專利名稱：：來自細(xì)菌的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶涉及聚酮化合物合酶的活化來合成長鏈多不飽和脂肪酸(例如，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。相關(guān)技術(shù)的說明在大多數(shù)有機(jī)體中脂肪酸生物合成的主要產(chǎn)物是16-和18-碳化合物。這些脂肪酸的鏈長度和不飽和度的相對比例在物種之中廣泛地變化。例如，哺乳動物主要產(chǎn)生飽和的和單不飽和脂肪酸，而大多數(shù)高等植物生產(chǎn)具有一個、兩個或三個雙鍵的脂肪酸，后兩者包含多不飽和脂肪酸(PUFA)。已經(jīng)報道了非常長鏈的PUFA,例如二十二碳六烯酸(DHA,22:6)二十碳五烯酸(EPA,20:5)來自幾個物種的海洋細(xì)菌,包括Mor/te〃a()man7a和5Tze麗we〃a印.(美國專利6,140,486)，以及來自》每'簾侈寸長口ScAz'zoc/z;^n.Mms/.禾口77^aw5toc/^^7'wm(美國專利公開20040235127)。兩種主要的PUFA家族是co-3脂肪酸(也稱為"n-3"脂肪酸)，例子是二十二碳六烯酸，以及co-6脂肪酸(也稱為"n-6"脂肪酸)，例子是花生四烯酸(ARA，20:4)。PUFA是細(xì)胞的質(zhì)膜和脂肪組織的主要成分，在其中它們可以分別以磷脂和甘油三酯存在。PUFA是哺乳動物中適當(dāng)?shù)陌l(fā)育所必需的，特別是在嬰兒腦部的發(fā)育中，以及對于組織形成和修復(fù)是必需的。幾種失調(diào)響應(yīng)于PUFA的治療。補(bǔ)充PUFA已經(jīng)顯示了降低血管成形術(shù)后再狹窄的幾率。還已經(jīng)很好地記載了某些膳食的od-3脂肪酸對于心血管疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的健康效益(Simopoulos,1997;James"a/.，2000)。進(jìn)一步的，PUFA已經(jīng)被暗示用于治療哮喘和銀屑病。證據(jù)表明，PUFA可能涉及鈣代謝，表明PUFA可能在骨質(zhì)疏松癥的治療或預(yù)防以及腎臟或泌尿道結(jié)石的治療或預(yù)防中是有用的。對于健康效益的大部分證據(jù)適用于長鏈co-3脂肪、EPA和DHA，其存在于魚類和魚油中。在這種證據(jù)的基礎(chǔ)上，加拿大(ScientificReviewCommittee,1990,NutritionRecommendations,MinisterofNationalHealthandWelfare,Canada,Ottowa)、歐洲(deDeckererwa/.，1998)、英國(TheBritishNutritionFoundation,1992，Unsaturatedfatty-acids-nutritionalandphysiologicalsignificance:ThereportoftheBritishNutritionFoundation'sTaskForce,ChapmanandHall,London)和美國(SimopoulosWa/.,1999)的健康專家和營養(yǎng)學(xué)家建議提高這些PUFA的膳食消耗。重要的主要的長鏈PUFA包括DHA和EPA，其主要在不同類型的魚油中存在，以及ARA,其在絲狀真菌例如Mortierella(被孢霉屬)中發(fā)現(xiàn)。對于DHA,存在著大規(guī)模生產(chǎn)的許多來源，包括多種海洋生物、從冷水海洋魚類獲得的油、以及蛋黃級分。然而，存在著與從天然來源大規(guī)模生產(chǎn)PUFA相關(guān)的幾個缺點(diǎn)。PUFA的天然來源，例如動物和真菌，傾向于具有高度異質(zhì)性的油成分。因而從這些來源獲得的油可能需要廣泛的純化來分離出一種或多種期望的PUFA，或來產(chǎn)生富集了一種或多種PUFA的油。PUFA的天然來源還在可用性方面受到不受控制變動的支配。魚類資源可能經(jīng)歷天然的變異或可能由于過量捕撈而耗盡。此外，即時有著它們的治療效益的壓倒性證據(jù)，關(guān)于co-3脂肪酸的膳食建議沒有被注意。魚油劑具有令人不快的味道和氣味，這不可能從期望的產(chǎn)物中經(jīng)濟(jì)地分離出來，使得這種產(chǎn)物作為食品添加劑是無法接受的。動物油，特別是魚油，可能積累環(huán)境污染物。食物可以富含魚油，但是，這種富含由于成本以及在世界范圍內(nèi)魚類資源的衰減是成問題的。這個問題對于全魚的消費(fèi)和攝食也是障礙。盡管如此，如果提高魚類攝食的健康信息被社會接受，在滿足對魚類的需求方面可能有問題。此外，這種工業(yè)的穩(wěn)定性是成問題的，其嚴(yán)重地依賴水產(chǎn)業(yè)飼養(yǎng)的野生魚類資源(Naylor^a/.,2000)。其他的自然局限性促成了生產(chǎn)co-3脂肪酸的新方法。天氣和疾病可能引起魚類產(chǎn)量的變動。有機(jī)體例如Mortierella的大規(guī)模發(fā)酵是昂貴的。天然的動物組織含有很低數(shù)量的ARA，并且難以被加工。微生物例如Porphyridium(紫球藻屬)和Mortierella難以在工業(yè)規(guī)模上培養(yǎng)。許多海洋微生物通過聚酮化合物合酶(PKS)機(jī)制產(chǎn)生非常長鏈的PUFA，例如DHA和EPA。PKS是由多功能的多肽組成的酶復(fù)合物，所述多肽以反復(fù)的方式催化復(fù)雜分子從單體底物的合成。PKS是本領(lǐng)域公知的，這種序列的許多實(shí)例可以在文獻(xiàn)中找到。在Mon'te〃a中，PKS從丙二?；?CoA和乙酰-CoA合成DHA。為了活化這種PKS，需要磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(Ppt)通過輔酶A的4'-磷酸泛酰巰基乙胺基部分對保守的絲氨酸殘基的共價附著來催化載體蛋白的翻譯后活化、脂肪酸合成、聚酮化合物合成、以及非核糖體多肽合成，一種包括脂肪酸、聚酮化合物和非核糖體肽的天然產(chǎn)物的生物合成所需的反應(yīng)。Ppt以及根據(jù)它們的載體蛋白特異性被分類。在含有多種需磷酸泛酰巰基乙胺基途徑的有機(jī)體中，以及表明了每個途徑尤其自己的Ppt。雖然已經(jīng)克隆了M廳W"flPKS(美國專利NO.6,140，486(FacciottiWa/.)),沒有發(fā)現(xiàn)Ptp。Allen和Bartlett(2002)聲稱，他們未能從A/on7e/Z"克隆Ppt基因。已經(jīng)嘗試了許多方法在才直物中生產(chǎn)DHA和EPA(WO05103253A1(Singhe"/.),WO04071467A2(KinneyWg/.))。這些方法通常以分步的方式使用脫飽和酶/延伸酶。這種方法具有使用6-8個基因和引起中間體的積累的缺點(diǎn)，中間體的積累是潛在地不希望的結(jié)果。使用PKS/Ppt方法，需要的轉(zhuǎn)基因的數(shù)量將更少(4-5個)，不預(yù)期中間體的積累。因此，有益的是獲得涉及長鏈PUFA生物合成的遺傳物質(zhì)，以及在植物系統(tǒng)中，特別是地基的陸地作物植物系統(tǒng)中表達(dá)所分離的材料，所述植物系統(tǒng)可以被操作來提供商業(yè)數(shù)量的一種或多種PUFA的生產(chǎn)。還需要的是提高人類和動物中。-3脂肪酸的攝取。因而，存在著需要來提高大范圍的Q3-強(qiáng)化營養(yǎng)食品和食品添加劑，從而受試者可以選擇適合于他們的一般飲食習(xí)慣的飼料、飼料成分、食物、食物成分。特別有益的將是具有提高的DNA或EPA的種子油。當(dāng)前僅有一種oa-3脂肪酸ALA可以在才直物油中獲得。然而，存在著攝食的AL向更長鏈的co-3脂肪酸例如EPA和DHA的不良轉(zhuǎn)化。這已經(jīng)在共同待決美國公開NO.20040039058"抑制性失調(diào)的治療和預(yù)防"中展現(xiàn)了，通過使用亞麻籽油從社區(qū)平均值lg/天提高到14g/天的ALA攝取僅僅少量地提高了血漿磷脂EPA水平。ALA攝取中的14倍增加引起了血漿磷脂EPA中的2倍增力。(Manzioris"，1994)。因而，為此，需要有效的和商業(yè)上可用的利用聚酮化合物合成復(fù)合物和活化該復(fù)合物的Ppt的PUFA生產(chǎn)、編碼Ppt的基因、以及產(chǎn)生它們的重組方法。對于含有更高相對比例的DHA或EPA、含有它們的食物成分和添加劑，也存在著需求。對于生產(chǎn)特定的PUFA的可靠的和經(jīng)濟(jì)的方法，也存在著需求。來自表達(dá)細(xì)菌PKS復(fù)合物的、含油種子作物例如油菜、大豆、玉米、葵花或亞麻的油，在長4連PUFA、DHA或EPA方面是富集的。可以利用這種油來生產(chǎn)富集od-3脂肪酸的食物和食品增補(bǔ)劑，這種食物的消費(fèi)有效地提高EPA和DHA的組織水平。全部用co-3富集的油生產(chǎn)或制備的食物和食品，例如牛奶、人造黃油和香腸，將產(chǎn)生治療效益。因而，對于能夠活化PKS、用于具有PUFA富集的油的轉(zhuǎn)基因作物植物中的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的新核酸，以及從此產(chǎn)生的改進(jìn)的油，存在著強(qiáng)烈的需求。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供了編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離的核酸。這些可以用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞或修飾植物的脂肪酸組成或植物產(chǎn)生的油。本發(fā)明的一個實(shí)施方式是選自以下構(gòu)成的組的分離的多核苷酸序列(a)在5xSSC、50%曱酰胺和42°C的條件下，與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8雜交的多核普酸；(b)編碼SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列的多核普酸；和(c)編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸。在本發(fā)明的某些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述多核苷酸編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少80%、85%或90%的序列同一性、包括與這些序列的至少約82%、87%、89%、92%、95%、98%和99%的同一性的多肽。技術(shù)人員將認(rèn)識到，由于這些序列是相關(guān)的，給定的序列可能同時地與這些多肽序列的超過一種享有90%或更高的同源性。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所編碼的多肽具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性。在又一個方面，本發(fā)明提供了DNA構(gòu)建體，其包含與編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源啟動子，其中所述DNA分子選自以下構(gòu)成的組(a)編碼SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列的多核苷酸；(b)在5xSSC、50%曱酰胺和42。C的條件系，與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8雜交的多核苷酸；以及(c)編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸。在其他實(shí)施方式中，所述啟動子是在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中有功能的。在某些實(shí)施方式中，在其中啟動子有功能的真核細(xì)胞是植物細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述啟動子是種子增強(qiáng)的啟動子。在再又一個方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體包含與編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源啟動子。在另一個實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括與DNA分子可操作連接的異源啟動子，所述DNA分子編碼包含磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(diǎn)的聚酮化合物(polyketide)合成酶多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述編碼包含磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(diǎn)的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子來自于Mon'fe〃aman7za。在又一個實(shí)施方式中，所述DNA分子編碼與SEQIDNO:19具有至少70%的序列同一性的聚酮化合物合酶多肽，或在此以下描述的任何已知的聚酮化合物合酶。所述宿主細(xì)胞可以是植物、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。在再又一個方面，本發(fā)明提供了由用在此提供的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞組成的植物和它的子代，所述DNA構(gòu)建體包含與編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源因型的植物包含改變的脂肪酸新陳代謝。在一個實(shí)施方式中，所述植物選擇由油菜(canola)、Sra肌'cac謂/&s^7、、含油種子油菜(oilseedrape)、油菜籽(rapeseed)、大豆、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻、花生、芝麻、棉籽、亞麻籽、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、稻米、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱構(gòu)成的組。本發(fā)明還提供了從所述植物產(chǎn)生的種子、油和粗粉，其被定義為包含可檢測的本發(fā)明提供的DNA分子或多肽。另外，本發(fā)明提供了動物飼料和人類食品成份。在再又一個方面，本發(fā)明提供了制造含有二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸的植物油的方法，包括步驟(a)生長包含本發(fā)明的宿主細(xì)胞、進(jìn)一步包含聚酮化合物合酶的植物；(b)產(chǎn)生種子；(c)以及加工所述種子來獲得油。附圖的簡要說明以下附圖形成了本說明書的部分，被包括在內(nèi)以進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖并結(jié)合在此呈現(xiàn)的特定實(shí)施方式的詳細(xì)說明，可以更好地理解本發(fā)明。附圖1顯示了載體pMON68081的圖。附圖2顯示了載體pMON68080的圖。附圖3顯示了載體pMON94547的圖。附圖4顯示了載體pMON94544的圖。附圖5顯示了載體pMON94534的圖。附圖6顯示了載體pMON68084的圖。附圖7顯示了載體pMON68085的圖。附圖8顯示了載體pMON97063的圖。附圖9顯示了載體pMON94563的圖。附圖10顯示了載體pMON97066的圖。附圖11顯示了載體pMON96401的圖。附圖12顯示了載體pMON78528的圖。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明通過提供用于創(chuàng)建具有改善的DHA和/或EPA含量的植物的方法和組合物克服了先有技術(shù)的局限性。有機(jī)體例如植物的脂肪酸含量的修飾呈現(xiàn)了許多益處，包括改善的營養(yǎng)和健康效益。脂肪酸含量的修飾可以用于實(shí)現(xiàn)在植物、植物部分和植物產(chǎn)物，包括植物種子油，以及細(xì)菌和真菌中有益水平的DHA和/或EPA。例如，當(dāng)在植物的種子組織中產(chǎn)生DHA時，油可以從種子分離，一般地產(chǎn)生含油的DHA,其隨后可以用于提供食品和其他產(chǎn)物中有益的特征。本發(fā)明的各個方面包括用于修飾細(xì)胞的PUFA含量的方法和組合物，例如，修飾植物細(xì)胞的PUFA含量。與本發(fā)明相關(guān)的組合物包括新的分離的多核苷酸序列、DNA構(gòu)建體以及由本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物和/或植物部分。宿主細(xì)胞可以被操作以表達(dá)編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶多肽的多核苷酸，所述多肽催化另一個多肽的磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(diǎn)的泛酰巰基乙胺化。提供了以下定義作為對理解本發(fā)明的幫助。用語"DNA序列"、"核酸序列"、"核酸分子"和"核酸片段"是指包含核苷酸的有序排列的物理結(jié)構(gòu)。DNA片段、序列或核苷酸序列可以含有在大核苷酸分子、載體等等之內(nèi)。此外，在這些序列中核酸的有序排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。用語"編碼序列"、"編碼區(qū)"、"結(jié)構(gòu)序列"和"結(jié)構(gòu)核酸序列"是指其中核苷酸以各自形成密碼子的一系列三聯(lián)體排列的DNA序列、核酸序列、核酸分子的全部或片段。每個密碼子編碼特定的氨基酸。因而，編碼序列、編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)序列和結(jié)構(gòu)核酸序列編碼形成蛋白、多肽或肽序列的一系列氨基酸。編碼序列、編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)序列和結(jié)構(gòu)核酸序列可以含有在大的核酸分子、載體等等之內(nèi)。此外，在這些序列中核苷酸的有序排列可以以序列表、附圖、表格、電子媒體等等的形式描繪。術(shù)語"cDNA"是指互補(bǔ)于并來自mRNA的雙鏈DNA。"表達(dá)"是指一種過程，基因的編碼信息通過它被轉(zhuǎn)變?yōu)樵诩?xì)胞中存在并運(yùn)作的結(jié)構(gòu)。表達(dá)的基因包括被轉(zhuǎn)錄成RNA、然后被翻譯成蛋白質(zhì)的那些，以及被轉(zhuǎn)錄成RNA但不翻譯成蛋白質(zhì)的那些(例如，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核^唐體RNA)。如在此使用的，"基因"是指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括在編碼序列之前(5'非編碼序列)和之后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。"天然基因"是指在自然中存在具有其自身的調(diào)節(jié)序列的基因。"嵌合基因"是指任何基因，其不是天然基因，包含在自然中不在一起存在的調(diào)節(jié)和編碼序列。因而，嵌合基因可以包含來自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來自相同來源但以不同于自然中存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。"內(nèi)源基因"是指在有機(jī)體的基因組中在其自然位置的天然基因。"外源基因"或"轉(zhuǎn)基因"是指通過轉(zhuǎn)化過程導(dǎo)入到基因組中的基因。轉(zhuǎn)基因包括通過轉(zhuǎn)化過程導(dǎo)入的基因組DNA(例如，與其活性啟動子連接的基因組DNA)。"異源，，是指來自不同來源的兩種或多種核酸或蛋白序列之間的關(guān)系。例如，如果這樣的組合不是自然中通常存在的，啟動子對于編碼序列是異源的。此外，如果在特定的細(xì)胞或有機(jī)體中不會天然發(fā)生，特定的核酸序列對于它所插入的細(xì)胞或有機(jī)體可以是"異源的"。"序列同源性"是指在兩個或更多核酸或氨基酸序列之間就位置同一性的百分比而言的相似性水平。術(shù)語同源性還用于指出在不同的核酸或蛋白之間的相似功能性質(zhì)的概念。"雜交"是指當(dāng)核酸鏈具有充分的序列互補(bǔ)性時核酸的第一鏈與第二鏈經(jīng)由氫鍵堿基配對結(jié)合的能力。如在此使用的，如果核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱核酸分子是另一個核酸分子的"互補(bǔ)物"。如此處使用的，當(dāng)一個分子的每一個核苷酸與另一個分子的核苷酸互補(bǔ)時，稱為分子顯示出"完全的互補(bǔ)性"。因而，當(dāng)它們的相互雜交具有足夠的穩(wěn)定性以允許它們在合適的條件下保持相互的退火時，稱兩條核酸鏈具有充分的互補(bǔ)性。如在此使用的，術(shù)語"同源性"是指就核苷酸位置同一性百分比，即，序列相似性或同一性方面在多核苷酸序列之間的相似性水平或同一性百分比。如在此使用的，術(shù)語同源性還指在不同的多核苷酸分子之間的相似功能性質(zhì)的概念。當(dāng)在某些條件下它們特異性地雜交形成雙鏈體分子，多核苷酸分子是同源的。在這些條件下，稱為嚴(yán)格條件，一種多核苷酸分子可以用作探針或引物來鑒定享有同源性的其他多核苷酸分子。用語"嚴(yán)格條件"是對于通過特異性雜交操作，例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdeditionVolumes1，2,and3.J.F.Sambrook,D.W.Russell，andN.Irwin，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2000(SambrookWa/.)中所討論的，核酸探針與目標(biāo)核酸(即，與感興趣的特定核酸序列)的雜交來功能上定義的。因而，本發(fā)明提供的核苷酸序列可以利用它們的能力來與多核普酸分子片段的互補(bǔ)延伸選擇性地形成雙鏈分子。取決于預(yù)想的應(yīng)用，人們將希望采用變動選擇性的應(yīng)用，人們一般希望采用相對I嚴(yán)格條件來形成雜交物，例如，人們將選擇相對低的鹽度和/或高溫度條件，例如在約50。C到約70。C下約0.02M到約0.15MNaCl所提供的。例如，高嚴(yán)格條件是以高嚴(yán)格洗滌緩沖液(0.2xSSC，0.1%SDS,65°C)洗滌雜交過濾器至少兩次。另外，曱酰胺可以用于提高嚴(yán)格度。因而高嚴(yán)格條件還包括5xSSC、50%曱酰胺和42°〇。通過雜交的多核苷酸分子^r測是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，美國專利NO,4,965，188和5,176,995的教導(dǎo)是雜交分析方法的范例。用語"分離的"意指已經(jīng)從其自然環(huán)境移除，不考慮它的最終分布。例如，"分離"自稻米的核酸序列，例如通過^Uf舀米細(xì)月包克隆，當(dāng)^皮插入到玉米細(xì)胞的基因組時保持了"分離的"。用語"可操作連接"是指兩種或多種核酸區(qū)域或核酸序列的空間排列，從而它們發(fā)揮它們相互的合適效果。例如，啟動子區(qū)域可以相對于核酸序列放置，從而所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄被所述啟動子區(qū)域指導(dǎo)。啟動子區(qū)域和核酸序列是"可操作連接的"。術(shù)語"磷酸泛酰巰基乙氨基轉(zhuǎn)移酶或PPT"是指一種通過輔酶A的4'-磷酸泛酰巰基乙胺部分與保守的絲氨酸殘基的共價附著，來催化載體蛋白例如聚酮化合物合酶的多肽的翻譯后活化的酶。術(shù)語"聚酮化合物合酶"是指由多功能多肽組成的酶復(fù)合物，所述多功能多肽以反復(fù)方式催化復(fù)雜分子從單體底物的合成。在Mon'te〃awanVza中，PKS復(fù)合物從丙二?；?CoA和乙酰-CoA合成DHA。例如，在M.man'"a中，PKS含有由開放閱讀框Orf5、Orf6、Orf7和Orf8編碼的4個多肽(MetzWa/.，2001),在美國專利6，140,486中分別被稱為Orf6、Orf7、Orf8和Orf9。為了活化這種復(fù)合物，磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶需要泛酰巰基乙胺基化由Orf5編碼的多肽。幼enwze〃"sp.SCRC2738的PKS復(fù)合物合成EPA(Metz"a/.,2001)。"上游，，和"下游，，是對于核苷酸序列的位置以及編碼序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯方向所使用的位置術(shù)語，其通常在5'到3'方向上進(jìn)行。術(shù)語"啟動子"或"啟動子區(qū)域"是指核酸序列，通常存在于編碼序列的上游(5'),其能夠指導(dǎo)核酸序列成為RNA分子的轉(zhuǎn)錄。啟動子或啟動子區(qū)域一般提供了RNA聚合酶的識別位點(diǎn)以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始所必需的其他因素。如在此期待的，啟動子或啟動子區(qū)域包括通過插入或刪除調(diào)節(jié)區(qū)、使啟動子經(jīng)歷隨機(jī)或定點(diǎn)誘變等等所衍生的啟動子變體。啟動子的活性或強(qiáng)度可以通過就它產(chǎn)生的RNA凄t量、或在細(xì)力包或組織中積累的蛋白質(zhì)數(shù)量，相對于類似測量的第二啟動子來定量。用語"3'非編碼序列，，是指位于編碼序列的下游的核苷酸序列，包括多聚腺苷酸識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號其他序列。這些通常被成為3'非翻譯區(qū)域或3'-UTR。多腺苷酸化信號通常以影響多聚腺苷酸段向mRNA前體的3'末端的添加為特征。不同的3'非編碼序列的作用由Ingelbrecht等(1989)例證。"翻譯前導(dǎo)區(qū)序列，，或"5'非翻譯區(qū)"或"5'UTR"都是指位于基因的啟動子序列和編碼序列之間的核苷酸序列。5'-UTR存在于完整加工的翻譯起始序列的mRNA上游。5'-UTR可以影響向mRNA的主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效力。已經(jīng)描述了翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例(TurnerandFoster,1995)。"RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是DNA序列的理想互補(bǔ)拷貝時，它被稱為原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。來自原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列被稱為成熟RNA。"信使RNA，，(mRNA)是指沒有內(nèi)含子并且可以被細(xì)胞翻譯成多肽的RNA。"DNA構(gòu)建體"是指相互可操作連接來裝配成重組DNA分子的異源遺傳元件，可以包含提供宿主細(xì)胞中DNA多核苷酸分子的表達(dá)的元件以及提供所述構(gòu)建體的維持的元件。植物表達(dá)盒包含遺傳元件的可操作的連接，當(dāng)被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中時提供期望的基因產(chǎn)物的表達(dá)。"重組載體"是指任何試劑，通過它或在它之中，目標(biāo)核酸被擴(kuò)增、表達(dá)或保存，例如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制序列、噬菌體或線性單鏈的、環(huán)形單鏈的、線性雙鏈的、或環(huán)形雙鏈的DNA或RNA核苷酸序列。重組載體可以被合成，或來自于任何來源，并能夠基因組整合或自主復(fù)制。"調(diào)節(jié)序列"是指位于編碼序列或內(nèi)含子的上游(5')、之中或下游(3')的核苷酸序列，它的存在或缺乏影響所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。"基本上同源的"是指在序列上至少約90%相同的兩個序列，如通過例如DNAStar(Madison,WI)中的CLUSTALW算法所測量的。"基本上純的"是指從在其天然狀態(tài)通常與其相關(guān)的基本上所有其他分子在分離的分子。更優(yōu)選的，基本上純的分子是在制品中存在的優(yōu)勢種?；旧霞兊姆肿涌梢允谴笥诩s60%地沒有、優(yōu)選的約75%地沒有、更優(yōu)選的約90%地沒有、以及最優(yōu)選的約95%地沒有天然混合物中存在的其他分子(不包括溶劑)。用語"基本上純的，，不意圖涵蓋以它們的天然狀態(tài)存在的分子。優(yōu)選的，本發(fā)明的核酸分子和多肽是基本上純的。術(shù)語"轉(zhuǎn)化，，是指核酸導(dǎo)入接受者宿主中。術(shù)語"宿主"是指細(xì)菌細(xì)胞、真菌、動物或動物細(xì)胞、植物或種子、或任何4直物部分或組織，包括植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚芽和花粉。如在此使用的，"轉(zhuǎn)基因植物"是具有被穩(wěn)定導(dǎo)入其基因組，例如核或質(zhì)體基因組中的外源核酸的植物。術(shù)語"同基因，，作為具有或缺乏轉(zhuǎn)基因的植物或植物系之間的比較性術(shù)語，是指除了所討論的轉(zhuǎn)基因之外植物或林系具有相同或相似的遺傳背景。例如，代表來自親本F2群體的表型相似或相同選集的所謂的姐妹系被認(rèn)為是"同基因的"。當(dāng)使用未轉(zhuǎn)化的親本作為回交親本、使穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植物的子代與未轉(zhuǎn)化的親本林系雜交或回交，同時針對型(通過分子標(biāo)記物分析的基因型，或通過田間觀察的表型，或兩種)和轉(zhuǎn)基因來選擇時，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因林系被認(rèn)為是與其未轉(zhuǎn)化的親本系是高度"同基因的"。術(shù)語"種子"、"籽粒"和"谷粒"被理解為在含義上是等價。術(shù)語籽粒通常用于描述玉米或稻米植物的種子。在所有植物中，種子是由種皮、胚芽、糊粉和胚乳組成的成熟的胚珠。編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的核酸在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了來自MorZ&〃aman'wa的編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的新的核酸。在某些實(shí)施方式中，所述核酸包含SEQIDNO:2、4、6或8。本發(fā)明還提供了使用這種核酸，包括SEQIDNO:2、4、6和8的方法。在一個實(shí)施方式中，這些核酸分子在本發(fā)明的上下文中被用于改變植物種子中的油的組成。這些核酸分子可以-使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為才莫板和合適的寡核苷酸引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCRTM擴(kuò)增技術(shù)來擴(kuò)增。做為選擇，它們可以使用標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)，例如自動化的DNA合成儀來合成。編碼期望的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸可以以多種方式來鑒定。舉例來說，期望的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的來源，例如來自Moritella的庫，用可檢測的酶學(xué)或化學(xué)合成的探針來篩選，所述探針可以從DNA、RNA或非天然發(fā)生的核苷酸、或其混合物產(chǎn)生。探針可以從已知的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的多核普酸酶學(xué)地合成，用于正常的或降低嚴(yán)格度的雜交方法。寡核苷酸探針也可以用于篩選來源，并且可以基于已知的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的序列，包括在已知的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶之中保守的序列，或基于從期望的純化蛋白質(zhì)獲得的肽序列?；诎被嵝蛄械墓押塑账崽结樋梢允呛啿⒌?，以包括遺傳密碼的簡并性，或者可以偏向于支持來源有機(jī)體的偏愛密碼子。寡核苷酸也可以被用作引物，用于從已知的或懷疑的來源反轉(zhuǎn)錄的mRNA的PCR;PCR產(chǎn)物可以是全長cDNA,或可以用于產(chǎn)生探針來獲得期望的全長cDNA。做為選擇，期望的蛋白質(zhì)可以被完全地測序，并進(jìn)行編碼多肽的DNA的完全合成。一旦分離出期望的基因組或cDNA,它可以通過已知的方法來測序。本領(lǐng)域公認(rèn)的是，這些方法常遭遇錯誤，從而同一區(qū)域的多次測序是常規(guī)的，并仍然預(yù)期導(dǎo)致在產(chǎn)生的推斷序列中可測量的錯誤率，特別是在具有重復(fù)結(jié)構(gòu)域、廣泛的二級結(jié)構(gòu)、或稀有的堿基組成的區(qū)域，例如具有高GC堿基含量的區(qū)域中。當(dāng)出現(xiàn)矛盾時，可以進(jìn)行重新測序，并可以采用特殊的方法。特殊的方法可以包括改變測序條件，通過使用不同溫度；不同的酶；改變寡核苷酸形成高級結(jié)構(gòu)的能力的蛋白質(zhì)；改變的核苷酸例如ITP或曱基化的dGTP;不同的凝膠組成，例如，添加曱酰胺；不同的引物或遠(yuǎn)離問題區(qū)域的引物；不同的模板例如單鏈DNA。還可以采用mRNA的測序。如果希望，編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的核酸的序列可以被修改而不改變表達(dá)的蛋白質(zhì)的最終氨基酸序列，使得所述序列在植物宿主中更易于表達(dá)。編碼序列可以是人工的DNA。如在此使用的人工DNA是指非天然發(fā)生的DNA多核苦酸分子。人工DNA分子可以通過各種方法來設(shè)計，例如，基于取代第一多核苷酸的密碼子來產(chǎn)生等效物的本領(lǐng)域中已知的方法，乃至改進(jìn)的、第二代人工多核苷酸，其中這種新的人工多核苷酸對于轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)的表達(dá)是有用的。設(shè)計方面通常采用密碼子利用率表，該表格通過編選分離自植物、植物型、科或?qū)俚木幋a序列集合中密碼子出現(xiàn)頻率來產(chǎn)生。其他設(shè)計方案包括降低多腺普酸化信號、內(nèi)含子剪接位點(diǎn)、或序列的長的AT或GC延伸的出現(xiàn)(美國專利5,500,365)。全長編碼序列或其片段可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從人工DNA產(chǎn)生。維持了此處期待的功能、在此公開的核苷酸序列或調(diào)節(jié)元件的修飾處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這種修飾包括插入、替換和刪除，特別是反映了遺傳密碼的簡并性的替換。本發(fā)明從Mon'化〃a分離了產(chǎn)生具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的分離的DNA序列。編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的序列可以在轉(zhuǎn)基因植物、微生物或動物中表達(dá)來有效活化聚酮化合物合酶。也可以使用與在此提供的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶多核苷酸基本上相同的、或編碼與磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶多肽基本上相同的多肽的其他多核苷酸。"基本上相同的"是指氨基酸序列或核酸序列在優(yōu)選性提高的順序上展現(xiàn)了與SEQIDNO:5、SEQIDNO:7中的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶多肽序列或編碼這些多肽的序列至少75%、80%、85%、90%、95%、98或99%的同一性。使用序列分析軟件進(jìn)行多肽或多核苷酸比較，例如，GCGWisconsin程序包的SequenceAnalysis軟件包(Acc勿s，SanDiego,CA)和MEGAlign(DNAStar，Inc.,1228S.ParkSt.,Madison,Wis.53715)。這種軟件通過指定相似性或同一性的程度來匹配相似的序列。DNA構(gòu)建體本發(fā)明提供了DNA構(gòu)建體，其包含與在此描述的核酸可操作連接的異源啟動子。啟動子的選擇，例如，可被描述為強(qiáng)表達(dá)、弱表達(dá)、可誘導(dǎo)表達(dá)、組織增強(qiáng)表達(dá)(即，在組織中特異地或優(yōu)先地表達(dá))、器官增強(qiáng)表達(dá)(即，在器官中特異地或優(yōu)先地表達(dá))和發(fā)育增強(qiáng)表達(dá)(即，在發(fā)育的特定階段特異地或優(yōu)先地表達(dá))的啟動子，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。類似地，如上所述的核酸分子與啟動子的組合也在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)(參見,例如SambrookWa/.，1989)。本發(fā)明使用的啟動子一般包括，但不限于，在細(xì)菌、噬菌體、真菌或植物細(xì)胞中起作用的啟動子。用于細(xì)菌表達(dá)的有用啟動子有l(wèi)acZ、Sp6、T7、T5或五.co/ZglgC啟動子。用于真菌的有用的啟動子包括5^ccAaramyce51cereWw'aeGall(West,Wa/.(1984))、ASaccAaramjyc&s1/蘭6enmtl(Maundrell，K.(1990))、A^ewmyporacraw"ccg-l(FreitagMandSelkerEU(2005))和尸/c/n'am"/mwo/z.caAUG1(Invitrogen)。用于植物細(xì)胞的有用的啟動子包括Y玉米蛋白Z27啟動子(參見，例如Lopes"a/.(1995))、L3oleosin啟動子(美國專利No.6,433,252)、大麥PER1啟動子(Stacey1996)、CaMV35S啟動子(Odell"a/.1985)、CaMV19S(Lawton"a/.，1987)、nos(Ebert"a/.,1987)、Adh(WalkerWa/.，1987)、蔗糖合酶(Yang"a/.,1990)、肌動蛋白(Wang"a/.,1992)、cab(SullivanWa/.,1989)、PEPCase啟動子(Hudspethe"/.,1989),或與R基因復(fù)合體相關(guān)的那些(Chandler"a/.，1989)。玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Richins"a/.，1987)、arcelin、番茄E8、patatin、遍在蛋白、mannopine合成酶(mas)和微管蛋白啟動子是有用啟動子的其他實(shí)例。存在著各種各樣的植物啟動子序列，其可以用于驅(qū)動轉(zhuǎn)基因植物中編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的多核普酸的組織特異性表達(dá)。實(shí)際上，在本發(fā)明的特定的實(shí)施方式中，使用的啟動子是種子特異性啟動子。這些啟動子的實(shí)例包括來自這些基因例如napin(Kridl"a/.，1991)、菜豆蛋白(Bustos，1989)、大豆胰蛋白酶抑制物(Riggs,Wa/.，1989)、ACP(Baerson"1993)、石更脂?；?ACP脫々包和酶(Slocombe"a/.,1994)、大豆卩-伴球蛋白的a'亞單位(P-Gm7Salpha',參見例如，Chen"a/.,1986)、Wc/a/a6aUSP(P-Vf.Usp,參見例如，美國專利申請10/429,516,SEQIDNO:1、2和3)、球蛋白啟動子(參見例如BelangerandKriz,(1991)，大豆卩-伴球蛋白的a亞單位(7Sa)(美國專利申請10/235,618,通過引用合并)和Zea畫"L3oleosin啟動子(P-Zm丄3，參見，例如，Honge"/.，1997)。在玉米中表達(dá)的啟動子包括來自編碼玉米蛋白(zeins)的基因的啟動子，玉米蛋白是在玉米胚乳中發(fā)現(xiàn)的一組儲存蛋白質(zhì)。玉米蛋白基因的基因組克隆已經(jīng)被分離(Pedersen"a/.,1982;RussellWa/.,1997),可以使用來自這些克隆包括15kD、16kD、19kD、22kD和27kD基因的啟動子。已知在玉米中和在其他植物中起作用的其他種子表達(dá)增強(qiáng)啟動子包括以下基因的啟動子WaxyU效粒結(jié)合的淀粉合酶)、Brittle和Shrunken2(ADP葡萄糖焦磷酸化酶)、Shrunken1(蔗糖合酶)、分支酶I和II、淀粉合成酶、脫支酶、oleosins、谷蛋白和Betll(基礎(chǔ)胚乳轉(zhuǎn)移層)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的其他啟動子也是本發(fā)明預(yù)期的。此外，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或增強(qiáng)子的復(fù)制物可以用于提高來自特定啟動子的表達(dá)。這些增強(qiáng)子的實(shí)例包括，但不限于，Adhintronl(Callis"a/.,1987)、稻米肌動蛋白內(nèi)含子(McElroyW,1991;美國專利No，5，641，876)、蔗#唐合酶內(nèi)含子(Vasil""/.,1989)、玉米HSP70內(nèi)含子(也稱為Zm.DnaK)(美國專利5,424,412,Brown"fl/.)、TMVQ元件(GallieWfl/.,1999)、CaMV35S增強(qiáng)子(美國專利5,359,142&5,196,525,McPhersonW)或章魚石咸合成酶增強(qiáng)子(美國專利5,290,924,LastWa/.)。由于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列的起點(diǎn)之間的DNA序列，即，非翻譯前導(dǎo)序列可以影響基因表達(dá)，人們也可以希望采用特定的前導(dǎo)序列?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何前導(dǎo)序列。優(yōu)選的前導(dǎo)序列指導(dǎo)連接的基因的最佳表達(dá)水平，例如，通過提高或維持mRNA穩(wěn)定性和/或通過防止不適當(dāng)?shù)姆g起始(Joshi,1987)。這種序列的選擇處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的處理能力之內(nèi)。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以包括靠近所述盒的3'末端的序列，其充當(dāng)信號來終止異源核酸的轉(zhuǎn)錄，并指導(dǎo)產(chǎn)生的mRNA的多聚腺苷酸化。這些通常被成為3'非翻譯區(qū)域或3'-UTR。可以作為轉(zhuǎn)錄終止信號的某些3'元件可以包括來自Agrobacteriumtumefaciens的胭脂石咸合成酶基因(nos)的那些(Bevan^a/.,1983)、napin3'非翁3譯區(qū)(Kridl"a/.,1991)、球蛋白3'非翻譯區(qū)(BelangerandKriz,1991)、來自大豆的Adrl2基因的3，非翻譯區(qū)(發(fā)育素下調(diào)的)(Wang"a/.，PCT公開WO200250295)或來自zein基因，例如Z27的一種(Lopes"a/.,1995)。本領(lǐng)域已知的其他3'調(diào)節(jié)元件也可以用于本發(fā)明的載體中。在此描述的核酸分子可以被克隆到任何適合的載體中，并可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何適合的宿主。載體的選擇和構(gòu)建它們的方法是本領(lǐng)域熟知的，在技術(shù)文獻(xiàn)中一般地描述了(一般參見，"RecombinantDNAPartD"(1987))。所述載體將優(yōu)選地包含調(diào)節(jié)序列，例如轉(zhuǎn)錄和翻i爭起始密碼子以及終止密碼子，其特異于載體將要導(dǎo)入其中的宿主類型，視情況地并考慮該載體是DNA還是RNA可以制備環(huán)形或線形的載體構(gòu)建體，含有連接到在原核或真核宿主細(xì)胞中有功能的復(fù)制系統(tǒng)的如上所述的完整核酸序列或其部分。復(fù)制系統(tǒng)可以來源于ColEl,2mp質(zhì)粒、X噬菌體、fl絲狀噬菌體、jgro^acfen'wm4勿種(例^口，Afw/we/ac/ews牙口Ar/H'zog^wes)等等。除了復(fù)制系統(tǒng)和插入的核酸序列之外，所述載體可以包括容許選擇轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主的一種或多種標(biāo)記基因。標(biāo)記基因包括抗生抗性，例如，對抗生素、重金屬、除草劑等等的抗性，在營養(yǎng)缺陷宿主中的補(bǔ)足來提供原養(yǎng)，等等。本發(fā)明提供了包含在此描述的核酸分子、任選的以載體形式的核酸分子的宿主細(xì)胞。適合的宿主包括植物、細(xì)菌和真菌細(xì)胞，包括Sacc/mram;;c&scereWWae和臉wms/oracms510。五.co"宿主包括TB-1、TG畫2、DH5a、XL畫BlueMRF，(Stratagene，Austin,TX)、SA2821、Y1090和TG02。才直物細(xì)月包包^^f旦不限于，大豆、Brassicacampestris、油菜、含油種子油菜(oilseedrape)、油菜籽(rapeseed)、海甘藍(lán)、芥菜、蓖麻、花生、芝麻、棉籽、亞麻籽、紅花、油棕、亞麻、葵花、苜蓿、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、粟、高粱和稻米構(gòu)成的組。在宿主細(xì)胞中的表達(dá)可以以短暫的或穩(wěn)定的方式實(shí)現(xiàn)。短暫的表達(dá)可以從導(dǎo)入的構(gòu)建體發(fā)生，其含有在宿主細(xì)胞中起作用的表達(dá)信號，但是所述構(gòu)建體不能復(fù)制并且很少在宿主細(xì)胞中整合，或者所述宿主細(xì)胞不能增殖。短暫表達(dá)也可以伴隨著誘導(dǎo)與感興趣的基因可操作連接的可調(diào)節(jié)啟動子的活性，從而這種誘導(dǎo)系統(tǒng)經(jīng)常展現(xiàn)很地的基礎(chǔ)表達(dá)水平。通過導(dǎo)入可以整合到宿主基因組中、或可以在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的構(gòu)建體，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)。通過使用位于所述表達(dá)構(gòu)建體上、或用表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的可選擇標(biāo)記，隨后選擇表達(dá)所述標(biāo)記的細(xì)胞，可以選擇感興趣基因的穩(wěn)定表達(dá)。當(dāng)穩(wěn)定的表達(dá)來自整合時，構(gòu)建體的整合可以在宿主基因組內(nèi)隨機(jī)地發(fā)生，或可以通過使用含有與宿主基因組同源的區(qū)域的構(gòu)建體，其足以將重組物靶向宿主基因座。當(dāng)構(gòu)建體被耙向內(nèi)源基因座時，全部或某些轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)域可以由內(nèi)源基因座提供。宿主細(xì)胞中的表達(dá)可以涉及本領(lǐng)域:技術(shù)人員已知的發(fā)酵技術(shù)。發(fā)酵的宿主細(xì)月包可以是原4亥生物，例in五化/^n'c/H》co/z',或真4亥生物，例3口酵母5Vzcc/m廠om;;c&s1cerevz'Wae、或絲習(xí)犬真菌7Vewrcwpo廠acrtwsa。通過發(fā)酵生產(chǎn)PUFA的實(shí)例包括MoWwe〃a(美國專利6,319,698)和77irawWracA;^7'a/es(美國專利6,451,567)。期待的是通過使用游離的或整合的表達(dá)載體，超過一個基因可以被導(dǎo)入并在宿主細(xì)胞中增殖。當(dāng)兩種或更多基因從獨(dú)立的復(fù)制載體中表達(dá)時，希望的是每個載體具有不同的復(fù)制方式。每個導(dǎo)入的構(gòu)建體，無論是整合的或不是，將具有不同的的選擇方式，并且應(yīng)當(dāng)沒有與另一個構(gòu)建體的同源性，以維持穩(wěn)定表達(dá)并防止構(gòu)建體之間元件的重新分配。導(dǎo)入的構(gòu)建體的調(diào)節(jié)區(qū)域、選擇方式和增殖方法的明智選擇可以實(shí)驗(yàn)上地確定，從而所有導(dǎo)入的多核苷酸以必需的水平表達(dá)來提供期望的產(chǎn)物的合成。多肽本發(fā)明提供了由在此描述的核酸分子編碼的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶。聚酮化合物合酶是由多功能的多肽組成的酶復(fù)合物，所述多肽以反復(fù)的方式催化復(fù)雜分子從單體底物的合成。在肘0〃>//(3man'""中，PKS復(fù)合物從丙二?；?CoA和乙酰-CoA合成DHA。為了活化這種復(fù)合物，需要磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶。所述多肽優(yōu)選的包含氨基末端和羧基末端。所述多肽可以包含D-氨基酸、L-氨基酸，或D-與L-氨基酸的混合物。對天然氨基酸序列產(chǎn)生變體多肽的改變可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法來制備。例如，通過在合成時改變核酸分子的序列可以方便地將氨基酸替換引入所述多肽中。通過將包含修飾的序列的合成寡核苷酸連接到表達(dá)載體中，也可以引入位點(diǎn)特異性突變。作為選擇，可以使用寡核苷酸指導(dǎo)的、位點(diǎn)特異性誘變步驟，例如在Walder"(1986);Bauer"a/.(1985);和美國專利4,518,584和4,737,462.中公開的。在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的是選擇合成的和天然發(fā)生的氨基酸，其作為對任何特定的天然發(fā)生氨基酸的保守性或中性替換。普通技術(shù)人員理想地將考慮進(jìn)行任何特定氨基酸替換的環(huán)境，還考慮側(cè)鏈的疏水性或極性、側(cè)鏈的一般大小、在生理?xiàng)l件下具有酸性或堿性的側(cè)鏈的pK值。例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸通常適合相互替換，更通常地是精氨酸和組氨酸。本領(lǐng)域已知的是，這是因?yàn)樗腥齻€氨基酸都具有堿性側(cè)鏈，而賴氨酸和精氨酸的側(cè)鏈的pK值相互之間比組氨酸(約6)更接近(約10和12)。類似地，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸通過適當(dāng)?shù)叵嗷ト〈?，條件是甘氨酸通常不適合替代該組的其他成員。這是因?yàn)楫?dāng)摻入到多肽中時這些氨基酸的每一個都是相對疏水性的，但是甘氨酸缺乏a碳容許了旋轉(zhuǎn)的phi和psi角(在a碳周圍)有這樣大的構(gòu)象自由度，從而甘氨酸殘基可能觸發(fā)在其他氨基酸相互替換時通常不發(fā)生的構(gòu)象或二級結(jié)構(gòu)中的改變。通常適合相互替換的其他氨基酸組包括但不限于，由谷氨酸和天冬氨酸構(gòu)成的組；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸構(gòu)成的組；以及由絲氨酸、蘇氨酸和任選的酪氨酸構(gòu)成的組。另外，普通技術(shù)人員可以容易地分類合成氨基酸和天然發(fā)生的氨基酸。如果期望，所述多肽可以被修飾，例如，通過糖基化、酰胺化、羧化作用或磷酸化，或通過加酸鹽、酰胺、酉旨、特別是C-末端酯以及本發(fā)明的多肽的N-酰基衍生物的生成。通過根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法與其他部分形成共價或非共價復(fù)合物，所述多肽還可以被修飾來產(chǎn)生蛋白衍生物。共價結(jié)合的復(fù)合物可以通過將化學(xué)部分連接到多肽包含的氨基酸的側(cè)鏈的功能基團(tuán)上，或連接到N-或C-末端來制備。理想地，這種修飾和結(jié)合不會有害地影響多肽(和其變體)的活性。雖然這種修飾和結(jié)合可能具有更大或更小的活性，所述活性期望地不是消極的，并且是未改變的多肽的特征。所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以通過多種常規(guī)技術(shù)的任何一種來制備。所述多肽可以是從天然發(fā)生的來源或從重組來源分離的或基本上純化的。例如，對于重組蛋白來說，編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA片段可以使用公知的分子遺傳技術(shù)(參見，例如，ManiatisWa/.，1989)和在此處的"實(shí)施例，，中引用的其他參考文獻(xiàn))亞克隆到合適的載體中。片段可以被轉(zhuǎn)錄，蛋白隨后在體外翻譯。也可以采用商業(yè)上可獲4f的^式劑盒(例3口，由Clontech,MountainView，CA;AmershamLifeSciences,Inc.,ArlingtonHeights,IL;Invitrogen,Carlsbad,CA等等生產(chǎn)的)。任選的可以在核酸的操作中采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。多肽也可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法使用自動化肽合成儀來合成。作為選擇，所述多肽(和片段、變體和融合蛋白)可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)肽合成^支術(shù)(例如，如Bodanszky(1984)中概述的)來合成。特別地，所述多肽可以使用固相合成的步驟來合成(參見，例如，Merrifield,1963;BaranyWa/.，1987;和美國專利5,424,398)。如果期望，這可以使用自動化肽合成儀來進(jìn)行。t-丁氧基羧基(t-BOC)或9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸保護(hù)基團(tuán)的去除以及蛋白從樹脂上的分離可以伴隨著例如在降低的溫度下的酸處理。含多肽的混合物任何可以被提取，例如，使用二乙醚，來除去非肽有機(jī)化合物，合成的蛋白質(zhì)可以從樹脂粉未中提取(例如，使用約25%w/v乙酸)。在多肽的合成之后，任選地可以進(jìn)行進(jìn)一步的純化(例如，使用HPLC)來消除任何不完整的蛋白質(zhì)、多肽、肽或游離氨基酸。氨基酸和/或HPLC分析可以對合成的多肽進(jìn)行來驗(yàn)證其身份。對于根據(jù)本發(fā)明的其他應(yīng)用，優(yōu)選的是產(chǎn)生所述多肽來作為更大的融合蛋白的部分，通過化學(xué)結(jié)合，或通過本領(lǐng)域已知的遺傳學(xué)方法。就此來說，本發(fā)明還提供了包含所述多肽(或其片段)或其變體以及具有任何期望的性質(zhì)或效應(yīng)物功能的一種或多種其他多肽/蛋白的融合蛋白。對于特定蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和鑒定的分析是基于各種物理-化學(xué)的、結(jié)構(gòu)的、功能的，或蛋白質(zhì)的其他性質(zhì)。獨(dú)特的物理-化學(xué)或結(jié)構(gòu)性質(zhì)容許通過電泳步驟，例如天然或變性凝膠電泳或等電聚焦，或者通過層析技術(shù)，例如離子交換或凝膠排阻層析來分離和鑒定。單獨(dú)蛋白質(zhì)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)提供了使用特異性抗體來以例如ELISA分析的形式檢測它們存在的才幾會。方法的組合可以用于實(shí)現(xiàn)更高的特異性，例如Western印跡，其中抗體被用于定位已經(jīng)通過電泳技術(shù)分離的單獨(dú)基因產(chǎn)物。其他技術(shù)可以用于確切地確認(rèn)目標(biāo)產(chǎn)物的身份，例如通過純化后的氨基酸測序來評估。雖然這些是最常見的，也可以使用其他步驟。分析過程可以通過蛋白質(zhì)的功能來鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)，特別是當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)是能夠催化涉及特定底物和產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)的酶時。例如，在植物提取物中，這些反應(yīng)可以通過物理和/或化學(xué)過程通過提供和測定反應(yīng)的底物損失和產(chǎn)物生成來測量。在很多情況下，基因產(chǎn)物的表達(dá)通過評估其表達(dá)的表型結(jié)果來確定。這種評估可以僅僅是視覺觀察，或可以包括分析。這種分析可以采取許多形式，例如，分析植物的化學(xué)成分、形態(tài)學(xué)或生理性質(zhì)方面的改變。通過表達(dá)編碼酶或儲存蛋白質(zhì)的基因、或通過改變淀粉數(shù)量的酶、或通過改變油組成的酶，可以改變化學(xué)組成，所述儲存蛋白質(zhì)改變氨基酸組成并且這種改變可以通過氨基酸分析來檢測，所述淀粉數(shù)量可以通過近紅外反射光譜來分析，所述油組成可以通過氣相色語法來檢測。形態(tài)改變可以包括更大的身材或更厚的莖桿。本發(fā)明的核酸分子、DNA構(gòu)建體和多肽可以用于農(nóng)業(yè)方法和各種篩選分析中。例如，核酸分子可以用于在宿主細(xì)胞中經(jīng)由載體表達(dá)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，用于檢測生物樣品中編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用于經(jīng)由Southern印跡來4全測編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的基因中的遺傳改變，用于抑制磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，或用于增量調(diào)節(jié)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶。所述多肽可以用于在植物中補(bǔ)償磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的缺失，或補(bǔ)償具有降低的活性或無活性的突變磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的存在，或用于在植物中處理磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的過多的底物水平，不管是直接還是間接的。做為選擇，所述多肽可以用于根據(jù)調(diào)節(jié)它們活性的能力來篩選試劑?？贵w可以用于檢測和分離相應(yīng)的多肽，以及降低這種多肽在體內(nèi)的可用性。植物轉(zhuǎn)化在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生表達(dá)期望的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。向植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼期望的蛋白質(zhì)的期望的多核苷酸序列的各種方法是本領(lǐng)域已知的，包括(l)物理方法，例如顯微注射、電穿孔和微粒介導(dǎo)的遞送(biolistics或基因槍技術(shù))；(2)病毒介導(dǎo)的遞送；和(3)土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最常用的方法是土壤桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移過程，以及biolistics或微注射微粒轟擊介導(dǎo)的過程。一般地，核轉(zhuǎn)化是期望的，但當(dāng)專門地轉(zhuǎn)化質(zhì)體，例如葉綠體或淀粉體是期望的時，可以利用期望的多核苷酸的微粒介導(dǎo)的遞送來轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通過使用屬于土壤桿菌屬的遺傳工程化的土^泉纟田菌來實(shí)現(xiàn)。帶有Ti或Ri質(zhì)粒的fwme/a"'ews和爿gra^c化n'wmr/n'zogew^的許多野生型和解除的菌才朱可以用于才直物的基因轉(zhuǎn)移。經(jīng)由稱為"T-DNA"的特定DNA的轉(zhuǎn)移來進(jìn)行向許多植物品種中的基因轉(zhuǎn)移，所述特定DNA可以被遺傳工程化來攜帶任何期望的DNA片段，如在例如Bidney等的美國專利6,265,638中進(jìn)一步詳細(xì)描述的，通過引用將其公開內(nèi)容合并在此。土壤桿菌介導(dǎo)的植物的遺傳轉(zhuǎn)化涉及幾個步驟。第一步，其中強(qiáng)毒土壤桿菌和植物細(xì)胞首先相互接觸，一般稱為"接種"。接種優(yōu)選地伴隨著某些對一些植物細(xì)胞的損傷方法，其是否植物細(xì)胞成分，例如coumaryl醇類、sinapinate(其被還原為乙酰丁香酮)、芥子醇和松柏醇，其活化土壤桿菌中的致病因子。在接種之后，允許土壤桿菌和植物細(xì)胞/組織在適合生長和T-DNA轉(zhuǎn)移的條件下一起生長幾小時到幾天或更久的一段時間。這個步驟稱為"共培養(yǎng)"。在共培養(yǎng)和T-DNA遞送之后，用殺細(xì)菌或抑細(xì)菌試劑處理植物細(xì)胞來殺死保持與外植體接觸的和/或在含有外植體的器皿中的土壤桿菌。如果在缺乏任何選擇性試劑的情況下進(jìn)行這個步驟，以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞相對于非轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的優(yōu)勢生長，則這一般稱為"延遲"步驟。如果在存在偏愛轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的選擇壓力的情況下進(jìn)行這個步驟，則它被稱為"選擇"步驟。當(dāng)使用"延遲"時，一般跟隨著一個或多個"選擇"步驟。對于微粒轟擊(美國專利No.5，550,318(Adams"a/.);美國專利No.5,538,880(Lundquistet.al.)、美國專利No.5，610，042(Chang"a/.);和PCT公開WO95/06128(AdamsWa/.);通過完全引用將它們每一個特別地合并在此)，用核酸包被微粒子，并通過推力遞送到細(xì)胞中。示范性的顆粒包括由鴒、鉬和優(yōu)選的金組成的那些。通過加速將DNA遞送到植物細(xì)胞中的方法的說明性實(shí)施方式是Biolistics顆粒遞送系統(tǒng)(BioRad,Hercules,CA)，其可以用于將包祐:有DNA或細(xì)胞的顆粒通過篩子，例如不銹鋼篩或Nytex篩推進(jìn)到用懸浮液中培養(yǎng)的單子葉植物細(xì)胞覆蓋的過濾器表面上。微粒轟擊技術(shù)是廣泛可用的，可以用于轉(zhuǎn)化實(shí)際上任何植物物種。已經(jīng)通過微粒轟擊轉(zhuǎn)化的物種的實(shí)例包括單子葉植物物種，例如玉米(國際公開NO.WO95/06128(AdamsWa/.))、大麥、小麥(美國專利NO.5,563,055(TownsendWa/.)，通過完全引用合并在此)、稻米、燕麥、黑麥、甘蔗和高粱；以及許多雙子葉植物，包括煙草、大豆(美國專利NO.5,322,783(Tomes通過完全引用合并在此)、葵花、花生、棉花、番茄和一4殳的豆莢(美國專利No.5,563,055(TownsendWa/.)，通過完全引用合并在此)。為了對轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞進(jìn)行選擇或記分而不考慮轉(zhuǎn)化方法，被導(dǎo)入細(xì)胞中的DNA含有基因，其在可再生的植物組織中起作用來產(chǎn)生為植物組織賦予對其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可選擇、可篩選或可記分標(biāo)記物的目標(biāo)基因?qū)ǖ幌抻赑-葡糖醛酸酶(GUS)、綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(LUX)、抗生素或除草劑耐受性基因?？股乜剐曰虻膶?shí)例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博來霉素)；氨曱蝶呤(和三曱氧芐二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四環(huán)素。編碼涉及除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于關(guān)于草甘膦耐受性的美國專利No.5，627,061(Barry，"a/.,)、美國專利No5,633,435(Barry,"a/.，)和美國專利No6,040,497(Spencer，Wa/.，)中描述的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的多核普酸分子和美國專利No.5,094,945(Comai)中描述的aroA;關(guān)于溴苯腈耐受性的美國專利No.4，810,648(Duerrschnabd，w/.,)中描述的編碼溴苯腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；關(guān)于達(dá)草滅耐受性的在Misawa，Wa/.,(1993)和Misawa，Wa/.，(1994)中描述的編碼八氫番茄紅素脫飽和酶(Ccrtl)的多核苷酸分子；Sathasiivana/.(1990)中描述的針對磺酰脲除草劑的抗性的編碼乙酰羥基酸合酶(AHAS，akaALS)的多核苷酸分子；以及Wohlleben,"g/.，(1988)中描述的戶W基因和DeBlock,Wa/.,(1987)中描述的bar基因，其各自提供了glufosinate和bialaphos耐受性。來自各種轉(zhuǎn)化的外植體的植物的再生、發(fā)育和培養(yǎng)是本領(lǐng)域中充分記載了的。這種再生和生長過程一般包括選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和培養(yǎng)那些個體化的細(xì)胞的步驟，從一般的胚胎發(fā)育階段到生根的植物苗階段。類似地再生轉(zhuǎn)基因胚芽和種子。然后將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因的生根的芽種植到合適的植物生長培養(yǎng)基，例如土壤中。在對選擇性試劑的暴露下幸存的細(xì)胞，或在篩選分析中記分為陽性的細(xì)胞，可以在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)移到溫室或生長箱發(fā)育成熟之前，將發(fā)育的植物苗轉(zhuǎn)移到少土的植物生長混合物中，并鍛煉得耐寒。本發(fā)明可以使用任何可轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。在此使用的可轉(zhuǎn)化是指細(xì)胞或組織能夠進(jìn)一步增殖來產(chǎn)生植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識至'J,許多才直物細(xì)胞或組織是可轉(zhuǎn)化的，其中在外源DNA的插入和合適的培養(yǎng)條件之后，植物細(xì)胞或組織可以形成分化的植物。適合于這些目的的組織可以包括但不限于不成熟的胚芽、鱗片組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物、不成熟的花序、芽分生組織、結(jié)節(jié)外植體、愈傷組織、胚軸組織、籽葉、根和葉。以上引述的TomesWfl/.'783專利描述了一種方法，用細(xì)胞分裂素處理、隨后孵育一段時期，足以允許子葉節(jié)組織中的未分化細(xì)胞分化成分生組織細(xì)胞，并允許細(xì)胞進(jìn)入發(fā)育的Gl和分裂期之間的階段，聲稱其改善了轉(zhuǎn)化的敏感性?？梢允褂萌魏芜m合的植物培養(yǎng)基。適合的培養(yǎng)基包括但不限于，基于MS的培養(yǎng)基(MurashigeandSkoog,1962)或基于N6的培養(yǎng)基(ChuWa/.，1975)，補(bǔ)充有植物生長調(diào)節(jié)劑，包括但不限于發(fā)育素、細(xì)胞分裂素、ABA和赤霉素。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉組織培養(yǎng)基的變化，當(dāng)適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充時，其支持了植物組織生長和發(fā)育，并適合于植物轉(zhuǎn)化和再生。這些組織培養(yǎng)基可以作為商業(yè)產(chǎn)品購買，或常規(guī)地制備或修改。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，用于轉(zhuǎn)化和再生的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑例如營養(yǎng)物和生長調(diào)節(jié)劑，以及其他培養(yǎng)條件，例如孵育期間的光強(qiáng)度、pH值和孵育溫度，可以根據(jù)特定的目標(biāo)品種來優(yōu)化。在DNA構(gòu)建體被穩(wěn)定地?fù)饺氲睫D(zhuǎn)基因植物中并被確認(rèn)是可操作的之后，它可以通過有性雜交導(dǎo)入到相同其他植物或另一種有性相容的物種中。取決于要雜交的物種，可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)的任一種。的植物，還包括這些植物的子代。如在此使用的，術(shù)語"子代"表示根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任何世代的后代，其中所述子代包括根據(jù)本發(fā)明制備的選定DNA構(gòu)建體。如在此公開的，"雜交"植物來提供相對于起始植物系具有一個或多個添加的轉(zhuǎn)基因或等位基因的植物系，被定義為通過雜交起始系與包含本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因或等位基因的供體植物系引起特定的序列被導(dǎo)入植物系的技術(shù)。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，例如，人們可以進(jìn)行以下的步驟(a)第一(起始系)和第二(包含期望的轉(zhuǎn)基因或等位基因的供體植物系)親本植物的植物種子；(b)將所述第一和第二親本植物的種子生長成帶有花朵的植物；(c)用來自第二親本植物的花粉傳粉到第一親本植物的花；以及(d)收獲帶有受精的花朵的親本植物上產(chǎn)生的種子?；亟辉诖吮欢x為包括以下步驟的過程(a)將含有期望的基因、DNA序列或元件的第一基因型的植物與缺乏所述期望的基因、DNA序列或元件的第二基因型的植物雜交；(b)選擇含有所述期望的基因、DNA序列或元件的一個或多個子代植物；(c)將所述子代植物與第二基因型的植物雜交；和(d)重復(fù)步驟(b)和(c)以將期望的DNA序列從第一基因型的植物轉(zhuǎn)移到第二基因型的植物。DNA結(jié)果。DNA序列已經(jīng)基因插入其中的植物基因型可以稱為回交轉(zhuǎn)化的基因型、系、自交體或雜交體。類似地，缺乏期望的DNA序列的植物基因型可以稱為未轉(zhuǎn)化的基因型、系、自交體或雜交體。種子、粗粉、油和包含種子、粗粉和油的產(chǎn)品本發(fā)明還提供了超過約1000、更優(yōu)選的約20,000、再更優(yōu)選的約40,000個種子的容器，其中超過約10%、更優(yōu)選的約25%、更優(yōu)選的約50%、再更優(yōu)選的約75%,或更優(yōu)選的約90%的種子是來自本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明還提供了超過約10kg、更優(yōu)選的約25kg、再更優(yōu)選的約50kg種子的容器，其中超過約10%、更優(yōu)選的約25%、更優(yōu)選的約50%、再更優(yōu)選的約75%,或更優(yōu)選的約90%的種子是來自本發(fā)明的植物的種子。本發(fā)明的任何才直物或其部分可以被收獲，以及任選的一皮加工來產(chǎn)生飼料、粗粉或油產(chǎn)品。為這個目的的特別優(yōu)選的植物部分是收獲的谷粒，但可以收獲其他植物部分并用于干草或青貯料。產(chǎn)生飼料、粗粉和油產(chǎn)品的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，美國專利4,957,748;5,100,679;5，219，596;5,936,069;6,005,076;6,146,669;和6,156,227。本發(fā)明的谷?；蛳?分可以與其他谷?；虼?分混合。方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了提供具有提高的DHA或EPA含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法。這種方法可以包括，例如，將編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶和PKS復(fù)合物的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中，并從所述轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞再生具有提高的DHA或EPA含量的植物。更具體地，本發(fā)明提供了生產(chǎn)含有DHA或EPA的植物油的方法，包括步驟(a)生長包含用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的植物，所述DNA構(gòu)建體包含與編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA分子可操作連接的異源啟動子，其中所述DNA分子選自以下構(gòu)成的組在5xSSC、50%曱酰胺和42。C的條件下，與SEQIDNO:6或SEQIDNO:8雜交的多核普酸，或其互補(bǔ)物；編碼SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列的多核苷酸；編碼與SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸；編碼SEQIDNO:l的多肽的多核苷酸；以及編碼SEQIDNO:3的多肽的多核苷酸，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含聚酮化合物合酶；(b)產(chǎn)生種子；和(c)加工所述種子來獲得油。本發(fā)明進(jìn)一步提供了提供轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物可以含有提高的DHA或EPA水平，其中所述提高的水平大于在非轉(zhuǎn)化的植物中存在的水平。對于飲食補(bǔ)充，純化的PUFA、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分、或其衍生物，可以摻入烹調(diào)油、脂肪或配制的人造黃油中，從而在正常使用中接受者將接受期望的數(shù)量。PUFA也可以摻入嬰兒配制食品、營養(yǎng)增補(bǔ)劑或其他食物產(chǎn)品，可以用作抗炎試劑或膽固醇降低試劑。如在此使用的，"可食用組合物，，被定義為可以被哺乳動物攝食的組合物，例如食品、營養(yǎng)物質(zhì)和藥物組合物。如在此使用的，"食品"是指可以用作或被制備用作哺乳動物的食物的物質(zhì)，包括可以在食物(例如油炸用油)或食物添加劑的制備中使用的物質(zhì)。例如，食品包括用于人類消費(fèi)的動物，或由此而來的任何產(chǎn)品，例如，雞蛋。典型的食品包括但不限于飲料(例如，軟飲料、充碳酸氣的飲料、準(zhǔn)備混合的飲料)、泡制的食物(例如，水果和蔬菜)、調(diào)味汁、調(diào)味料、色拉油、果汁、糖漿、餐后甜點(diǎn)例如，布丁、凍、結(jié)冰的和填滿的、烘焙食品和冷凍甜食，例如冰淇淋和水糕)、軟冷凍食品(例如，軟冷凍奶油、軟冷凍冰洪淋和酸奶，軟冷凍奶油，例如乳制的和非乳制的人造稠黃油)，油和乳化的產(chǎn)品(例如，起酥油、人造黃油、蛋黃醬、黃油、烹調(diào)油和色拉油)和半干食品(例如，米飯和狗糧)。添加劑或補(bǔ)充劑被攝食。這些可以與營養(yǎng)物質(zhì)例如各種維生素和礦物質(zhì)一起配制，并摻入基本上液體的組合物，例如營養(yǎng)飲料、豆?jié){和湯中，基本上固體的組合物；以及明膠，或用于形成粉末來包括入各種食物。在這種功能或健康食物中有效成分的含量可以類似于典型的藥物試劑中含有的。純化的PUFA、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分也可以摻入到動物，特別是家畜的祠料中。這樣，動物自己可以受益于富含PUFA的膳食，而來自這種家畜的食物產(chǎn)品的人類消費(fèi)者也可以收益。對于藥物用途(人類或獸醫(yī))，所述組合物一般可以口服地施用，但是可以通過任何途徑來使用，通過所述途徑它們可以被成功地吸收，例如胃腸外的(即，皮下的、肌內(nèi)注射的或靜脈內(nèi)的)、直腸的、陰道的或體表的，例如，皮膚軟膏劑或洗液。本發(fā)明的PUFA、轉(zhuǎn)化的植物或植物部分可以單獨(dú)施用，或與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合地施用。當(dāng)可用時，膠嚢是優(yōu)選的口服施用形式。如以上闡述的膳食添加劑也可以提供口服的施用途徑。本發(fā)明的不飽和酸可以以共軛的形式，例如，鹽、酯、酰胺或脂肪酸的前藥來施用。任何藥學(xué)上可接受鹽被本發(fā)明包括，特別優(yōu)選的是鈉、鉀或鋰鹽。還包括的是N-烷基多羥基胺鹽，例如N-曱基葡糖胺，在PCT公開WO96/33155中找到。優(yōu)選的酯是乙酯。對于固體鹽，PUFA也可以以片劑形式施用。對于靜脈內(nèi)施用，PUFA或其書于生物可以摻入到商用配方，例如Intralipids中。實(shí)施例包括以下實(shí)例來說明本發(fā)明的實(shí)施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在根據(jù)本發(fā)明人公開的當(dāng)前技術(shù)的實(shí)施例中所公開的技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)踐中良好地運(yùn)作。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)當(dāng)前公開的內(nèi)容應(yīng)當(dāng)理解，可以在公開的特定的方案中進(jìn)行許多變化，在不離開本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下仍獲得相象的或類似的結(jié)果。更具體地，顯而易見的是，可以用化學(xué)上和生理學(xué)上都相關(guān)的某些試劑替換在此描述的試劑，而達(dá)到相同的或相似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的所有這種相似的替換和修改都認(rèn)為處在由附隨的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。實(shí)施例1磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶序列的克隆克隆了三種細(xì)菌磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶。來自Wewa"e〃aSCRC-2738的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(Ppt)的氨基酸序列(SEQIDNO:17)被用于檢索公眾數(shù)據(jù)庫的在EPA或DHA生物合成中起作用的新的；/^。這種檢索產(chǎn)生了來自57ew"we〃flowe/t/e"w^MR-1(SEQIDNO:1)(So-///)和Co/廳脂"c/^，/麼"(SEQIDNO:3)(Cp-///)的推定的來自S/^mme〃ao"e^e"w、PCRMR-l(SEQIDNO:2)和Co/we〃z'a;"c/^eo;Arae"(SEQIDNO:4)的；;^的核酸序列4吏用以下的引物配對使用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(Roche,AppliedScience,Indianapolis,IN)來克隆Shewnew5':tcgagctcgcatatgaagattgagcttttttttatacc(SEQIDNO:9)Shew3':tcttaattaattagtcagccaaactagccgo(SEQIDNO:10)Colwenew5':tcgagctcgcatatgacttctttttctcaatctg(SEQIDNO:11)Colwe3':tcttaattaattagatttcctgataaccaagtag(SEQIDNO:12).使用對于57^K^ze〃a和Co/we肌ap//分別設(shè)置在55。C和52。C的熔解溫度擴(kuò)增基因25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用7V&I和消化，并連接到AWd和消化的NovagenpACYC-Duet-l(EMDBiosciences,Darmstadt,Germany)，分別引起pMON68081(附圖1)和pMON68080(附圖2)的形成。為了克隆A/oW&〃aman>m石奔酸泛酰3?；野坊D(zhuǎn)移酶(Mm-)，比對S/^HYme〃aSCRC-2738;/^(SEQIDNO:18)、C./"c/^eo^raea戶^和S.owaV/e"w、MR-1的核苷酸序列來鑒定這些序列的最保守的區(qū)域。So卞;^(SEQIDNO:2的bps425-635)和Q7-//7/(SEQIDNO:4的bps389-596)中的保守核苷酸序列的區(qū)域通過這種比對來鑒定出，選擇這個區(qū)域中的序列來產(chǎn)生探針，利用來自C./"c/^eo^Araea和ow^We"w\yMR-1的基因組DNA作為模板DNA和以下的引物ShewandlaFltaggtgtcgatattgagcggg(SEQIDNO:13)ShewnellaRltoaaa能caaaggattttaae(SEQIDNO:14)ColwelliaFltcggttgtgatgttgaaaatac(SEQIDNO:15)ColwelliaRlttaaaactaaaatcagcgagt(SEQIDNO:16).根據(jù)廠家的方案使用PCRDIG探針合成試劑盒(Roche)產(chǎn)生毛地黃毒苷標(biāo)記的探針，用于94。C、55。C和65。C各30秒的30個循環(huán)，之后在65。C孵育7分鐘，和隨后在4。C孵育。毛地黃毒苷標(biāo)記的探針用于Southern雜交來探測M.總基因組DNA中的同源序列，cwe^eww;MR-1和C.;^c/^eo^raea作為陽性對照。根據(jù)廠家的方案使用DIGEasyHyb(Roche)在30。C進(jìn)行雜交。使用0.5xSSC、0.1%SDS在室溫下洗滌濾過器兩次。使用抗毛地黃毒苷-AP、Fab片段和DigWash和BlockBufferSet(Roche)根據(jù)廠家方案顯現(xiàn)Dig標(biāo)記的探針。使用Co/we肌a探針獲得了來自Mman'加DNA的最強(qiáng)信號。在某些情況下，這些信號與使用幼enw2e〃G探針從M.manTmDNA獲得的弱信號重合。根據(jù)Southern雜交實(shí)驗(yàn)，選擇M.wan'waDNA的和尸Wl消化來克隆雜交片段。使用Sg/II或尸WI消化總基因組DNA,在瓊脂糖凝膠上大小分級，切下適當(dāng)大小的片段。使用Qiagen凝膠提取試劑盒(Qiagen，Valencia,CA)純化DNA片段。分級的DNA的等分量在瓊脂糖凝膠上跑動，使用Turboblotter(Schleicher&Schuell，Keene,NH)根據(jù)廠家的方案印跡在尼龍膜(Roche,Mannheim,Germany)上。目標(biāo)片段通過利用Co/we〃&探針的Southern雜交來鑒定。選擇Sg/II級分5和尸WI級分4來產(chǎn)生pSP72中的部分庫(Promega,Madison，WI)。這些庫轉(zhuǎn)化到」&c/^n'c/H'aco/ZDH5a中，克隆的庫等分到96孔平板的反應(yīng)孔中過夜生長。培養(yǎng)等分量進(jìn)行旋轉(zhuǎn)沉淀，丟棄上清液，細(xì)胞顆粒重懸浮在lOjil10。/qSDS溶液中。細(xì)胞顆粒加熱l分鐘到100°C,點(diǎn)樣在尼龍膜(Roche)上。根據(jù)廠家方案，通過在含有1.5MNaCl的0.5MNaOH中孵育5分鐘，通過在含有1.5MNaCl的0.5MTris/HCl、pH7.6中孵育5分鐘來中和，在2xSSC中洗滌5分鐘，在StratageneUV-Stratalinker2400(Stratagene,LaJolla,CA)中通過1分鐘UV孵育來固定，使DNA變性。使用Co/we〃/ap內(nèi)探針探測所述印跡。陽性信號跟蹤回來源反應(yīng)孔，來自該反應(yīng)孔的等分量平鋪來獲得單個菌落。這些單個的菌落接種到含有100mg/1carbampicillin的250i!lLB中。生長細(xì)胞，重復(fù)如上所述的雜交操作來鑒定含有單個陽性克隆的反應(yīng)孔。生長陽性克隆，分離質(zhì)粒DNA,并用Sg/H、尸vwll、尸WI或Sa/I消化。這些消化物用于Southern雜交來確認(rèn)陽性克隆。此時，所有剩余的克隆被發(fā)現(xiàn)是陽性的。挑選最終的克隆中的三個(兩個^g/n克隆和一個尸Wl克隆)用于DNA測序分析。完整序列的生物信息學(xué)分析揭示了，尸WI克隆僅含有部分Mw-p/"而Sg/II克隆含有完整的開放閱讀框。所有三個克隆的完整DNA序列被組裝到一個重疊群(contig)中。選擇一個5g/II克隆用于進(jìn)一步的克隆實(shí)驗(yàn)(pMON96400)。Mm卞W的推定的氨基酸序列在SEQIDNO:5中顯示，如果起始密碼子是TTG(稱為長Mm-/;/)。使用Met的可選擇起始密碼子在SEQIDNO:5的氨基酸43發(fā)現(xiàn)(產(chǎn)生稱為短Mm-;;^的多肽，SEQIDNO:7)。長Mm卞W的核酸序列是SEQIDNO:6。短Mm-p;^的核酸序列在SEQIDNO:8中示出。本發(fā)明的Ppt的氨基酸相關(guān)性的比較在表1中示出。表l:磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例2磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶序列在￡^c/^n'c/H'aco/《'中的表達(dá)為了展現(xiàn)實(shí)施例1中描述的的功能，將Mon'te〃aman'wfl聚酮化合物合酶(PKS)基因克隆到NovagenpDUET載體(EMD，Biosciences,Darmstadt,Germany)中，一種4個相容的co//表達(dá)載體的組。這種PKS由核酸(SEQIDNO:20)、or/6(SEQIDNO:22)、or/7(SEQIDNO:24)和o^/8(SEQIDNO:26)編碼的4個多肽組成，在6，140,486中分別被稱為or/6、or/7、or/S和or/9。使用pDUET載體的3中構(gòu)建了表達(dá)載體pMON94547(Orf5和Orf6)(附圖3)、pMON94544(Orf7)(附圖4)和pMON94534(Orf8)(附圖5)。第四種pDUET載體被用于pW表達(dá)。為了獲得酶活性的PKS,Orf5表達(dá)產(chǎn)物需要泛酰巰基乙胺基化，其由Ppt催化。將每種細(xì)菌/7W克隆到pACYC-DUET-l中。在實(shí)施例1中描述了pMON68081和pMON68080的構(gòu)建。類似地，兩種不同的4偉定的M.man'wa/Ws,短Mm畫//Z或長Mm-/;尋皮克隆到相同的基礎(chǔ)載體中，Co/we肌a和幼ewfl"e〃a分別產(chǎn)生pMON68084(附圖6)和pMON68085(附圖7)。longMm-j^fPCR引物(SEQIDNO:27)將推定的TTG起始改變?yōu)锳TG。然后每種；/^在五.co/Z中與M.man'"aPKS基因一起表達(dá)，孵育24小時，凍干的五.co"細(xì)胞直接用硫磺酸/甲醇來曱基化，通過氣相色譜法分析脂肪酸曱基酯的EPA和DHA含量。結(jié)果在以下的表2中顯示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>在五.co//中完整的Mon7e//aman'""PKS與任何測試的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶的共表達(dá)，引起了DHA的積累，而沒有Ppt共表達(dá)的M.man'""PKS的表達(dá)沒有引起DHA積累。Cp-ppf與不完整的PKS(缺少Orf8)的共表達(dá)也不引起DHA積累。這些結(jié)果表明，所有測試的PPT泛酰巰基乙氨基化M.man'""PKS，引起活性的多酶復(fù)合物的形成。已經(jīng)展現(xiàn)了Orf7(美國專利6,140,486中的Orf8)控制PUFA生產(chǎn)PKS的最終產(chǎn)物中的鏈長度。57^Twme〃a/w^e/a"'e"s的PKS產(chǎn)生EPA。在含有;w^e/acZe^PKS簇的五.co/z'中的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用Mon'化〃aman>zflor/7補(bǔ)足時，or/7缺失突變體產(chǎn)生了DHA。用于活化PKS的Ppt不改變產(chǎn)物，因而本發(fā)明的Ppt被用于在與EPA生產(chǎn)PKS組合時產(chǎn)生EPA,在與DHA生產(chǎn)PKS組合時產(chǎn)生DHA。實(shí)施例3磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶序列在植物中的表達(dá)為了展現(xiàn)M.wan7mPKS，包括M.;/^在植物中合成DHA的能力，產(chǎn)生了幾個植物表達(dá)盒。修飾o;/5-8的基因用于在雙子葉植物中表達(dá)。已知的是，非內(nèi)源蛋白編碼序列可能不在植物中良好表達(dá)(美國專利5,880,275,通過引用合并在此)。因而，使用Orfs5-8的天然PKS多肽序列(SEQIDNO:19、21、23和25)，通過(1)使用與高度表達(dá)的大豆蛋白類似的密碼子利用率偏愛性，和2)消除早先表征的和已知影響植物中mRNA穩(wěn)定性的RNA不穩(wěn)定化元件(美國專利5,880,275)和通過在ATG起始密碼子之前引入Kozak序列(Joshi"a/.,1997),設(shè)計和構(gòu)建了人工蛋白質(zhì)編碼多核苷酸序列。產(chǎn)生的修飾的多核苷酸序列編碼在序列上與天然多肽相同的多肽。二元載體pMON97063(附圖8)含有的表達(dá)盒(密碼子修飾的，SEQIDNO:28)(在具有L-Ph.DnaK前導(dǎo)區(qū)的FMV.35S-enh啟動子的控制下)和短Mm-(SEQIDNO:8)(在CaMV35S-enh啟動子和L-CaMV35S前導(dǎo)區(qū)的控制下)。這個載體攜帶Bar基因作為可選擇標(biāo)記。二元載體pMON94563(附圖9)通過克隆or/6的表達(dá)盒(密碼子修飾的，SEQIDNO:29)(在具有L-CaMV35S前導(dǎo)區(qū)的CaMV35S-enh啟動子的控制下)、or/7(密碼子修飾的，SEQIDNO:30)(在具有L-Ph.DnaK前導(dǎo)區(qū)的FMV35S-enh啟動子的控制下)和or/S(密碼子修飾的，SEQIDNO:31)(在具有L-CaMV35S前導(dǎo)區(qū)的CaMV35S-enh啟動子的控制下)的表達(dá)盒來產(chǎn)生。pMON94563帶有提供草甘膦抗性的CP4標(biāo)記物。二元載體pMON97066(附圖10)含有與pMON94563相同的表達(dá)盒，但是or/7盒在or/6盒之前而不是之后。所有構(gòu)建體通過DNA測序來序列一驗(yàn)證。二元載體配對pMON97063和pMON94563、或pMON97063和pMON97066<吏用土i裏桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化共轉(zhuǎn)染到爿ra&t/o/wz^Aa/zVma中。再生植物，分析轉(zhuǎn)化的Rl爿ra&Wo;:^植物的葉材料和這些^:物的R2種子的脂肪酸含量和組成。為了產(chǎn)生攜帶所有4種PKS基因和的單個多基因二元載體，用HindIII和Notl消化低拷貝數(shù)的二元載體pMON83934，與由寡聚體MCS-3(SEQIDNO:32)和MCS畫4(SEQIDNO:33)構(gòu)成的多聚接頭連接。產(chǎn)生的載體稱為pMON68091。or/6、or/7、or/5和CP4可選擇標(biāo)記的表達(dá)盒通過Hindm/^sAVI消化從pMON94563上切除，并連接到HindIIIASw'WI消化的pMON68091中。產(chǎn)生的二元載體用Aycl和5w'WI消化，并與含有通過^s/WI/^scI消化切除的、來自pMON97063的w/5和的表達(dá)盒連接。產(chǎn)生的二元載體pMON96401(附圖11)經(jīng)由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)化到爿ra^Wo戸^Afl/Zfl加和大豆中。植物進(jìn)行再生，分析來自這些植物的葉和種子材料的脂肪酸含量和組成。含有pMON96401的48個Rl事件在Jra&Wo/w/s中產(chǎn)生。通過氣相色譜法分析來自這項(xiàng)研究的成熟的R2種子。所分析的48個事件中的9個產(chǎn)生了DHA(表3)。表3含有pl事件<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>用pMON96401轉(zhuǎn)化的R2^ra&Wo戸^種子的4個含DHA事件的分子特征在表4中表示。數(shù)據(jù)表明，通過TaqMan敏AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)終點(diǎn)分析所測定的，產(chǎn)生DHA的事件對于5個轉(zhuǎn)基因的存在是陽性的。表4^m^Wo戸^pMON96401基因存在<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>在pMON96401Jra^Wo/w^種子的R3世代中，通過氣相色譜法，表型保持了0.025-0.1%范圍的DHA。通過使用魚油作為標(biāo)準(zhǔn)的氣相色譜法/飛行時間質(zhì)譜法，確認(rèn)了氣相色譜峰是DHA。對于Mon'te〃aman7zaPKS的種子特異性表達(dá)，使用種子特異性啟動子例如p7Sa、p7Sa,、Arcelin-5、USP88、pNapin、pFAE或pOleosin將天然的或密碼子修飾的基因克隆為單個基因表達(dá)盒。隨后，使用低拷貝數(shù)的二元載體例如pMON83934作為基礎(chǔ)載體，組裝這些表達(dá)盒來將所有五種基因組合到單個二元載體中。產(chǎn)生的五基因載體(它們的每一種攜帶所有四個PKS基因加上p內(nèi)表達(dá)盒)可以含有相互之間順序或取向可變的表達(dá)盒。這些載體轉(zhuǎn)化到大豆中，分析產(chǎn)生的大豆種子的脂肪酸含量和組成。用于M.man'waPKS和M.man7za/p/的種子特異性表達(dá)的多基因載體的實(shí)例如下。雙子葉植物密碼子強(qiáng)化的PKS和；內(nèi)基因的種子特異性表達(dá)的表達(dá)盒如表5所描述的來組裝。表達(dá)盒按照頭接尾的取向組裝，引起pMON78528(附圖12)的形成。這種二元載體使用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)化到大豆和^ra^Wo;w、中，分析產(chǎn)生的種子的脂肪酸含量和組成。表5:M.man'加PKS的種子特異性表達(dá)盒。啟動子_^_3'UTR_napin(SEQIDNO:35)短Mm-ppKSEQIDNO:34)napin3'(SEQIDNO:36)Arcelin5Oy7(SEQIDNO:30)Arcelin53'7Sa，(SEQIDNO:29)7Sa,3'7Sa<>/8(SEQIDNO:31)nos3'USP88O》(SEQIDNO:28)Adrl2為了展現(xiàn)M.wan'waPKS與M.manVza—起來在玉米中合成DHA的能力，產(chǎn)生了幾種植物表達(dá)盒。修飾0^5-8和戶j^的基因用于在單子葉植物中表達(dá)。已知的是，非內(nèi)源蛋白編碼序列可能不在植物中良好表達(dá)(美國專利5,880,275,通過引用合并在此)。因而，使用早先描述的天然Orf和Ppt多肽序列，通過1)使用類似于高度表達(dá)的玉米蛋白質(zhì)的密碼子利用率偏愛，和通過2)消除早先表征的和已知影響植物中的mRNA穩(wěn)定性的RNA不穩(wěn)定化元件(美國專利5,880,275),來設(shè)計和構(gòu)建了人工蛋白質(zhì)編碼多核苷酸序列。產(chǎn)生的修飾的多核苷酸序列編碼在序列上與天然多肽相同的多肽。用含有修飾的多核苷酸序列的載體通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來獲得轉(zhuǎn)化的外植體。從轉(zhuǎn)化的組織再生植物。然后對溫室生長的植物分析目標(biāo)基因表達(dá)水平以及油的組成，包括DHA或EPA。實(shí)施例4聚酮化合物合酶序列的克隆從2個物種中克隆出八個候選的聚酮化合物合酶基因。M.mtm'"flPKS基因的推斷的氨基酸序列(SEQIDNO:19、21、23和25)用于檢索可用的數(shù)據(jù)庫中的W麵"eZ/ao腦We腦;(ATCC#—700550)和Co/we〃i";wc/^eo;//^we(ATCC#—BAA-681)中的新的聚酮化合物合酶基因。&owaWe"w、積累EPA,而C.;w;;c/^eo^/^eae積累DHA。才艮據(jù)這一點(diǎn)，相信的是，這些細(xì)菌中的PUFA生產(chǎn)將來自PKS機(jī)制。檢索從每種細(xì)菌產(chǎn)生了一組4個候選PKS基因。利用PCR克隆技術(shù)，將這些基因克隆到TOPO克隆載體中，證實(shí)序列，在Duet表達(dá)載體中亞克隆(參見表6)?！稴.owd(ie腦S與M.man7zao//<5、o//7、和/^一起在五.co"中的表達(dá)，如通過氣相色譜法測定的，發(fā)現(xiàn)引起多達(dá)0.2。/。DHA的形成，i正實(shí)了6".o"ezV/e"w、or/5的預(yù)測的功能。類似地，通過在中與M.waWwa基因一起表達(dá)，或通過在五.co/z'中表達(dá)來自Wewawe〃a或Co/we肌a的完整PKS基因或這兩個物種的組合，確認(rèn)了表6中所列的每個基因的功能。做為選擇，功能在植物中展現(xiàn)。表6:用于67^wfl"e〃"和Co/we肌"PKS基因的五.co/z'表達(dá)載體。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>參考文獻(xiàn)以下列出的參考文獻(xiàn)通過應(yīng)用合并在此，達(dá)到它們補(bǔ)充、說明、提供背景、教導(dǎo)方法、技術(shù)和/或在此采用的組合物的程度。美國專利4,518,584、美國專利4，737，462、美國專利4,810,648、美國專利4,957,748、美國專利4,965,188、美國專利5,094,945、美國專利5，100，679、美國專利5,176，995、美國專利5，196,525、美國專利5,219,596、美國專利5,290,924、美國專利5,322,783、美國專利5,359,142、美國專利5,424,398、美國專利5，424，412、美國專利5,500,365、美國專利5，538，880、美國專利5，550，318、美國專利5,563,055、美國專利5,610,042、美國專利5,627,061、美國專利5，633，435、美國專利5,641,876、美國專利5,880,275、美國專利5，936，069、美國專利6,005,076、美國專利6,040,497、美國專利6,140,486、美國專利6,140，486、美國專利6,140,486、美國專利6,140,486、美國專利6,146,669、美國專利6,156,227、美國專利6,265,638、美國專利6,319,698、美國專利6,433,252、美國專利6,451，567、美國申請10/235,618、美國申請10/429,516、美國公開20040039058、美國/>開20040235127AllenandBartlett,Aif/c廠o&》/ogK，148(Pt6):1903-I913,2002.Baersona/.，/V""fAfoZ.及'o/.,22(2):255-267,1993.Barany"/nf./'iVo紐i"30:705-739,1987.Bauer"at/.,Gewe,37:73,1985.BelangerandKriz,Cen".,129:863-872，1991,BevaneZaUwc/e/"c/血/as.,ll(2):369-385,1983.Bodanszky,In:尸nf"ci》/escj/"jPe/7"'ife^v^Aaiy,Springer-Verlag，Heidelberg,1984,Buatos'。/.，P!a/rtCeW,1(外839-853'1989.Callise"/.,Ge"幼力ev.,1:1183-1200,1987,Chandler"a/.,尸/fl"rCW/'1:1175-1183,1989.ChenJVoc.Afe/.Jcarf.5fcz'.Lffi4，83:8560-8564,1986.ChuSc/eK"a及":'ca，18:659-668,1975.DeDeckerer,五w.J!C7/汰油frv，52:749，1998.DeBlocke/fl/.，SWSOJ!,6:2513-2519,1987.Eberte,/"iVoc.Ato/.5tf.84:5745-5749,1987-FreitagandSelker，Cwr.Opiw_C幼et￡>ev.，15(2):191-199,2005.Galliea/.,Ce//,1:301，1999.Hong"a/,'Afo/.及'o/"34(3):549-555,1997.HudspethandGrula，尸toWAfo/.及W.，12:579-589,1989,Ingelbredhta。/.,W加rCe//，1:671-680,1989.Jamesa/.，5femf".^wArf加28:85，2000.Joshi"o/.,尸/ararAfo/.5!'o/.,35(6>:993-10011997.Joshi^wcW"c他及es.,15:6643-6653,1987,KridlWa/,，&ed&(.1:209:219,1991.Kridl"a/,,iiej.,1:209-219,1991.LawtonefaZ.,PtewfAfo/.說。/.9:315-324,1987.Lopes"o/.,Afo/.G饑(e朋"247:603-613,1995.Maniatis,ef<zZ.，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989.ManzioriseZ/.,J/w.■/C7!>j.胸n,59:1304,1994.Maundrell，義及oZ.C力e加.，265(19):10857-I0864，1990.McElroyefa/.,Afo/.G^m.2M(1):15(M60,1991.Menifield,7.^m.CVie限85:2149-2154,1963.Metzef敘e"ce,293(5528):290-293,2001.Misawaa/,戶/a"",4:833-840，1993.Misawa"a/,尸/。n",6:481-489,1994.MurashigeandSkoog^P/yw》Z.'P/加，15:473497,1962.Naylorefo/,,iV。ftw，405:1017,2000.PCT申請WO04071467A2PCT申請WO05103253A1PCT申請WO2002/50295PCT申請WO95/06128PCT申請WO96/33155PederenCe//,29:1015-1026,1982.RecombinantDNAPartD，MethodsinEnzymology,Vol.153,WuandGrossman,eds.,AcademicPress,1987.Richinsa/.,ATwcfeic^c!Vfe及a.，20:8451,1987.Ri銘s,""/.'P/a^Ce//,1(6):609-621，1989.Russelle"/.,7>"。7wgem'cias.,6(2):157國168,1997.Sambrookc/.,M/ecw/arcfow'g:aZai。rotf。/y柳a/wo/,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHaibor，NY,l卿.Saihasiivana/.,M<c/.^c始18:2188-2193,1990.SjmopoulosdCo〃.Mifr"18:487，1999.Simopoulos,C饑J:外j;嵐75:234^239,1997Slocombeefc二，104(4):167-176,1994.Staceya/.,腺.腺,，31:1205-1216,1996,SullivaB時a/.,Afo/.Ge汰CertW.，215(3):431"440，1989.TurnerandFoster,M>/ecw/arS!'她cA"3:225，1995.Vasil"a/.,P/。w尸Ajw'。iT.,91:1575-1579,1989.Waldcr^Gewe，42:133,1986.Walkere"/.,/Voc.油".Jcorf.iW,84:6624，1訴7.Wanga"Mofec.C"/.說o/,,12(8):3399-3406,1992,WohIIcbendGewe,70:25-37,1988.Yang"a/.，iV。cJVa比JCtxd>SW,t/SA87:9568-95741990.權(quán)利要求1.一種分離的多核苷酸，包含選自以下構(gòu)成的組的序列(a)在5×SSC、50％甲酰胺和42℃的條件下與SEQIDNO6或SEQIDNO8或其互補(bǔ)物雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽；(b)編碼SEQIDNO5或SEQIDNO7的多肽序列的多核苷酸；和(c)編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的、具有與SEQIDNO5或SEQIDNO7的多肽序列至少75％的序列同一性的多肽的多核苷酸。2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，進(jìn)一步定義為與異源啟動子可操作連接。3.—種DNA構(gòu)建體，其包含與權(quán)利要求1的分離的多核苷酸可操作連接的異源啟動子。4.權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子是在原核細(xì)胞中有功能的。5.權(quán)利要求3的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子是在真核細(xì)胞中有功能的。6.權(quán)利要求5的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子是在植物細(xì)胞中有功能的。7，權(quán)利要求6的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動子是種子增強(qiáng)的啟動子。8.—種宿主細(xì)胞，用與在所述宿主細(xì)胞中有功能的啟動子可操作連接的、編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA分子(a、)權(quán)利要求i的分離的多核苷:序列:'(b)編碼與SEQIDNO:1的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和(c)編碼與SEQIDNO:3的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核普酸。9.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼包含磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(diǎn)的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子，其中所述編碼聚酮化合物合酶多肽的DNA分子與異源啟動子可#:作連接。10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述聚酮化合物合酶多肽包含來自Mon化〃a的磷酸泛酰巰基乙胺附著位點(diǎn)。11.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼與SEQIDNO:19的多肽序列具有至少75%的序列同一性的聚酮化合物合酶多肽的DNA分子。12.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。13.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真菌或細(xì)菌細(xì)胞。14.權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，定義為相對于與所述宿主細(xì)胞相同基因型、但缺少所述DNA分子的細(xì)胞展現(xiàn)了改變的脂肪酸生物合成。15.—種轉(zhuǎn)基因植物，包含與在所述植物有功能的啟動子可操作連接的、編碼具有磷酸泛酰琉基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA分子，其中所述DNA分子包含選自以下構(gòu)成的組的序列(a)權(quán)利要求1的分離的多核苷酸序列；(b)編碼與SEQIDNO:1的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸；和(c)編碼與SEQIDNO:3的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核普酸。16.權(quán)利要求15的植物，其中所述植物選自由油菜、5mw/cacampes^〃.51、含'油種子、油菜(oilseedrape)、；由菜泮予(rapeseed)、大豆、crambe、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、葵花、玉米、稻米、大麥、粟、黑麥、小麥、燕麥、苜蓿和高粱構(gòu)成的組。17.權(quán)利要求15的植物，進(jìn)一步定義為包含編碼聚酮化合物合酶的DNA分子。18.權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中所述種子包含所包含的DNA分子。19.一種生產(chǎn)食物或飼料的方法，包括步驟(a)獲得權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因植物或其部分；和(b)從中生產(chǎn)所述食物或飼料。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述食物或飼料是油、青貯料、粗粉、糧食、淀粉、粉末或蛋白質(zhì)。21.—種通過權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的、包含可一全測的核酸分子的食物或飼料組合物，所述可檢測的核酸分子包含權(quán)利要求1的分離的多核苷酸。22.通過權(quán)利要求的方法生產(chǎn)的食物或祠料組合物，其中權(quán)利要求15的植物包含編碼聚酮化合物合酶的DNA分子，其中所述食物或飼料組合物包含二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。23.權(quán)利要求21的食物或飼料組合物，其中所述植物是在所述植物缺乏所述編碼聚酮化合物合酶的DNA分子和編碼具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的DNA分子時不生產(chǎn)二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸的物種。24.—種生產(chǎn)二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸的方法，包括步驟(a)在包含編碼聚酮化合物合酶的DNA分子的植物的種子中表達(dá)選自以下構(gòu)成的組的多核苦酸(i)權(quán)利要求1的分離的多核普酸序列，(ii)編碼與SEQIDNO:1的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核香酸，和(iii)編碼與SEQIDNO:3的多肽序列具有至少75%的序列同一性的多肽的多核苷酸，來產(chǎn)生二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸；和(b)從所述種子獲得二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。25.—種從根據(jù)權(quán)利要求24制備的植物產(chǎn)生的食物或祠料組合物，包含二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸。全文摘要本發(fā)明一般地涉及磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，其是聚酮化合物合酶復(fù)合物的活化所需的，以合成長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，例如，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。特別是，本發(fā)明涉及細(xì)菌磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶、用于它們在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的DNA構(gòu)建體，以及當(dāng)所述宿主細(xì)胞包含于植物中時涉及種子、油和粗粉。還提供的是生產(chǎn)含有二十二碳六烯酸和/或二十碳五烯酸的植物油的方法。文檔編號C12N9/12GK101415822SQ200780012056公開日2009年4月22日申請日期2007年1月30日優(yōu)先權(quán)日2006年1月31日發(fā)明者H·瓦倫丁,J·彭,S·斯克林申請人:孟山都技術(shù)有限公司