專利名稱：：生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，和使用CHO細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)重組生物藥物產(chǎn)品的方法。本發(fā)明也涉及重組CHO細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
：中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是用于生產(chǎn)藥用重組蛋白質(zhì)的最廣泛使用的細(xì)胞系，而且涉及CHO變體的方法占大量年收入(Andersen和Krummen,2002)。盡管缺少完全測序的基因組，已經(jīng)使用非-CHO陣列(Baik等人，2006)或?qū)Ｓ械腃HOcDNA陣列(Wong等人，2006)進(jìn)行了許多重要的CHO轉(zhuǎn)錄特性研究。這些研究已經(jīng)描述了在CHO培養(yǎng)過程中低溫和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。類似地，許多蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)研究了CHO的蛋白質(zhì)組和培養(yǎng)條件例如溫度引起的蛋白質(zhì)表達(dá)的變化(Baik等人，2006;Champion等人，1999;VanDyk等人2003;Kaufmann等人，1999;Lee等人，2003)。這些研究已經(jīng)增加了對CHO功能的調(diào)節(jié)的總體理解，特別是對于降溫效應(yīng)。已經(jīng)證實(shí)，重組生產(chǎn)CHO細(xì)胞系的低溫培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的生存力和增加的比生產(chǎn)力(Al-Fageeh等人，2006;Fogolin等人，2004;Furukawa和Ohsuye,1998;Kaufmann等人，1999)，同時(shí)維持產(chǎn)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Fogolin等人，2005;Yoon等人，2003b)。降低培養(yǎng)溫度的最明顯的結(jié)果是生長速率的立即降低，其它效應(yīng)包括降低的代謝(葡萄糖消耗，氧攝入，乳酸&銨生成)和增加的對剪切力和細(xì)胞凋亡的抗性(Chuppa等人，1997;Furukawa和Ohsuye，1998;Moore等人，1997;Yoon等人，2003a)。生長速率的降低與在細(xì)胞周期的Gl期的細(xì)胞的積累有關(guān)(Hendrick等人，2001;Kaufmann等人，1999;Yoon等人，2003a，b)，并且，已經(jīng)將G1期停滯與增加的生產(chǎn)力相關(guān)聯(lián)(Fussenegger,2001)。由于上面列出的原因，許多細(xì)胞培養(yǎng)方法釆用雙階段培養(yǎng)，通過使細(xì)胞在37'C生長，以使生物量最大化，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)至低溫，以促進(jìn)蛋白質(zhì)生產(chǎn)，同時(shí)維持更長的且更有活力的靜止/生產(chǎn)期(Fogolin等人，2004,2005;Butler，2005;Fox等人，2004)。兩種在變溫后誘導(dǎo)的最熟知的蛋白質(zhì)是冷誘導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)(CRIP)和RMB3。其中，已知CRIP會(huì)在低溫條件下造成生長停滯(Danno等人，2000;Nishiyama等人，1997,Sonna等人，2002)。但是，總體而言，關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞如何對低溫作出響應(yīng)知之甚少。miRNAs是在翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小的(22個(gè)核苷酸)非編碼的RNAs(ncRNAs)。每個(gè)miRNA表面上調(diào)節(jié)多個(gè)基因，預(yù)期在哺乳動(dòng)物中存在數(shù)百個(gè)miRNA基因(Lim等人2003)。1993年在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA(Lee等人，1993)，近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，存在巨大數(shù)量的這種分子(高達(dá)2%的人基因組編碼miRNAs(Miska，2005))。最近，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs對于發(fā)育(Ambros，2003;Chen等人，2004)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡(Brennecke等人2003)、細(xì)胞凋亡和脂肪代謝(Xu等人2003)和細(xì)胞分化(Chang等人2004)而言是至關(guān)重要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)，即某些miRNA分子在哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞的生長周期的不同階段表達(dá)不同。因此，本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞的修飾，以適當(dāng)?shù)默F(xiàn)有方式增加或降低特定miRNA的水平(即如表l所示)，以調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)物的生長。在一個(gè)實(shí)施方案中，促進(jìn)miRNA的表達(dá)，以促進(jìn)細(xì)胞停滯。細(xì)胞停滯與細(xì)胞周期的G1(生長停滯)期的細(xì)胞積累有關(guān)，且這與增加的生產(chǎn)率相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)不同的、但是有關(guān)的實(shí)施方案中，促進(jìn)在培養(yǎng)初期的特定miRNA的抑制或阻抑，從而在生長停滯前促進(jìn)生物量生成。這具有在更短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生增加的細(xì)胞工作原料的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在開始時(shí)促進(jìn)在培養(yǎng)初期的特定miRNA的抑制(或阻抑)，然后改變條件，以造成在細(xì)胞周期的生長停滯期中miRNA水平的增加(即通過miRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，或通過阻抑物的去除誘導(dǎo)編碼miRNA的核酸的表達(dá))。這些方法可以用于哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物的生長和應(yīng)用，尤其用于重組生物產(chǎn)品、特別是重組生物藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)。在本說明書中，術(shù)語"哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞"應(yīng)當(dāng)理解為是指，用于生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品例如生物藥品等的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這樣的細(xì)胞類型的實(shí)例是中囯倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，提供了生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的方法，該方法采用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含下述步驟(a)在細(xì)胞培養(yǎng)初期，制備一定生物量的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞；和(b)—旦達(dá)到希望的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞濃度，造成哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)一種或多種表1中的miRNA分子水平的增加。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道何時(shí)達(dá)到希望的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞濃度。一般而言，這是在細(xì)胞周期的生長停滯期開始時(shí)或即將開始之前。通常，用一種或多種表1中的miRNA分子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。合適地，miRNA分子是miRNA前體分子，理想地合成的miRNA前體分子。不管怎樣，miRNA分子可以是初始的miRNA或成熟的miRNA分子。表l中的初始的、前體和成熟的miRNA分子的序列可以在http:microma.sanger.ac.uk從miRNA序列、靶物和基因命名法數(shù)據(jù)庫MIRBase得到?；蛘撸梢杂迷谵D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的包含編碼表1中的miRNA分子的核酸序列的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通常，核酸序列編碼表1中的miRNA分子的前體。合適地，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。理想地，啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型的，當(dāng)溫度下降時(shí)理想地轉(zhuǎn)換到兩階段細(xì)胞培養(yǎng)。利用該使用表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，核酸序列也可以編碼初始miRNA或成熟miRNA，但是通常載體編碼表1中的任意miRNA分子的前體。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、或線性核酸構(gòu)建體例如PCR產(chǎn)物或限制片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用基于脂質(zhì)體的方法介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，例如，NeoFx(Ambion目錄號:4511)。但是，技術(shù)人員會(huì)明白其它轉(zhuǎn)染方法，例如，使用電穿孔介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或使用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。作為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的一個(gè)替代方案，該方法可以采用這樣的細(xì)胞，其工程化成具有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下且穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中的編碼表1中的miRNA分子的序列，且在這種情況下，該方法通常包含在生長周期中的希望的時(shí)刻誘導(dǎo)miRNA分子的表達(dá)，通常在細(xì)胞停滯期開始時(shí)或即將開始之前(即當(dāng)已經(jīng)達(dá)到希望的活生產(chǎn)細(xì)胞濃度時(shí))。通常，啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在這種情況下，溫度從37。C下降到31。C會(huì)誘導(dǎo)miRNA分子的表達(dá)。miRNA分子的編碼序列可以編碼miRNA的初始的、前體或成熟的形式；通常它編碼miRNA分子的前體形式，該前體通過細(xì)胞體系加工成成熟的miRNA。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在生長初期使用合適的阻抑物抑制細(xì)胞中的miRNA編碼序列，然后通過在生長停滯期時(shí)或即將開始之前撤去阻抑物，增加細(xì)胞中miRNA的水平。合適的啟動(dòng)子/阻抑物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，miRNA分子選自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的組。在另一個(gè)方面，本發(fā)明也提供了生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的方法，該方法采用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物，該方法包含下述步驟在培養(yǎng)初期過程中和通常在培養(yǎng)初期開始時(shí)，提高細(xì)胞內(nèi)一種或多種表l中的miRNA分子的抑制劑的水平。這樣的抑制劑的序列可以在http:microrna.sanger.ac.uk從miRNA序列、靶物和基因命名法數(shù)據(jù)庫MIRBase得到。合適地，該方法采用這樣的細(xì)胞，其工程化成具有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中的miRNA抑制分子的編碼序列，且其中該方法包含在培養(yǎng)初期、理想地在培養(yǎng)初期開始時(shí)誘導(dǎo)miRNA抑制分子的表達(dá)。這具有在生長停滯之前促進(jìn)生物量產(chǎn)生的作用，具有在更短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生增加的細(xì)胞工作原料的優(yōu)點(diǎn)。合適地，通過表達(dá)的誘導(dǎo)物的存在來誘導(dǎo)表達(dá)?；蛘?，編碼抑制劑的序列可以在阻抑型啟動(dòng)子的控制下。在該情況下，抑制劑在培養(yǎng)初期自由表達(dá)，在希望的細(xì)胞周期階段、通常在細(xì)胞周期的生長停滯期開始時(shí)或即將開始之前，加入阻抑物來抑制miRNA抑制劑的表達(dá)。優(yōu)選地，一旦達(dá)到合適的細(xì)胞生物量，就停止誘導(dǎo)miRNA抑制分子的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA抑制分子選自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的抑制劑的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，其包含下述步驟根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)初期過程中或在開始時(shí)，造成細(xì)胞內(nèi)一種或多種表1中的miRNA分子的抑制劑的水平的提高，隨后，根據(jù)本發(fā)明，在細(xì)胞周期的生長停滯期開始時(shí)或即將開始之前，提高細(xì)胞內(nèi)一種或多種表l中的miRNA分子的水平。通常，本發(fā)明的方法適用于CHO細(xì)胞例如CHO-K1或CHO-DUKX細(xì)胞或BHK細(xì)胞的生長和應(yīng)用。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，生長停滯期在比生長初期更低的培養(yǎng)溫度進(jìn)行。通常，生長初期在37'C進(jìn)行。合適地，生長停滯期在31'C進(jìn)行。本發(fā)明也涉及哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，其包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下且穩(wěn)定摻入細(xì)胞基因組中的編碼表l中的miRNA分子的核酸。優(yōu)選地，該核酸編碼選自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的組的miRNA分子。合適地，啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?；蛘撸蛄硗?，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞可以包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下且穩(wěn)定摻入細(xì)胞基因組中的編碼表1中的miRNA分子的抑制劑的核酸。合適地，該核酸編碼miRNA分子的抑制劑，該miRNA分子選自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的組。合適地，啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。通常，哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞是CHO細(xì)胞，例如，CHO-K1細(xì)胞或CHO-DUKX細(xì)胞?；蛘?，哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞可以是BHK細(xì)胞。這些細(xì)胞可以從英國Middlesex的LGCProtochematcc在下述目錄編號下得到CRL-10154-CHODuKX;CRL-9618畫CHOKl;CCL畫10陽BHK-21。因而，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞系可以被遺傳工程改造，以在生長停滯期或生長停滯期即將開始時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)特定miRNA分子(表l所示的)，從而在生長停滯期產(chǎn)生增加的miRNA分子水平，或可以將它們工程化成在細(xì)胞培養(yǎng)的初期誘導(dǎo)表達(dá)表1中的miRNA分子的抑制劑，或可以將它們工程化成實(shí)現(xiàn)二者，即在培養(yǎng)的初期表達(dá)miRNA分子的抑制劑，然后在細(xì)胞停滯期表達(dá)miRNA分子。應(yīng)當(dāng)明白，在本發(fā)明的方法和細(xì)胞系中，可以如下實(shí)現(xiàn)表達(dá)的控制使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，然后根據(jù)需要向培養(yǎng)液中加入或去除誘導(dǎo)物。技術(shù)人員會(huì)明白，本發(fā)明的方法和產(chǎn)物也可以如下控制使用組成型啟動(dòng)子，并通過使用表達(dá)的阻抑物來控制表達(dá)。因而，在本說明書中，當(dāng)使用術(shù)語"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解可以使用組成型啟動(dòng)子作為替代，且對技術(shù)人員來說，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所需的對方法或哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞系的改進(jìn)是顯而易見的。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的試劑盒，該試劑盒包含(a)哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞系；(b)用表1中的miRNA分子轉(zhuǎn)染細(xì)胞的工具；和/或(c)用表1中的miRNA分子之一的抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞的工具。轉(zhuǎn)染工具可以是暫時(shí)的或穩(wěn)定的，包含向細(xì)胞中導(dǎo)入下述任一種或兩種(a)合成的miRNA分子(或抑制劑)和(b)編碼miRNA分子(或編碼miRNA抑制劑)的核酸。圖1為在lxl()S細(xì)胞/ml接種后包含變溫的培養(yǎng)物(A)和在37。C恒溫培養(yǎng)的細(xì)胞CH0-K1批式培養(yǎng)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。在每種情況下，在接種后72和144小時(shí)(箭頭所示)從旋轉(zhuǎn)燒瓶取一式三份生物樣品；圖2為從TS樣品提取的RNA的15%變性丙烯酰胺凝膠分析證實(shí)了小RNA物質(zhì)的產(chǎn)率和完整性；圖3為所有6個(gè)CH0-K1樣品的無監(jiān)督聚簇分析產(chǎn)生2個(gè)主要的樣品簇，其將指數(shù)期(37°C)樣品與靜止期(3rc)樣品分開。從在頂部的簇樹結(jié)構(gòu)可以清楚地看出，樣品1(TSd3A)和樣品5(TSd6B)是異常值。每個(gè)miRNA的相對表達(dá)由從低(藍(lán)色)到高(紅色)表達(dá)的顏色代表。在簇下面給出了相對表達(dá)的范圍條；圖4為用于成熟的miRNA的檢測和定量的AmbionqRT-PCR過程的概要。該圖像的使用已經(jīng)經(jīng)過Ambion公司的允許。具體實(shí)施例方式材料和方法細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)在該研究中使用懸浮適應(yīng)的CH0-K1細(xì)胞。培養(yǎng)基由添加了10°/。胎牛血清(Sigma)的ATCC培養(yǎng)基(DMEM7含有谷氨酰胺和丙酮酸鈉的F-12Hams;Sigma)組成。根據(jù)需要，將細(xì)胞保持在37。C或3rC培養(yǎng)箱中旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上轉(zhuǎn)速為60rpm的250mL旋轉(zhuǎn)罐(Techne)中。對于批式培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以lxl(^細(xì)胞/mL將指數(shù)生長的細(xì)胞以lOOmL終體積接種進(jìn)旋轉(zhuǎn)罐。每天給所有培養(yǎng)物通入壓縮空氣(AirProducts)約lmin。每隔24小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞濃度，使用錐蟲藍(lán)排阻方法將活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開。對于變溫和在37。C的連續(xù)批式培養(yǎng)，各取一式三份旋轉(zhuǎn)罐用于在72和144小時(shí)取樣。RNA取樣和提取取樣后，在PBS中洗滌細(xì)胞團(tuán)2次，使用MiRVana提取試劑盒(Ambion)提供的裂解/結(jié)合溶液進(jìn)行裂解。在提取使用前，將這些裂解物儲(chǔ)存在-8(TC。生產(chǎn)商的說明書描述了通過有機(jī)方法和基于柱的方法的提取。使用Agilent6000納米芯片和通過15%變性丙烯酰胺凝膠電泳，測定RNA質(zhì)量。使用Nanodrop(ND-1000;Labtech、International)進(jìn)行RNA定量。MiRNA生物陣列分析(BioarrayAnalysis)。根據(jù)廠家的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程，通過Asuragen處理用于microRNA圖譜研究的樣品。如下得到microRNA富集的級分使lO[ig總RNA穿過flashPAGE分離裝置(Ambion,Inc.,Austin,TX),清潔，并使用flashPAGEReactionClean-Up試劑盒(Ambion，Inc.,Austin,TX)濃縮。在RNA分子的3'末端添加尾部，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用mirVanamiRNA標(biāo)記試劑盒(Ambion,Inc.，Austin,TX)進(jìn)行標(biāo)記。在聚(A)聚合酶介導(dǎo)的加尾反應(yīng)中摻入胺修飾的核苷酸，將Cy5琥珀酰亞胺酯(AmershamBiosciences(GEHealthcare),Piscataway，NJ)綴合至microRNA上的胺部分。使用mirVanamiRNABioarrayEssentials試劑盒(Ambion，Inc.,Austin,TX),進(jìn)行與mirVanamiRNABioarrays(Ambion,Inc.,Austin,TX)的雜交。使用GenePix4200AL掃描儀(MolecularDevices,UnionCity,CA)，在635nm的激發(fā)波長掃描陣列上的Cy5熒光。使用GenePixPro(version6.0,MolecularDevices,UnionCity,CA)，提取與探針和局部背景有關(guān)的熒光信號。使用Asuragen選擇的算法建立閾值和信號標(biāo)度，作為microRNAStandardServicePremiumAnalysis(miSSPpackage)的一部分執(zhí)行。使用Huber等人，2002所述的變差穩(wěn)定化轉(zhuǎn)化方法，通過GenePixPro為每個(gè)microRNA建立的背景調(diào)節(jié)的熒光值是標(biāo)準(zhǔn)化的。釆用單向ANOVA或t檢驗(yàn)的假設(shè)檢驗(yàn)取決于試驗(yàn)設(shè)計(jì)中組的數(shù)量。對于多組對比，我們使用單向ANOVA(方差分析)模型來測試零假設(shè)，即規(guī)定組間不存在差異的狀態(tài)。目的是過濾出在所有組之間具有相同表達(dá)水平的基因。在通過ANOVA鑒別出的差別表達(dá)的基因上進(jìn)行逐對對比，以觀察它們彼此的不同。對于每對處理，為每個(gè)基因進(jìn)行雙樣品t檢驗(yàn)，隨后使用5%的FDR,通過Benjamini和Hochberg(1995)所述的步增(step-up)方案進(jìn)行多重校正，以控制假發(fā)現(xiàn)率(FDR)。該方法稱作"保護(hù)的最小顯著差(LSD)"。報(bào)道了詳細(xì)的miRNA列表和有關(guān)的信息例如變化倍數(shù)和p-值。在培養(yǎng)144小時(shí)變溫的CHO-K1細(xì)胞的miRNA圖譜與在37。C的指數(shù)生長的CHO-K1細(xì)胞的對比將26種miRNA鑒別為明顯不同(如表1所示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>在下面的序列表中提供了上述miRNA的成熟轉(zhuǎn)錄物的序列。上述miRNA的初始轉(zhuǎn)錄物和前體轉(zhuǎn)錄物的序列可以在http:microma.sanger.ac.uk從miRNA序列、靶物和基因命名法數(shù)據(jù)庫MIRBase得到。在Griffiths-Jones等人的文章中解釋了該數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容和應(yīng)用。在本發(fā)明的方法中采用的miRNA抑制劑序列是表1所示的成熟miRNA的精確反義序列，可從http:〃microrna.sanger.ac.uk/sequences/得到。將抑制劑修飾成具有2'Ome修飾和含有氨基連接物的3'C3(AngieM、Cheng，MikeW、Byrom,JeffreyShelton和LanceP.Ford*"AntisenseinhibitionofhumanmiRNAsandindicationsforaninvolvementofmiRNAincellgrowthandapoptosis"NucleicAcidsResearch200533(4):1290-1297)。miR-21和miR-24miRNA的抑制劑可在AMI0206(miR-21)和AM10737(miR-24)目標(biāo)編號下從Ambion購得。為了檢測和定量特定的miRNA，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用miRVanaqRT-PCRmiRNA檢測試劑盒和引物組。在所有情況下，均將SuperTaq(Ambion)用于聚合反應(yīng)。使用SYBR綠和ROX標(biāo)準(zhǔn)化染料(Invitrogen)促進(jìn)檢測和標(biāo)準(zhǔn)化。使用ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)進(jìn)行RT和PCR反應(yīng)。使用0.05的p值截止值，使用t檢驗(yàn)檢查生物復(fù)制結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯著性?；趯π〖沂?Musmusculus)、褐家鼠(Rattusnorvigicus)和人類(Homosapiens)的pre-miR-21序列側(cè)翼的對應(yīng)基因組區(qū)域的比對，為克隆中國倉鼠miR-21設(shè)計(jì)弓|物。使用的引物是5'atgtttgctttgctttaaaccctgcctgagca3'和5'ctgcaaaccatgatgctgggtaatgtttga3'。從約5xl06CHO-Kl細(xì)胞提取基因組DNA(全血提取試劑盒，Nucleon)，在100ul水中洗脫。將1.5ul(約100ng)DNA用作PCR的模板。反應(yīng)物也含有引物(每種400nM)、lulDMSO和20.5ulPlatinumSupermix(Invitrogen)。循環(huán)條件是在95。C下3min，30個(gè)在94°C下30秒、在53。C下30秒和在72。C下45秒的循環(huán)，隨后在72。C下7min。在瓊脂糖凝膠上檢查PCR產(chǎn)物的適當(dāng)長度(ca.220bp)的特定帶，將剩余的混合物清除(QiagenPCR清除試劑盒)，用于測序。使用克隆引物(MWGBiotech，Germany),在兩條鏈上進(jìn)行測序。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)以lxl()S細(xì)胞/ml將懸浮適應(yīng)的CHO-K1細(xì)胞接種進(jìn)旋轉(zhuǎn)燒瓶(供應(yīng)商)，在37。C下培養(yǎng)6天，或在37。C下培養(yǎng)3天、隨后變溫至31。C再繼續(xù)培養(yǎng)3天。從圖l可以看出，變溫的細(xì)胞立即終止對數(shù)生長，沒有超過1.67xl06±0.15細(xì)胞/ml的峰活細(xì)胞密度，而在37。C下培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)對數(shù)生長另外24小時(shí)，達(dá)到2.02xl06±0.11細(xì)胞/ml的平均峰活密度。在72小時(shí)和144小時(shí)對細(xì)胞取樣，用于RNA和蛋白質(zhì)提取。在PBS中洗滌細(xì)胞團(tuán)2次，立即在miRVana裂解/結(jié)合緩沖液中裂解，在使用Ambion的mirVanamiRNA分離試劑盒提取之前儲(chǔ)存在-80°C。使用AgilentBioanalyzer對總RNA進(jìn)行QC,通過在15%變性聚丙烯酰胺凝膠上顯影，證實(shí)小RNA物質(zhì)的存在和完整性(圖2)。miRNA生物陣列分析。從在72小時(shí)轉(zhuǎn)換到3rC的細(xì)胞提取在第3天(TSd3)和第6天(TSd6)分離的總RNA的一式三份生物樣品，隨后用于miRNA生物陣列分析。當(dāng)用標(biāo)記的中國倉鼠RNA探測miRNA生物陣列時(shí)，平均百分比存在調(diào)用(percentpresentcall)是在27.3%(±4.8)區(qū)域，這與具有26.9%(±5.7)的平均存在調(diào)用的人細(xì)胞系RNA非常相當(dāng)。來自用CH0-K1RNA探測的陣列的平均熒光信號是306.4士55.2熒光單位，與人細(xì)胞數(shù)據(jù)(296.6士71.5)相當(dāng)。表達(dá)數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚簇分析揭示，作為離散的亞簇聚簇的CH0-K1樣品被分成在分析中包含的作為非倉鼠對照的6個(gè)人細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未顯示)。在CH0-K1樣品內(nèi)的無監(jiān)督的聚簇的結(jié)果是37。c下的指數(shù)期樣品與在3rc靜止期生長的那些樣品分離(圖3)。在亞簇內(nèi)，顯然旋轉(zhuǎn)樣品1(TSd3A)和5(TSd6B)是異常值，由于總體更低的中位前景讀數(shù)和與這些陣列有關(guān)的更低的百分比存在調(diào)用，這可能是標(biāo)記和/或雜交的假象。這是后續(xù)分析步驟的一個(gè)重要的質(zhì)量控制度量。使用在材料和方法中所述的統(tǒng)計(jì)方法來分析所有樣品，發(fā)現(xiàn)26種miRNA在72小時(shí)(TSd3)和144小時(shí)(TSd6)樣品之間被視作統(tǒng)計(jì)上不同的(p《0.05)(表I)。CH0-K1中特異性miRNA表達(dá)的定量QRT-PCR分析在第3天(37d3)和第6天(37d6)對在37。C下培養(yǎng)144小時(shí)的CH0-K1細(xì)胞的總RNA進(jìn)行取樣(圖lb),將來自第3天接受變溫處理的細(xì)胞的RNA(TSd3&TSd6)用于來自生物陣列分析的選定靶物的qRT-PCR分析。初步實(shí)驗(yàn)表明，每個(gè)反應(yīng)使用2.5ngRNA會(huì)達(dá)到最佳結(jié)果，并且在5S內(nèi)源對照的情況下，使用PCR-引物的1/10稀釋液。證實(shí)了5SRNA在所有樣品中以類似水平表達(dá)，無論生長階段或培養(yǎng)溫度，這與圖2中的質(zhì)量控制分析相一致。miRNA的qRT-PCR反應(yīng)的原理采用對特定miRNA的3'末端具有特異性的專有RT-引物，然后在RT-反應(yīng)步驟中通過ArrayScript酶延伸成micro-cDNA。qPCR步驟原位進(jìn)行，使用5'miRNA特異性的引物和靶向原始RT-引物的通用3'末端的3'通用引物(圖4)。因此，這是擴(kuò)增單個(gè)成熟的miRNA的高度特異性的方式。為了確保使用生物陣列和q-RT-PCR檢測的miRNA實(shí)際上是生物陣列上人和小鼠miRNA的真實(shí)的倉"i直系同源物，選擇一個(gè)代表性的miRNA(miR-21)用于克隆和測序。從下面表2可以看出，成熟的miR-21在可以得到該序列的所有物種間是保守的，但是整個(gè)前體序列與大鼠的序列完全相同。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2A、CHO-Klcgr-miR-21序列與小鼠(mmu-)、大鼠(rno-)、人(hsa-)和牛(bta-)miR-21的序列的比對。CHO序列與在SangermiRNA儲(chǔ)存庫(http:〃microrna.sanger.ac.uk/scquences/)中公開的mo-miR-21序歹l]相同。B、預(yù)測的cgr-miR-21的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，成熟的miRNA用紅色高亮顯示。討論如圖1所示，降低培養(yǎng)溫度對細(xì)胞生長具有瞬即效應(yīng)，也可以看出，在培養(yǎng)144小時(shí)后，在3rC下的細(xì)胞維持穩(wěn)定的活細(xì)胞數(shù)量，而在37。C下培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入晚靜止/死亡期。在變溫后觀察到的降低的代謝活性、剪切敏感性和細(xì)胞凋亡速率已經(jīng)促進(jìn)了它在重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用(Fogolin等人，2004;Fogolin等人，2005;Fox等人，2004)。在培養(yǎng)144小時(shí)變溫的CHO-K1細(xì)胞的miRNA圖譜與在37。C下指數(shù)生長的CHO-K1細(xì)胞的對比，將26個(gè)miRNA鑒別為顯著不同的(表l所示)。CHO-K1RNA的全圖譜分析清楚地表明，Ambion生物陣列適用于基于百分比存在調(diào)用和中位印跡強(qiáng)度的CHO繪圖。當(dāng)將CHO-Kl圖譜與6個(gè)人細(xì)胞系相比較時(shí)，清楚地觀察到，CHO-K1在它們表達(dá)的miRNA圖譜方面明顯不同。qRT-PCR驗(yàn)證研究表明，發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-24在批次運(yùn)行末期在CHO-K1細(xì)胞中以非溫度依賴性的方式顯著上調(diào)。qRT-PCR數(shù)據(jù)反映了在生物陣列中鑒別出的各個(gè)miRNA的相對表達(dá)水平，這指示生物陣列的定量以及定性方面。miR-21和miR-24與生長抑制的關(guān)聯(lián)與這里觀察到的結(jié)果相一致，因?yàn)閮煞NmiRNA在靜止細(xì)胞中升高，在該系統(tǒng)miR-21中可能不是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因子。在該實(shí)驗(yàn)室中的初步分析已經(jīng)揭示，在3rc下連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞中miR-21水平升高，這又與緩慢的生長相關(guān)聯(lián)。在上面的實(shí)施例中，申請人已經(jīng)鑒別出在停止增殖后中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中許多miRNA的增加的表達(dá)，所述停止是由于低溫培養(yǎng)或通過營養(yǎng)限制和廢物積累導(dǎo)致的正常靜止期生長。經(jīng)鑒定，成熟的miR-21在檢查的哺乳動(dòng)物物種中是完全保守的，這證實(shí)了下述理論，即成熟的miRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中非常保守。這允許使用人工哺乳動(dòng)物(例如鼠或人)miRNA前體分子(可從Ambion目錄號17100購得)修飾CHO細(xì)胞來過表達(dá)特定miRNA,或使用特定miRNA抑制劑分子(可從Ambion目錄號17000購得)來抑制miRNA作用。由于生物藥品的有效生產(chǎn)通常采用雙階段培養(yǎng)，其具有在37i:下的生長初期來產(chǎn)生足夠的生物量，隨后是在更低的培養(yǎng)溫度的生產(chǎn)期，申請人提出，表1中的miRNA分子和/或miRNA分子的抑制劑可以用于建立CHO細(xì)胞培養(yǎng)的有效生長和使用必需的條件或增強(qiáng)現(xiàn)有條件，尤其在重組生物藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)中。實(shí)例1:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA來抑制CHO生長一旦達(dá)到足夠的生物量(通常達(dá)到最大活細(xì)胞密度的約80%),使用導(dǎo)入CH0-K1細(xì)胞(LGSProtochem-atcc目錄編號CRL-9618-CH0K1)中的合成的miRNA前體分子miR-21(表1所示)(Ambion目錄號17100)修飾培養(yǎng)的CHO細(xì)胞行為。該轉(zhuǎn)染的目的是，在不變溫的情況下抑制生長和/或通過同時(shí)暫時(shí)轉(zhuǎn)染表I中的特定miRNA(單獨(dú)地或組合地)來增強(qiáng)降低培養(yǎng)溫度的有益效應(yīng)。通過常規(guī)的基于脂質(zhì)體的方法來介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，包括NeoFx(Ambion目錄號:45U)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用該方法。實(shí)例2、瞬時(shí)表達(dá)miRNA編碼序列來抑制CHO生長。一旦達(dá)到足夠的生物量(通常達(dá)到可達(dá)到的最大活細(xì)胞密度的約80%)，使用導(dǎo)入細(xì)胞中的表達(dá)載體(Ambion目錄號5775，5777，5779)中的合成的miRNA編碼序列(或從PCR反應(yīng)得到的線性表達(dá)分子或作為限制片段)修飾培養(yǎng)的CHO行為。這些表達(dá)構(gòu)建體至少含有下述組分-轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(組成型或誘導(dǎo)型，病毒的、哺乳動(dòng)物的或其它起源)和編碼miRNA前體分子的序列。采用的pSILENCER表達(dá)盒含有改進(jìn)的RNApolII型CMV啟動(dòng)子和優(yōu)化的SV40多腺苷酸化信號，以驅(qū)動(dòng)高水平表達(dá)。這會(huì)促進(jìn)廣范圍的細(xì)胞的高表達(dá)。該轉(zhuǎn)染的目的是，在不變溫的情況下抑制生長和/或通過同時(shí)轉(zhuǎn)染表I中的特定miRNA(單獨(dú)地或組合地)來增強(qiáng)降低培養(yǎng)溫度的有益效應(yīng)。通過常規(guī)的基于脂質(zhì)體的方法來介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，包括Lipofectamine2000(Invirogen)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書使用該方法。實(shí)例3、穩(wěn)定表達(dá)miRNA編碼序列來抑制CHO生長。建立新的基于CHO的細(xì)胞系，其具有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子MT控制下穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中的表I的miR-21或miR-24miRNA的編碼序列。在接受特定信號來激活啟動(dòng)子(即ZnS04)之前，該啟動(dòng)子是無活性的——一旦接受這些信號，則轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子控制下的任意編碼序列。該方法包含，將來自可商購的表達(dá)系統(tǒng)(Ambion目錄號5775，5777，5779)的miRNA編碼序列亞克隆進(jìn)誘導(dǎo)型系統(tǒng)例如pCytTS(Cytosbiotechnology)。其它可行的表達(dá)系統(tǒng)是完整的control系統(tǒng)(Stratagene)或pSUPERIOR(Oligoengine)(這也可以通過改進(jìn)Ambion載體以使其包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn))。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用常規(guī)的基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染劑例如Lipofectamine2000(Invitrogen),將這些新的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞。用適當(dāng)選擇劑進(jìn)行選擇，分離均質(zhì)克隆群體后，在降低培養(yǎng)溫度之前，新的細(xì)胞系以指數(shù)生長方式正常地生長。在該情況下，通過加入100)iM水平的ZnS04，誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)。或者，在溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的情況下，單獨(dú)的變溫會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)的生長停滯，這是由于增加的生長抑制性miRNA的表達(dá)(表l所示)。一般而言，在其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的情況下，通過在培養(yǎng)液中加入或撤去刺激/阻抑分子(例如四環(huán)素)來激活啟動(dòng)子。然后，可將這些新的細(xì)胞系理想地用于進(jìn)一步修飾，以表達(dá)用于治療目的重組糖蛋白質(zhì)。實(shí)例4、穩(wěn)定表達(dá)miRNA編碼序列來促進(jìn)CHO生長。建立新的基于CHO的細(xì)胞系，其具有在溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或另一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的乾向表1列出的miRNA的抑制劑序列。該方法包含，將來自可商購的表達(dá)系統(tǒng)(Ambion目錄號5775,5777，5779)的miRNA抑制劑編碼序列亞克隆進(jìn)誘導(dǎo)型系統(tǒng)，例如完整的control系統(tǒng)(Stratagene)或pSUPERIOR(Oligoengine)(這也可以通過改進(jìn)Ambion載體以使其包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn))。使用常規(guī)的基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染劑例如Lipofectamine2000(Invitrogen),將這些新的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO細(xì)胞。用適當(dāng)選擇劑分離均質(zhì)克隆群體后，在降低培養(yǎng)溫度之前，在誘導(dǎo)物/阻抑物(例如四環(huán)素)存在/缺失下，在37。C下培養(yǎng)在指數(shù)生長期加速生長的新細(xì)胞系，直到撤去誘導(dǎo)物/加入阻抑物為止。在這時(shí)，抑制劑的表達(dá)會(huì)終止。一旦撤去抑制劑，這將允許特定miRNA的表達(dá)、生長抑制并因此提高生產(chǎn)。設(shè)計(jì)該系統(tǒng)來提高生產(chǎn)力，這通過增加在培養(yǎng)早期的生物量生成和然后以正常方式促進(jìn)靜止期生產(chǎn)來實(shí)現(xiàn)。然后可將這些新的細(xì)胞系理想地用于進(jìn)一步修飾，以表達(dá)用于治療目的重組糖蛋白質(zhì)。實(shí)例5研究工具。通過鑒別靶分子和受特定miRNA表達(dá)/抑制影響的途徑，工業(yè)研究人員對在上面實(shí)例3和4下建立的穩(wěn)定細(xì)胞系非常感興趣。MiRNA通過阻止特定蛋白質(zhì)的翻譯起作用，因此諸如二維凝膠電泳等方法可以用于在特定蛋白質(zhì)表達(dá)或抑制后鑒別差別表達(dá)的蛋白質(zhì)，并從而鑒別靶物。這具有促進(jìn)細(xì)胞系構(gòu)建的合理設(shè)計(jì)方案和過程設(shè)計(jì)的潛力，例如在培養(yǎng)基配方中包含特定抑制劑分子。本發(fā)明不限于前文所述的實(shí)施方案，它們的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)可以改變，而不脫離本發(fā)明的精神。在這方面，盡管本發(fā)明的主要闡述涉及生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的方法，該方法同樣可以用于制備哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法中。權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的方法，該方法采用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物，該方法包含下述步驟修飾哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物，以調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)物中至少一種miRNA在生長周期中的水平。2、一種生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的方法，該方法釆用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物，該方法包含下述步驟(a)在細(xì)胞培養(yǎng)初期開始時(shí)或過程中，制備哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞的生物量；和(b)—旦達(dá)到希望的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞濃度，造成哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)一種或多種表l中的miRNA分子水平的增加。3、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中用一種或多種表1中的miRNA分子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述miRNA分子是合成的miRNA前體分子。5、如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中使用脂質(zhì)體遞送、電穿孔或磷酸鈣介導(dǎo)所述轉(zhuǎn)染。6、如權(quán)利要求l或2所述的方法，其中用在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的包含編碼表1中的miRNA分子的核酸序列的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述核酸序列編碼表l中的miRNA分子的前體。8、如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。9、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其釆用工程化成具有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中的表1中的miRNA分子的編碼序列或其前體的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，且其中該方法包含，在細(xì)胞周期的生長停滯期開始時(shí)或即將開始之前，誘導(dǎo)miRNA分子的表達(dá)。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。11、如任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述miRNA分子選自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的組。12、如權(quán)利要求l所述的方法，其包含下述步驟在培養(yǎng)初期開始時(shí)或在培養(yǎng)初期過程中，提高哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)一種或多種表1中的miRNA分子的抑制劑的水平。13、如權(quán)利要求l所示的方法，其中所述至少一種miRNA是初始的、前體、或成熟的表1中的miRNA。14、如權(quán)利要求12所述的方法，其采用工程化成具有在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中的抑制劑編碼序列的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，且其中該方法包含，在培養(yǎng)初期開始時(shí)或在培養(yǎng)初期過程中，誘導(dǎo)抑制分子的表達(dá)。15、如權(quán)利要求14所示的方法，其中表達(dá)由表達(dá)誘導(dǎo)物的存在或表達(dá)阻抑物的缺失來誘導(dǎo)。16、如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中一旦達(dá)到合適的細(xì)胞生物量，就停止誘導(dǎo)miRNA抑制分子的表達(dá)。17、如權(quán)利要求l所述的方法，其包含下述步驟在培養(yǎng)初期開始時(shí)或在培養(yǎng)初期過程中，提高細(xì)胞內(nèi)一種或多種表l中的miRNA分子的抑制劑的水平，隨后在細(xì)胞周期的生長停滯期之前或過程中，提高細(xì)胞內(nèi)一種或多種表1中的miRNA分子的水平。18、如任一項(xiàng)前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。19、如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述CHO細(xì)胞是CHO-K1細(xì)胞或CHO-DUKX細(xì)胞。20、如權(quán)利要求2至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中在比生長初期更低的培養(yǎng)溫度進(jìn)行生長停滯期。21、如權(quán)利要求20所述的方法，其中在37。C進(jìn)行生長初期。22、如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中在3rC進(jìn)行生長停滯期。23、一種哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，其包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下且穩(wěn)定摻入細(xì)胞基因組中的編碼表1中的miRNA分子(以初始的、前體或成熟的形式)的核酸。24、如權(quán)利要求23所述的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述核酸編碼選自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的組的miRNA分子。25、如權(quán)利要求23或24所述的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。26、一種哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，其包含在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下且穩(wěn)定摻入細(xì)胞基因組中的編碼表1中的miRNA分子的抑制劑的核酸。27、如權(quán)利要求26的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述核酸編碼miRNA分子的抑制劑，該miRNA分子選自包含hsa-miR-21和hsa-miR-24的組。28、如權(quán)利要求25或26所述的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。29、如權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)所述的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞是CHO細(xì)胞或BHK細(xì)胞。30、如權(quán)利要求29所述的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞是CHO-K1細(xì)胞或CHO-DUKX細(xì)胞。31、一種用于生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的試劑盒，其包含(a)哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞系；(b)用表1中的miRNA分子(以初始的、前體或成熟的形式)轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系的細(xì)胞的工具；和/或(c)用表1中的miRNA分子的抑制劑轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系的細(xì)胞的工具。32、如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中所述用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的工具包含瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的工具。33、如權(quán)利要求32所述的試劑盒，其中所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包含向細(xì)胞中導(dǎo)入下述一種或二者(a)合成的miRNA分子和(b)編碼miRNA分子的核酸。全文摘要生產(chǎn)重組生物產(chǎn)品的方法，該方法采用哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物，包含下述步驟在細(xì)胞培養(yǎng)初期制備哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞的生物量，一旦達(dá)到希望的哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞濃度，造成哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)一種或多種表1中的miRNA分子水平的增加。該方法也可以包含下述步驟在培養(yǎng)初期開始時(shí)或在培養(yǎng)初期過程中，增加哺乳動(dòng)物生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)一種或多種表1中的miRNA分子的抑制劑的水平。文檔編號C12P21/02GK101541972SQ200780031874公開日2009年9月23日申請日期2007年8月3日優(yōu)先權(quán)日2006年8月4日發(fā)明者尼奧·布魯恩,帕克·加梅爾,馬丁·科萊尼斯申請人:都柏林城市大學(xué)