專利名稱：：用于產生淀粉水解物的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于產生淀粉水解物(例如用于發(fā)酵方法)的改進的方法。
背景技術：
：的含淀粉材料(如顆粒狀淀粉)中產生發(fā)酵產物的方法。谷物、谷類或植物的塊莖包含淀粉。淀粉以孩i觀顆粒的形式存在，其在室溫不溶于水。當將水性的淀粉漿料加熱時，顆粒膨脹并最終脹破，將淀粉分子分散到所述溶液中。在此"凝膠化，，處理過程中，粘度有顯著的提高。由于在通常的工業(yè)方法中固體水平為約30-40%，因此必須使淀粉變稀薄或"液化"以使其能被處理。此粘度的降低通常通過酶法降解在稱為液化的方法中完成。在液化過程中，通過alpha-淀粉酶將長鏈淀粉降解為葡萄糖單元的較小的分枝的和線狀的鏈(糊精)。常規(guī)的酶的液化方法可以作為三步熱漿法(three-stephotslurry)進行。將漿料加熱至80-85。C并添加熱穩(wěn)定的a-淀粉酶以開始液化。然后將漿料在105-125。C噴射蒸煮(jet-cooked)以完成漿料的凝膠化，冷卻至60-95。C，并通常添加額外的a-淀粉酶以終結水解。液化方法通常在pH5-6進行。在糖化期間，將來自液化的糊精進一步水解以產生可以被發(fā)酵生物體(如酵母)代謝的低分子的糖DP,-3。水解通常使用葡糖淀粉酶完成，可選擇地或者除葡糖淀粉酶外，可以使用a-葡萄糖苷酶和/或酸性a-淀粉酶。全部的糖化步驟通常持續(xù)多至72小時，然而，普遍的是僅在高于50。C的溫度進行例如，40-90分鐘的預糖化，然后是在稱為同時糖化和發(fā)酵(SSF)的方法中在發(fā)酵期間完全糖化。使用加入醪(mash)的發(fā)酵生物(如酵母)進行發(fā)酵。然后回收發(fā)酵產物。對于乙醇，例如燃料乙醇、飲用乙醇或工業(yè)乙醇，發(fā)酵在通常約32。C的溫度進行通常35-60小時。當發(fā)酵產物是哞酒時，發(fā)酵在通常約14。C的溫度進行通常多至8天。發(fā)酵后，可以將醪例如用作啤酒，或蒸餾以回收乙醇。可將乙醇用作例如燃料乙醇、飲用乙醇和/或工業(yè)乙醇。從上述討論顯然的是，常規(guī)方法中的淀粉水解由于在各個步驟期間不同的溫度要求，是非常消耗能量的。幾個專利申請通過提供將顆粒狀淀粉轉化為乙醇而無消耗能量的凝膠化步驟的方法解決了該問題。乙醇的發(fā)酵方法。申請WO2005/003311和PCT/US05/46725提供了用于將顆粒狀淀粉轉化為可發(fā)酵糖(例如，用于乙醇生產)的真菌a-淀粉酶。申請PCT/DK2005/000819提供了用于將顆粒狀淀粉轉化為可發(fā)酵糖(例如，用于乙醇生產)的細菌a-淀粉酶。的方法。
發(fā)明內容本發(fā)明提供了用于從含淀粉材料產生淀粉水解物而不將所述含淀粉材料凝膠化的方法?？蓪⒌矸鬯馕镉米骼缣鹞秳┗蛴糜诋a生發(fā)酵產物，如乙醇。本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過將包含碳水化合物結合模塊的細菌a-淀粉酶的作用與包含碳水化合物結合模塊的真菌a-淀粉酶的作用組合，與使用增加量的包含碳水化合物結合模塊的細菌a-淀粉酶或增加量的包含碳水化合物結合模塊的真菌a-淀粉酶相比，實現(xiàn)了產率(yield)的增加。因此在第一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括用如下物質糖化顆粒狀淀粉a)葡糖淀粉酶，b)包含碳水化合物結合模塊(CBM)的細菌a-淀粉酶和c)包含CBM的真菌a-淀粉酶，以產生淀粉水解物。在優(yōu)選的實施方案中，將第一方面的淀粉水解物進一步與發(fā)酵生物體接觸以產生發(fā)酵產物，優(yōu)選乙醇。優(yōu)選地，糖化和發(fā)酵同時進行。在另一方面，本發(fā)明提供了包含碳水化合物結合模塊的細菌a-淀粉酶和包含碳水化合物結合模塊的真菌a-淀粉酶的作用的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，組合物進一步包含葡糖淀粉酶。優(yōu)選地，真菌酸性a-淀粉酶活性(AFAU)對葡糖淀粉酶活性(AGU)之間的比率(AFAU每AGU)是至少0.1,特別是至少0.16,如0.12-0.50或甚至更高的范圍。發(fā)明詳述在糖化含淀粉材料(如顆粒狀淀粉)的漿料前，制備具有20-55wt.-。/。干固體，優(yōu)選25-40wt,。/。干固體，更優(yōu)選30-35%干固體的含淀粉材料。漿料可以包4舌7jc和/或工藝水(processwaters)，例如釜餾物(stillage)(倒流(backset))、洗滌水、蒸發(fā)器冷凝物或餾出液、來自蒸餾的側流汽提器(sidestripper)水或其它發(fā)酵產品工廠的工藝水。由于本發(fā)明的方法在低于凝膠化溫度的溫度進行因而不發(fā)生明顯的粘性增加，因此如果需要可以使用高水平的釜餾物。在一個實施方案中，含水的漿料包含約1至約70vol.-。/。釜餾物，優(yōu)選15-60%vol.-。/。蒼餾物，尤其約30至50vol.-。/。釜餾物。為了使粉碎的含淀粉材料暴露更多的表面。在一個實施方案中，粒度為0.05-3.0mm,或粉碎的含淀粉材料的至少30。/o適于通過(fitthrough)具有0.05至3.0mm篩網的篩子。在進行本發(fā)明的方法后，含淀粉材料的干固體或含淀粉材料的淀粉的至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或優(yōu)選至少99%轉化為可溶的淀粉水解物。本發(fā)明的方法在低于起始凝膠化溫度的溫度進行。在優(yōu)選的實施方案中，本方法作為同時糖化和發(fā)酵方法來進行。在這樣的優(yōu)選實施方案中，方法通常在28。C-36。C，如29。C-35。C,如30。C-34。C,如大約32。C進行。根據本發(fā)明，可以在發(fā)酵過程中向上或向下調節(jié)溫度。在一個實施方案中，進行同時糖化和發(fā)酵使糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如約3wt,。/。以下或低于(below)約3wt-。/。，優(yōu)選低于約2wt,0/0，更優(yōu)選低于約lwt,。/。，更優(yōu)選低于約0.5%,或甚至更優(yōu)選低于O.lwt,%。可通過簡單采用調節(jié)量的酶和發(fā)酵生物體來實現(xiàn)這樣低水平的糖。本領域的技術人員可以容易地確定使用多少量的酶和發(fā)酵生物體。也可以選擇酶和發(fā)酵生物體的采用量以維持發(fā)酵培養(yǎng)物中低濃度的麥芽糖。例如，可控制麥芽糖水平低于約0.5wt,。/?；虻陀诩s0.2wt,%。本發(fā)明的方法可在3-7，優(yōu)選3.5至6，或更優(yōu)選4至5的范圍的pH進行。于本發(fā)明方法的含淀粉起始材料的實例包括塊莖、根、莖、全谷物(wholegrain)、玉米、穗軸(cobs)、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、稻豌豆、豆或谷類、含糖原料，如糖蜜、果實材料、糖、藤莖/甘蔗(cane)或糖甜菜、馬鈴薯，和含纖維素材料，如木材或植物殘余物。包括蠟質和非蠟質(waxyandnon-waxy)型的玉米和大麥。術語"顆粒狀淀粉"表示生的未烹制的淀粉，即，以其天然形式存在于谷類(cereal)、塊莖或谷物(grain)中的淀粉。淀粉作為不溶于水的微小顆粒形成于植物細胞中。當置于冷水中時，淀粉顆粒可吸收少量的液體并膨脹。在多至50。C至75。C的溫度該膨脹可為可逆的。然而，在更高的溫度稱為"凝膠化"的不可逆膨脹開始。將要處理的顆粒狀淀粉可以是高度精煉的淀粉質量，優(yōu)選至少90%，至少95%,至少97%或至少99.5°/。純，或者其可為包含粉碎的全谷物的較粗制含淀粉材料，所述粉碎的全谷物包括非淀粉級分例如胚殘余物(germresidue)和纖維。據本發(fā)明優(yōu)選兩種粉碎方法濕磨和干磨。在干磨中將全谷粒(wholekernel)磨碎并使用。濕磨提供胚和粗粉(淀粉顆粒和蛋白)的良好分離，并常常應用于將淀粉水解物用于產生糖漿的場合(location)。干磨和濕磨都是淀粉加工領域中所熟知的并且等同地預期用于本發(fā)明的方法。在一個實施方案中，粉碎后的粒度為0.05-3.0mm,或因而粉碎的含淀粉材料的至少30%，優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少70%，甚至更優(yōu)選至少90%適于通過具有0.05至3.0mm篩網，優(yōu)選具有0.1-0.5mm篩網的篩子。術語"起始凝膠化溫度，，表示淀粉凝膠化開始的最低溫度。在水中加熱的淀粉在50。C-75。C開始劍交化；確切的劍交化溫度依賴于特定的淀粉，并且可以由技術人員容易地確定。因此，起始^l交化溫度可以根據植物物種，植物物種的特定變種以及生長^f牛而變化。在本發(fā)明的上下文中，給出的含淀粉材料的起始凝膠化溫度是使用由Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/StMrke,Vol.44(12)pp.461-466(1992)所描述的方法，5%的淀粉顆粒的雙折射喪失時的溫度。將術語"淀粉水解物"理解為本發(fā)明的水解方法的可溶性降解產物。淀粉水解可包含單-、二-和寡糖，如葡萄糖、麥芽糖、麥芽糊精、環(huán)糊精和這些物質的任意混合物。優(yōu)選地，顆粒淀粉干固體的至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%,至少95%,至少96%，至少97%或至少98%轉化為可溶性淀粉水解物。術語"發(fā)酵產物"表示使用發(fā)酵生物體通過包括發(fā)酵步驟的方法所產生的產物。根據本發(fā)明預期的發(fā)酵產物包括醇類(例如，乙醇、曱醇、丁醇)；有機酸(例如，檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮類(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；氣體(例如，H2和C02);抗生素(例如，青霉素和四環(huán)素)；酶類；維生素(例如，核黃素、B12、P-胡蘿卜素)；和激素。在優(yōu)選的實施方案中，發(fā)酵產物是乙醇，例如，燃料乙醇；飲用乙醇(即，可飲用中性酒精(potableneutralspirit));或工業(yè)乙醇或用于可消耗醇工業(yè)(例如，啤酒和酒(wine))、乳品工業(yè)(例如，發(fā)酵奶產品)、皮革工業(yè)和煙草工業(yè)的產物。優(yōu)選的啤酒種類包含淡色啤酒(ale)、烈啤酒(stout)、缽爾透黑啤酒(porter)、陳貯啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麥芽酒(maltliquor)、happoushu、高醇啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒或清淡啤酒(lightbeer)。所使用的優(yōu)選發(fā)酵方法包括醇發(fā)酵方法，如本領域所熟知的。優(yōu)選的發(fā)酵方法是厭氧發(fā)酵方法，如本領域所熟知的。術語"發(fā)酵生物體"指任何生物體，包括細菌和真菌生物體，其適用于發(fā)酵方法且能夠產生期望的發(fā)酵產物。特別合適的發(fā)酵生物體是能夠使糖類(如葡萄糖或麥芽糖)直接或間接發(fā)酵(即，轉化)為期望的發(fā)酵產物。發(fā)酵生物體的實例包括真菌生物體，如酵母。優(yōu)選的酵母包括酵母屬的菌種(&cc/2aramyc^spp.)，且特別是釀酒酵母。商業(yè)可獲得的酵母包括，例如，RedStarTM/LesaffreEthanolRed(可從RedStar/Lesaffre，USA獲得)、FALI(可從Fleischmann，sYeast，BurnsPhilpFoodInc.分部，USA獲得)、SUPERSTART(可從Alltech獲得)、GERTSTRAND(可從GertStrandAB，Sweden獲得)和FERMIOL(可從DSMSpecialties獲得)。包含CBM的真菌和細菌a-淀粉酶根據本發(fā)明，將包含CBM的真菌a-淀粉酶和包含CBM的細菌a-淀粉酶應用于本發(fā)明的方法中。在優(yōu)選的實施方案中，a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶，例如，真菌酸性a-淀粉酶或細菌酸性a-淀粉酶。術語"酸性a-淀粉酶"表示以有效劑量添加的a-淀粉酶(E.C.3.2丄1)在3至7，優(yōu)選3.5至6，或更優(yōu)選4-5范圍的pH具有最佳活性。9包含CBM的細菌a-淀粉酶將術語"包含CBM的細菌a-淀粉酶"理解為包含催化域和CBM的酶，所述催化域和所述CBM都源自細菌來源。包含CBM的細菌a-淀粉酶可以是野生型細菌酶、這樣的野生型細菌酶的變體或雜合酶，其包含細菌a-淀粉酶催化域和細菌CBM。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中細菌a-淀粉酶催化域和/或細菌CBM源自芽孢桿菌屬CSa"7/w力或無氧芽孢4干菌屬G4"ox;^a"'〃w力優(yōu)選用于本發(fā)明的是任何包含CBM的細菌a-淀粉酶，包括雜合體和野生型，其中CBM具有如本文SEQIDNO:l中氨基酸521-619所示的序列或者CBM具有與所述序列同源的序列。還優(yōu)選用于本發(fā)明的是任何包含CBM的細菌a-淀粉酶，包括雜合體和野生型，其中催化域具有如本文SEQIDNO:1的氨基酸32-520所示的序列或者催化域具有與所述序列同源的序列。.在其它優(yōu)選的實施方案中，包含CBM的細菌a-淀粉酶包含源自地衣芽孢4干菌(及//c/zem》r附/力、解;定4分芽孑包沖干菌(及am_y/o//《wey^c/e/w)、斗古草芽孑包斥干菌(5.sw^7^)或嗜熱脂肪芽孢桿菌0S.WearaAwmo//zz7w"的菌抹的催化域，但是還可以源自其它芽孢桿菌菌種。預期的a-淀粉酶催化域的具體實例包括，與專利申請PCT/DK2005/000819(通過引用并入本文)中SEQIDNO:35中所示來自地衣芽孢桿菌的淀粉酶(BLA),SEQIDNO:41中所示來自地衣芽孢桿菌變體LE429的淀粉酶，SEQIDNO:36中所示來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的淀粉酶(BSG)，SEQIDNO:37中所示來自解淀粉芽孢桿菌的淀粉酶(BAN),SEQIDNO:38中所示來自5./za/o^ra"ceSP722的淀粉酶，SEQIDNO:39中所示的淀粉酶SP690，SEQID:40中所示的淀粉酶AA560具有至少60。/。，至少70%,至少80%或甚至至少90%同一性的淀粉酶催化域。催化域還可以源自嗜糖假單胞菌(尸"w^mowassacc/wra/^7fa)的淀粉酶，如來自WO04/111217(通過引用并入本文)中作為SEQIDNO:l公開的淀粉酶。在本發(fā)明的實施方案中，包含CBM的細菌a-淀粉酶是包含催化域的酶，所述催化域與WO99/19467(通過引用并入本文)中的SEQIDNO:1、2或3中所示序列中任一個具有至少70%，優(yōu)選至少80°/。，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少90%，如至少95%,至少96%,至少97%，至少98%或至少99%同一性。芽孢桿菌屬a-淀粉酶催化域還可以是變體和/或雜合體序列，特別是WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059和WO1002/10355(全部通過引用并入本文)中任一篇所述的。特別預期的a-淀粉酶變體公開于美國專利Nos.6,093,562,6，187,576和6，297，038(全部通過引用并入本文)并包括在WO96/23873中公開的-參見例如，第20頁，第1-10行(通過引用并入本文)-具有雙缺失的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶(BSGa-淀粉酶)變體，優(yōu)選與WO"/19467(通過引用并入本文)中公開的SEQIDNO:7所列的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比，對應于5(181-182)。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌屬a-淀粉酶催化域，特別是嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶，其具有對應于S(181-182)的雙缺失并與WO99/19467中公開的SEQIDNO:3所列的野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比進一步包含N193F取代(也表示為I181*+G182*+N193F)。在特別優(yōu)選的實施方案中，包含CBM的細菌a-淀粉酶是源自爿"o砂6"c說wco"to/w'""m的菌才朱的野生型細菌a-淀粉酶。優(yōu)選地，包含CBM的細菌a-淀粉酶具有本文SEQIDNO:l所示的序列。還優(yōu)選的是與本文SEQIDNO:l具有至少70。/。同一性，例如至少80%或甚至至少90%的同一性，如至少95%，至少96%,至少97%,至少98%，或至少99%同一性的多肽。在其它的實施方案中，包含CBM的細菌a-淀粉酶是在PCT/DK2005/000819中作為SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14(通過引用并入本文)公開的雜合酶之一或者與這些序列之一同源的MSt亭列。可以以O.OOl至l.Omg/gDS，優(yōu)選以0.01至0.5mg/gDS的量，更優(yōu)選以0.02至0.2mg/gDS的量使用細菌a-淀粉酶。以AFAU測量，可以以O.Ol-lOAFAU/gDS的量，以0.05-2.5AFAU/gDS的量，或更優(yōu)選以0.1-1AFAU/gDS，如大約0.5AFAU/gDS的量4吏用細菌a-淀粉酶。以KNU測量，可以以0.001-10KNU/gDS的量，以0.005-2KNU/gDS的量，或更優(yōu)選以0.01-0.2KNU/gDS,如大約0.035KNU/gDS的量使用細菌a-淀粉酶。包含CBM的真菌a-淀粉酶將術語"包含CBM的真菌a-淀粉酶"理解為包含催化域和CBM的酶，所述催化域和所述CBM都源自真菌來源。包含CBM的真菌a-淀粉酶可以是野生型真菌酶、這樣的野生型真菌酶的變體或雜合酶，其包含真菌a-淀粉酶催化域和真菌CBM。在一個實施方案中，野生型酸性a-淀粉酶源自川地曲霉(X^wg/〃wAavrac/7/)的菌抹，特別是在WO2005/003311的SEQIDNO:41中所示的多肽或同源序列，例如包含以下一個或多個取代的所述多肽的變體G33A、L36K、S74A、D75Y、E77D、P120A、1153D、D154N、W155Y、D156E、N157D、L158Q、Q162E、E166L、T169N、1170T、E199K、E199L、D232L、N233D、N235D、L238Y、D239T、W256Y、Q257P、E331Q、S336A、D339K、D339N、V340D和Y342A。最優(yōu)選的變體包含下列一個或多個取代S74A、E166L、E199L、D339K和D156E。然而更優(yōu)選的是具有多個取代S74A/E166L/E199L的變體。在優(yōu)選的實施方案中，包含CBM的真菌a-淀粉酶是雜合a-淀粉酶。真菌雜合酶，如本文所指，包括含有連接(即，共價連結)于包含碳水化合物結合模塊(CBM)的氨基酸序列的真菌來源的a-淀粉酶(EC3.2丄1)的氨基酸序列的種類，優(yōu)選真菌來源的。適用于本發(fā)明方法使用的雜合酶的真菌a-淀粉酶催化域包括源自曲霉屬04werg/〃w)的菌抹的酸性a-淀粉酶，如米曲霉0^/wg/〃wwyzae)和黑曲霉(Apew說Mw'ge。a-淀粉酶。優(yōu)選的真菌a-淀粉酶是Fungamyl-樣a-淀粉酶，其優(yōu)選源自米曲霉的菌抹。在本公開中，術語"Fungamyl-樣a-淀粉酶，，表示與WO96/23874的SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的成熟部分顯示高同一性，即至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少％%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一性的a-淀粉酶。優(yōu)選的雜合酶包含F(xiàn)ungamyl-樣a-淀粉酶催化域和源自羅耳阿太菌(Ara訴")葡糖淀粉酶的CBM。適用于本發(fā)明方法使用的雜合酶的另一個優(yōu)選的酸性a-淀粉酶催化域源自黑曲霉菌林。在優(yōu)選的實施方案中，酸性真菌a-淀粉酶是來自Swiss-prot/TeEMBL數據庫中以原始登錄號P56271作為"AMYA—ASPNG"公開的黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶，并在WO89/01969(實施例3)中更詳細地描述。也將酸性黑曲霉酸性a-淀粉酶表示為WO2005/003311中的SEQIDNO:8。優(yōu)選的酸性a-淀粉酶淀粉酶催化域還包含所述酸性真菌淀粉酶的變體，其與WO2005/003311中的SEQIDNO:8具有至少70%同一性，如至少80%或至少90%同一性，如至少95%,至少96%,至少97%,至少98%，或甚至至少99%同一性。優(yōu)選地，包含CBM的真菌a-淀粉酶是WO2005/003311中公開的變體JA01。適用于本發(fā)明方法使用的雜合酶的另一個優(yōu)選的酸性a-淀粉酶淀粉酶催化域是專利申請PCT/US05/46725(通過引用并入本文)中公開的任何a-淀粉酶催化域，且優(yōu)選催化域源自其中公開的任何菌種，特別地選自由如下組成的組細毛嗜熱霉(772wmomj;c&s/am^"ow力，特別是具有PCT/US05/46725(通過引用并入本文)的SEQIDNO:14中氨基酸1-441的多肽；畸枝霉屬的菌種(Ma/6ra"c/zeasp.)，特別是具有SEQIDNO:18中氨基酸1-471的多肽；微小根毛霉(i/n'zomwcor;ws/〃w)，特別是具有SEQIDNO:20中氨基酸1-450的多肽；D/c/wtomoc/aAww/ze^e/^e/,特別是具有SEQIDNO:22中氨基酸1-445的多肽；韌革菌屬的菌種OStewmsp.)，特別是具有SEQIDNO:26中氨基酸1-498的多肽；栓菌屬的菌種(rrametessp.)，特別是具有SEQIDNO:28中氨基酸18-513的多肽；鮭貝革蓋菌(Cw7V/wcww0ra)，特別是具有SEQIDNO:30中氨基酸1-507的多肽；刺杯毛孢屬的菌種(Z^"e/nas/on'wwsp.),特別是具有SEQIDNO:32中氨基酸1-481的多肽；0，toypon'o/^sp.,特別是具有SEQIDNO:34中氨基酸1-495的多肽；色二孢屬的菌種(Dzj9/0&asp.)，特別是具有SEQIDNO:38中氨基酸1-477的多肽；粘帚霉屬的菌種(G//oc/aAwmsp.)，特別是具有SEQIDNO:42中氨基酸1-449的多肽；叢赤殼屬的菌種(iVe"Wasp.)，特別是具有SEQIDNO:115中氨基酸1-442的多肽；鐮孢屬的菌種(Fwan'"msp.),特別是具有SEQIDNO:4中氨基酸1-480的多肽；具有SEQIDNO:6中氨基酸1-478的多肽；或具有SEQIDNO:117中氨基酸1-441的多肽；橙色嗜熱子嚢菌(77^m2oaycw做ra""cw",特別是具有SEQIDNO:125中氨基酸1-477的多肽；雅致枝霉(77zam/"^wme/egam),特別是具有SEQIDNO:131中氨基酸1-446的多肽；冠毛犁頭霉(JfoWacn、toto),特別是具有SEQIDNO:157中氨基酸41-481的多肽；枝頂孢霉屬的菌種(v4cwmom'"msp.)特別是具有SEQIDNO:159中氨基酸22-626的多肽；Com'oc/^etosp.,特別是具有SEQIDNO:161中氨基酸24-630的多肽；Mer—^;g""/ew，特別是具有SEQIDNO:163中氨基酸27-602的多肽；青霉屬的菌種(尸em'c做wwsp.),特別是具有SEQIDNO:165中氨基酸21-643的多肽；淤泥鏈霉菌(&reptomjces//wosws)，特別是具有SEQIDNO:167中氨基酸29-566的多肽；Sw^/Z^orapracwrvato，特別是具有SEQIDNO:169中氨基酸22-613的多肽；總狀共頭霉(5^"ce;^a/^m^racewoswm)，特別是具有SEQIDNO:171中氨基酸21-463的多肽；皺褶栓菌(rrawefescwm^ato),特別是具有SEQIDNO:173中氨基酸21-587的多肽；7>/c/2o;/2aearaccato，特別是具有SEQIDNO:175中氨基酸30-773的多肽；Fa/^Wa廠wZ)n'com,特別是具有SEQIDNO:177中氨基酸22-586的多肽；Fa/saWa^"W//，特別是具有SEQIDNO:179中氨基酸20-582的多肽。還優(yōu)選的是a-淀粉酶淀粉酶催化域，其具有與上述多肽同源的序列。最優(yōu)選地，雜合體包含專利申請PCT/US05/46725(通過引用并入本文)中公開的CBM,優(yōu)選地CBM來自選自下組的葡糖淀粉酶尸ac/zj^ytosporapapayracea(SEQIDNO:76)、環(huán)帶栓菌(rram"es"'"gw/afa)(SEQIDNO:78)、大白樁蒜(丄e"co/7ax/〃"sg/ga"ft/力(SEQIDNO:80)、羅耳阿太菌(^決e/^ra訴//)(SEQIDNO:92)、川地曲霉(SEQIDNO:94)、黑曲霉(SEQIDNO:96)或來自選自下組的a-淀粉酶PCT/US05/46725(通過引用并入本文)中的7Hc/zc;p/2eraearaccato(SEQIDNO:52)、orapravwrrato(SEQIDNO:82)、^&an'an^hcoM(SEQIDNO:84)、枝頂孢霉屬的菌種(SEQIDNO:86)、Mm>〃w5g/gawtews(SEQIDNO:88)、/4"ox;^a"7/z^co幽m/""ra(SEQIDNO:90)、Cbc/weto取(SEQIDNO:98)、C畫'oc/zaetos/.(SEQIDNO:137)、皺褶對全菌(rrametescorragato)(SEQIDNO:139)、Fa/rahos;^r招(SEQIDNO:141)和青霉屬的菌種(SEQIDNO:143)。還優(yōu)選的是與上述序列中的任一個同源的序列。還優(yōu)選用于本發(fā)明的是專利申請PCT/US05/46725中公開的V001、V002、V003、V004、V005、V006、V007、V008、V009、V010、VOll、V012、V013、V014、V015、V016、V017、V018、V019、V021、V022、V023、V024、V025、V026、V027、V028、V029、V030、V031、V032、V033、V034、V035、V036、V037、V038、V039、V040、V041、V042、V043、V047、V048、V049、V050、V051、V052、V054、V055、V057、V059、V060、V061、V063、V064、V065、V066、V067、V068和V069，并且通過引用并入本文。還優(yōu)選的是與上述序列中的任一個同源的序列。更優(yōu)選的是包含CBM的真菌a-淀粉酶，其中真菌a-淀粉酶催化域是與SEQIDNO:4的氨基酸13至450具有至少70%同源性的氨基酸序列，其優(yōu)選來自微小根毛霉和/或真菌CBM是與SEQIDNO:2的氨基S臾488至595具有至少70%同源性的氨基酸序列，優(yōu)選源自黑曲霉的菌抹的序列，優(yōu)選源自黑曲霉葡糖淀粉酶的序列。最優(yōu)選地，包含CBM的真菌a-淀粉酶是PCT/US05/46725中公開的雜合體V039，其包含來自微小根毛霉a-淀粉酶的CD和來自黑曲霉葡糖淀粉酶的接頭和CBM,并具有如本文SEQIDNO:2中氨基酸13-595所示的序列。可以以0.001至1.0mg/gDS的量，優(yōu)選以0.01至0.5mg/gDS的量，更優(yōu)選以0.02至0.2mg/gDS的量^f吏用真菌a-淀4分酶。以AFAU測量，可以以0.01-10AFAU/gDS的量，以0.05-2.5AFAU/gDS的量，或更優(yōu)選以0.1-1AFAU/gDS,如大約0.5AFAU/gDS的量使用真菌a-淀粉酶。葡糖淀粉酶術語"葡糖淀粉酶活性"表示葡聚糖l,4-a-葡萄糖普酶，其連續(xù)從鏈的非-還原末端水解末端l,4-連接的a-D-葡萄糖殘基，釋放P-D-葡萄糖，其屬于EC3.2.1.3酶類。用于本發(fā)明方法的葡糖淀粉酶可以具有PCT/US05/46724的SEQIDNO:2中公開的氨基酸序列，并在本文顯示為SEQIDNO:3或與SEQIDNO:3具有至少70%、優(yōu)選至少75%、或至少80%、或至少85%、或90%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%同一性。葡糖淀粉酶可以優(yōu)選源自環(huán)帶栓菌?？蛇x才奪地，用于本發(fā)明方法的葡糖淀粉酶可以具有PCT/US05/01147作為SEQIDNO:2的氨基酸殘基l至561顯示的氨基酸序列，或與所述SEQIDNO:2(氨基酸殘基l至561)具有至少70。/。、優(yōu)選至少75%、或至少80%、或至少85%、或90%、或至少95%、至少96%、至少97°/。、至少98%或甚至至少99%同一性的氨基酸序列。葡糖淀粉酶可以優(yōu)選源自羅耳阿太菌。還優(yōu)選的是WO99/28448中公開的源自ra/arow_ycaseweraom7的葡糖淀粉酶和Boel等，(1984)，EMBOJ.3(5)p.1097-1102中公開的源自黑曲霉的葡糖淀粉酶。黑曲霉葡糖淀粉酶可從NovozymesA/S作為SprizymeP1usTm和SprizymeFuelTM獲得?？梢砸?.01至2.0mg/gDS的量，優(yōu)選以0.05至1.0mg/gDS的量，更優(yōu)選以0.1至0.5mg/gDS的量使用葡糖淀粉酶。以AGU測量，可以以O.Ol-lOAGU/gDS的量，以0.05-2.5AGU/gDS的量，或更優(yōu)選以0.1-1AGU/gDS,如約0.5AGU/gDS的量使用葡糖淀粉酶。蛋白酶根據本發(fā)明的方法，可以在糖化和/或發(fā)酵期間還提供蛋白酶。在優(yōu)選的實施方案中，蛋白酶是微生物來源的酸性蛋白酶，優(yōu)選真菌或細菌來源的。合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和細菌蛋白酶。優(yōu)選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，蛋白酶，其特征為在酸性條件(低于pH7，優(yōu)選3.5至6，或更優(yōu)選4至5)下水解蛋白的能力。期望的酸性真菌蛋白酶包括源自如下的真菌蛋白酶曲霉屬、毛霉屬(Mwcor)、才艮霉屬(//n'zo;ws)、念J朱菌屬(Qmc^a)、革蓋菌屬(CoWo/w)、內座殼屬(五"fifc^/"^)、_￡>2//7(W70_p/7^^、l巴菌屬(7r/ex)、青霉屬(尸em.c/〃/w附)、'J、核菌屬(5Wera"wm)和球擬酵母屬(7brw/opw;y)的真菌蛋白酶。特別期望的是源自黑曲霉(參見例如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)、齋藤曲霉(J5perg7'〃MSsa"o/)(參見例3口，Yoshida,(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)、泡盛曲霉(v4，rg/腸a而膨n')(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5),927-933)、棘孢曲霉C^/^g/〃wacw/e"/w力(WO95/02044)或米曲霉(Js;erg/〃twoo^ae),如pepA蛋白酶；以及來自孩丈小毛霉(A/wcor;ms〃/w力或米黑毛霉(Mwcor脂'e/ze/)的酸性蛋白酶。期望的還有中性或堿性蛋白酶，如源自芽孢桿菌屬的菌抹的蛋白酶。特別預期用于本發(fā)明的蛋白酶源自解淀粉芽孢桿菌并具有可在Swissprot作為登錄號P06832獲得的序列。還期望的是與可在SwissProt作為登錄號P06832獲得的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或特別是至少99%的同一性的蛋白酶。進一步期望的是與WO2003/048353中作為SEQ,ID.NO:l公開的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98°/?；蛱貏e是至少99%的同一性的蛋白酶。還期望的是木瓜蛋白酶-樣蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)之內的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain))、EC3.4.22.7(蘿蘼蛋白酶(asclepain》、EC3.4.22.14(actinidain)、EC3.4.22.15(組織蛋白酶(cathepsin)L)、EC3.4.22.25(甘氨酰內肽酶(glycylendopeptidase))和EC3.4.22.30(caricain)。可以以0.1-1000AU/kgdm，優(yōu)選1-100AU/kgDS和最優(yōu)選5-25AU/kgDS的量添加蛋白酶。其它成分16在糖化和/或發(fā)酵期間可以提供其它成分以增加本發(fā)明方法的有效性。例如，營養(yǎng)物(例如發(fā)酵生物體微量營養(yǎng)物)、抗生素、鹽(例如鋅鹽或鎂鹽)、其它酶如肌醇六磷酸酶、纖維素酶、半纖維素酶、外切和內切葡聚糖酶以及木聚糖酶。發(fā)酵產物的回收在發(fā)酵后可任選地回收發(fā)酵產物，如乙醇?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)方式(例如蒸餾)來進行回收。本文中描述和要求保護的本發(fā)明不局限于本文公開的具體實施方案的范圍，因為這些實施方案意欲作為本發(fā)明的幾個方面的說明。任何等同的實施方案意欲在本發(fā)明的范圍之內。實際上，從前面的說明，除本文顯示和描述的那些之外，本發(fā)明的各種修飾對于本領域的那些技術人員是顯而易見的。這些修飾也意欲落入所附權利要求的范圍內。在沖突的情況下，以包括定義的本公開為準。本文引用了各種參考文件，其公開內容通過引用整體并入。材料與方法葡糖淀粉酶酸性細菌a-淀4分酶(ABAA)源自」"o;c;^a"7/wsco"tom/"(ms并具有SEQIDNO:l中所示的序列。酸性真菌(x-淀粉酶(AFAA)包含微小根毛霉a-淀粉酶催化域和黑曲霉葡糖淀粉酶接頭和CBM并具有SEQIDNO:2中所示的序列。源自黑曲霉的葡糖淀粉酶在Boel等，(1984),EMBOJ.3(5)p.1097-1102中公開并且可從NovozymesA/S獲得。葡糖淀粉酶源自環(huán)帶栓菌并且具有SEQIDNO:3中所示的序列。酵母RedStar頂可以從RedStar/Lesaffre,USA獲得。同源性/同一性在本發(fā)明的上下文中，多肽"同一性"指兩個氨基酸序列之間的同一性程度?？赏ㄟ^本領域已知的計算機程序，如GCG程序包(ProgramManualfortheWisconsinPackage,8版，1994年8月，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，G,D.，(1970)JournalofMolecularBiology,48，443-453)中提供的GAP合適地確定同一性。使用多肽序列比較的下列設置GAP產生罰分為3.0和GAP延伸罰分為0.1。術語"同源序列，，用于表征與已知序列具有至少70%、優(yōu)選至少75%、或至少80%、或至少85%、或90%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%同一性的序列。用于同源性確定的氨基酸序列的相關部分是成熟多肽，即沒有信號肽。a-淀粉酶活性(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物來確定淀粉分解活性。該方法基于改性馬鈴薯淀粉通過酶的分解，并通過將淀粉/酶溶液的樣品與^典溶液混合來跟蹤反應。起初，形成藍黑色，但是在淀粉分解過程中，藍色變弱并逐漸變?yōu)榧t褐色，其與有色的玻璃標準物相比。將一個KiloNovoa-淀粉酶單位(KNU)定義為在標準條件下(即在37。C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)將5260mg淀4分干物質MerckAmylumsolubile糊精化的酶量。更詳細描述該分析方法的文件夾EB-SM-0009.02/01可根據向NovozymesA/S，Denmark要求而獲得，所述文件夾通過引用并入本文。酸性a-淀粉酶活性當根據本發(fā)明使用時，任何酸性a-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)測量。可選擇地，酸性a-淀粉酶的活性可以以AAU(酸性a-淀粉酶單位)測量。酸性a-淀粉酶單位(AAU)可以以AAU(酸性a-淀粉酶單位)測量酸性a-淀粉酶活性，這是一種絕對(absolute)方法。一個酸性淀粉酶單位(AAU)是在標準化的條件下，每小時將lg淀粉(100。/。干物質)轉化為產物的酶量，所述產物在與已知強度(strength)的碘溶液反應后在620nm處具有與顏色參照之一等同的發(fā)射(transmission)。標準條件/反應條件底物可溶性淀粉濃度約20gDS/L.緩沖液檸檬酸鹽，約0.13M,pH二4.2碘溶液40.176g碘化鉀+0.088g硤/L自來水15。-20。dH(德國硬度(Germandegreehardness))pH:4.2溫育溫度30oC18反應時間ll分鐘波長620nm酶濃度0.13-0.19AAU/mL酶工作范圍0.13-0.19AAU/mL淀粉應為Lintner淀粉，其為在實驗室中用作比色指示劑的稀糊淀粉(thin-boilingstarch)。通過將天然淀粉用稀鹽酸處理，使其保持與石典生成藍色的能力，從而獲得Lintner淀粉。進一步細節(jié)可以在歐洲專利No.140410中找到，其公開通過引用并入本文。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)可以以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)測量酸性a-淀粉酶活性，其相對于酶標準物確定。將lFAU定義為在下述標準條件下每小時降解5.260mg淀粉干物質的酶量。酸性a-淀粉酶，一種內切-a-淀粉酶(l，4-a-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C3.2丄1)，水解淀粉分子內部區(qū)中的a-l,4-糖苷鍵以形成不同鏈長的糊精和寡糖。與碘形成的顏色的強度與淀粉濃度成正比。使用反向比色法在特定的分析條件下測定淀粉濃度的減少作為淀粉酶活性。淀粉+碘""定麟糊精+寡糖40°C，2.5A=590廳藍/紫1=23秒脫色標準條件/反應條件底物可溶性淀粉約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，約0.03M碘(12):0,03g/LCaCl2:1.85mMpH:2.50±0.05溫育溫度40oC反應時間23秒波長590nm酶濃度0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL更詳細描述該分析方法的文件央EB-SM-0259.02/01可根據向NovozymesA/S,Denmark要求而獲得，所述文件夾通過引用并入本文。葡糖淀粉酶活性可以以AGI單位測量或以淀粉葡萄糖芬酶單位(AGU)測量葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶活性(AGI)葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡萄糖苷酶)將淀粉轉化為葡萄糖。在此通過用于活性測定的葡萄糖氧化酶方法來確定確定葡萄糖的量。該方法在AmericanAssociationofCerealChemists,2000;ISBN:1-891127-12匿8中，于"ApprovedmethodsoftheAmericanAssociationofCerealChemists".Vol.1-2AACC中的76-11節(jié)"淀粉-葡糖淀粉酶方法及用葡萄糖氧化酶進行葡萄糖的后續(xù)測量"中描述。一個葡糖淀粉酶單位(AGI)是在該方法的標準條件下每分鐘形成l微摩葡萄糖的酶量。標準條件/反應條件底物可溶性淀粉，濃度約16g千物質/L.緩沖液乙酸鹽，約0.04M,pH二4.3pH:4.3溫育溫度60°C反應時間15分鐘反應的終止NaOH至約0.2g/L的濃度(pH9)酶濃度0.15-0.55AAU/mL.淀粉應該是Linter淀粉，這是在實驗室中用作比色指示劑的稀糊淀粉。將天然淀粉用稀鹽酸處理，使其保持與碘生成藍色的能力，從而獲得Lintner淀粉。葡糖淀粉酶活性(AGU)將Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在標準條件下每分鐘水解l微摩爾麥芽糖的酶量，所述標準條件為37。C、pH4.3，底物麥芽糖23.2mM,緩沖液乙酸鹽0.1M，反應時間為5分鐘?？梢允褂米詣臃治鱿到y(tǒng)。向葡萄糖脫氫酶試劑中加入變旋酶(mutarotase)，從而將存在的任何a-D-葡萄糖轉化成P-D-葡萄糖。在上述反應中，葡萄糖脫氫酶特異性地與(3-D-葡萄糖反應形成NADH，使用光度計在340nm處測定形成的NADH，作為測定起始葡萄糖濃度的量度。AMG溫育底物麥芽糖23.2mM緩沖液乙酸鹽0.1MpH:4.30±0.05溫育溫度37°C±1反應時間5分4中酶工作范圍0.5-4.0AGU/mL顯色反應GlucDH:430U/L變旋酶9U/LNAD:0.21mM緩沖液磷酸鹽0.12M;0.15MNaClpH:7.60±0.05溫育溫度37°C士1反應時間5分鐘波長340nm更詳細描述這種分析方法的文件夾(EB-SM-0131.02/01)可根據向NovozymesA/S，Denmark要求而獲得，所述文件夾通過引用并入本文。蛋白水解活性(AU)可以用變性血紅蛋白作為底物來確定蛋白水解活性。在用于確定蛋白水解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化變性的血紅蛋白，并用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血紅蛋白。用酚試劑確定TCA可溶產物的量，所述酚試劑與酪氨酸和色氨酸顯藍色。將一個Anson單位(AU)定義為在標準條件(即25。C、pH"和10分鐘反應時間)下以初始速率消化血紅蛋白，^f吏得每分鐘釋放一定量的TCA可溶產物的酶量，所述可溶產物與酚試劑給出與一毫當量(milliequivalent)酪氨酸相同的顏色。更詳細描述這種分析方法的文件夾AF4/5可4艮據向NovozymesA/S,Denmark要求而獲得，所述文件夾通過引用并入本文。實施例l:從194.44g粉碎的玉米(corn)(90Q/。小于0.5mm),305.56g37mMNaOAc，0.025%疊氮化鈉，20mMCaCl2,pH4.5制備35%DS漿料。用5NNaOH將pH調節(jié)至4.5并將漿料在室溫攪拌溫育一小時。對于每個反應將5g漿料加入20ml管，并在添加酶之前將管在32。C溫育一小時。在每個管中添加適量的酶，如表l所示，加蓋并立即渦旋。將管在32。C溫育并在0.5、1、2、3和4小時時渦旋。在4小時處通過添加50micrL40%112804終止反應。每個反應重復進行三次。樣本制備包括將上清液離心并將其通過0.45微米濾器過濾。將等待HPLC分析的樣本保存于4。C。HPLC結果在下面表1中顯示。表l.與多種葡糖淀粉酶(GA),細菌a-淀粉酶(BAA)和真菌a-淀粉酶(FAA)的組合溫育后水解產物中的糖濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例2將磨碎的玉米410g(90%小于0.5mm)與590g自來水(tapwater)、3,0mL1g/L青霉素和lg尿素混合。用5NNaOH將pH調節(jié)至4.5。DS水平確定為35。/。。對于每個反應將5g此漿料加入20ml管中。根據表2或3在每個管中添加適量的酶，接著添加200microL酵母增殖物/5g發(fā)酵物，然后在32。C溫育。每個處理進行9次重復發(fā)酵。在24小時、48小時和70小時時間點選擇3個重復進行分析。將管在24、48和70小時時渦旋。時間點分析包括管稱重和為HPLC準備樣本。HPLC準備包括通過添加50microL40%112804終止反應、離心和通過0.45um濾器過濾。將等待HPLC分析的樣本保存在4。C。HPLC結果在表2中顯示。表2.與環(huán)帶栓菌葡糖淀粉酶(GA)、細菌a-淀粉酶(BAA)和真菌a-淀粉酶(FAA)的組合及酵母溫育后的乙醇產率(yield)。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>權利要求1.一種方法，其包括使用如下物質將顆粒狀淀粉糖化a)葡糖淀粉酶，b)包含碳水化合物結合模塊(CBM)的細菌α-淀粉酶，和，c)包含CBM的真菌α-淀粉酶，以產生淀粉水解物。2.權利要求l的方法，還包括將所述淀粉水解物與發(fā)酵生物體接觸以產生發(fā)酵產物。3.權利要求1或2中任一項的方法，其中糖化和發(fā)酵同時進行。4.權利要求l-3中任一項的方法，其中在發(fā)酵后回收所述發(fā)酵產物。5.權利要求l-4中任一項的方法，其中所述發(fā)酵產物是醇，優(yōu)選乙醇，尤其是燃料乙醇，可飲用乙醇和/或工業(yè)乙醇。6.權利要求l-5中任一項的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶和/或包含CBM的細菌a-淀粉酶是酸性真菌a-淀粉酶和/或酸性細菌a-淀粉酶。7.權利要求l-6中任一項的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶和/或包含CBM的細菌a-淀粉酶是包含CBM的野生型酶或野生型酶的遺傳修飾的變體。8.權利要求l-7中任一項的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶源自川地曲霉的菌抹。9.權利要求l-8中任一項的方法，其中所述包含CBM的細菌a-淀粉酶源自黃熱芽孢桿菌的菌抹。10.權利要求l-9中任一項的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶和/或包含CBM的細菌a-淀粉酶是雜合酶，優(yōu)選包含a-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物結合模塊(CBM)和任選的接頭的雜合酶。11.權利要求1-10中任一項的方法，其中所述真菌a-淀粉酶催化域是與SEQIDNO:4的13至450位氨基酸具有至少70°/。同源性的氨基酸序列，優(yōu)選源自微小根毛霉。12.權利要求l-ll中任一項的方法，其中所述真菌CBM是與SEQIDNO:2的488至595位氨基酸具有至少70。/。同源性的氨基酸序列，優(yōu)選源自黑曲霉的菌抹的序列，優(yōu)選源自黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶的序列。13.權利要求1-12中任一項的方法，其中所述包含CBM的真菌a-淀粉酶是與SEQIDNO:2的13至595位的氨基酸具有至少70%同源性的氨基酸序列。14.權利要求1-13中任一項的方法，其中所述細菌a-淀粉酶催化域是與SEQIDNO:1的32至520位的氨基酸具有至少70%同源性的氨基酸序列。15.權利要求1-14中任一項的方法，其中所述細菌a-淀粉酶催化域和/或CBM源自黃熱芽孢桿菌。16.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述細菌CBM是與SEQIDNO:1的521至619位氨基酸具有至少70%同源性的氨基酸序列。17.權利要求1-16中任一項的方法，其中所述葡糖淀粉酶源自羅耳阿太菌04欣^^//^')、環(huán)帶栓菌或黑曲霉。18.權利要求1-17中任一項的方法，其中所述方法在存在蛋白酶或肌醇六磷酸酶的條件下進行。19.權利要求1-18中任一項的方法，其中所述含淀粉的材料從塊莖、根、莖、果實或全谷物中獲得。20.權利要求1-19中任一項的方法，其中所述含淀粉的材料從谷類中獲得。21.權利要求l-20中任一項的方法，其中所述含淀粉的材料從玉米、穗軸、小麥、大麥、黑麥、買羅高粱、西米、木薯(cassava)、樹薯、木薯(tapioca)、高粱、稻或馬鈴薯中獲得。22.權利要求1-21中任一項的方法，其中所述方法在3-7，優(yōu)選3.5-6或更優(yōu)選4-5的pH進行。23.權利要求l-22中任一項的方法，其中干固體含量(DS)為20-55wt,%,優(yōu)選25-40wt,%,更優(yōu)選30-35wt.-G/o的范圍。24.權利要求l-23中任一項的方法，其中在糖化和發(fā)酵期間將糖濃度保持在約3wt.%以下或低于約3wt.%的水平。25.權利要求l-24中任一項的方法，其中通過將含淀粉材料粉碎至0.1-0.5mm的粒度來制備粉碎的含淀粉材料。26.權利要求l-25中任一項的方法，其中所述粉碎的含淀粉材料是通過干磨或濕磨獲得的顆粒狀淀粉。27.權利要求l-26中任一項的方法，其中所述粉碎的含淀粉材料是全谷物。28.權利要求l-27中任一項的方法，其中在發(fā)酵期間的溫度為28°C-36°C，例如29。C-35°C,例如30。C-34。C，例如大約32。C。29.適合糖化顆粒狀淀粉的組合物，所述組合物包含含有碳水化合物結合模塊(CBM)的細菌a-淀粉酶，以及含有CBM的真菌a-淀粉酶。30.權利要求29的組合物，其還包含葡糖淀粉酶。31.權利要求29或30中任一項的組合物，其還包含一種或多種選自下組的酶蛋白酶、肌醇六磷酸酶、纖維素酶、半纖維素酶、外切葡聚糖酶和內切葡聚糖酶，和木聚糖酶。全文摘要本發(fā)明涉及用于產生淀粉水解物和任選的發(fā)酵產物，如乙醇的方法。文檔編號C12P19/14GK101466844SQ200780021874公開日2009年6月24日申請日期2007年6月15日優(yōu)先權日2006年6月15日發(fā)明者卡斯滕·安德森,吉姆·劉,安德斯·維克索-尼爾森申請人:諾維信公司;諾維信北美公司