,4-丁三醇是可用于形成能量化合物(energeticcompound)以及生物活性劑(例如，P-螨信息素)的手性多羥基醇。外消旋的D，L-1,2,4-丁三醇可以進行硝化以形成高能材料D，L-l，2,4-丁三醇三硝酸酯，其比傳統(tǒng)的高能塑化劑硝化甘油具有更低的沖擊敏感性、更高的熱穩(wěn)定JohnsHopkinsUniversity,ChemicalPropulsionInformationAgency:WhitingSchoolofEngineering,Columbia,Maryland,2000)。雖然1，2，4-丁三醇的單個對映異構(gòu)體可以進行賄化，但D，L-l，2,4-丁三醇的外消旋混合物通常用作1，2，4-丁三醇三硝酸酯的合成前體。1,2，4-丁三醇三硝酸酯是同時具有民用和軍用潛力的高能塑化劑。參見V.Lindner,Wxpk)sives.In尺z'rA;-0/7z艦r五wqyc/o/Wao/C7ze脂.ca/rec/mo/og_y(9"/me.(Wiley，NewYork,1994)。因此，用1,2,4-丁三醇三硝酸酯替代硝化甘油作為高能材料不僅能夠降低與這種制造和操作方法相關(guān)的危險性，而且可提高最終產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。但是，1,2,4-丁三醇的有限供應(yīng)限制了1，2,4-丁三醇三硝酸酯的大規(guī)模生產(chǎn)。1,2,4-丁三醇目前利用酯化的D，L-蘋果酸(如蘋果酸二甲酯)的NaBH4還原通過D,L-蘋果酸在C2_6醇和四氫呋喃的混合物中進行高壓催化氫化反應(yīng)而進行商業(yè)生產(chǎn)(圖la)(美國專利6479"4，Schofield等，授權(quán)日2002年11月12日；國際公開WO99/44976，lkai等，公開日1999年9月10日)。這一化學(xué)合成路徑也產(chǎn)生許多種副產(chǎn)物，且合成每一噸1，2，4-丁三醇要產(chǎn)生多噸的副產(chǎn)物，因為這一反應(yīng)對于每千克被還原的蘋果酸二甲酯產(chǎn)生2-5kg的硼酸鹽。參見，例如，國際公開WO98/08793,Monteith等，授權(quán)日1998年3月5日；國際公開WO99/44976,Ikai等，公開日1999年9月10日；H.八dkins&H.R.Billica，J.爿m.C7zem.Soc,70:3121(1948);美國專利4973769，Mueller等，授權(quán)日1990年11月27日，和美國專利6355848,Antons等，授權(quán)日2002年3月12日。適當(dāng)?shù)靥幚砀碑a(chǎn)物鹽流的成本加上采用化學(xué)計量量的NaBH4的花費將這一反應(yīng)的應(yīng)用限制于小量的1,2,4-丁三醇的生產(chǎn)。結(jié)果，最近開發(fā)出了更經(jīng)濟的和對環(huán)境更安全的用于獲得D-、L-和D，L-1,2，4-丁三醇的生物合成技術(shù)，其中D-異構(gòu)體通過D-木糖或D-木質(zhì)酸(D-xylonicacid)的生物轉(zhuǎn)化獲得，而L-異構(gòu)體通過L-阿拉伯糖或L-阿糖酸的生物轉(zhuǎn)化獲得(圖lb);且各對映異構(gòu)體的生物合成已經(jīng)通過D-木質(zhì)酸或L-阿糖酸的中間性使用雙微生物工藝成功地得到i正明。參見,侈'J^口，W.Niu等，Microbialsynthesisoftheenergeticmaterialprecursor1,2,4-butanetriol./爿w.C7zem.125:12998-1299917(2003)。然而，這些生物合成路徑的大規(guī)模應(yīng)用受到經(jīng)濟上的挑戰(zhàn)，因為它們需要采用大量的被發(fā)現(xiàn)對于使菌株培養(yǎng)最優(yōu)化來說很重要的營養(yǎng)添加劑并且需要純化生物合成中間體以使1,2，4-丁三醇產(chǎn)量最大化。因此，有利的是提供能夠通過在非昂貴的培養(yǎng)基(例如，補充碳源的低鹽培養(yǎng)基(minimalsaltsmedium))上生長而生物合成1,2，4-丁三醇的一種重組細胞。雖然木糖/木質(zhì)酸和阿拉伯糖/阿糖酸兩種路徑都可以用于獲得1,2，4-丁三醇，但是D-木糖及D-木質(zhì)酸相對于例如L-阿拉伯糖或L-阿糖酸具有經(jīng)濟優(yōu)勢，部分地是由于D-木糖在低成本的碳源原料(如在木頭和植物纖維廢料中發(fā)現(xiàn)的半纖維素)中更普遍存在的事實。例如，這反映在可商購得到的戊糖的價格對比上，其顯示L-阿拉伯糖價格為D-木糖的大約兩倍(例如，參見Sigma-Aldrich產(chǎn)品號XI500,10mg的純度〉99%的D-木糖價格為6.25美元，而產(chǎn)品號A3256,10mg的純度〉99%的L-阿拉伯糖價格為13.00美元)。因此，理想的是獲得利用D-木糖(或D-木質(zhì)酸)源且可用于生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)量的1，2,4-丁三醇的1,2,4-丁三醇生物合成系統(tǒng)。但是，最近也意外地發(fā)現(xiàn)，用于工業(yè)規(guī)模的1,2,4-丁三醇生物合成的各種需要的宿主細胞包含造成從D-木糖或D-木質(zhì)酸獲得的1，2,4-丁三醇的實際產(chǎn)量降低到顯著低于理論產(chǎn)量最大值的水平的天然生物催化活性。因此，有利的是提供利用D-木糖或D-木質(zhì)酸，但可以通過抑制或滅活這種碳轉(zhuǎn)用(carbon-diverting)生物催化活性而提高產(chǎn)量的改良的1，2，4-丁三醇生物合成宿主細胞。對于D-1，2,4-丁三醇生物合成系統(tǒng)進行這種進一步改良的主要挑戰(zhàn)在于缺乏關(guān)于催化人工生物合成途徑(圖lb)的第一步的D-木糖脫氫酶的遺傳信息和在微生物宿主細胞中存在上面所述的未闡明的分解代謝背景。因此，更為有利的是提供編碼具有將D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木質(zhì)酸的有效能力的酶且可以在用于D-l，2，4-丁三醇生物合成的宿主細胞中表達的特定D-木糖脫氫酶基因，以及鑒定不希望的分解代謝反應(yīng)的特性以提供控制該分解代謝反應(yīng)的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容在各種實施方式中，本發(fā)明提供能夠?qū)-木糖(或D-木質(zhì)酸)源生物轉(zhuǎn)化為1,2,4-丁三醇，且其中一種或多種碳轉(zhuǎn)用生物催化活性受到抑制或滅活的改良的宿主細胞。在一些實施方式中，受到抑制或滅活的碳轉(zhuǎn)用生物催化活性是能夠分裂3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸以形成丙酮酸和乙醇醛的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶。本發(fā)明還提供特定的新型D-木糖脫氫酶及其編碼序列。本發(fā)明進一步提供制備D-l，2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(l)包含1，2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶、(c)2-酮酸脫羧酶和(d)醇脫氬酶，其中所述細胞體是經(jīng)操作抑制或滅活了3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽或其核酸的細胞體；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1,2,4-丁三醇的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生1,2,4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3，4-二羥基-D-丁醛，和(4)所述醇脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l,2,4-丁三醇；從而制備D-l,2,4-丁三醇。制備D-l，2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(l)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或者具有D-木糖脫氫酶活性的SEQIDNO:192或SEQIDNO:4的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶、(c)2-酮酸脫羧酶和(d)醇脫氫酶；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1,2,4-丁三醇的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-D-丁趁，和(4)所述醇脫氫酶將所得的3，4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l,2,4-丁三醇；從而制備D-l,2，4-丁三醇。制備D-l,2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(l)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細月包體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木^f唐脫氫酶，(b)D-木質(zhì)酸脫水酶，其包含(i)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一個的氨基酸序列，或者(ii)莓實假單胞菌(尸"^/owo"w/rag0(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:IO的多肽，(c)2-酮酸脫羧酶和(d)醇脫氫酶；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1，2，4-丁三醇的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以乂人D-木沖唐產(chǎn)生1，2,4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行20(1)所述D-木糖脫氬酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮4唐酸，(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3，4-二羥基-D-丁醛，和(4)所述醇脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l,2,4-丁三醇；乂人而制備D-l,2，4-丁三醇。制備D-l,2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(l)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶，其包含(i)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(ii)莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:IO的多肽，(b)2-酮酸脫羧酶和(c)醇脫氫酶；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1,2,4-丁三醇的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生1，2，4-丁三醇和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(2)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-D-丁醛，和(3)所述醇脫氫酵將所得的3，4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l，2,4-丁三醇；從而制備D-l，2，4-丁三醇。制備D-l,2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(l)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶，(b)2-酮酸脫羧酶和(c)醇脫氬酶，其中所述細胞體是經(jīng)操作抑制或滅活了3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽或其核酸的細胞體；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1，2，4-丁三醇的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生1，2,4-丁三醇和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(2)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-D-丁醛,和(3)所述醇脫氫酶將所得的3，4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l,2,4-丁三醇；從而制備D-l,2，4-丁三醇。其中所述重組細胞體包括含有所述酶系統(tǒng)的單細胞的這些方法；由此制備的D-l，2,4-丁三醇的這些方法；通過這些方法制備的D-l，2,4畫丁三醇；由其制備1,2，4-丁三醇三硝酸酯的方法；通過這類方法制備的D-l，2，4-丁三醇三硝酸酯;包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或者具有D-木糖脫氬酶活性的SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脫氫酶；編碼該酶的核酸，和包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或者SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的同源多核苷酸任一項的堿基序列的核酸；包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽、包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽的莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶、或者莓實假單胞菌D-木質(zhì)酸脫水酶氨基酸序列的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木質(zhì)酸脫水酶；編碼該酶的核酸，和包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或者SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的同源多核苷酸任一的石威基序列的核酸。這種酶在D-1,2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)中的用途。分離的或重組的1,2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)，包括(A)包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或者具有D-木糖脫氫酶活性的SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脫氫酶，(B)D-木質(zhì)酸脫水酶，(C)2-酮酸脫羧酶和(D)醇脫氫酶，該酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成D-l,2,4-丁三醇。分離的或重組的D-l,2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)，包括(A)D-木糖脫氫酶，(B)D-木質(zhì)酸脫水酶，其包含(l)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(2)莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:IO的多肽，(C)2-酮酸脫羧酶和(D)醇脫氫酶，該酶系統(tǒng)能夠催化D-木3f唐轉(zhuǎn)化成D-l，2，4-丁三醇。分離的或重組的1,2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)，包括(A)D-木質(zhì)酸脫水酶，其包含(l)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(2)莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽，(B)2-酮酸脫羧酶和(C)醇脫氫酶，該酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成D-l，2，4-丁三醇。包含該酶系統(tǒng)的重組細胞體；包括含有所述酶系統(tǒng)的單細胞的這類細胞體；為重組的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶"缺失"的DgPiT細胞的這類細胞；3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶敲除載體，其包含含有SEQIDNO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:U的nt55-319中任一的堿基序列的多核苷酸，其中所述載體能夠以使3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因或其編碼的醛縮酶失活的方式插入3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因的基因組拷貝中或與其重組。重組DgPu—(3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶"缺失")細胞；制備3-脫氧-D-甘油-戊酸的方法，包括(A)提供(l)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶和(c)2-酮酸還原酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-戊酸的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-戊酸和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酉同斗唐酉交，詳口(3)所述2-酮酸脫氳酶(還原酶)將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸；從而制備3-脫氧-D-甘油-戊酸。制備3-脫氧-D-甘油-戊酸的方法，包括(A)提供(l)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶和(b)2-酮酸還原酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-戊酸的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-戊酸和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行()所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(2)所述2-酮酸脫氬酶(還原酶)將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸；從而制備3-脫氧-D-甘油-戊酸。制備D-3,4-二羥基-丁酸的方法,包括(A)提供(l)包含D-3，4-二羥基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶和(c)2-酮酸脫羧酶和(d)醛脫氫酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生D-3，4-二羥基-丁酸的條件下能夠向I)-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生D-3，4-二羥基-丁酸和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運4亍(1)所述D-木糖脫氮酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-1)-丁醛，和(4)所述醛脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-3,4-二羥基-丁酸；從而制備D-3,4-二羥基-丁酸。制備D-3,4-二羥基-丁酸的方法，包括(A)提供(l)包含D-3，4-二羥基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶、和(b)2-酮酸脫羧酶和(c)醛脫氬酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生D-3，4-二羥基-丁酸的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生D-3，4-二羥基-丁酸和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件25下通過以下作用運行(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(2)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二鞋基-D-丁醛，和(3)所述醛脫氫酶將所得的3，4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-3,4-二羥基-丁酸；從而制備D-3，4-二羥基-丁酸。制備(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸的方法,包括(A)提供(l)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶和(c)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生(45)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸和其中所述木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(3)所述2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸；從而制備(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸。制備(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸的方法，包括(A)提供(l)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)[)-木質(zhì)酸脫水酶和(b)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸和其中所述木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)26在所述條件下通過以下作用運行(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(2)所述2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸；從而制備(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸。其中細胞體包括含有所述酶系統(tǒng)的單細胞的這些方法；其中細胞是重組的DgPu—細胞的這些方法；通過這一方法制備的3-脫氧-D-甘油-戊酸、D-3，4-二羥基-丁酸和/或(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸。分離的或重組的3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)，其包含(A)D-木糖脫氫酶、(B)D-木質(zhì)酸脫水酶和(C)2-酮酸還原酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸。分離的或重組的3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)，其包含(A)D-木質(zhì)酸脫水酶和(C)2-酮酸還原酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸。分離的或重組的D-3,4-二羥基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)，其包含(A)D-木糖脫氫酶、(B)D-木質(zhì)酸脫水酶、及(C)2-酮酸脫羧酶和(D)醛脫氫酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成D-3,4-二羥基-丁酸。分離的或重組的D-3,4-二羥基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)，其包含(A)D-木質(zhì)酸脫水酶、(B)2-酮酸脫羧酶和(C)醛脫氫酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成D-3，4-二羥基-丁酸。分離的或重組的(45>2-氨基-4,5-二羥基戊酸生物合成酶系統(tǒng)，其包含(A)D-木糖脫氫酶、(B)D-木質(zhì)酸脫水酶和(C)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成(45)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸。分離的或重組的(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸生物合成酶系統(tǒng)，其包含(A)D-木質(zhì)酸脫水酶和(B)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸。包含這一酶系統(tǒng)的重組細胞體；其中細胞體包括含有所述酶系統(tǒng)的單細胞的重組細胞體；其中所述細胞為重組的DgPu—細胞的重組細胞體；篩選候選的酶編碼多核苷酸的方法，包括(A)提供(l)包含與編碼酶多肽的編碼序列大約20個或更多相連核苷酸相同的核堿基序列的核酸或核酸類似物探針，所述酶多肽具有以下任一氨基酸序列(a)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或(b)SliQIDNO:12的19-319位殘基的氨基酸序列，或(c)包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽的莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶的氨基酸序列，或(d)保持生物催化活性的上述(a)、(b)或(c)中任一項的保守置換變異體的氨基酸序列或同源氨基酸序列；和(2)包含或懷疑包含這種探針可以特異性結(jié)合的至少一種靶多核苷酸的測試樣品；(B)使所述探針與測試樣品在探針可以特異性地與耙多核苷酸(如果存在)雜交的條件下接觸以形成探針-靶多核苷酸復(fù)合物；及(C)檢測是否由此形成任何探針-靶多核苷酸復(fù)合物，其中被確認為復(fù)合物一部分的多核苷酸由此被鑒別為候選的酶編碼多核苷酸。對以下表位具有特異性的抗體(A)具有以下任一氨基酸序列的酶多肽(1)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或(2)SEQIDNO:12的19-319位殘基的氨基酸序列，或(3)包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽的莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶的氨基酸序列，或(4)保持生物催化活性的上述(l)、(2)或(3)中任一項的保守置換變異體的氨基酸序列或同源氨基酸序列；或者(B)具有編碼這種酶多肽(A)的堿基序列的多核苷酸或核酸類似物。進一步的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑼ㄟ^這里提供的說明書變得很清楚。應(yīng)當(dāng)理解的是，本說明書和特定的實施例只是用于舉例說明的目的，而不意圖限制本公開的范圍。28附圖簡要說明這里描述的附圖僅用于舉例說明的目的，并不意圖以任何方式限制本公開的范圍。圖1顯示了1,2,4-丁三醇的合成路徑。(la)當(dāng)前在C2-6醇中使用硼氫化鈉和四氫呋喃從蘋果酸二曱酯合成1，2，4-丁三醇的工業(yè)合成方式。(lb和lc)D-和L-l,2，4-丁三醇的生物合成途徑。酶a)D-木糖脫氬酶；a')L-阿拉伯糖脫氳酶；b)D-木質(zhì)酸脫水酶；b，)L-阿糖酸脫水酶；c)2-fi畫復(fù)脫羧酶；d)醇脫氫酶。圖2顯示了在莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶的部分編碼序列的分離中包括的步驟。(2a)從莓實假單胞菌純化的D-木質(zhì)酸脫水酶的SDS-PAGE。(2b)來自純化的D-木質(zhì)酸脫水酶的胰蛋白酶消化肽的N-末端序列。簡并引物按照下劃線的肽序列進行設(shè)計。(2c)D-木質(zhì)酸脫水酶的部分DNA序列和翻譯的氨基酸序列。標(biāo)記為"3"的下劃線DNA部分編碼肽3的部分，標(biāo)記為"4"的下劃線DNA部分編碼肽4的部分，且標(biāo)記為"5"的下劃線DNA部分編碼肽5的部分。圖3顯示了大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝途徑(即丙酮酸/乙醇醛途徑)及其基因的基因組結(jié)構(gòu),，(3a)假定的大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝途徑。酶(a)D-木質(zhì)酸脫水酶；(b)3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶。(3b和3c)大月勿桿菌yjh和yag基因.蔬。圖4給出了表征在單一木質(zhì)酸源上生長的大腸桿菌突變體性能的棒圖。(4a)大腸桿菌菌抹在含有D-木質(zhì)酸作為唯一碳源的M9培養(yǎng)基上的生長特征。培養(yǎng)板在37。C下孵育72小時，及在含有D-木質(zhì)酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌菌抹的D-木質(zhì)酸脫水酶(空白柱)和3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶(點狀柱)的比活性。(4b)在含有D-木質(zhì)酸(65mM)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌菌林的分解代謝物蓄積。D-木質(zhì)酸(空白柱)，3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸(點狀柱)。圖5給出了顯示大腸桿菌由木糖源合成1,2,4-丁三醇的圖表和曲線圖以及修訂的1,2,4-丁三醇生物合成路徑圖。(5a)在發(fā)酵罐控制培養(yǎng)29奈件下大腸桿菌在低鹽培養(yǎng)基中合成1，2，4-丁三醇的概要。(5b)大腸桿菌WNl3/pWN7.126B在培養(yǎng)基中的細胞生長(空白圓圈)和1,2,4-丁三醇蓄積(條紋棒)。箭頭表示D-木糖添加的時間點。(5c)在WN13/pWN7.126B培養(yǎng)過程中D-木糖脫氬酶(空白柱)和D-木質(zhì)酸脫水酶(點狀柱)的比活性。(5d)修訂的D-l，2，4-丁三醇生物合成路徑圖，顯示了可以將碳利用從主要途徑轉(zhuǎn)向到產(chǎn)生副產(chǎn)物化合物的潛在分解代謝途徑步驟。用于標(biāo)記的步驟的酶(和它們的基因)(a)D-木糖脫氫酶CxYZ/z);(b)D-木質(zhì)酸脫水酶O^G和，gF);(c)2-酮酸脫羧酶(mJ/C);(d)醇脫氫酶(例如，(e)2-酮酸脫氫酶(j勿E和；;a/J^);(f)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶；(g)醛脫氫酶；(h)3-脫氧-0-甘油-戊酮糖酸醛縮酶0^扭和；^//);(kl)木糖異構(gòu)錄；(k2)醛糖還原酶；(k3)木質(zhì)酸脫水酶。圖6給出了生物合成路徑圖，其顯示了步驟h和kl受到阻斷的D-木糖利用實施方式中共有的D-1,2，4-丁三醇合成策略的副產(chǎn)物的合成。顯示了在低鹽培養(yǎng)基上生長的重組細胞的各種化合物的典型凈產(chǎn)量，且用于顯示的步驟的酶個體包括(a)D-木糖脫氫酶(新月柄桿菌(C.(:t證幽'力Xdh);(b)D-木質(zhì)酸脫水酶(大腸桿菌Y.jhG和YagF);(c)2-3同酸脫羧酶(惡臭假單胞菌(/>戸//由)MdlC苯曱酰甲酸脫羧酶)；(d)醇脫氫酶(大腸桿菌AdhP);(e)2-酮酸脫氫酶(大腸桿菌KADH);(f)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶(大腸桿菌KAAT);(g)醛脫氫酶(大腸桿菌ALDH);(h)2-酮酸醛縮酶(大腸桿菌YagE和YjhH;即滅活的和.和(kl)D-木糖異構(gòu)酶(大腸桿菌XylA,即滅活的"'/zi)。圖7給出了將編碼醇脫氫酶的"i/尸基因插入大腸桿菌基因組中的具體實施例方式下面的說明本質(zhì)上只是示例性的，并不意圖限制本公開、應(yīng)用或用、力、.迎。本申請的主題涉及2006年3月31日提交的美國專利申請11/396117號、2004年9月30日提交并在2005年7月28日以/>開號WO20()5/()68642公開的國際專利申請PCT/US2004/031997及2003年10月1日提交的美國臨時專利申請60/507708號的主題，這些專利文獻的公開內(nèi)容在此通過引用并入。下面的定義和非限制性的指引在審查對這里提出的本發(fā)明的說明時考慮。這里使用的標(biāo)題(如"
背景技術(shù)：
"和"
發(fā)明內(nèi)容")和小標(biāo)題(如"掃描分析"和"方法")只是意圖在本發(fā)明的公開范圍內(nèi)對主題進行大體的組織，并不意圖限制本發(fā)明或其任何方面的公開范圍。說明書和特定的實施例盡管表明是本發(fā)明的實施方式，但它們僅是為了舉例說明的目的，而不意圖限制本發(fā)明的范圍。另外，對具有所述特征的多個實施方式的列舉并不意味著排除具有另外的特征的其它實施方式或者引入特別是，在"
背景技術(shù)：
"中公開的主題可以包括本發(fā)明范圍內(nèi)的技術(shù)的某些方面，且可能并不構(gòu)成對現(xiàn)有技術(shù)的引用。在"
發(fā)明內(nèi)容"中^開的主題不是本發(fā)明整個范圍或其任何實施方式的詳盡的或完全的公開一種物質(zhì)在本說明書的一節(jié)中被分類為或說明為具有特定的效用(如，"催化劑")是為了方便的目的而進行的，而不應(yīng)當(dāng)推斷為當(dāng)該物質(zhì)用于任何給定的組合中時必須必然地或唯一地4安照這里的分類發(fā)揮作用、，提供特定的實施例用于舉例說明如何完成或使用本發(fā)明的組合物和方法的目的，除非另外明確地說明，它們不意圖表示本發(fā)明的給定實施方式已經(jīng)或沒有完成或經(jīng)過測試。這里對參考文獻的引用并不構(gòu)成承認那些參考文獻是現(xiàn)有技術(shù)獻的內(nèi)容的任何討論只是意圖提供參考文獻的作者作出的論斷的一般總結(jié)，而不構(gòu)成對該文獻的內(nèi)容的準(zhǔn)確性的承認。在本說明書的"詳細說明"部分中引用的所有參考文獻在此通過引用全文引入。除非另外說明，如"一"和"一個"的冠詞在這里用于表示"至少一個"。在這里用于描述給定實施方式的如具有、包括、含有和包含的用語是用于表示該實施方式中可以存在進一步的成分(如，組分、步驟或條件)的開放性用語。如這里所使用的，詞語"優(yōu)選的"和"優(yōu)選地"指的是在特定環(huán)境中提供特定優(yōu)勢的實施方式。但是，在相同的或其它的環(huán)境中其它實施方式也可以是優(yōu)選的。另外，列舉一個或多個優(yōu)選的實施方式并不暗示其它的實施方式是不可用的，也不意圖從本發(fā)明的范圍中排除其它的實施方式。如這里所涉及的，除非另外特別指明，所有組成百分比為按照總組合物的重量計算。本發(fā)明提供從碳源產(chǎn)生D-1，2，4-丁三醇和中間體的生物工程化合成方法、材料和生物體。本發(fā)明的生物轉(zhuǎn)化方法是基于生物合成途徑的從頭(denovo)建立，從而D-l^，〔丁三醇從碳源合成(圖2)。如這里所使用的，一對酸指稱的術(shù)語的成員(如"木質(zhì)酸(xylonicacid)"和"木質(zhì)酸(xylonate)")可互換使用，除非另外明確地說明或從上下文內(nèi)容顯示不是如此。如這里所使用的抗體包括天然抗體和重組抗體，如嵌合抗體和CDR-接枝抗體。如這里所使用的，"抗體片段"包括含有氨基酸序列與完整抗體相同的Fv結(jié)構(gòu)(無論是天然的或重組的)且由此保持對完整抗體特異性的抗原或表位的結(jié)合特異性的任何多肽。因此，如這里所使用的抗體片段包括Fv、Fab、Fab，、F(ab，)2、恒定域缺失的抗體(例如，CH2-域缺失的抗體)和單鏈抗體(例如，scFv)?？贵w或抗體片段可以是單價的或多價的，即后一類型具有至少兩個Fv-型結(jié)合位點，其中至少一個是對酶多肽、核酸或其核酸類似物具有特異性的l:v結(jié)構(gòu)或如其抗獨特型抗體一樣具有對這種Fv結(jié)構(gòu)的特異性。如這里所使用的，如"生物催化劑的基因"的術(shù)語指的是編碼該生物催化劑的核酸。因此，提到如3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶核酸指的是編碼該特定醛縮酶的核酸。如這里所使用的生物催化劑可以是傳統(tǒng)多肽型的酶或基于抗體的酶(抗體酶)或者可以是基于核酸的酶(例如，DNA核酶或RNA核酶)。如這里所使用的，"細胞體"指的是細胞，或者其原生質(zhì)體或圓球質(zhì)體，或者具有生物催化活性的細胞片段(例如，胞質(zhì)體、細胞器32或溶胞產(chǎn)物)；在細胞死亡后生物催化活性得到保持的情況下，可以使用死的全細胞生物催化劑，例如細胞形骸(cellghost)。細胞體可以包括生物體、器官、組織、組織樣品、細胞培養(yǎng)物或其它細胞集合。在一些實施方式中微生物細胞和植物細胞可能是特別有用的。熱穩(wěn)定的高能材料(l,2，4-丁三醇三硝酸酯)的廣泛應(yīng)用受到缺乏合成其前體(l,2，4-丁三醇)的經(jīng)濟路徑的阻礙。在各種不同實施方式中，本發(fā)明提供能夠增加按照先前建立的人工生物合成途徑在低鹽培養(yǎng)基中從D-木糖合成D-l，2,4-丁三醇的重組宿主細胞。本發(fā)明人關(guān)于新型D-木糖脫氫酶(Xdh)(其可以催化D-木糖氧化為D-木質(zhì)酸)的發(fā)現(xiàn)和對野生型大腸桿菌K-12中先前未確認的D-木質(zhì)酸分解代謝途徑的在本發(fā)明的一些實施方式中，提供了可以在低鹽培養(yǎng)基中直接由[)-木糖合成D-l，2，4-丁三醇的重組的微生物宿主細胞，例如重組的細菌宿主細胞，如重組的大腸桿菌。因此，現(xiàn)在工業(yè)規(guī)模的D-l，2，4-丁三醇生物合成的生產(chǎn)是可能的，并使得例如D-l,2,4-丁三醇三硝酸酯得到更廣泛的利用。實驗數(shù)據(jù)表明，D-l，2，4-丁三醇三硝酸酯表現(xiàn)出與外消旋的1,2,4-丁三醇三硝酸酯相同的爆炸性能，并因此D-l，2,4-丁三醇是與外消旋的1，2，4-丁三醇同樣有用的硝化目標(biāo)(J.Salan，Personalcommunication.IndianHeadDivision,NavalSurfaceWarfareCenter,UnitedStatesNavy.IndianHead,Maryland,2005)。如上面所提到的，改善D-l,2，4-丁三醇生產(chǎn)的基于D-木糖/木質(zhì)酸的生物合成途徑的主要障礙包括缺乏D-木糖脫氫酶的遺傳特性的知識和碳通過大腸桿菌宿主菌株中的活性而從該生物合成路徑向其它途徑的分解代謝轉(zhuǎn)向。在本發(fā)明的各種實施方式中，現(xiàn)在提供和鑒定了新型的D-木質(zhì)酸脫水酶及其編碼序列，例如莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶的部分編碼序列和氨基酸序列，及兩種新發(fā)現(xiàn)的細菌D-木質(zhì)酸脫水酶。現(xiàn)在也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了來自大腸桿菌的新型D-木質(zhì)酸脫水酶和基因。關(guān)于碳的分解代謝轉(zhuǎn)用的問題，本發(fā)明的各種實施方式提供催化這一分解代謝作用的來自大腸桿菌的酶及其基因。因此，在各種實施方式中，現(xiàn)在提供了這種分解代謝轉(zhuǎn)用被抑制或滅活的重組細胞。在本發(fā)明的各種實施方式中，這些細胞能夠在低鹽培養(yǎng)基中生物合成[)-1,2,4-丁三醇。在本發(fā)明的各種實施方式中，提供的重組細胞為含有能夠完成基于木糖源的D-1，2,4-丁三醇生物合成途徑的酶系統(tǒng)的單細胞。在一些實施方式中，提供的重組D-1,2,4-丁三醇生物合成細胞進一步具有一個或多個碳轉(zhuǎn)用分解代謝活性的敲除。在提出的D-木質(zhì)酸分解代謝途徑的步驟中，脫水酶首先催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成1,2，4-丁三醇途徑中間體3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，其隨后通過醛縮酶催化的反應(yīng)被裂解成丙酮酸和乙醇醛。因此，D-木質(zhì)酸分解代謝途徑的闡明導(dǎo)致了醛縮酶催化的丙酮酸/乙醇醛生物合成活性的確認，該活性很大程度上導(dǎo)致碳從1,2,4-丁三醇生物合成途徑轉(zhuǎn)向，因而帶來產(chǎn)率的伴隨降低?，F(xiàn)在采用隨機轉(zhuǎn)座子誘變的分析揭示，大腸桿菌的D-木質(zhì)酸分解代謝作用通過分解代謝物阻遏進行調(diào)節(jié)。現(xiàn)在通過利用染色體敲除突變體的酶檢驗和表型分析已經(jīng)在大腸桿菌W3110中鑒定了兩套編碼關(guān)鍵分解代謝酶的基因?；蚝?SEQIDNO:5和7)編碼D-木質(zhì)酸脫水酶?；騘77//和，g五(SEQIDNO:11和13)分別編碼相應(yīng)的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶。在各種不同實施方式中，現(xiàn)在提供重組的D-木糖-D-l,2，4-丁三醇生物轉(zhuǎn)化細胞(例如，微生物細胞；大腸桿菌細胞)，其中3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶活性受到抑制或滅活，例如通過破壞其醛縮酶編碼基因。經(jīng)過操作以抑制或滅活3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽或其核酸的細力包在這里可以稱作重組的DgPu—細月包。在本發(fā)明的各種實施方式中，D-木糖-D-l,2,4-丁三醇生物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞經(jīng)操作以將基因整合到其染色體中。在其中的一些實施方式中，例如在示例性的大腸桿菌WN13/pWN7.126B中，現(xiàn)在已經(jīng)獲得了D-l，2,4-丁三醇產(chǎn)量的極大提高，例如在發(fā)酵罐控制的培養(yǎng)條件下以300/。(mol/mol)的產(chǎn)率從D-木糖獲得6.2g/L的D-1,2,4-丁三醇?，F(xiàn)在已經(jīng)在培養(yǎng)基中鑒定的其它有用的分子包括3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸、3-脫氧-D-甘油-戊酸、(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸和D-3,4-二羥基丁酸。因此，現(xiàn)在也可以提供用于這些另外的有用分子的生物合成的酶系統(tǒng)和重組細月包。1)-1,2,4-丁三醇生物合成的原料。在本發(fā)明的各種實施方式中，D-木糖可以被用作本發(fā)明的D-l，2，4-丁三醇生物合成酶途徑的原料。可以使用各種D-木糖源。在一些實施方式中，D-木糖源可以是或包含純木糖或木糖與其它成分的混合物。在一些實施方式中，D-木糖源可以是或包含非木糖的碳源，其中包含本發(fā)明的酶途徑的重組細胞或者包含并能夠表達其基因的重組細胞能夠利用該非木糖碳源以獲得D-木糖?？梢允褂酶鞣N各樣的這類替代木糖源。因此，在一些實施方式中，木糖源可以包括簡單碳源，例如葡萄糖，其中細胞具有由其合成木糖的能力。在一些實施方式中，細胞可能具有通過利用細胞的核苷糖代謝、淀粉或蔗糖代謝或者蛋白聚糖代謝途徑從簡單碳源(例如葡萄糖)合成木糖的能力?？梢曰谒拗骷毎麑⒏鞣N碳源轉(zhuǎn)化成D-木糖或I)-木質(zhì)酸的能力而利用各種不同碳源。簡單碳源的一些例子包括CI-C18的均-或雜-脂族化合物，包括Cl-C8雜脂族化合物和碳氧化物，以及包含其殘基的宿主細胞可水解的聚合物。在一些實施方式中，可以使用多元醇類或糖類。在各種不同實施方式中，木糖可以通過包含以下酶的細胞從例如葡萄糖合成(1)將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖-6-磷酸的葡糖激酶(例如，EC2.7.1.1);(2)將D-葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖-l-磷酸的葡糖磷酸變位酶(例如，EC5.4.2.2);(3)將D-葡萄糖-l-磷酸轉(zhuǎn)化成UDP-D-葡萄糖的UTP:葡萄糖-l-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(例如，EC2.7.7.91);(4)將UDP-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成UDP-D-葡糖醛酸的UDP-葡萄糖-6-脫氫酶(例如，EC1,l丄22)和(5)將UDP-D-葡糖酪酸轉(zhuǎn)化成UDP-D-木糖的UI)P-葡糖醛酸脫羧酶(例如，EC4.1.1.35)。UDP-D-木糖可以進行水解以提供D-木糖，或者可以用于生物合成含木糖殘基的生物聚合物，例如通過木聚糖合酶(例如，EC2.4.2.24)的作用，其中該生物聚合物可以隨后被水解，例如如下面所描述的，以提供D-木糖的天生的或重組的能力。在一些實施方式中，植物細胞，或者原生質(zhì)體或圓球質(zhì)體，可以用作能夠從簡單碳源合成D-木糖的宿主細在一些實施方式中，木糖源可以是或包含含木糖殘基的聚合物，如含木糖殘基的生物聚合物，例如任何含木糖殘基的半纖維素或果膠，其中細胞具有由其合成木糖的能力。因此，木糖源可以是或包含以下物質(zhì)的任何一種或多種均-或雜-木聚糖，例如葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖-葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖或葡糖醛酸-阿拉伯糖基木聚糖；木糖葡聚糖；木糖聚半乳糖醛酸；木糖半乳聚糖；木糖脫氧半乳聚糖或木糖半乳糖脫氧半乳聚糖等等，或其任意組合。具有從含木糖殘基的聚合物合成木糖的能力的細胞可能包含提供該能力的酶，如用于水解均-或雜-木聚糖骨架的木糖殘基鍵的木聚糖酶(例如，KC3.2.1.8、3.2.1.32、3.2.1.126、3.2.1.136或3.2.1.156)和/或用于水解側(cè)鏈木糖殘基鍵的木糖苷酶(例如，EC3.2丄32、3.2.1.37或3.2.1.72)。木聚糖酶和/或木糖普酶可以單獨存在或與其它非木聚糖酶/非木糖苷酶、聚合物操作或聚合物片段操作的水解酶組合，例如以下的一種或多種酶糖苷酶；酯酶；葡糖醛酸苷酶(glycuronosidase);聚糖酶，例如外切-或內(nèi)切-葡聚糖酶、-半乳聚糖酶或-巖藻聚糖酶；葡糖醛酸酶，例如外切-或內(nèi)切-半乳糖醛酸酶；或其組合。可用于本發(fā)明各種實施方式的細胞可能具有從含木糖殘基的聚合物合成D-木糖的天生的或重組的能力。在一些實施方式中，木糖源可以包含D-木酮糖或D-木糖醇，其中細胞具有由其合成木糖的能力，例如其中細胞分別包含木糖異構(gòu)酶(EC5.3.1.5)或酪糖還原酶(EC1.1.1.21)?？捎糜诒景l(fā)明各種實施方式的細胞可能具有從D-木酮糖或D-木糖醇合成D-木糖的天生的或重組的能力。在各種不同實施方式中，D-木質(zhì)酸可以用作本發(fā)明的1,2，4-丁三醇生物合成酶途徑的原料?？梢允褂酶鞣ND-木質(zhì)酸源。在一些實施方式中，D-木質(zhì)酸源可以是或包含純D-木質(zhì)酸或木質(zhì)酸與其它成分的混合物。在一些實施方式中，D-木質(zhì)酸源可以是或包含非木質(zhì)酸的碳源，其中包含本發(fā)明的酶途徑的重組細胞或者包含并能夠表達其基因的重組細胞能夠利用該非木質(zhì)酸碳源以獲得D-木質(zhì)酸?？梢允褂酶鞣N各樣的這類替代木質(zhì)酸源。因此，在一些實施方式中，木質(zhì)酸源可以包括簡單碳源，例如葡萄糖，其中細胞具有由其合成木質(zhì)酸的能力。在一些實施方式中，木質(zhì)酸源可以包括2-脫氫-3-脫氧-D-木質(zhì)酸，其中細胞具有由其合成木質(zhì)酸的能力，例如其中細胞包含木質(zhì)酸脫水酶(1':C4.2.1.82)。可用于本發(fā)明各種實施方式的細胞可能具有從例如簡單碳源或從2-脫氬-3-脫氧-D-木質(zhì)酸合成D-木質(zhì)酸的天生的或重組的能力。在各種不同實施方式中，這里使用的木糖源或木質(zhì)酸源可以包含D-木糖內(nèi)酯，其中細胞能夠?qū)⑵浞謩e轉(zhuǎn)化為木糖或木質(zhì)酸，例如其中細胞分別包含D-木糖-l-脫氫酶(EC1.1.1.175)或木質(zhì)酸-1，4-內(nèi)酯酶(EC3.1.1.68)。可用于本發(fā)明各種實施方式的細胞可能具有從D-木質(zhì)酸內(nèi)酯(xylonolactone)合成D-木糖或D-木質(zhì)酸的天生的或重組的^匕"h利用木糖源或木質(zhì)酸源的能力可能是用于制備本發(fā)明的重組細胞的細胞天然具有的，或者可以重組地加入到細胞上。具有將含木糖殘基的生物聚合物轉(zhuǎn)化為D-木糖的天然能力的細胞的例子包括真菌細胞，如脈孢菌(A^wrc^;ora)、曲霉菌(j^erg〃/w)和青霉菌(尸em'c/〃&w)，以及細菌細胞，如桿菌(Sac/〃w)、假單月包菌(尸化wcfomowas)和鏈霉菌(&/towyc^)。但是，本發(fā)明的重組的1,2,4-丁三醇合成細胞可以在含木糖殘基的生物聚合物存在的情況下與具有將含木糖殘基的聚合物轉(zhuǎn)化成D-木糖的能力的細胞(例如分泌半纖維素酶的細胞)共培養(yǎng)以向重組的1,2,4-丁三醇合成細胞提供木糖。在使用另一替代的木糖源或木質(zhì)酸源的情況下，可以與具有分泌進行木糖或木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化反應(yīng)的酶的能力的細胞一起進行類似的共培養(yǎng)。D-l，2，4-丁三醇生產(chǎn)的生物合成途徑。參見圖5d,在各種不同實施方式中，本發(fā)明的D-1,2,4-丁三醇生物合成途徑可以利用木質(zhì)酸源而采用圖5d的步驟B、C和D,或者利用木糖源而采用圖5d的步驟A、B、C和D。這些步驟由以下酶催化(a)D-木糖脫氫酶(;a//0、(b)I)-木質(zhì)酸脫水酶(例如，v,G或"gF)、(c)2-酮酸脫羧酶(例如，wd/C)和(d)醇脫氫酶。如這里所使用的，在該步驟(d)的上下文中，"醇脫氫酶"指的是具有將3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-1,2，4-丁三醇的催化活性的任何醇脫氫酶，例如，AdhP或AdhE或YiaY型的醇脫氫酶。在本發(fā)明的實施例中，編碼苯甲酰曱酸脫羧酶(EC4.1.1.7)的惡臭假單胞菌md/C編碼序列用于提供2-酮酸脫羧酶活性。用于步驟A和B的酶在下面的章節(jié)中進行更詳細的描述。在本發(fā)明的實施例中，天生的大腸桿菌脫氫酶活性被用于催化!,2,4-丁三醇形成的最終步驟(d)。雖然不希望受到理論的限制，但據(jù)認為該脫氫酶活性通過一種或多種伯醇脫氫酶實現(xiàn)；這些也稱作醛還原酶。但是，表現(xiàn)出這一醛還原酶活性的任何酶(即能夠?qū)?，4-二羥基丁酪還原成1,2，4-丁三醇的酶)可以被取代。其它表現(xiàn)出有用的醛還原酶活性的酶的例子包括例如，非大腸桿菌天生的或非本發(fā)明的體內(nèi)實施方式中的宿主細胞天生的伯醇脫氫酶，和羰基還原酶。這些酶的具體例子包括NADH-依賴醇脫氫酶(EC1.1.1.1)、NADPH-依賴醇脫氫酶(KC丄1.2)和NADPH-依賴羰基還原酶(EC1.1丄184)。可運行以實現(xiàn)本發(fā)明的生物催化途徑的酶系統(tǒng)可以通過將至少一個基因插入所選擇的宿主細胞中以構(gòu)建未在野生型細胞中出現(xiàn)的途徑而提供。因此，能夠按照本發(fā)明的體內(nèi)實施方式產(chǎn)生1,2，4-丁三醇的重組宿主細胞是已經(jīng)過轉(zhuǎn)化從而變得能夠?qū)崿F(xiàn)從D-木糖產(chǎn)生D-l,2,4-丁三醇或從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生D-l,2，4-丁三醇中的至少一種的細胞。按照本發(fā)明的D-1,2,4-丁三醇生物合成的方法和系統(tǒng)可以在L-l,2，4-丁三醇生物合成的方法和系統(tǒng)存在或不存在的情況下運行。在D-和L-l,2,4-丁三醇被同時合成的實施方式中，所得到的異構(gòu)體的38混合物可以進行灘化以形成D，L-1，2，4-丁三醇三硝酸酯。1，2，4-丁三醇的用途和4汙生物。按照本發(fā)明的實施方式制備的1，2，4-丁三醇可以被分離，例如用作如血清甘油酯色語分析的標(biāo)準(zhǔn)(參見，例如H.Li等，J丄—to.(2006年6月20日)[印刷之前在httpWorld-Wide-Websitejlr.org/cgi/reprint/D600009-JLR200vl上電子公開l)，和/或1,2,4-丁三醇可以衍生化以形成需要的產(chǎn)物。在各種不同實施方式中，1,2,4-丁三醇三賄酸酯可以通過硝化而作為衍生物產(chǎn)生。在本發(fā)明實施方式中產(chǎn)生的1,2,4-丁三醇的硝化可以容易地通過使用多種可商購的硝化劑進行。常用的硝化劑包括11n03(或hn03與h2s04的混合物)、n204(或n204與n02的混合物)、n2o5(或N;z05與服03的混合物)、:^02(:1、過氧亞硝酸鹽"+o=n-o-o一可以作為例如Na+、K+、Li+、銨或四烷基銨過氧亞硝酸鹽的形式商購得到)和四硝基曱烷，及包含一種或多種這類物質(zhì)的組合物。這些硝化劑可以按照現(xiàn)有技術(shù)中已知的各種不同的硝化條件和過程中的任一種使用以獲得1，2，4-丁三醇三硝酸酯。或者，在本發(fā)明的實施方式中產(chǎn)生的1,2,4-丁三醇可以通過生物合成或化學(xué)合成路徑轉(zhuǎn)化成其它有用的衍生化合物，參見，例如N.Shimizu等，腸&c/mo/.腸c/z纖.67(8》1732-1736(2003年8月)。如這里隨后所描述的，發(fā)酵罐培養(yǎng)可以用于促進碳源轉(zhuǎn)化成D-1，2,4-丁三醇。然后培養(yǎng)肉湯可以被硝化以從培養(yǎng)肉湯形成丁三醇三硝酸酯。在另一種實施方式中，丁三醇可以從培養(yǎng)肉湯中提取、清洗或純化，隨后進行硝化。補料分批式(fed-batch)發(fā)酵工藝、沉淀方法和純化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一旦形成，1,2,4-丁三醇三硝酸酯可以用作高能(例如，爆炸性)組合物的活性成分，其可以是爆炸裝置或例如火箭燃料的形式。爆炸裝置包括設(shè)計為用于或用作軍火、采石工程、采礦業(yè)、緊固(釘接、鉚接)、金屬焊接、拆除、水下爆破和焰火裝置的那些裝置；該裝置也可以設(shè)計或用于其它目的，如破冰、樹根爆破(treeroot-blasting)、金屬成型等等。在形成高能(例如，爆炸性)組合物時，1，2，4-丁三醇三硝酸酯可以與進一步的爆炸性化合物及，可選擇地或附加地，與進一步的非爆炸性化合物混合，例如惰性材料、穩(wěn)定劑、塑化劑或燃料。進一步的爆炸性化合物的例子包括，但不限于硝化纖維素、硝化淀粉、硝化糖、硝化甘油、三硝基曱苯、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、三硝基苯甲硝胺、季戊四醇四硝酸酯、環(huán)三亞甲基三硝胺、環(huán)四亞曱基四硝胺、甘露糖醇六硝酸酯、苦味酸銨、重金屬疊氮化物和重金屬雷酸鹽。進一步的非爆炸成分包括，但不限于鋁、燃料油、蠟、脂肪酸、木炭、石墨、礦脂、氯化鈉、碳酸鈣、硅石和發(fā)J黃。醇三硝酸酯的組合物和含有該1,2,4-丁三醇三硝酸酯的爆炸裝置。通過按照本發(fā)明的實施方式的方法制備的1,2,4-丁三醇三硝酸酯可以用于爆破或推進實物體的方法，該方法包括在所述實物體的表面上或鄰近于所述實物體的表面引爆含有該1，2，4-丁三醇三硝酸酯的爆炸裝置。按照本發(fā)明和實施方式的其它物品和組合物包括以下這些。包含有按照本發(fā)明實施方式的酶系統(tǒng)的重組宿主細胞，和為DgPu—細胞的這類細胞。DgPu—細胞。包含編碼按照本發(fā)明實施方式的酶系統(tǒng)的可表達核酸的重組宿主細胞。包含含有這一酶系統(tǒng)的組合物及利用該組合物產(chǎn)生1，2,4-丁三醇或其它需要的產(chǎn)物的使用說明的試劑盒；包含編碼這一酶系統(tǒng)的核酸及利用該核酸形成能夠產(chǎn)生1，2,4-丁三醇或其它需要的產(chǎn)物的重組細胞的使用說明的試劑盒；包含含有能夠表達這一酶系統(tǒng)的重組宿主細胞的組合物及利用該組合物產(chǎn)生1，2,4-丁三醇或其它需要的產(chǎn)物的使用說明的試劑盒。丁三醇以外的替代生物合成產(chǎn)物及其途徑。作為導(dǎo)致本發(fā)明的工作的一部分，多種先前未識別的1，2，4-丁三醇生物合成途徑的副產(chǎn)物在本發(fā)明的1,2,4-丁三醇合成細胞中得到確認，該細胞的丙酮酸/乙醇醛分解代謝途徑(圖5d的步驟h)通過滅活其3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸酪縮酶基因而受到阻斷。這些副產(chǎn)物化合物中有(1)通過2-酮酸還原酶活性作用而由3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸形成的3-脫氧-D-甘油-戊酸，(2)通過醛脫氫酶活性作用而由3，4-二羥基-D-丁醛形成的D-3,4-二羥基-丁酸，和(3)通過2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性作用而由3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸形成的(4S)-2-氨基-4,5-二羥基-戊酸。這些化合物包含手性中心且因此可以用于合成生物活性物質(zhì)和其它物質(zhì)，如下列實施例中的那些。3-脫氧-D-甘油-戊酸可以用于制備3-脫氧-戊酸內(nèi)酯，一種可以作為生長促進劑加入牲畜飼料的養(yǎng)殖促進劑化合物，參見，例如美國專利5391769，Matsumoto等，1995年2月21日授權(quán)。3,4-二羥基-丁酸可用于合成抗高膽固醇血癥藥物，參見，例如美國專利公開2006/0040898,Puthiaparampil等，2006年2月23日出版和美國專利5998633，Jacks等，1999年12月7日授權(quán)。2_氨基-4,5-二羥基戊酸可用于形成金屬蛋白酶抑制劑化合物，參見，例^口I).T.Elmore,"PeptideSythesis",第一章,jm/woJczWs,尸ep"fife51""J/Vo化,7w,vol.34,(RSC,2003)(在第18頁)。因此，在各種實施方式中，本發(fā)明的3_脫氧-D-甘油-戊酸生物合成途徑可以利用木質(zhì)酸源而采用圖5d的步驟b和e，或者利用木糖源而采用步驟a、b和e。在各種實施方式中，本發(fā)明的D-3，4-二羥基-丁酸生物合成途徑可以利用木質(zhì)酸源而采用圖5d的步驟b、c和g，或者利用木糖源而采用步驟a、b、c和g。在各種實施方式中，本發(fā)明的(4S)-2-氨基-4,5-二羥基-戊酸生物合成途徑可以利用木質(zhì)酸源而采用圖5d的步驟b和f，或者利用木糖源而采用步驟a、b和f。在這些途徑中任一種途徑的一些實施方式中，一種或多種催化到另外兩種化合物中的一種的替代轉(zhuǎn)化反應(yīng)的步驟b后的酶可以被抑制或滅活，并且任選地催化到1,2,4-丁三醇的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的一種或多種酶和/或3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶可以被抑制或滅活，正如將木糖、木質(zhì)任何其它酶中的一種或多種可以被抑制或滅活一樣。類似地，一種或多種催化步驟e、f和/或g的酶可以在能夠合成1,2,4-丁三醇的本發(fā)明41酶系統(tǒng)的各種實施方式中被抑制或滅活。不希望的分解代謝活性的滅活或抑制。在除木糖醇以外的木糖源被用于本發(fā)明的木糖生物轉(zhuǎn)化途徑的各種實施方式中，圖5d步驟k2的宿主細胞醛糖還原酶和/或作用于其木糖醇產(chǎn)物的酶可以纟皮抑制或滅活以防止木糖的轉(zhuǎn)用；類似地，在使用D-木酮糖以外的這類木糖源的情況下，圖5d步驟kl的宿主細胞木糖異構(gòu)酶和/或作用于其D-木酮糖產(chǎn)物的酶，例如木酮糖激酶(EC2.7.1.17)，可以被抑制或滅活以幫助防止木糖的轉(zhuǎn)用。在木糖源包含例如，木糖、含木糖殘基的聚合物或簡單碳源的情況下，這兩種策略可以一起采用以幫助防止木糖的轉(zhuǎn)用。在D-木質(zhì)酸以外的木質(zhì)酸源被用于本發(fā)明的木質(zhì)酸生物轉(zhuǎn)化途徑的各種實施方式中，或者在采用木糖生物轉(zhuǎn)化途徑的各種實施方式中，圖5d步驟k3的宿主細胞木質(zhì)酸脫水酶和/或作用于其2-脫氫-3-脫氧-D-木質(zhì)酸產(chǎn)物的酶，例如圖5d步驟h的2-脫氫-3-脫氧-D-戊糖酸醛縮酶(EC4.1.2.28),可以被抑制或滅活以幫助防止木糖的轉(zhuǎn)用。因此，可以抑制或滅活將需要的原料或中間體從按照本發(fā)明的實施方式所選擇的生物合成途徑轉(zhuǎn)用的任一途徑或所有途徑。在本發(fā)明的任一生物合成途徑中，不論是采用木糖或木質(zhì)酸源，作用于其2-脫氫-3-脫氧-D-木質(zhì)酸產(chǎn)物的酶，例如圖5d步驟h的2-脫氫-3-脫氧-D-戊糖酸醛縮酶(EC4.1.2.28),可以;波抑制或滅活以幫助防止碳從所希望的途徑轉(zhuǎn)用于其它途徑。參照圖5d,如上面所提到的，步驟e由2-酮酸還原酶活性(或a-羥酸脫氫酶，例如ECl丄99.6)催化，一種2-酮酸還原酶序列是例如，Genbank登錄號AAC74117..gi:87081824,由U00096…gi:48994873編碼。步驟f由2-酮酸操作的轉(zhuǎn)氨酶活性(例如，EC2.6.1.21或2.6.1.67)催化，一種轉(zhuǎn)氨酶序列是例如，Genbank登錄號YP556835..gi:91781629，由NC—007951..gi:91781384的nt280347-281312編碼。步驟g由醛脫氫酶活性(例如，EC1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.5、1.2.99.3或1.2.99.7)催化，一種醛脫氫酶序列是例如，Genbank登錄號AAA23428,.gi:145224,由M38433.,gi:145223編碼。步驟kl由木糖異構(gòu)酶(EC5.3丄5)催化，一種木糖異構(gòu)酶序列是Genbank登錄號ABG71642.,gi:l10345405，由CP000247.,gi:l10341805編碼。步驟k2由醛糖還原酶(EC1丄1.21)催化，一種醛糖還原酶序列是Genbank登錄號AAG54503.,gi:12512935，由AK005174.,gi:56384585編碼。步驟k3由木質(zhì)酸脫水酶(EC4.2.1.82)催化，參見，例如ASDahms&ADonald,"D-xylo-Aldonatedehydratase,"跑/70A￡""歸/.90(Pt.E):302-305(1982)。圖5d步驟h由3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶催化，其序列包括SEQIDNO:12和14,分別由SEQIDNO:l1和13編碼。這些序列可以例如，通過生物信息搜索或雜交分析用于在以開發(fā)成按照本發(fā)明實施方式的重組宿主細胞為目標(biāo)的細胞中鑒別其它的這類不希望的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因。這些基因序列和通過其用途鑒別的這類其它的分解代謝醛縮酶的基因序列可以用于構(gòu)建設(shè)計為滅活這些醛縮酶基因的多核苷酸載體，例如質(zhì)粒。RNA干擾技術(shù)可以替代地用于抑制這些基因的表達。因此，3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶活性可以在希望的宿主細胞被抑制或滅活。因此，這里還提供用于合成D-l，2,4-丁三醇、3-脫氧-D-甘油-戊酸、D-3,4-二羥基-丁酸或(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸中的一種或多種的新型的酶系統(tǒng)和單獨或結(jié)合地包含酶系統(tǒng)的重組細胞。在各種不同實施方式中，這類酶系統(tǒng)或重組細胞能夠從木糖源或木質(zhì)酸源合成這些化合物。3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶也可以在包含從L-阿拉伯糖或L-阿糖酸生物合成L-l,2，4-丁三醇的工程化生物途徑的重組宿主細胞中受到抑制或滅活，以類似地防止3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的轉(zhuǎn)用。已經(jīng)操作而抑制或滅活3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽或其核酸的細胞體在這里可以稱作重組的DgPu—體，例如重組的DgPu—細胞。酶多肽和編碼序列。在按照本發(fā)明的一些實施方式中，提供了具有I)-木糖脫氫酶活性的多肽。SEQIDNO:2和4各代表起到催化D-木糖到D-木質(zhì)酸的轉(zhuǎn)化作用的野生型木糖脫氫酶(Xdh)的氨基酸序列。在按照本發(fā)明的一些實施方式中，提供了編碼本發(fā)明的D-木糖脫氫酶的多核苷酸或核酸類似物。SEQIDNO:l和3各代表野生型[)-木糖脫氫酶的DNA編碼序列(x^/z)。在按照本發(fā)明的一些實施方式中，提供了具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的多肽。SEQIDNO:6和8各代表起到催化D-木質(zhì)酸到3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的轉(zhuǎn)化作用的野生型D-木質(zhì)酸脫水酶的氨基酸序列大腸桿菌YjhG和YagF。在按照本發(fā)明的一些實施方式中，提供了編碼本發(fā)明的D-木質(zhì)酸脫水酶的多核苷酸或核酸類似物。SEQIDNO:5和7各代表野生型D-木質(zhì)酸脫水酶的DNA編碼序列大腸桿菌"'AG禾口少ag/7。類似地，由SEQIDNO:9編碼的SEQIDNO:IO代表來自莓實假單胞菌的該莓實假單胞菌D-木質(zhì)酸脫水酶片段的氨基酸序列，該細菌由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollcction)(Manassas,VA,U.S.)以登錄號ATCC4973向公眾提供。該D-木質(zhì)酸脫水酶和其基因可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)中的任何一種(例如，在下面的實施例部分中描述的技術(shù))從細菌中分離。該酶的DNA編碼序列具有大約1300nt的推定長度，且具有靠近其端部包含SKQIDNO:9的;咸基序列的3，-端部分。該編碼的D-木質(zhì)酸脫水酶多肽具有大約430+的推定長度、大約60kDa的近似MW,且具有靠近其端部包含SEQIDNO:IO的氨基酸序列的C-末端部分。該酶也能夠催化I)-木質(zhì)酸到3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的轉(zhuǎn)化。在按照本發(fā)明的一些實施方式中，提供了編碼3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶的多核香酸或者包含其編碼序列的多核苷酸。SEQIDNO:12和14各代表可以催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸到丙酮酸和乙醇醛的轉(zhuǎn)化反應(yīng)的野生型醛縮酶的氨基酸序列大腸桿菌YjhH和YagE。如上所述，可以使用編碼這些氨基酸序列的核酸序列構(gòu)建敲除載體或RNA干擾載體。在按照本發(fā)明的一些實施方式中，提供了編碼本發(fā)明的D-木質(zhì)酸脫水酶的多核苷酸或核酸類似物，例如，SEQIDNO:ll和13各代表野生型3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶的DNA編碼序列大腸桿菌w'/z//和_yag￡。同樣，SEQIDN0:12的19-319殘基代表可以催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸到丙酮酸和乙醇醛的轉(zhuǎn)化的野生型大腸桿菌YjhH醛縮酶的替代氨基酸序列。如上所述，可以使用編碼這一氨基酸序列的核酸序列構(gòu)建敲除載體或RNA干擾載體。在按照本發(fā)明的一些實施方式中，提供了編碼本發(fā)明的D-木質(zhì)酸脫水酶的多核苷酸或核酸類似物，例如，SEQIDNO:ll的nt55-957表示野生型大腸桿菌YjhH醛縮酶的替代氨基酸序列的DNA編碼序列。SEQIDNO:ll的完全或替代核苷酸序列可以用于例如，篩選其它的這類醛縮酶和/或制備敲除載體或RNA干護u載體。SEQIDNO:12的完全或替代氨基酸序列可以用于例如，催化所述的反應(yīng)或用作產(chǎn)生和/或選擇抗體和結(jié)合分子的表位靶標(biāo),，編碼酶的核酸和多肽變異體。按照本發(fā)明的編碼序列可以可操作地與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制元件連接，該元件在希望的宿主細胞，例如微生物(例如，細菌、真菌/酵母、古細菌(archaea)或原生生物)或植物(例如，雙子葉植物、單子葉植物、棵子植物、苔蘚植物或蕨類植物)細胞中發(fā)揮功能，雖然也可以使用脊推動物(例如，哺乳動物或人類)或非脊推動物(例如，昆蟲)細胞。本發(fā)明的核酸可以被整合到核酸載體中和/或可以用于轉(zhuǎn)化宿主細胞。遺傳元件、載體和轉(zhuǎn)化技術(shù)的例子包括在美國專利6803501，Baerson等，2004年10月12日授權(quán)，和7041805,Baker等，2006年5月9日授權(quán)中描述的那些，其說明內(nèi)容通過引用并入本文。本發(fā)明的編碼序列可以進行突變，例如通過隨機或定點突變，以引入氨基酸置換、缺失或插入；可以由此引入保守氨基酸置換。有用的保守氨基酸置換包括在例如美國專利7008924，Yan等，2006年3月7日授權(quán)中描述的那些，其說明內(nèi)容通過引用并入本文。在嚴(yán)格條件下的雜交，或者人工或自動的(例如，生物信息學(xué)的)序列的對比，可以使用本發(fā)明的多肽或核酸的序列進行，以篩選具有或編碼與這里按照序列表中的序列定義的酶相同的生物催化活性的進一步的候選酶多肽或進一步的候選酶編碼多核苷酸，例如同源多肽或多核苷酸。序列同源性(對齊的序列的相似性或同一性)的可用量度和用于雜交篩選的嚴(yán)格雜交條件包括在例如，美國專利7049488,Fischer等，2006年5月23日授權(quán)和7041805，Baker等，2006年5月9日授權(quán)中描述的那些，其說明內(nèi)容通過引用并入本文。在一些實施方式中，同源氨基酸序列可以是至少70%，或者大約或至少75%、80%、85%、90%或95%與給定的序列表中所列多肽同源。在一些實施方式中，同源核石咸基序列可以是大約或至少90%或95%、98%與給定的序列表中所列多核苷酸同源。按照本發(fā)明的編碼序列可以按照現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何技術(shù)進行密碼子優(yōu)化以提高其在希望的細胞中的表達，例如，如在美國專利6858422，Giver等，2005年2月22日中所描述的，其說明內(nèi)容通過引用并入本文。因此，保持相同類型的生物催化活性的本發(fā)明給定酶的保守置換氨基酸變異體和本發(fā)明給定酶的同源酶可以用于在本發(fā)明的酶系統(tǒng)、途徑和方法中發(fā)揮相同的功能。按照本發(fā)明的多核苷酸(例如包含SEQIDNO:l、3、5、7、9、11或13中任一項的堿基序列的多核苷酸)及本發(fā)明的編碼相同活性的酶的其它多核苷酸，可以在用于獲得在各自編碼的酶的功能上的希望的增強或變化的定向進化過程中用作模板，例如通過兩輪或多輪的基因重組(例如，基因改組)和/或?qū)δ０宓碾S機突變(例如，通過易錯PCR)或定點突變(例如，點突變)。編碼序列和形成操作部分的基因可以進行密碼子優(yōu)化以在選擇的宿主細胞中發(fā)揮功能或更好地發(fā)揮功能。可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種密碼子優(yōu)化技術(shù)中的任一種。這里可以使用的基本DNA操作和遺傳技術(shù)可以按照例如，T.Maniatis等.MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1982)和J.Sambrook等，Molecularcloning:Alaboratorymanual(第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進行，該文獻通過引用并入本文。46篩選試驗。在本發(fā)明的一些實施方式中，本發(fā)明的編碼酶多肽的核酸或核酸類似物可以用于通過形成雙鏈體或三鏈體的雜交分析篩查至少懷疑包含另一種編碼同一活性的酶的核酸的樣品。可用于這一目的的探針可能包含來自本發(fā)明的編碼多肽的核酸的至少10個，或者大約或至少20、30、40或50個堿基的連續(xù)堿基序列。該探針可以進行可檢測的標(biāo)記，例如，使用顯色的、非猝滅的或可逆地猝滅的焚光、發(fā)光或磷光標(biāo)記，或者可以反應(yīng)以產(chǎn)生可檢測的信號(如光子信號)的標(biāo)記，或者可進行反應(yīng)以連接到提供可檢測的信號的結(jié)構(gòu)上的結(jié)合位點-或結(jié)合分子-型的標(biāo)記(如生物素-或抗生物素蛋白-標(biāo)記的探針)。類似地，編碼酶多肽的核酸的核堿基序列信息可以用于生物信息學(xué)方法中(例如，電腦模擬(insilico)或者通過直接可視化)以識別另一核堿基序列為編碼相同活性的酶的序列或候選的編碼相同活性酶的序列。可以制備具有對本發(fā)明各種實施方式的酶多肽或核酸的結(jié)合特異性的抗體。這些抗體可以用于篩查至少懷疑包含相同活性的酶或編碼相同活性酶的核酸的生物分子文庫、混合物等等，即其活性與提供該序列或用作抗原的生物分子為同一類型。也可以制備對這些抗體的抗獨特型抗體且用于篩選目的?？贵w可以可檢測地標(biāo)記。具有這種結(jié)合特異性的適體可以可選擇地制備并用于這一目的。實施例莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶部分基因序列的分離。莓實假單胞菌(ATCC4973)中的D-木糖分解代謝途徑在可以利用該糖作為生長碳源時被誘導(dǎo)。參見，例如R.Weimberg，Pentoseoxidationby/rag/'</.S/o/.C7zem.236:629-635(1961)。因此，D-木質(zhì)酸脫水酶從含木糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞純化。純化使用DK-52陰離子交換柱、羥磷灰石柱、苯基瓊脂糖凝膠柱和HPLCResourceQ陰離子交換柱進行。這一方法導(dǎo)致97倍的純化，使得基于SDS-PAGE分析的蛋白質(zhì)純度接近均質(zhì)。純化的蛋白質(zhì)的分子量在變性蛋白質(zhì)凝膠中估算為60kDa(圖2a)。為分離編碼純化的D-木質(zhì)酸脫水酶的基因，蛋白質(zhì)通過胰蛋白酶消化進行處理且HPLC-純化的消化產(chǎn)物進行N-末端序列分析。這樣獲得五個短肽的氨基酸序列(圖2b)。對這五個肽序列的短和幾乎精確匹配的NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST分析顯示了幾個含有對所有五項查詢具有接近80%同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。因此使用其同源體在來自NCBI數(shù)據(jù)庫的母蛋白質(zhì)中的相對位置來估計五個肽在莓實假單胞菌D-木質(zhì)酸脫水酶中的相對位置。使用按照肽3和肽5的部分氨基酸序列設(shè)計的一對簡并引物，我們成功地從莓實假單胞菌的基因組[)NA擴增了單DNA產(chǎn)物。該PCR產(chǎn)物克隆到pCRTOPO-2.1載體中并確認插入的DNA序列(圖2c)。為進一步證明是否這一410bp的DNA片段編碼純化的D-木質(zhì)酸脫水酶，我們檢查了由該DNA序列"在閱讀框內(nèi)(inframe)"翻譯的肽序列(圖2c)。該肽的N-末端包含延伸到其C-末端端部的肽3的部分氨基酸序列(圖2c)。該肽的C-末端包含延伸到其N-末端端部的肽5的部分氨基酸序列(圖2c)。另外，翻譯的肽還包含肽4的整個氨基酸序列，肽4估計在D-木質(zhì)酸脫水酶中位于肽3和肽5之間。因此我們得出結(jié)論，PCR產(chǎn)物是編碼來自莓實假單胞菌的D-木質(zhì)酸脫水酶的部分基因。新型D-木糖脫氫酶的發(fā)現(xiàn)。D-l，2，4-丁三醇生物合成途徑的第一步利用D-木糖脫氫酶活性以將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸(圖lb)。雖然編碼該酶的基因已經(jīng)從古細菌和哺乳動物中分離，但這些報道的酶在大腸桿菌中的表達需要利用特殊的宿主菌抹以補償不同物種之間密碼子使用上的差異。參見，例如U.Johnsen&P.Schoenheit，Novelxylosedehydrogenaseinthehalophilicarchaeon//o/oarcw/a證/to脂自,'J.^"m.o/.186:6198-6207(2004);S.Aoki等，IdcmtificationofdimericdihydrodioldehydrogenaseasNADP+-dependentD-xylosedehydrogenaseinpigliver，CTz簡.Sz'o/.130-132:775-784(2001);和Y.Asada等，RolesofHis-79andTyr-180ofO-xylosedehydrogenase/dihydrodioldehydrogenaseincatalyticfunction,A/oc/，.S/o;/z"./es.Comw頭.278:333-337(2000)。因此，為了構(gòu)建合成D-l，2,4-丁三醇的大腸桿菌，希望的是可以容易地在常規(guī)大腸桿菌菌抹中表達的D-木糖脫氬酶。在多種代謝木糖的假單胞菌菌抹中，D-木糖脫氫酶和D-木質(zhì)酸脫水酶都報道為D-木糖利用的關(guān)鍵分解代謝酶。參見，例如R.Weimberg,/歷o/.C7zem.236:629-635(1961);和A.S.Dahms,3-Deoxy-D-pentulosonicacidaldolaseanditsroleinanewpathwayofD-xylosedegradation.B/oc/zew.歷0/7/2，Cowwww.60:1433-1439(]974)。我們試圖通過細菌染色體的生物信息學(xué)分析鑒定編碼D-木糖脫氫酶的基因。采用來自莓實假單胞菌的D-木質(zhì)酸脫水酶的部分氨基酸序列進行了ERGO細菌基因組數(shù)據(jù)庫的BLAST分析。真菌伯克霍爾德菌(SwA/zo/cfen'a/imgoram)LB400蛋白質(zhì)(參見SHQIDNO:2，由SEQIDNO:l編碼)，其由ERGO細菌基因組數(shù)椐庫注解為半乳糖酸脫水酶，顯示出最高的同源性評分。在先前的NCBI數(shù)據(jù)庫分析中，相同的蛋白質(zhì)也顯示為包含與對純化的D-木質(zhì)酸脫水酸進行蛋白酶消化獲得的所有五個肽具有高同源性的氨基酸序列。當(dāng)我們檢查與建議的半乳糖酸脫水酶鄰接的ORF的功能時，我們鑒定了一種推定的酶，在ERGO數(shù)據(jù)庫中標(biāo)明為RBU11704,屬于短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族。因為構(gòu)成SDR超家族的一個主要的酶組是糖脫氫酶，例如葡萄糖脫氫酶，該真菌伯克霍爾德菌蛋白質(zhì)因此被認為是D-木糖脫氫酶候選物以進行進一步的鑒定，參見，例如H.Joeravall等，Short-chaindehydrogenases/reductases(SDR),B/oc/zew.34:6003-6013(1995)。檢查與其它與部分D-木質(zhì)酸脫水酶具有高同源性的蛋白質(zhì)鄰接的ORF進一步揭示了第二種屬于SDR超家族的推定蛋白質(zhì)。這一新月柄桿菌CB15蛋白質(zhì)(參見SEQIDNO:4，由SEQIDNO:3編碼)，在ERGO數(shù)據(jù)庫中標(biāo)明為RCO01012,由在新月柄桿菌的CauloCyc(參見http互聯(lián)網(wǎng)站biocyc.org)途徑/基因組數(shù)據(jù)庫中命名為CC0821的基因編碼。先前提出CC0821基因為可以潛在地編碼D-木糖脫氫酶的兩種基因中的一種。參見，例如A.K.Hottes等，TranscriptionalprofilingofC薦/o6(2"ercr^ce齒sduringgrowthoncomplexandminimalmedia,J./h"er,W.186:1448-1461(2004)。蛋白質(zhì)序列比對表明，蛋白質(zhì)RCO01012與來自真菌伯克霍爾德菌的蛋白質(zhì)RBU11704具有77%的同源性。真菌伯克霍爾德菌蛋白質(zhì)RBU11704和新月柄桿菌蛋白質(zhì)RCO01012的表征利用了通過鎳/次氮基三乙酸(Ni-NTA)樹脂(由QIAGENInc.,Valencia,CA，U.S.提供)純化的N畫末端6xHis-標(biāo)記的融合蛋白。在被測試的糖中，D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡萄糖可以在兩種酶的催化下氧化成相應(yīng)的糖酸。另一方面，D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、2-脫氧-D-葡萄糖、D-葡萄糖-6-磷酸和D-核糖不是兩種酶中任一種的底物。與優(yōu)先以NADP+作為輔因子的兩種先前報道的D-木糖脫氫酶相比，在提供NAD+而非NADP+作為輔因子時，兩種細菌酶顯示出500倍以上的更高活性。參見，例如U.Johnsen&P.Schoenheit,5""eno/.186:6198-6207(2004);和Y.Asada等，腸c/z艮腸p/z,to.Co顯跳278:333-337(2000)。在酶分析中包含二價陽離子(Zn2+或Fe2+)對純化的酶的比活性沒有影響。兩種酶的最大活性在pH8.3左右觀察到。酶動力學(xué)的分析揭示了兩種酶相對于其它糖來說對D-木糖具有顯著較低的Km,而蛋白質(zhì)RCO01012的Km(D-木糖)值(0.099mM)比蛋白質(zhì)RBU11704的Km(D-木糖)值(0.97mM)低10倍(表1)。另外，新月柄桿菌酶相對于真菌伯克霍爾德菌酶對C5底物L(fēng)-阿拉伯糖具有更高活性，但對C6底物D-葡萄糖具有較低活性。作為D-木糖脫氫酶，新月柄桿菌酶比古細菌和哺乳動物酶效率(kcat/Km)更高，而真菌伯克霍爾德菌酶具有與報道的酶相當(dāng)?shù)拇呋?表1)。我們在這里將ERGO數(shù)據(jù)庫中來自真菌伯克霍爾德菌LB400的蛋白質(zhì)RBU11704和來自新月柄桿菌CB15的蛋白質(zhì)RCO01012稱作D-木糖脫氫酶(Xdh)?；谶@兩種酶的動力學(xué)數(shù)據(jù)，選擇來自新月柄桿菌的D-木糖脫氬酶用于嘗試構(gòu)建能夠從D-木糖合成D-l，2,4-丁三醇的大腸桿菌菌林。50表1.D-木糖脫氫酶的動力學(xué)數(shù)據(jù)木糖脫氫酶及源輔因子D-木糖D-葡萄糖L-阿拉伯糖KmKmkcafKmkcatKmkcat(mM)(mM)(O(mM)(A(mM)(AXdh-真菌伯克霍爾德菌0.26a0.9729176124313Xdh-新月柄0.13a0.09941538243440Xdh-嗜鹽死海古菌(//.0.15b1.271-—--mDD100.55b6.44.8一——a-輔因子為NAD+。b-輔因子為NADP+。c-酶在所有kcat值的計算中都看作單體。大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝途徑的闡明。我們先前已經(jīng)觀察到大腸桿菌K-12野生型菌抹W3110可以通過未識別的分解代謝途徑利用D-木質(zhì)酸作為生長的唯一碳源。參見，例如W.Niu,Microbialsynthesisofchemicalsfromrenewablefeedstocks.博士論文(MichiganStateUniversity,EastLansing,MI,2004)。在如jk匕i告養(yǎng)的W3110的無細胞提取物中，我們檢測到D-木質(zhì)酸脫水酶活性和3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶活性(圖4a)。兩種活性都未在含其它常用碳源(例如D-葡萄糖)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的W3110細胞中檢測到(參見，例如W.Niu,同前)。代謝物蓄積的^NMR分析進一步揭示，乙二醇和甘醇酸酯由在D-木質(zhì)酸上培養(yǎng)的W3110累積。兩種分子都與大腸桿菌中的乙醇醛分解代謝有關(guān)。D-木糖分解代謝途徑先前也已經(jīng)在假單胞菌菌抹中報道了(參見，例如R.Weimberg，/.CTz綴236:629-635(1961);和A.S.Dahms，Aoc/ze附.S/o;^^.尺m.Commtm.60:1433-1439(1974))。利用這一信息，我們提出大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝的一種假51設(shè)途徑(圖3a)。在這一途徑中，D-木質(zhì)酸首先通過D-木質(zhì)酸脫水酶的催化轉(zhuǎn)化為3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，該酶也催化由D-木糖生物合成D-l,2，4-丁三醇的第二步驟(圖lb)。該途徑的第二步涉及醛縮酶催化的2-酮酸中間體的裂解以形成丙酮酸和乙醇醛。盡管提出的途徑的第一反應(yīng)形成本發(fā)明的D-l,2,4-丁三醇生物合成的關(guān)鍵中間體，但第二反應(yīng)將該中間體從生物合成轉(zhuǎn)用于細胞生長。因此，提高大腸桿菌的D-l,2，4-丁三醇生物合成的一種策略是使用不能表達功能活性的2-酮酸醛縮酶的大腸桿菌菌抹。這樣，細胞中的所有2-酮酸中間體將引入到生物合成途徑。但是，這一策略的成功應(yīng)用在沒有對提出的途徑進行確認和對編碼提出的分解代謝酶的基因進行鑒定的情況下是不可能的。我們首先試圖通過隨機誘變方式闡明大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝途徑。大腸桿菌K-12野生型菌抹W3110的突變體使用EZ::Tn5<R6K，n7KAN-2>TnpTransposome試劑盒(EPICENTREBiotechnologies,Madison,Wl,U.S.)產(chǎn)生。為分離包含插入到對于D-木質(zhì)酸分解代謝關(guān)鍵的基因中的轉(zhuǎn)座子的候選物，篩選喪失了在包含I)-木質(zhì)酸作為唯一碳源的M9培養(yǎng)板上生長的能力但在包含D-葡萄糖作為唯一碳源的M9培養(yǎng)板上培養(yǎng)時保持與野生型菌抹相同的生長率的W3110突變體。從1200個W3110突變體中，使用這一表型分析確定了三個候選物。該候選物中的兩個具有插入到編碼腺苷酸環(huán)化酶的基因中的轉(zhuǎn)座子。參見，例如M.Riley&B.Labedan,/二s、c/zer/Cco//geneproducts:physiologicalfunctionsandcommonancestries,InF.C.Neidhardt，(編輯),EscherichiacoliandSalmonella:0〃w/"rMo/ecw/arSz'o/ogyat2118-2202(第二版)(ASMPress,Washington,DC,1996)。第三個候選物具有插入到編碼環(huán)AMP受體蛋白(CRP)的crp基因中的轉(zhuǎn)座子(F.C.Neidhardt，同前)。作為大腸桿菌中的全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，CRP與其DNA靶的結(jié)合受到cAMP胞質(zhì)濃度的調(diào)節(jié)。參見，例如M.H.Saier等，Regulationofcarbonutilization,InF.C.Neidhardt,(編輯)，EscherichiacoliandSalmonella:Q〃m/w朋(i她/織/ar5油g少at1325-1443(第二版)(ASMPress,Washington,DC,1996)。研究也表明，缺乏腺苷酸環(huán)化酶活性的大腸桿菌菌林具有低的cAMP胞質(zhì)濃度(M.H.Saier等，同前)。cya和/或基因的破壞產(chǎn)生不能在受到分解代謝物阻遏的任何碳源上生長的分解代謝阻遏的大腸桿菌菌抹(M.H.Saier等，同前)。因此，我們把不能使用D-木質(zhì)酸作為生長的唯一碳源的qya和突變體的分離看作D-木質(zhì)酸的大腸桿菌分解代謝受到分解代謝物阻遏調(diào)節(jié)的指征。為避免重復(fù)分離具有受損的分解代謝物阻遏調(diào)節(jié)的突變體，我們使用了包含甘油作為唯一碳源的第三類型的M9培養(yǎng)板來篩選另外的2500個W3110突變體。因為大腸桿菌的甘油分解代謝也受到分解代謝物阻遏的調(diào)節(jié)，我們改為尋找能夠以D-葡萄糖和丙三醇作為唯一碳源生長但不能以D-木質(zhì)酸作為唯一碳源生長的W3110突變體。但是令人驚異的是，沒有觀察到具有這種表型的突變體。隨機誘變試驗不能揭示與大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝途徑關(guān)聯(lián)的任何結(jié)構(gòu)基因。在理解大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝的進一步嘗試中，進行了大腸桿菌K-12基因組的生物信息學(xué)分析，其從使用莓實假單胞菌D-木質(zhì)酸脫水酶的部分氨基酸序列的BLAST4企索開始。我們確定了四個與查詢序列具有32-41%范圍內(nèi)的序列同一性的候選脫水酶。除了兩個經(jīng)過深入研究的酶(6-磷酸葡萄糖酸脫水酶和二羥酸脫水酶)外，另外兩個未經(jīng)鑒定的推定脫水酶由基因"7zG(97.424min)和基因(6.0872min)編碼。對jy'/zG和上游和下游的大腸桿菌基因組區(qū)域的檢查顯示了兩套編碼推定的DNA轉(zhuǎn)錄抑制蛋白Oy'/7/和；;ag/)、推定的轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)(y乂/2F和j^gG)及推定的醛縮酶/合酶(yy7z7/和戸g五)的基因(圖3b)。另外的編碼推定的P-木糖苷酶的基因(yag/7)也位于yagF基因附近。兩套基因的結(jié)構(gòu)都與以/ac操縱子為例的其它大腸桿菌分解代謝途徑編碼基因的結(jié)構(gòu)相似。另一個引人注目的現(xiàn)象是兩套基因都編碼對于通過我們提出的途徑的可調(diào)節(jié)D-木質(zhì)酸分解代謝是必要的和充分的酶(圖3a)。為了將來的方便性，我們將這兩套基因命名為J^基因簇和，g基因簇。為研究和_y"g基因簇在大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝中的作用，我們首先檢測了這兩個推定的脫水酶和兩個推定的醛縮酶/合酶的體外活性。將基因；^G、"gF、j^/7和，g五的PCR擴增DNA產(chǎn)物分別克隆到蛋白質(zhì)表達載體pJF118EH中。在分析中使用表達目標(biāo)酶的大腸桿菌細胞的無細胞溶菌液。使用'HNMR，我們能夠-險測到在表達YjhG或YagF的大腸桿菌的溶菌液催化的酶反應(yīng)中從D-木質(zhì)酸形成了3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸。'HNMR分析還顯示，^7z/7和；^g五編碼的兩個推定的醛縮酶/合酶可以催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和乙醇醛。我們進一步使用分光光度分析法證實了YjhH和YagE的醛縮酶活性。通過在酶反應(yīng)中包含乳酸脫氯酶，醛縮酶催化的從3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸形成丙酮酸的反應(yīng)根據(jù)NADH的氧化進行監(jiān)測。這些結(jié)果表明，YjhG和YagF確實具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性；另外，YjhG和YagF確實具有3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶活性。接著，我們檢查是否"77和jag基因簇對于大腸桿菌的D-木質(zhì)酸分解代謝是必要的。因為闡明大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝途徑的目的是探究構(gòu)建不能消耗3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的大腸桿菌突變體的可能性和評價這一分解代謝改變對大腸桿菌的D-l，2,4-丁三醇生物合成的影響，因此以編碼兩個醛縮酶的基因(^72/f和y"g五)為目標(biāo)進行染色體敲除試驗。從野生型菌抹W3110產(chǎn)生了四個大腸桿菌突變體。大腸桿菌WN3和WN4是兩個單敲除的菌^^朱。W3110染色體上"'^^基因的部分DNA序列替換為編碼氯霉素抗性蛋白質(zhì)的基因得到菌抹WN3(表2)。W3110染色體上少agE基因的部分DNA序列替換為編碼卡那霉素抗性蛋白質(zhì)的基因得到菌抹WN4(表2)。大腸桿菌W5是包含菌4朱WN3和WN4的兩種突變的雙敲除菌4朱(表2)。表2.細菌菌抹和質(zhì)粒菌抹/質(zhì)粒相關(guān)特性？1用/來源真菌伯克霍爾德菌LB400野生型ARSCB15野生型ATCC莓實假單胞菌野生型ATCCDH5a/"cZAW5/W7IrwitrogenW3110野生型K-12CGSCW3110c，W3110，::KanR本研究W3110crp::KanR本研究WN3W311QyyW::CmR本研究WN4本研究WN5W3::CmR;;"g￡::KanR本研咒■6本研咒WN7W3110勿7z/Z勿ag&^4本研咒W311(toviW3110鮮」本研咒WN13本研咒pKD3ApR，CmR文獻27pKD4ApR,KanR文獻27pKD46KanR文獻27pCRTOP02.1KanRIrwitrogenpQE30ApRQiagenpJG7.246ApR，pQE30中的/"C實驗室菌抹pJF118EHApR,尸》,文獻26pRC1.55BCmR,pSU18中的實驗室菌抹pWN7.270AApR,pJF118EH中的"K7本研究pWN7.272AApR,pJFI18EH中的，gF本研究pWN8.020AApR，pJFU8EH中的，g￡本研究pWN8.022AApR,pJF118EH中的^zi7本研咒55<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>計算機分析顯示，各脫水酶編碼基因與上游醛縮酶編碼基因共享潛在的啟動子序列(圖3b)。為減輕由插入到醛縮酶編碼基因中的基因引起的對脫水酶表達的潛在極性突變效應(yīng)，通過從菌林WN5的染色體中去除這兩個抗生素抗性基因標(biāo)志而產(chǎn)生第四種大腸桿菌突變體WN6(表2)。然后評價這四個突變體菌4朱在M9固體培養(yǎng)基上的生長特性(圖4a)。大腸桿菌野生型菌抹W3110和分解代謝抑制菌抹W3110c在這些試驗中作為對照。當(dāng)提供葡萄糖作為唯一碳源時，所有四個突變體菌4朱在M9培養(yǎng)板上具有與菌4朱W3110類似的生長率。但是，當(dāng)提供D-木質(zhì)酸作為唯一碳源時，僅兩個單敲除的突變菌抹能夠在M9培養(yǎng)板上生長，但相對于野生型對照菌抹具有較低生長率(圖4a)。在37。C孵育72h后在相同的培養(yǎng)基上未檢測到大腸桿菌WN5、WN6和W3110cr/的明顯生長(圖4a)。這些觀察表明，WN3和WN4在D-木質(zhì)酸上的較低生長率是由與D-木質(zhì)酸利用直接相關(guān)的分解代謝蛋白質(zhì)的較低活性引起的。并且因為完全缺乏這些催化活性，大腸桿菌WN5和WN6喪失了利用D-木質(zhì)酸作為唯一碳源進行生長的能力。我們進一步分析了四個突變體菌抹的兩種D-木質(zhì)酸分解代謝酶(D-木質(zhì)酸脫水酶和3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶)的表達。酶分析利用了在含有D-木質(zhì)酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的單個菌抹的無細胞溶菌液。兩個單敲除的大腸桿菌突變體(WN3和WN4)同時表達脫水酶和醛縮酶(圖4a)。由于預(yù)計的極性突變效應(yīng)，雙敲除突變體WN5不表達兩種分解代謝酶中的任一種(圖4a)。另一方面，無標(biāo)志的突變體菌林WN6恢復(fù)了表達D-木質(zhì)酸脫水酶的能力，而仍然缺失3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸趁縮酶活性(圖4a)。使用^NMR，我們還監(jiān)測了經(jīng)過酶表達分析的細胞培養(yǎng)物的D-木質(zhì)酸消耗和分解代謝物蓄積。在培養(yǎng)結(jié)束時，大腸桿菌WN5和W3310crp不消耗任何D-木質(zhì)酸。野生型大腸桿菌菌抹W3110消耗了培養(yǎng)基中的所有D-木質(zhì)酸，而兩個單敲除大腸桿菌突變體和WN6僅消耗掉部分的D-木質(zhì)酸(圖4b)。在六個菌抹中，大腸桿菌WN6是唯一向培養(yǎng)基中分泌醛縮酶的底物(3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸)的菌抹(圖4b)。至此，從體外和體內(nèi)試驗獲得的結(jié)果都證實大腸桿菌的D-木質(zhì)酸分解代謝遵循我們提出的途徑(圖3a)。另外，需要的分解代謝酶的兩個拷貝由屬于37'/和_y"g基因簇的基因編碼。D-l，2，4-丁三醇的微生物合成。我們首先評價消除3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶活性對大腸桿菌從D-木質(zhì)酸合成D-l,2，4-丁三醇的影響。為此目的構(gòu)建了兩個大腸桿菌宿主菌抹，W3110"M和WN7。W3110wM直接源自野生型菌株W3110(表2)，而WN7直接源自菌抹WN6(表2)。兩個宿主菌抹共有位于染色體上的同一突變基因。該化M基因編碼3-磷酸甘油酸脫氬酶，該酶是L-絲氨酸生物合成必需的。因此，當(dāng)細胞成功地維持SerA-編碼質(zhì)粒時，缺少該酶活性的大腸桿菌菌株可能僅在沒有補充L-絲氨酸的低鹽培養(yǎng)基中生長。這一營養(yǎng)壓迫策略廣泛地用作質(zhì)粒維持的有效手段。參見，例如K.M.Dmths等，Shikimicacidandquinicacid:replacingisolationfromplantsourceswithrecombinantmicrobialbiocatalysis,</.爿w.CVzem.iSoc.121:1603-1604(1999)。除了^M基因外，質(zhì)粒pWN7.126B也包含從惡臭假單胞菌(ATCC12633)分離的wd/C基因(表2)。m6Z/C基因編碼2-酮酸脫羧酶(見SEQIDNO:44,由SEQIDNO:43編碼)，其為催化D-l,2，4-丁三醇生物合成途徑中的第三步驟的酶(圖lb)。在33。C的溫度和pH7.0下，微生物合成在發(fā)酵罐控制的培養(yǎng)條件57下在低鹽培養(yǎng)基中進行，使溶解氧水平維持在10%的空氣飽和度。參J^"L，{列^口K.Li等,Fed-batchfermentorsynthesisof3畫dehydroshikimicacidusingrecombinant￡^c/zerz'c/z/aco/z'，Sz'o&c/wo/.64:61-73(1999)。葡萄糖作為細胞生長的唯一碳源提供。含有D-木質(zhì)酸鉀的溶液加入到培養(yǎng)基中作為生物合成原料。為避免由于培養(yǎng)基中的高葡萄糖濃度引起的對D-木質(zhì)酸分解代謝酶表達的分解代謝物阻遏，穩(wěn)態(tài)葡萄糖濃度維持在大約0.2mM。培養(yǎng)48h后，大腸桿菌W3110^M/pWN7.126B(其具有功能性的D-木質(zhì)酸分解代i射途徑)僅以0.75%的產(chǎn)率從18g的D-木質(zhì)酸合成0.08g/L的D-1,2,4-丁三醇(圖5a)。相反，大腸桿菌WN7/pWN7.126B(其可以表達具有催化活性的D-木質(zhì)酸脫水酶，但不表達3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶)以45%的產(chǎn)率從28g的D-木質(zhì)酸合成8.3g/L的D-l，2,4-丁三醇(圖5a)。因此，該結(jié)果證明3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸酪縮酶的滅活是增加大腸桿菌在低鹽培養(yǎng)基中從D-木質(zhì)酸合成D-1,2,4-丁三醇的成功策略。但是，大腸桿菌生物催化劑中D-木質(zhì)酸分解代謝途徑的破壞在理論上應(yīng)導(dǎo)致從D-木質(zhì)酸到D-l，2,4-丁三醇的100%的轉(zhuǎn)化。為理解生物合成過程中源自D-木質(zhì)酸的碳流，我們分析了WN7/pWN7.126B菌抹發(fā)酵液的副產(chǎn)物形成情況。在除去細胞后，48h培養(yǎng)后收獲的發(fā)酵液使用Dowex1(C1—型)和Dowex50(H+型)離子交換樹脂進行純化。各純化步驟的溶質(zhì)含量用^NMR進行分析。我們因此檢測到3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸、3-脫氧-D-甘油-戊酸、(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸和D-3,4-二羥基丁酸(圖5b)。第一種分子是指定的生物合成中間體。第二和第三種分子可能分別是該中間體的還原和轉(zhuǎn)氨產(chǎn)物。這三種副產(chǎn)物的蓄積表明D-木質(zhì)酸脫水酶(其催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的形成)的體內(nèi)催化活性與2-酮酸脫羧酶(其催化該2-酮酸轉(zhuǎn)化成D-3,4-二羥基丁醛)的體內(nèi)催化活性之間的失配(圖lb)。為理解D-3，4-二羥基丁酸形成的機理，我們還分析了大腸桿菌WN7/pRC1.55B(其不表達2-酮酸脫羧酶)的發(fā)酵液。但是，該有機酸沒有在純化的發(fā)酵液中檢測到。因此，D-3,4-二輕基丁酸非?？赡苁荄-3，4-二羥基丁醛的氧化產(chǎn)物(圖5d)。我們通過構(gòu)建宿主菌抹WN13對大腸桿菌在低鹽培養(yǎng)基中直接從D-木糖合成D-l,2，4-丁三醇進行檢驗。大腸桿菌WN13是通過用x^Z/z(新月柄桿菌)-CV7/基因盒置換x_y"x_y/A基因簇的基因組拷貝而由菌林WN7獲得的(表2)。w"基因編碼D-木糖異構(gòu)酶。x_y/S基因編碼D-木酮糖激酶。這是大腸桿菌的D-木糖分解代謝必需的兩種酶。因此WN13的染色體修飾消除了其利用D-木糖作為唯一碳源進行生長的能力。作為第二種后果，大腸桿菌WN13可以在x_y"啟動子的控制下表達D-木糖脫氫酶活性。對大腸桿菌WN13/pWN7.126B的[)-1，2，4-丁三醇生物合成在類似于上述發(fā)酵罐控制培養(yǎng)條件下進行評價。唯一的改變是在所示的時間點將D-木糖而不是D-木質(zhì)酸加入到培養(yǎng)基中作為生物合成的原料(圖5b)。在培養(yǎng)48h后，大腸桿菌WN13/pWN7.126B以30%的產(chǎn)率從30g的D-木糖合成了6.2g/L的D-l，2,4-丁三醇(圖5a)。在菌抹WN13/pWN7.126B的培養(yǎng)基中也檢測到與菌林WN7/pWN7.126B蓄積的生物合成副產(chǎn)物相同的副產(chǎn)物。在整個培養(yǎng)過程中對D-木糖脫氬酶比活性的分析表明，該酶的表達是由D-木糖誘導(dǎo)的(圖5c)。這一結(jié)果顯示，^/z基因的染色體整合獲得了成功。由于這些發(fā)現(xiàn)和重組菌抹的構(gòu)建，增強的1,2,4-丁三醇的生物催化現(xiàn)在有可能成為提供立體選擇性、且采用溫和的反應(yīng)條件和該方法的環(huán)境良好特性的商業(yè)選擇。D-l,2，4-丁三醇的生物合成遵循的是圍繞特定革蘭氏陰性細菌采用的氧化D-木糖分解代謝途徑建立的這一人工生物合成途徑(圖lb)。參見，例如R.Weimberg,J.歷o/.C72ew.236:629-635(1961)和A.S.Dahms,S/oc/zem.S/op/z".Cow附肌60:433-1439(1974)。本發(fā)明的各種實施方式改善了這一途徑和其1,2,4-丁三醇生產(chǎn)水平，包括單宿主細胞可以進行從木糖到1，2，4-丁三醇的合成的實施方式，且在各種實施方式中可以在低鹽培養(yǎng)基上進行1,2,4-丁三醇的合成。先前未報道的大腸桿菌D-木質(zhì)酸分解代謝途徑(圖3a)的闡明現(xiàn)在允許在低鹽培養(yǎng)基中實現(xiàn)D-l,2，4-丁三醇的生物合成。在大腸桿菌K-l2野生型菌林中發(fā)現(xiàn)了由力/z和少ag基因簇編碼的兩套分解代謝酶(圖3b)。染色體敲除試驗顯示任一基因簇編碼的酶足以使大腸桿菌利用D-木質(zhì)酸作為唯一碳源進行生長(圖4a),另外，在突變菌林WN5中觀察到的極性突變效應(yīng)(圖4)表明編碼3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸^縮酶的基因(yy/77/和j^gE)和編碼D-木質(zhì)酸脫水酶的基因和形成了兩個轉(zhuǎn)錄操縱子。由兩個基因簇編碼的分解代謝酶的表達由D-木質(zhì)酸誘導(dǎo)且受到分解代謝物阻遏的緊密調(diào)節(jié)。存在編碼同一酶活性的兩個基因拷貝解釋了為什么一次只能有效地使一個基因產(chǎn)生突變的轉(zhuǎn)座子隨機誘變試驗不能揭示D-木質(zhì)酸分解代謝途徑的結(jié)構(gòu)基因。編碼D-木質(zhì)酸脫水酶和3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶的基因的確認也將有利于下一步對兩種酶的動力學(xué)和結(jié)構(gòu)研究。我們的初步酶分析顯示，由基因W/z//和基因編碼的兩種醛縮酶可以催化D-和L-3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸異構(gòu)體的裂解(數(shù)據(jù)未顯示)。因此這兩種酶與從硫磺礦硫化葉菌OSW/0/0^^^//"mWc^)分離的2-酮-3-脫氣葡糖酸醛縮酶一起為催化非立體特異性的醛反應(yīng)(aldoreaction)的少數(shù)醛縮酶的成員。參見，例如A.Theodossis等，Thestructuralbasisforsubstratepromiscuityin2-keto-3-deoxygluconatealdolasefromtheh:ntner-DoudoroffpathwayinjSV^/o/o^^so(/i^an'cz^，《/CTze附.279:43886-43892(2004)。同樣地，這些由基因》/7//和基因編碼的醛縮酶可以被有效地滅活或抑制以增加使用L-阿拉伯糖或L-阿糖酸源作為原料的生物合成途徑中L-l，2,4-丁三醇的產(chǎn)量。大腸桿菌直接從D-木糖合成D-l,2,4-丁三醇也受益于新型細菌D-木糖脫氫酶(Xdh)的發(fā)現(xiàn)。除了具有與以前報道的酶相當(dāng)?shù)拇呋释?表1),來自真菌伯克霍爾德菌和新月柄桿菌的新型D-木糖脫氫酶還可以在通常使用的大腸桿菌生產(chǎn)菌抹中有效地表達為具有催化活性的形式。因此，這兩種D-木糖脫氫酶可以在多種常用的細菌生60產(chǎn)菌抹中用于生產(chǎn)1,2,4-丁三醇或其它需要的產(chǎn)物。為降低與生物催化制備相關(guān)的成本，現(xiàn)在已經(jīng)從喪失了以D-木糖和D-木質(zhì)酸作為唯一碳源生長的能力的宿主菌抹構(gòu)建了合成D-l，2，4-丁三醇的大腸桿菌。結(jié)果，大腸桿菌WN13/pWN7.126B在I)-葡萄糖上進行培養(yǎng)，D-葡萄糖相對于D-木糖是一種更便宜的原料。生物催化劑僅將D-木糖用于生物合成的目的。除了產(chǎn)生生物合成的目標(biāo)物(D-1,2，4-丁三醇)和特指的生物合成中間體(3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸)外，還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌WN13/pWN7.126B合成先前并未報道為常見的細菌代謝物的其它有用分子，包括3-脫氧-D-甘油-戊酸、(4S)-2-氨基-4，5-二鞋基戊酸和D-3，4-二羥基丁酸(圖5d)。在本發(fā)明的各種實施方式中，一種或多種酶可以受到抑制或滅活以減少或消除這些副產(chǎn)物的形成并因此進一步增加D-l,2,4-丁三醇的生物合成。盡管如此，副產(chǎn)物中的多個立構(gòu)中心可以用作化學(xué)合成的有價值的手性合成子。大腸桿菌WN13/pWN7.1268的遺傳修飾可以潛在地導(dǎo)致新的菌抹以將"副產(chǎn)物，，作為目標(biāo)分子合成。D-l,2，4-丁三醇生物合成途徑的分子多樣性的擴展顯示了細菌催化網(wǎng)絡(luò)的靈活性，這是反映自然的生物合成途徑進化的"酶募集(enzymerecruitment)"理i侖的J見象。參見,例長口R.A.Jensen,Enzymerecruitmentinevolutionofnewfunction,Xm.We乂A^'crc^/o/.30:409-425(1976);,口S.Schmidt等，Metabolites:ahelpinghandforpathwayevolution7Vew血Woc/z簡.5"c/.28:336-341(2003)。外源催化活性(包括D-木糖脫氫酶和2-酮酸脫羧酶)整合到大腸桿菌天然催化網(wǎng)絡(luò)中導(dǎo)致碳流的重新布線和新型代謝產(chǎn)物的生物合成。材料和方法化學(xué)物質(zhì)和培養(yǎng)基。用于發(fā)酵的木質(zhì)酸鉀如先前描述的進行制備。參見，W.Niu等，/爿肌C/2e肌Soc.125:12998-12999(2003)?；瘜W(xué)合成的木質(zhì)酸鉀用于酶分析和培養(yǎng)基制備。參見，例如8.]^00^&K.P.Link,Carbohydratecharacterization:I.Theoxidationofaldosesbyhyp()ioditeinmethanol;andII.Theidentificationofsevenaldo-monosaccharidesasbenzimidazolederivatives,乂5z'o/.CTzew.133:293-311(1940)。3-脫氧-D，L-甘油-戊糖酮酸被化學(xué)合成。參見例々口A.C.Stoolmiller,DL-andL-2-keto-3-deoxyarabonate-l,2.jV/W/zoa^41:101-103(1975)。所有其它的化學(xué)物質(zhì)從商業(yè)來源購買。所有溶液在蒸餾的去離子水中制備。LB培養(yǎng)基(參見，例如J.H.Miller,Exper/膨塗,7M/ecw/arCewWcs1(ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY,1972))(1L)包含細菌用胰蛋白胨(IOg)、細菌用酵母提取物(5g)和NaCl(10g)。M9鹽(lL)包含Na2HP04(6g)、KH2P04(3g)、NH4C1(1g)和NaCl(0.5g)。M9基本培養(yǎng)基在1L的M9鹽中包含D-葡萄糖(10g)、MgS04(0.12g)和鹽酸硫胺素(0.001g)。M9D-木質(zhì)酸培養(yǎng)基在M9低鹽中包含D-木質(zhì)酸鉀(10g)而不是D-葡萄糖。M9甘油培養(yǎng)基在M9低鹽中包含甘油(10g)而不是D-葡萄糖。在適當(dāng)?shù)那闆r下加入抗生素達到如下的終濃度氨節(jié)青霉素(Ap),50叫/mL;氯霉素(Cm)，20嗎/mL和卡那霉素(Kan)，50|ng/mL。異丙基—p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)制備為500mM的原液。M9鹽、MgS04、葡萄糖和甘油的溶液單獨地高壓滅菌，然后混合。D-木質(zhì)酸鉀、鹽酸硫胺素、抗生素和IPTG的溶液通過0.22氺m的濾膜除菌。固體培養(yǎng)基通過向液體培養(yǎng)基加入Difco瓊脂到1.5。/。(w/v)的終濃度而制備。標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵培養(yǎng)基(lL)包含K2HP04(7.5g)、檸檬酸鐵(III)銨(0.3g)、檸檬酸一水合物(2.1g)和濃硫酸(1.2mL)。發(fā)酵培養(yǎng)基在高壓滅菌前通過加入濃NH40H調(diào)節(jié)到pH7.0。下面的補充劑恰在開始發(fā)酵前加入D-葡萄糖、MgS04(0.24g)和包括(NH4)6(M。7024).4H20(0.0037g)、ZnS〇,7H20(0.0029g)、H3B03(0.0247g)、CuS04'5H20(0.0025g)和MnCl2.4H20(0.0158g)的痕量礦物質(zhì)。IPTG原液按照需要加入到標(biāo)示的終濃度。葡萄糖和MgS04(lM)溶液單獨地進行高壓滅菌處理。需要的話加入抗沫劑204(Sigma-AldrichCorp.,St.Louis,MO，U.S.)。核苷酸和氨基酸序列。核苷酸和氨基酸序列顯示于表3中。表3.所列序列的確認<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>SEQIDNO:19大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(y乂/zG)的正向引物SEQIDNO;20大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(yy/zG)的反向引物S1:QIDNO:21大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(yag。的正向引物SJiQIDNO:22大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(yagF)的反向引物Sl:QIDNO:23大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(X/7zf/)的正向引物SI':QIDNO:24大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因0^7/)的反向引物SEQIDNO:25大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yag五)的正向引物SKQIDNO:26大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yag五)的反向引物Sl'》IDNO:27用于構(gòu)建質(zhì)粒pWN9.068A的新月柄桿菌CB15D-木糖脫氫酶基因的正向引物SKQIDNO:28用于構(gòu)建質(zhì)粒pWN9.068A的新月柄桿菌CB15D-木糖脫氫酶基因的反向引物Sl:QIDNO:29莓實假單胞菌木質(zhì)酸脫水酶基因的正向引物SI:QIDNO:30莓實假單胞菌木質(zhì)酸脫水酶基因的反向引物SEQIDNO:31用于^C壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(^7z/7)的DNA片段的正向引物SEQIDNO:32用于破壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因0;y7Lf/)的DNA片段的反向引物Sl:QIDNO:33用于破壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yag巧的DNA片段的正向引物SI"IDNO:34用于破壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸64醛縮酶基因(^g巧的DNA片段的反向引物SEQIDNO:35用于將xi插入大腸桿菌基因組DNA中的DNA片段的正向引物SI"II)NO:36用于將x函插入大腸桿菌基因組DNA中的DNA片段的反向引物SI》II)NO:37大腸桿菌醇脫氬酶的DNA編碼序列(基因"W尸)S即I)NO:38大腸桿菌醇脫氬酶的氨基酸序列(AdhP)SEQII)NO:39大腸桿菌2-酮酸脫氫酶的DNA編碼序列(基因SKQII)NO:40大腸桿菌2-酮酸脫氫酶的氨基酸序列(YiaE)SKQIDNO:41大腸桿菌2-酮酸脫氫酶的DNA編碼序列(基因少cdff)SEQ11)NO:42大腸桿菌2-酮酸脫氬酶的氨基酸序列(YcdW)Sl》IDNO:43惡臭假單胞菌2-酮酸脫羧酶的DNA編碼序列(基因SI"IDNO:44惡臭假單胞菌2-酮酸脫羧酶的氨基酸序列(MdlC)注意到在SEQIDNO:11中，ntl-3顯示為推定的啟動密碼子，而nt55-57顯示為替代的啟動密碼子,使得nt55-960成為替代的YjhH3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶肽的編碼序列。類似地，在SEQIDNO:2中，Met(l)是推定的啟動Met，且Met(19)是替代的啟動Met,使得Met(19)-Val(319)成為替代的YjhH3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸醛縮酶肽。細菌菌林和質(zhì)粒。大腸桿菌K-12菌抹W3110得自大腸桿菌遺傳保藏中心(五.GeneticStockCenter)(YaleUniversity,NewHaven,CT，U.S.)。質(zhì)粒的構(gòu)建在得自LifeTechnologiesInc.(Rockville，MD，U.S.)的大腸桿菌DH5a中進行。莓實假單胞菌(ATCC4973)和新月柄桿菌(ATCC19089)得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA，U.S.)。真菌伯克霍爾德菌LB400以登錄號NRRLB-18064得自ARS專利培養(yǎng)物保藏中心(ARSPatentCultureCollection)(UnitedStatesDepartmentofAgriculture,Peoria,IL,U.S.)。質(zhì)粒pJFl18EH(參見，例如J.P.Furste等，MolecularcloningoftheplasmidRp4primaseregionin65amulti-host-rangefac/3expressionvector,Cewe48:119-131(1986))由密執(zhí)安州立大學(xué)的M.Bagdasarian教授惠贈。同源重組采用質(zhì)粒pKD3、pKD4、pKD46和pCP20(參見,K.A.Datsenko&B丄.Wanner,OnestepinacUvationofchromosomalgenesinfoc/zer/c/n'aco//K-12usingPCRproducts,尸亂淑/.Scz'.,97:6640-6645(2000)),這些質(zhì)粒得自大腸桿菌遺傳保藏中心。質(zhì)粒pCRTOP02.1購自InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA，U.S.)。質(zhì)粒pQE30購自QIAGEN，Inc.。這里使用的所有菌抹和質(zhì)?？偨Y(jié)于表2中。一般分子生物學(xué)和質(zhì)粒構(gòu)建。標(biāo)準(zhǔn)方案用于質(zhì)粒DNA的構(gòu)建、純4匕禾口分才斤。參見，J.Sambrook&D.W.Russell,Mo/ecw/arC/o"Z"g,a/^oratoryMw編/(第三版，2001)(ColdSpringHarborLab.Press,ColdSpringHarbor,NY)。大腸桿菌基因組DNA按照D.G.Pitcher等，"RapidextractionofbacterialgenomicDNAwithguanidiumthiocyanate，"zip;/.M/cra^o/.8:151-56(1989)中描述的過程分離。其它細菌菌株基因組DNA的分離采用K.Wilson,"PreparationofgenomicDNAfrombacteria,"inCw/re"f尸ratoco/sMo/ecw/ar(RMAusubel等編輯)2.4.1-2.4.5(1987)(Wiley，NY)中先前建立的方法。Fast-LinkDNA連一妾試劑盒購自EPICENTREBiotechnologies。DN八聚合酶I(Klenow片段)和小牛腸堿性磷酸酶購自InvitrogenC()rp.。PCR擴增按照Sambrook&Russell(2001)中所述的方法進行。DNA聚合酶購自StratageneCorp.(LaJolla,CA，U.S.)。引物由密執(zhí)安州立大學(xué)(EastLansing,MI，U.S.)的大分子結(jié)構(gòu)小組合成。DNA測序服務(wù)由密執(zhí)安州立大學(xué)的基因組技術(shù)支持d、組提供。來自真菌伯克霍爾德菌LB400的xd/z基因使用具有下劃線的/i"wHl限制性酶切位點的正向和反向引物由自希望的菌抹分離的基因組DNA擴增5-CGGGATCCATGTATTTGTTGTCATACCC(SEQIDN():15)和5'誦CGGGATCCATATCGACGAAATAAACCG(SEQIDNO:16)。所得到的DNA用SamHI消化，然后連接到pJG7.246的5awHI位點中而得到質(zhì)粒pWN9.044A。質(zhì)粒pWN9.046A包含編碼新月柄桿菌CB15D-木糖脫氫酶的基因。該質(zhì)粒采用與pWN9.044A相同的策略構(gòu)建。下面的引物用于擴增來自新月柄桿菌CB15基因組DNA的涵基因5，畫GCGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCC(SEQIDN0:17)和5,畫GCGGATCCGATGACAGTTTTCTTAGGTC(SEQIDN():18)。大腸桿菌基因由自菌抹W3110分離的基因組DNA擴增。下面的引物用于擴增基因w力G(EcoRI和///"dill限制性酶切位點以下劃線表示)5'-CGGAATTCATGTCTGTTCGCAATATT(SEQIDNO:19)和5'-GCAAGCTTAATTCAGGTGTCTGGATG(SEQIDNO:20)?；蛏?a^，利用下面的引物進行擴增(五coRI和///"dill限制性酶切位點以下劃線表示)5'-CGGAATTCGATGACCATTGAGAAAAT(SEQIDN():21)和5'-GCAAGCTTCAACGATATATCTCAACT(SEQIDNO:22)。jy7zG和；^2g尸PCR片段定位于pJFl18EH的￡coRI和///"dill位點之間分別產(chǎn)生質(zhì)粒pWN7.270A和pWN7.272A。下面的引物用于擴增基因(EcoRI和SawHI限制性酶切位點以下劃線表示)5'-CGGAATTCATGGGCTGGGATACAGAAAC(SEQIDNO:23)和，/g/二'利用下面的引物進行擴增(五coRI和j9"wHI限制性酶切位點以下劃線表示)5'-CGGAATTCATGATTCAGCAAGGAGATC(SEQIDNO:25)和5'-TAGGATCCTTATCGTCCGGCTCAGCAA(SEQIDN():26)。"7z/7和少ag五PCR片段定位于pJF118EH的五coRI和SamHI位點之間分別產(chǎn)生質(zhì)粒pWN8.022A和pWN8.020A。質(zhì)粒pWN7.126B源自質(zhì)粒pWN5.238A。參見，W.Niu等，JJw.125:12998-12999(2003)。通過消化從質(zhì)粒pRCl.55B釋放含有"M基因的1.6-kbDNA片段?；疢基因座與Scol消化的pWN5.238A連接產(chǎn)生質(zhì)粒pWN7.126B。為產(chǎn)生大腸桿菌WN13的目的構(gòu)建了質(zhì)粒pWN9.068A。來自新月柄桿菌CB15的x^基因利用下面具有下劃線的印/zI限制性酶切位點的引物擴增5-GCGCATGCATGTCCTCAGCCATCTATCC(SEQIDNO:27)和5-GCGCATGCGATGACAGTTTTCTTAGGTC(SEQIDNO:28)。得到的PCR片段插入到質(zhì)粒pKD3的位點中產(chǎn)生pWN9.068A。一般酶學(xué)。細胞通過在4。C下以4000g的離心進行收集。收獲的細胞重懸于適宜的緩沖液中并隨后用弗氏破碎儀(Frenchpress)(16,000psi或大約110.3MPa)通過兩個操作過程進行破碎。細胞碎片通過以48000g離心20分鐘而除去。蛋白質(zhì)濃度采用Bradford染料結(jié)合方法測定。參見，M.M.Bradford,"Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding,"^腦/.腸c/縫72:248(1976)。蛋白質(zhì)分析溶液購自Bio-RadLaboratories,Inc.(Hercules,CA，U.S.)。蛋白質(zhì)濃度通過與用牛血清白蛋白制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比而確定。D-木質(zhì)酸脫水酶活性按照先前描述的方法進行分析。參見，A.S.Dahms&A.Donald,"D-xylo-Aldonatedehydratase,"M^/w^y///^z少mo/.90:302-305(1982)。在反應(yīng)過程中形成的2-酮酸以其縮氨基脲衍生物形式進行定量。重懸緩沖液含有Tris-HCl(50mM，pH8.0)和MgCl2(10mM)。制備了兩種溶液并分別在3(TC孵育3分鐘。第一種溶液(150(iL)含有Tris-HCl(50mM,pH8.0)、MgCl2(10mM)和適當(dāng)量的細胞溶解產(chǎn)物。第二種溶液(25jiL)含有D-木質(zhì)酸鉀(O.lM)。在兩種溶液混合(時間=0)后，按時間間隔取出等分試樣(30^L)并與在水中含有1%(w/v)鹽酸氨基脲和0.9%(w/v)乙酸鈉的氨基脲試劑(200^L)混合。在30。C孵育15分鐘后，各樣品用H20稀釋到1mL。沉淀的蛋白質(zhì)通過微離心(microfugation)除去。在250nm測量縮氨基脲的吸光度。一個單位的D-木質(zhì)酸脫水酶活性被定義為在30。C每分鐘形成1,umol的2-酮酸。10200M"cm"的摩爾消光系統(tǒng)(250nm)用于2-酮酸縮氨基脲書f生物。D-木糖脫氫酶采用先前描述的改良方法進行分析。參見，A.S.I)ahms&J.Russo，"D-Xylosedehydrogenase,"Mef/70fi^五wzymo/.89(Pt.D):226-28(1982)。重懸緩沖液含有Tris-HCl(100mM，pH8.3)。酶反應(yīng)液(lmL)含有Tris-HCl(100mM，pH8.3)、NAD+(2.5mM)、D畫木糖(10mM)和適當(dāng)量的酶。酶活性通過在340nm監(jiān)測NADH的形成而用分光光度法進行測量。一個單位的D-木糖脫氫酶被定義為在33。C每分鐘形成1pmol的NADH(s=6220M"cm")。3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶活性按照先前描述的改良偶聯(lián)分析進行測量。參見，A.S.Dahms&A.Donald,"2-keto-3-deoxy-D-xylonatealdolase(3-deoxy-D-pentulosonicacidaldolase),"MeAoA/"90(Pt.E):269_72(1982)。在2-酮酸裂解時釋放的丙酮酸在乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)中進行監(jiān)測。重懸緩沖液含有HEPES(100mM，pH7.8)。分析溶液(lmL)含有HEPES(100mM，pH7.8)、NADH(2mM)、乳酸脫氬酶(25U)、3-脫氧-D,L-甘油-戊酮糖酸(5mM)和適當(dāng)量的酶，由無細胞溶胞產(chǎn)物中的NADH氧化酶活性和可能的內(nèi)源性丙酮酸引起的NADH背景消耗通過對照試驗進行校正。一個單位的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶活性;陂定義為在室溫下每分鐘形成1jumol的NAD+^iZSONr'cm-1;^莓實假單胞菌D-木質(zhì)酸脫水酶的部分基因序列的分離。用于蛋白質(zhì)純化的莓實假單胞菌培養(yǎng)使用包含KH2P04(4.5g)、Na2HP04(4.7g)、NH4Cl(lg)、CaCl2(0.01g)、檸檬酸鐵銨(O.lg)、MgS04(0.25g)和玉米漿(O.lg)的液體培養(yǎng)基(lL)。參見，例如R.Weimberg，丄C/z綴236:629-635(1961)。接種菌的生長通過將莓實假單胞菌單菌落從營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)板引入到包含D-木糖(0.25g)的lOOmL液體培養(yǎng)基中開始。細胞在30。C攪拌條件下培養(yǎng)24h。將所得到的細胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到包含具有10gD-木糖的1L液體培養(yǎng)基的2L發(fā)酵容器中。在30°C、pH6.5條件下以650rpm的攪拌速度進行48h的發(fā)酵罐控制培養(yǎng)。細胞通過在4。C以8000g離心10分鐘而收獲。用于純化來自莓實假單胞菌的D-木質(zhì)酸脫水酶的緩沖液包括緩沖液A:Tris-HCl(50mM,pH8.0)、MgCl2(2.5mM)、二硫蘇糖醇(DTT)(1.0mM)、苯曱基磺酰氟(PMSF)(0.25mM);緩沖液B:Tris-HCl(50mM，pH8.0)、MgCl2(2.5mM)、DTT(1.0mM)、PMSF(0.25mM)、NaCl(500mM);緩沖液C:磷酸鉀(2.5mM,pH8.0)、MgCl2(2.5mM)、69DTT(1.0mM)、PMSF(0.25mM);緩沖液D:磷酸鉀(250mM,pH8.0)、MgCl2(2.5mM)、DTT(1.0mM)、PMSF(0.25mM);緩沖液E:Tris畫HCl(50mM，pH8.0)、MgCl2(2.5mM)、DTT(l.OmM)、PMSF(0.25mM)、(NH4)2S04(1M)。所有蛋白質(zhì)純化操作在4。C完成。在純化過程中監(jiān)測D-木質(zhì)酸脫水酶比活性。將莓實假單胞菌細胞(150g,濕重)重懸于250mL緩沖液A中并用弗氏破碎儀在16,000psi(大約110.3MPa)壓力下通過兩次操作過程進行破碎。細胞碎片通過離心(48000g，20分鐘，4'C)除去。將細胞溶解產(chǎn)物加到用緩沖液A平衡的DEAE柱(5x18cm，裝填二乙氨乙基瓊脂糖樹脂粒)上。該柱用1L緩沖液A清洗，隨后用線性梯度(1.75L+1.75L,緩沖液A/緩沖液B)洗脫。合并包含D-木質(zhì)酸脫水酶的部份并濃縮到100mL。在對緩沖液C(3x1L)進行透析后，將蛋白質(zhì)加載到用緩沖液C平衡的羥磷灰石柱(2.5x35cm)上。該柱用350mL的緩沖液C清洗并用線性梯度(850mL+850mL，緩沖液C/緩沖液D)洗脫。合并含有D-木質(zhì)酸脫水酶的部份并濃縮到30mL。在對緩沖液E(3x300mL)進行透析后，將蛋白質(zhì)溶液加到用緩沖液E平衡的苯基瓊脂糖凝膠柱(2.5x15cm)上。該柱用200mL的緩沖液E清洗，隨后用線性梯度(400mL+400mL,緩沖液E/緩沖液A)洗脫。合并含有I)-木質(zhì)酸脫水酶的部份并濃縮到15mL。在對緩沖液A(3x150mL)進行透析后，將蛋白質(zhì)樣品(15x0.1mL)加載到用緩沖液A平衡的ResourceQ柱(6.4mmx30mm,1mL)(得自AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,U.S.)上。該柱用25mL的緩沖液A和緩沖液B的90:10(v/v)混合物清洗，并用20倍柱體積的緩沖液A中的線性梯度NaCl(50mM至200mM)洗脫。合并含有D-木質(zhì)酸脫水酶的部份并濃縮到0.5mL。在對緩沖液A(3x10mL)進行透析后，酶在液氮中速凍并儲存在大約-80。C。純化D-木質(zhì)酸脫水酶的胰蛋白酶消化、消化產(chǎn)物的HPLC純化和N-末端肽測序由密執(zhí)安州立大學(xué)的大分子結(jié)構(gòu)小組完成。編碼部分莓實假單胞菌D-木質(zhì)酸脫水酶的DNA片段使用下面的引物由莓實假單胞菌的基因組DNA進行擴增5'-CTGGARGAYTGGCARCGYGT(Sl:QIDNO:29)和5'-GTRTARTCYTCRGGRCCYTC(SEQIDN():30)。PCR產(chǎn)物按照制造商的說明(InvitrogenCorp.)克隆到pCRTOP02.1載體中。插入體的DNA序列使用M13正向和M13反向引物確定。N-末端6xHis-標(biāo)記的D-木糖脫氫酶的純化和鑒定。將大腸桿菌DH5a/pWN9.044A和DH5a/pWN9.046A的單菌落分別接種在5mL的含Ap的LB培養(yǎng)基中。接種菌在37。C攪拌條件下培養(yǎng)過夜。細胞隨后轉(zhuǎn)移到500mL的含Ap的LB培養(yǎng)基中并在37。C攪拌條件下生長。當(dāng)接種菌的OD,達到0.4-0.6時，細胞培養(yǎng)物在冰上保持10分鐘。然后將IPTG溶液加入到培養(yǎng)基中達到0.5mM的終濃度。細胞在30。C培養(yǎng)另外的12h,然后通過在4。C以4000g離心5分鐘收獲細胞。將收獲的細月包重懸在含有Tris-HCl(100mM，pH8.0)的重懸緩沖液中。如一般酶學(xué)部分中描述的那樣獲得無細胞的溶胞產(chǎn)物。6xHis-標(biāo)記的D-木糖脫氫酶的純化使用Ni-NTA樹脂按照生產(chǎn)商(Qiagen)提供的方案進4亍。無細胞的溶胞產(chǎn)物(16mL)與4mL的Ni-NTA瓊脂糖樹脂(50%漿(w/v))混合，且混合物在4。C攪拌1小時。然后將溶胞產(chǎn)物樹脂漿轉(zhuǎn)移到聚丙烯柱上，且該柱用含有Tris-HCl(100mM,pH8.0)、咪唑(20mM)和NaC1(300mM)的清洗緩沖液(2x16mL)清洗。6xHis-標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過用含有Tris-HCl(100mM，pH8,0)、咪唑(250mM)和NaC1(300mM)的洗脫緩沖液(2x4mL)清洗而從柱上洗脫。洗脫的蛋白質(zhì)溶液對細胞重懸緩沖液進行透析以除去咪唑和NaCl。蛋白質(zhì)樣品使用SDS-PAGE進行分析。D-木糖脫氫酶的pH依賴性使用下面的緩沖液中的一種在33°C下在pH4.4和pH9.0之間測量乙酸鹽(100mM，pH4.4-5.6)、bis-Tris(100mM,pH5.6-7.5)或Tris-HCl(100mM，pH7.5-9.0)。酶的底物特異性在含有NAD+(2.5mM)和碳水化合物(50mM)的Tris-HCl緩沖液(10071mM,pH8.3)中在33。C進行測試。D-木糖脫氫酶的Km和kcat值通過使用非線性回歸算法(Prism4，GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CA，U.S.)分析試驗數(shù)據(jù)而獲得。大腸桿菌的隨機誘變。大腸桿菌菌抹W3110的體外轉(zhuǎn)座子誘變利用EZ::TN<R6K，〃7KAN-2>TnpTransposome試劑盒(Epicentre)按照生產(chǎn)商提供的方案進行。EZ:TNTM<R6K"n7KAN-2>transposon-EZ:TNTM轉(zhuǎn)座酶復(fù)合體通過電穿孔引入到感受態(tài)(electrocompetent)大腸桿菌W3110中。將電穿孔的細胞接種在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板上以選擇具有插入到染色體中的轉(zhuǎn)座子的突變體。在這些選擇培養(yǎng)板上生長的菌落進一步劃線作為餅板(pieplate)。對來自這些餅板的單菌落進行表型分析。從具有需要的表型的W3110分離的基因組DNA使用EcoRI或A層1II消化。內(nèi)含EZ::TNtm〈R6Kyori/KAN-2〉轉(zhuǎn)座子的染色體區(qū)域通過用消化的基因組DNA的自連接混合物電穿孔大腸桿菌TransforMaxECIOOD/zV+感受態(tài)細胞(Epicentre)援救。側(cè)鄰轉(zhuǎn)座子元件的基因組DNA的核苷酸序列通過對從含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板上回收的轉(zhuǎn)化抹分離的質(zhì)粒進行測序而確定。DNA測序試驗利用生產(chǎn)商(Epicentre)提供的引物。j;y/^/和j;agf基因的位點特異性誘變。大腸桿菌W3110中^7//和基因的破壞利用先前描述的染色體修飾方法。參見，K.A.Datsenko&B丄.Wanner,尸roc.M3".爿cadt/&497:6640-6645(2000)。在這一方法中，包含編碼噬菌體入紅色同源重組機構(gòu)的質(zhì)粒的大腸桿菌菌抹，通過使用與目標(biāo)基因同源的引物和攜帶FLP識別靶(FRT)位點側(cè)鄰的抗生素抗性基因的模板質(zhì)粒擴增的線性DNA片段轉(zhuǎn)化。用于破壞力/z//基因的DNA片段使用下面的引物從模板pKD3擴增GTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQIDNO:31)和TATGAATATCCTCCTTAGT(SEQIDNO:32)。用于破壞基因的DNA片段使用下面的引物從模板pKD4擴增AATATCCTCCTTAGT(SEQIDNO:33)和GCTGGAGCTGCTTCG(SEQIDNO:34)。PCR片段用D/"I消化并通過電泳純化。純化的DNA片段通過電穿孔分別引入到大腸桿菌W3110/pKD46中。在染色體上含有"7zT/::CmR的候選大腸桿菌WN3在含有氯霉素的LB培養(yǎng)板上選擇。在染色體上含有少"g五::KanK的候選大腸桿菌WN4在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)板上選擇。候選菌林的正確基因型使用PCR進行驗證。大腸桿菌WN5通過j^g^::Kar/經(jīng)Pl噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見J.H.Miller，同上)到WN3的基因組中而產(chǎn)生。從大腸桿菌WN5的染色體中除去抗生素抗性基因按照先前描述的方法進行。參見，K.A.Datsenko&B丄.Wanner,尸rac.7Va〃.Jcat/.tAS^97:6640-6645(2000)。所獲得的菌4朱命名為WN6。合成D-l，2，4-丁三醇的大腸桿菌宿主菌抹的構(gòu)建。大腸桿菌W3110",^和WN7按照先前描述的方法(K,Li等.，5/o&c/mo/.5/oe"g.64:61-73(l"9))分別從菌4朱W3110和WN6產(chǎn)生。大腸桿菌W3110j9^^:U/z-CmR按照與菌抹WN3和WN4的構(gòu)建相同的過程構(gòu)建。用于染色體置換的DNA片段使用下面的引物從質(zhì)粒pWN9.068A擴增CAGCCATCTATCCC(SEQIDNO:35)和TATCCTCCTTAGT(SEQIDNO:36)。候選菌抹W3110"/z!5:U/2-CmR在含有氯霉素的LB培養(yǎng)板上選擇。大腸桿菌WN3通過xy/^S:U/z-CmR經(jīng)Pl噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見J.H.Miller，同上)到WN7的基因組中而產(chǎn)生。發(fā)酵罐控制培養(yǎng)條件。發(fā)酵采用2.0L工作容量的B.BraunM2培養(yǎng)容器。通過DCU-3控制的B.BraunBiostatMD提供功能。數(shù)據(jù)收集采用裝有B.BraunMFCS/Win軟件(vl.l)的DellOptiplexGs+5166M個人計算機(PC)。溫度、pH和葡萄糖進料用PID控制回路控制。所有發(fā)酵維持33。C的溫度。pH通過加入濃NH40H或2NH2S04而維持在7.0。溶解氧(D,O.)使用配備IngoldA型02滲透膜的Mettler-Toledo12mm可消毒式02傳感器測量。D.O.維持在10%空氣飽和度。發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始葡萄糖濃度為23.5g/L。接種從瓊脂培養(yǎng)板挑取的單菌落引入5mL的M9培養(yǎng)基中開始。培養(yǎng)物在37。C和250rpm攪拌條件下生長直到它們變混濁(大約24h),隨后轉(zhuǎn)移到100mL的M9培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在37。C和250rpm下生長另外的1011。然后將接種菌(00600=1.0-3.0)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵容器中并開始批發(fā)酵(t-0h)。在發(fā)酵過程中下使用三階段方法將D.O.濃度維持在10%空氣飽和度。使用初始設(shè)置為0.06L/L/min的空氣流，通過將攪拌速度從50rpm的初始設(shè)置點增加到預(yù)設(shè)的最大值940rpm維持D.O.濃度。使攪拌速度恒定在940rpm，然后質(zhì)量流控制器通過將空氣流速從0.06L/L/min增加到預(yù)設(shè)的最大值1.0L/L/min來維持D.O.濃度。在恒定的攪拌速度和恒定的空氣流速下，D.O.濃度最終通過氧傳感器控制的葡萄糖進料在剩下的發(fā)酵中保持在10%空氣飽和度。在該階段開始時，由于培養(yǎng)基中殘留的初始葡萄糖導(dǎo)致D.O.濃度落在10%空氣飽和度以下。這一過程在葡萄糖(65%w/v)進料開始以前持續(xù)大約IO分鐘至30分鐘。葡萄糖進料PID控制參數(shù)對于微分控制(To)設(shè)置為0.0s(關(guān)閉)，對于積分控制(T,)設(shè)置為999.9s(最小控制作用)。Xp設(shè)置為950%以獲得O.l的Kc。IPTG原液(l.OmL)在18h加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。D-木糖或D-木質(zhì)酸鉀的溶液在24h、30h、36h和42h加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。按照所示的時間間隔采集發(fā)酵液的樣品(5-10mL)。通過用水稀釋發(fā)酵液(1:100)隨后測量OD600測定細胞密度。使用0.43g/L/OD600的轉(zhuǎn)換系數(shù)計算大腸桿菌細胞的干細胞重量(g/L)。剩余的發(fā)酵液進行離心以獲得無細胞發(fā)酵液。細胞團用于酶分析。代謝物鑒定。對于1，2，4-丁三醇的生物合成，1,2，4-丁三醇在無細胞發(fā)酵液中的濃度按照W.Niu等，/C7z綴Soc.125:12998-12999(2003)的方法通過GC分析進行定量。無細胞發(fā)酵液中其它分子的濃度通過'IINMR進行定量。將溶液減壓濃縮至干，再一次由020減壓濃縮至干，然后重新溶解于含已知濃度的3-(三曱硅烷基)-丙-2,2,3,3-d4酸鈉鹽(TSP，LancasterSynthesisInc.)的D20中。所有'HNMRi普在VarianVXR-500FT-NMR能語儀(500MHz)上記錄?；衔锿ㄟ^使用以下共振的'HNMR進行定量o-木質(zhì)酸(54.08,d，1H);3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸(54.58,m,1H)。為鑒別發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物合成副產(chǎn)物，首先將無細胞的發(fā)酵液加到Dowex-1X4樹脂(C廣型)上。在用三倍柱體積的水清洗之后，柱子用十倍柱體積的0.1MHC1洗脫。合并流過和清洗的部份并進一步加到Dowex-50X8樹脂(H+型)上。在用三倍柱體積的水清洗之后，柱子用十倍柱體積的1MHC1洗脫。對純化獲得的部份進行中和并用'HNMR進行分析。通過將純化樣品的'HNMR譜與基準(zhǔn)試樣的'HNMR譜進行對比完成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸和D-3，4-二羥基丁酸的鑒別。為鑒別其它分子，采用以下的NMR數(shù)據(jù)3-脫氧-D-甘油-戊酸，NMR(D20,500MHz，TSP,5=0ppm)，54.12(dd,J=4,8Hz,1H),3.91(m,1H),3.67(dd，J=3,12Hz,1H)，3.54(dd，J=6，12Hz,1H),1.94(ddd，./=1,4，14Hz,1H),1.76(ddd,J=1,8，15Hz，1H);(4S)2-氨基-4,5-二羥基戊酸，NMR(D20,500MHz,TSP,5=0ppm)，54.01(dd，J=5，6Hz,1H),3.89(m,1H),3.64(dd,J=4,12Hz,1H)，3.55(dd，J二6，12Hz,1H)，2.04(dd，J=5，7Hz,2H)。宿主細胞醇脫氫酶活性的鑒定。進行篩選候選的大腸桿菌醇脫氫酶的嘗試以確認哪一個具有將3，4-二羥基-1)-丁醛還原成D-l,2,4-丁三醇的最高活性(表4)。這些嘗試導(dǎo)致AdhP(例如，SEQIDNO:38，由SHQIDNO:37編碼)的鑒別。表4.用于還原3,4-二羥基-D-丁醛的大腸桿菌脫氫酶的篩選<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>為進一步鑒定AdhP的作用，例如確定是否它是在合成D-l,2，4-丁三醇的大腸桿菌構(gòu)建體中負責(zé)3,4-二羥基-D-丁醛還原的唯一脫氫酶，刪除KITIO中的^//z尸基因(表5)并評價這一刪除對D-l，2，4-丁三醇生物合成的影響(表6)。表5中下劃線表示宿主細胞基因型的變化。表5.用于評價^//z尸滅活和D-l，2,4-丁三醇生物合成的菌抹構(gòu)建體基因型WN3/pWN7.126B大腸桿菌W3110化MA力A^AWN10/pWN7.126B大腸桿菌W3110w"A;^//A表6.fl^P滅活對D-l,2,4-丁三醇生物合成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>這些測試表明，在刪除a函尸后D-l，2,4-丁三醇的形成減少(表6)且3，4-二羥基-D-丁酸與D-l,2,4-丁三醇的比值增大(表6)。這些試驗確認，在合成D-l，2,4-丁三醇的大腸桿菌構(gòu)建體中ac/Zz尸很可能在3，4-二羥基-D-丁醛的還原中發(fā)揮作用，但ai尸不是唯一參與這一還原反應(yīng)的脫氫酶，因為其它酶表現(xiàn)出較低水平的相同活性。AdhP醇脫氫酶過度表達的效應(yīng)。為了驗證是否AdhP過度表達可以降低3,4-二羥基-D-丁酸的量并增加D-l，2，4-丁三醇的量，使用啟動子之后的的質(zhì)粒定位表達(大腸桿菌WN13/pML6.195，表7)或者啟動子之后ad/z尸的染色體組插入(大腸桿菌KIT4/pWN7.126B,表7)進行分析。按照圖7中圖示的方案進行基因組插入。表7中的下劃線顯示宿主細胞基因型的改變。表7.用于評價"函尸過度表達和D-1,2,4-丁三醇生物合成的菌抹<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>結(jié)果示于表8中。這些結(jié)果表明基因組插入是最成功的策略(表8)。表8.ad/z尸過度表達對D-l,2，4-丁三醇生物合成的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>在新型丁三醇生物合成途徑中滅活竟?fàn)庩P(guān)鍵中間體的酶的效果。推測中間體3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸還原成副產(chǎn)物3-脫氧-D-甘油-戊酸是造成通過本發(fā)明的新途徑合成的D-l，2，4-丁三醇產(chǎn)率和濃度降低的原因。參見圖5d中的反應(yīng)(e)。兩種2-酮酸脫氫酶，YiaE(SEQIDNO:40，由SEQIDNO:39編碼)和YcdW(SEQIDNO:42，由SEQIDNO:41編碼)，已經(jīng)確認為催化3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸的這一還原。為確定是否可以獲得丁三醇產(chǎn)率的提高，進行了聲"￡和>^/『的基因組滅活(大腸桿菌KIT18/pWN7.126B,表9)。表9.用于評價少&￡和jc^r敲除對D-1，2,4-丁三醇生物合成的影響的菌才朱構(gòu)建體基因型WN13/pWN7.126B大腸桿菌W3110"MA^'/7〃A大腸桿菌W3110化MA;^HAKIT18/pWN7.126Bvag^xv/^S::x<i/z-a(i/z尸-尸,?！竄lWa五^通過監(jiān)測副產(chǎn)物形成確定從D-木糖生物合成D-l，2,4-丁三醇(表10)。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>這一數(shù)據(jù)顯示，基因滅活降低了副產(chǎn)物3-脫氧-D-甘油-戊酸的濃度并提高了生物合成的D-l，2,4-丁三醇的濃度和產(chǎn)率。也觀察到大腸桿菌KIT18/pWN7.126B比大腸桿菌WN13/pWN7.126B繼續(xù)生長更長的一段時間。這允許加入和消耗較大量的D-木糖(50g對30g,表10),其導(dǎo)致D-l，2,4-丁三醇濃度的顯著的提高。增加加入到大腸桿菌KIT18/pWN7.126B培養(yǎng)物中的D-木糖的量也導(dǎo)致生物合成的D-l,2，4-丁三醇相對于3,4-二羥基-D-丁酸的比值顯著提高(表10)。總之，這些結(jié)果顯示通過本發(fā)明的新途徑的丁三醇生物合成通過添加利用3，4-二羥基-D-丁醛的醇脫氫酶的第二拷貝，優(yōu)選第二基因組拷貝或多個拷貝，如W/z尸(或"函￡或>^7),而得到提高。另外，這些結(jié)果顯示，2-酮酸脫氫酶活性的滅活，例如通過滅活yiaE和ycdW，獨立地提高了丁三醇產(chǎn)量。當(dāng)進行組合時，這兩種增加的因素在由D-木糖生物合成的D-1，2，4-丁三醇濃度上提供了令人驚異的80%的增加。序列表的自由文字真菌伯克霍爾德菌LB400RBU11704木糖脫氫酶的編碼序列新月柄桿菌CB15RCO01012木糖脫氫酶的編碼序列大腸桿菌yjhG木質(zhì)酸脫水酶的編碼序列大腸桿菌yagF木質(zhì)酸脫水酶的編碼序列莓實假單胞菌ATCC4973木質(zhì)酸脫水酶片段的編碼序列n為a、c、g或t大腸桿菌yjhH3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶的編碼序列推定的起始密碼子替代的起始密碼子大腸桿菌yjhH3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽的替代編碼序列推定的起始子Met大腸桿菌yjhH3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽替代的大腸桿菌yjhH3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽^奪代的起始子Met大腸桿菌yagE3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶的編碼序列真菌伯克霍爾德菌LB400D-木糖脫氫酶基因(RBU11704)的正向擴增引物真菌伯克霍爾德菌LB400D-木糖脫氫酶基因(RBU11704)的反向擴增引物新月柄桿菌CB15D-木糖脫氫酶基因(RCO01012)的正向擴增引物新月柄桿菌CB15D-木糖脫氫酶基因(RCO01012)的反向擴增引物大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(yjhG)的正向擴增引物大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(yjhG)的反向擴增引物大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(yagF)的正向擴增引物大腸桿菌W3110D-木質(zhì)酸脫水酶基因(yagF)的反向擴增引物大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yjhH)的正向擴增引物81大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yjhH)的反向擴增引物大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yagE)的正向擴增引物大腸桿菌W31103-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yagE)的反向擴增引物用于構(gòu)建質(zhì)粒pWN9.068A的新月柄桿菌CB15D-木糖脫氫酶基因的正向擴增引物用于構(gòu)建質(zhì)粒pWN9.068A的新月柄桿菌CB15D-木糖脫氫酶基因的反向擴增引物莓實假單胞菌木質(zhì)酸脫水酶基因的正向擴增引物莓實假單胞菌木質(zhì)酸脫水酶基因的反向擴增引物用于破壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yjhH)的DNA片段的正向擴增引物用于破壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yjhll)的DNA片段的反向擴增引物用于破壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yagl。的DNA片段的正向擴增引物用于破壞大腸桿菌基因組3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因(yagE)的DNA片段的反向擴增引物用于將xdh插入大腸桿菌基因組DNA中的DNA片段的正向擴增引物用于將xdh插入大腸桿菌基因組DNA中的DNA片段的反向擴增引物來自GenBankU00096的大腸桿菌AdhP醇脫氫酶的編碼序列IIJBMEC1.1.1.1的AdhPl-丙醇優(yōu)先的、含兩個鋅離子的醇脫氬酶(GenBank登錄號AAC74551)H24-V131構(gòu)成屬于PfamA登錄號PF08240的醇脫氬酶GroES樣82與催化鋅離子結(jié)合的保守CysG57-V71構(gòu)成劃分在共有模式為"G-H-E-x-{EL}-G-(AP)-x(4)-[GA]-x(2)-[IVSAC]"的ProSite登錄號PS00059下的含辭酉f脫氛酵特征域(signaturedomain)與催化鋅離子結(jié)合的保守His與第二鋅離子結(jié)合的保守Cys與第二鋅離子結(jié)合的保守Cys與第二鋅離子結(jié)合的保守Cys與第二鋅離子結(jié)合的保守Cys與催化鋅離子結(jié)合的保守CysP161-E299構(gòu)成屬于PfamA登錄號PF00107的鋅結(jié)合醇脫氫酶域G172-L260構(gòu)成屬于"SAM(及某些其它核普酸)結(jié)合基序"的ProSite登錄號PS50193的核苷酸結(jié)合基序來自GenBankAE005174的大腸桿菌yiaE2-酮酸脫氫酶的編碼序列YiaE2-酮酸脫氫酶(GenBank登錄號AAG58702)來自GenBankAP009048的大腸桿菌ycdW2-酮酸脫氬酶的編碼序列YcdW2-酮酸脫氫酶(GenBank登錄號BAA35814)來自GenBankAY143338的惡臭假單胞菌mdlC2-酮酸脫羧酶的編碼序列MdlC2-酮酸脫羧酶(GenBank登錄號AAC15502)權(quán)利要求1、一種制備D-1，2，4-丁三醇的方法，包括(A)提供(1)包含1，2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶、(c)2-酮酸脫羧酶和(d)醇脫氫酶，其中所述細胞體是經(jīng)操作使(e)3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽或其核酸、(f)2-酮酸脫氫酶多肽或其核酸或者(g)同時(e)和(f)受到抑制或滅活的細胞體；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1，2，4-丁三醇的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生1，2，4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行從而制備D-1，2，4-丁三醇(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3，4-二羥基-D-丁醛，和(4)所述醇脫氫酶將所得的3，4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-1，2，4-丁三醇。2、一種制備D-l,2，4-丁三醇的方法，包括(A)提供(1)包含1,2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或者具有D-木糖脫氫酶活性的SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶、(c)2-酮酸脫羧酶和(d)醇脫氫酶；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1，2,4-丁三醇的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生1,2,4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，醇(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-D-丁醛，和(4)所述醇脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l，2，4-丁三醇。3、一種制備D-l,2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(1)包含1,2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氬酶，(b)D-木質(zhì)酸脫水酶，包含(i)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(ii)莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:IO的多肽，(c)2-酮酸脫羧酶，和(d)醇脫氫酶；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1,2，4-丁三醇的條件下能夠向D-木糖脫氬酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生1,2,4-丁三醇和其中木糖源向D-木糖脫氬酶提供D-木糖的條件下，(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-D-丁醛，和(4)所述醇脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l，2,4-丁三醇。4、一種制備D-1,2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(1)包含1,2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶，包含(i)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(ii)莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:IO的多肽，(b)2-酮酸脫羧酶，和(c)醇脫氫酶；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1,2,4-丁三醇的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生1,2,4-丁三醇和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)D-l，2,4-丁三醇:(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(2)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-D-丁醛，和(3)所述醇脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l，2,4-丁三醇。5、一種制備D-l，2,4-丁三醇的方法，包括(A)提供(1)包含1，2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶，(b)2-酮酸脫羧酶和(c)醇脫氫酶，其中所述細胞體是經(jīng)操作使(d)3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶多肽或其核酸、(e)2-酮酸脫氫酶多肽或其核酸或者(f)同時(d)和(e)受到抑制或滅活的細力包體；和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生1,2,4-丁三醇的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生1，2，4-丁三醇和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)D-l,2,4-丁三醇:(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(2)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3，4-二羥基-D-丁醛，和(3)所述醇脫氫酶將所得的3，4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-l，2，4-丁三醇。6、根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中，所述重組細胞體包括包含所述酶系統(tǒng)的單細胞。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述細胞是微生物細胞或才直物細月包。8、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述木糖源包含D-木糖。9、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述木糖源包括可以在所述條件下由其同化合成D-木糖的碳源。10、根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述木糖源包括可以在所述條件下由其水解得到D-木糖殘基的含D-木糖殘基的聚合物。11、根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中，所述方法進一步包括回收由此制備的D-l,2,4-丁三醇的步驟。12、按照權(quán)利要求1-5任一項所述的方法制備的D-l，2，4-丁三醇。13、一種制備1,2,4-丁三醇三硝酸酯的方法，包括(A)提供按照權(quán)利要求1-5任一項所述的方法制備的D-1，2,4-丁三醇和硝化劑，及(B)使所述D-lJ,4-丁三醇與硝化劑在所述硝化劑可以硝化D-1，2，4-丁三醇的條件下接觸，由此制備1,2,4-丁三醇三硝酸酯。14、按照權(quán)利要求13所述的方法制備的D-l，2，4-丁三醇三硝酸酯。15、一種D-木糖脫氫酶，其包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、或者具有D-木糖脫氫酶活性的SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的D-木糖脫氫酶在D-l，2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)中的用途。17、編碼權(quán)利要求15所述的D-木糖脫氫酶的核酸。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、或者SEQIDNO:l或SEQIDNO:3的同源多核苷酸中任一項的堿基序列。19、根據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸，其中，所述核酸是多核苷酸載體。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸，其中，所述載體是質(zhì)粒。21、一種包含以下任一的氨基酸序列的D-木質(zhì)酸脫水酶SEQIDNO:6;SEQIDNO:8;SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽；包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽的莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶、或者莓實假單胞菌D-木質(zhì)酸脫水酶氨基酸序列的保守置換變異體或同源多肽。22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的D-木質(zhì)酸脫水酶在D-l，2，4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)中的用途。23、編碼權(quán)利要求21所述的D-木質(zhì)酸脫水酶的核酸。24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或者SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的同源多核苷酸任一項的堿基序列。25、根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸，其中，所述核酸是多核苷酸載體。26、根據(jù)權(quán)利要求25所述的核酸，其中，所述載體是質(zhì)粒。27、一種分離的或重組的1，2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)，包括(A)包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或者具有D-木糖脫氬酶活性的SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列的D-木糖脫氫酶，(B)D-木質(zhì)酸脫水酶，(C)2-酮酸脫羧酶，和CD)醇脫氫酶，該酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成D-l，2,4-丁三醇。28、一種分離的或重組的1，2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)D-木糖脫氫酶，(B)D-木質(zhì)酸脫水酶，包含(1)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(2)莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽，(C)2-酮酸脫羧酶，和(D)醇脫氫酶，該酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成D-l,2，4-丁三醇。29、一種分離的或重組的1,2,4-丁三醇生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)D-木質(zhì)酸脫水酶，包含(1)SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或者具有D-木質(zhì)酸脫水酶活性的SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的保守置換變異體或同源多肽中任一的氨基酸序列，或者(2)莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶或者其保守置換的變異體或同源多肽的氨基酸序列，該酶包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:IO的多肽，(B)2-酮酸脫羧酶，和(C)醇脫氫酶，該酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成D-l，2,4-丁三醇。30、一種重組細胞體，其包含權(quán)利要求27-29任一項所述的酶系統(tǒng)。31、根據(jù)權(quán)利要求30所述的重組細胞體，其中，所述細胞體包括含有所述酶系統(tǒng)的單細胞。32、根據(jù)權(quán)利要求31所述的重組細胞體，其中，所述細胞是重組的DgPu—細胞。33、一種3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶敲除載體，包含具有SEQII)NO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:11的nt55畫319中任一的堿基序列的多核苷酸，其中所述載體能夠以使3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因或其編碼的醛縮酶失活的方式插入3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶基因的基因組拷貝中或與其重組。34、一種重組細胞，其為DgPif(3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸醛縮酶"缺失")、或KAD—(2-酮酸脫氫酶"缺失")、或同時DgPiT和KAD一表型。35、一種制備3-脫氧-D-甘油-戊酸的方法，包括(A)提供(1)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氬酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶和(c)2-酮酸還原酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-戊酸的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生3-脫氧-I)-甘油-戊酸和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的-D-甘油-戊酸(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(3)所述2-酮酸脫氫酶(還原酶)將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸。36、一種制備3-脫氧-D-甘油-戊酸的方法，包括(A)提供(1)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶和(b)2-酮酸還原酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-戊酸的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生3-脫氧-D-甘油-戊酸和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行從而制備3-脫氧-D-甘油-戊酸(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(2)所述2-酮酸脫氫酶(還原酶)將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸。37、按照權(quán)利要求35或36所述的方法制備的3-脫氧-D-甘油-戊酸。38、一種制備D-3，4-二羥基-丁酸的方法，包括(A)提供(1)包含D-3，4-二羥基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶、(c)2-酮酸脫羧酶和(d)醛脫氫酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生D-3,4-二羥基-丁酸的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生D-3，4-二羥基-丁酸和其中木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行從而制備D-3,4-二羥基-丁酸(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，(3)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3，4-二羥基-D-丁醛，和(4)所述醛脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-3，4-二羥基-丁酸。39、一種制備D-3,4-二羥基-丁酸的方法，包括(A)提供(1)包含D-3，4-二鞋基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶、(b)2-酮酸脫羧酶和(c)醛脫氫酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生D-3，4-二羥基-丁酸的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生D-3，4-二羥基-丁酸和其中木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運從而制備D-3，4-二羥基-丁酸(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(2)所述2-酮酸脫羧酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成3,4-二羥基-D-丁醛，和(3)所述醛脫氫酶將所得的3,4-二羥基-D-丁醛轉(zhuǎn)化成D-3，4-二羥基-丁酸。40、按照權(quán)利要求38或39任一項所述的方法制備的D-3,4-二羥基-丁酸。41、一種制備(45>2-氨基-4，5-二羥基戊酸的方法，包括(A)提供(1)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木糖脫氫酶、(b)D-木質(zhì)酸脫水酶和(c)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生(45>2-氨基-4，5-二羥基戊酸的條件下能夠向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的木糖源；及(B)將所述細胞體和木糖源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木糖產(chǎn)生(45>2-氨基-4，5-二羥基戊酸和其中所述木糖源向D-木糖脫氫酶提供D-木糖的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行從而制備(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸(1)所述D-木糖脫氫酶將D-木糖轉(zhuǎn)化成D-木質(zhì)酸，(2)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將所得的D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(3)所述2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸。42、一種制備(45>2-氨基-4,5-二羥基戊酸的方法，包括(A)提供(1)包含3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)的重組細胞體，所述酶系統(tǒng)包含(a)D-木質(zhì)酸脫水酶和(b)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，和(2)在所述酶系統(tǒng)可運行以產(chǎn)生(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸的條件下能夠向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的木質(zhì)酸源；及(B)將所述細胞體和木質(zhì)酸源置于其中所述酶系統(tǒng)可以從D-木質(zhì)酸產(chǎn)生(45>2-氨基-4，5-二羥基戊酸和其中所述木質(zhì)酸源向D-木質(zhì)酸脫水酶提供D-木質(zhì)酸的條件下，所述酶系統(tǒng)在所述條件下通過以下作用運行從而制備(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸(1)所述D-木質(zhì)酸脫水酶將D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸，和(2)所述2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶將所得的3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸轉(zhuǎn)化成(45)-2-氨基-4,5-二羥基戊酸。43、按照權(quán)利要求41或42任一項所述的方法制備的(4S)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸。44、根據(jù)權(quán)利要求35、36、38、39、41或42任一項所述的方法，其中，所述重組細胞體包括含有所述酶系統(tǒng)的單細胞。45、根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述細胞是重組的DgPu一細胞。46、一種分離的或重組的3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)D-木糖脫氫酶、(B)D-木質(zhì)酸脫水酶和(C)2-酮酸還原酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸。47、一種分離的或重組的3-脫氧-D-甘油-戊酸生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)D-木質(zhì)酸脫水酶和(C)2-酮酸還原酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成3-脫氧-D-甘油-戊酸。48、一種分離的或重組的D-3，4-二羥基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)D-木糖脫氬酶、(B)D-木質(zhì)酸脫水酶、(C)1酮酸脫羧酶和(D)醛脫氫酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成D-3，4-二羥基-丁酸。49、一種分離的或重組的D-3,4-二羥基-丁酸生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)D-木質(zhì)酸脫水酶、(B)2-酮酸脫羧酶和(C)醛脫氫酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成D-3,4-二羥基-丁酸。50、一種分離的或重組的(45)-2-氨基-4，5-二羥基戊酸生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)D-木糖脫氫酶、(B)D-木質(zhì)酸脫水酶和(C)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木糖轉(zhuǎn)化成(4S)-2-氨基-4,5-二羥基戊51、一種分離的或重組的(45>2-氨基-4,5-二羥基戊酸生物合成酶系統(tǒng)，包含(A)I)-木質(zhì)酸脫水酶和(B)2-酮酸轉(zhuǎn)氨酶，所述酶系統(tǒng)能夠催化D-木質(zhì)酸轉(zhuǎn)化成(4Q-2-氨基-4，5-二羥基戊酸。52、包含權(quán)利要求46-51任一項的酶系統(tǒng)的重組細胞體。53、根據(jù)權(quán)利要求52所述的重組細胞體，其中，所述細胞體包括含有所述酶系統(tǒng)的單細胞。54、根據(jù)權(quán)利要求53所述的重組細胞體，其中，所述細胞為重組的DgPu—細胞。55、一種篩選候選的酶編碼多核苷酸的方法，包括(A)提供(1)包含與編碼酶多肽的編碼序列大約20個或更多相連核苷酸相同的核堿基序列的核酸或核酸類似物探針，所述酶多肽具有以下任一氨基酸序列(a)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或(b)SF,QIDNO:12的19-319位殘基的氨基酸序列,或(c)包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽的莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶的氨基酸序列，或(d)保持生物催化活性的上述(a)、(b)或(c)中任一項的保守置換變異體的氨基酸序列或同源氨基酸序列；和種靶多核苷酸的測試樣品；(B)使所述探針與測試樣品在探針可以特異性地與存在的靶多核苷酸雜交的條件下接觸以形成探針-靶多核苷酸復(fù)合物，及(C)檢測是否由此形成任何探針-靶多核苷酸復(fù)合物，其中被確認為復(fù)合物一部分的多核苷酸因此被鑒別為候選酶編碼多核苷酸。56、一種對以下物質(zhì)的表位具有特異性的抗體(A)具有以下任一氨基酸序列的酶多肽(1)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12或14任一的氨基酸序列，或(2)SEQIDNO:12的19-319位殘基的氨基酸序列，或(3)包含具有大約430+殘基的推定長度、大約60kDa的近似MW和C-末端部分在近末端部包含氨基酸序列SEQIDNO:10的多肽的莓實假單胞菌(ATCC4973)D-木質(zhì)酸脫水酶的氨基酸序列，或(4)保持生物催化活性的上述(l)、(2)或(3)中任一項的保守置換變異體的氨基酸序列或同源氨基酸序列；或者(B)具有編碼這種酶多肽(A)的堿基序列的多核苷酸或核酸類似物。57、根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其中所述醇脫氫酶活性由至少兩個可表達的編碼AdhP的核酸單元表達。全文摘要本發(fā)明涉及改良的酶系統(tǒng)、重組細胞及采用該細胞生產(chǎn)生物合成的D-1，2，4-丁三醇的方法、由此制備的D-1，2，4-丁三醇及其衍生物、由其制備的D-1，2，4-丁三醇三硝酸酯以及可用于該酶系統(tǒng)和重組細胞中的酶和基因。文檔編號C12P7/18GK101512004SQ200780032753公開日2009年8月19日申請日期2007年7月19日優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日發(fā)明者J·W·佛羅斯特,W·牛申請人:密歇根州州立大學(xué)托管委員會