專利名稱:選擇和穩(wěn)定dsRNA構(gòu)建體的制作方法
選擇和穩(wěn)定dsRNA構(gòu)建體
背景技術(shù):
本發(fā)明主張2006年2月13日遞交的美國臨時(shí)專利申請60/772,736的 優(yōu)先權(quán),其通過引用整體導(dǎo)入本文。
1. 發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及RNAi構(gòu)建體在植物中的穩(wěn)定表達(dá)以使得能夠?qū)χ参锊?原體和害蟲(pest)進(jìn)行基因控制。本發(fā)明提供用于提高源自該構(gòu)建體的 dsRNAs效力的方法和組合物。
2.
背景技術(shù):
當(dāng)互補(bǔ)雙鏈RNA (dsRNA)短鏈存在于活細(xì)胞或被導(dǎo)入活細(xì)胞時(shí), 當(dāng)dsRNA和靶基因轉(zhuǎn)錄本之間具有核酸序列相似性的區(qū)域時(shí),可特異地 影響"把"基因的表達(dá)。該RNA分子可包括由"間隔"區(qū)分開的互補(bǔ)序列以 便形成RNA的雙鏈區(qū)。dsRNA可被稱作二聚RNaseIII核糖核酸酶(也稱 作"dicer"酶)的酶切割成長度約21-25堿基對的節(jié)段;稱作siRNAs ("短 干擾RNAs"(short interfering RNAs)或"小干擾RNAs,,) 。 siRNA在RNA國 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體("RISC")中產(chǎn)生特異的RNAse活性以水解粑基因 mRNA,從而轉(zhuǎn)錄后抑制耙基因的表達(dá)。只有與siRNA互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄本被 切開并降解,因此該作用(有時(shí)也稱作RNA干擾(RNA interference, RNAi))是基因特異的。在許多生物包括秀麗線蟲(Cae"oWzaZ^^ e/egara ) fFire等,1998 ), 果繩(Z)myo/ /z/A3me/awoga他r ), 昆蟲包 括鞘翅目(Co/ec^era) (Bucher等,2002 )和鱗翅目(Z^/7Wo/7&ra, (Uhlirova等,2003; Bettencourt等,2002 ),真菌(Cogoni等,2000), 和植物例如擬南芥(Jra6,'^;^W/^/&^)等之中,已使用RNAi特異性 地打斷基因表達(dá)。存在于植物中的dsRNA還可引導(dǎo)耙定的染色質(zhì)區(qū)的 DNA甲基化,導(dǎo)致基因沉默(例如Wassenegger等,1994; Carthew, 2001; Zilberman等,2004 )。
有效使用RNAi導(dǎo)致特定耙基因表達(dá)的抑制,因此RNAi構(gòu)建體在轉(zhuǎn) 基因作物中的穩(wěn)定表達(dá)可以允許對害蟲控制的新型基因方法。然而,盡 管由植物中原位U" / /a"ta)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的dsRNA耙向另一生物,但可 引起植物中的原位應(yīng)答,例如轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄本的切開("切割"),以及轉(zhuǎn)
基因宿主植物中同源轉(zhuǎn)基因的沉默。這些應(yīng)答可減少或消除dsRNA產(chǎn)生 并因此減少或消除其對耙生物的效力。
設(shè)計(jì)(Wesley等,2001; Yuan等,2004; Reynolds等,2004; Arziman 等,2005 )。在一些生物中,sRNA ("小RNA")分子(包括dsRNA) 的全身轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是已知的(例如Voinnet 2005 ),并且已知被轉(zhuǎn)運(yùn)的核 糖核苷酸序列對其攝入效率起作用(Winston等,2002 )。例如,秀麗線 蟲(C. e/eg"ra)需要長度約100個(gè)堿基對(bp)的dsRNA以例如通過SID l蛋白豐裕地(productively)攝入至腸細(xì)胞(Feinberg和Hunter, 2003 ), 而WO9953050描述了在間隔區(qū)包括內(nèi)含子序列的dsRNA構(gòu)建體。然而, 導(dǎo)致對抗把害蟲的活性dsRNA的優(yōu)化生產(chǎn)、穩(wěn)定化和攝入,而同時(shí)保證 編碼該dsRNA的轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá),并避免宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因沉默的參 數(shù)并未理解清楚。因此需要保證特異的、有效的dsRNA-編碼轉(zhuǎn)基因在植 物內(nèi)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄,以及該生成的dsRNA的隨后的轉(zhuǎn)運(yùn)及攝入,以在耙植 物病原體和害蟲物種中產(chǎn)生有效且特異的基因抑制。
下述附圖形成本說明書的 一部分并^皮包括以進(jìn)一步說明本發(fā)明的某 些方面。通過參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè),并結(jié)合本文呈現(xiàn)的具體實(shí) 施方式的詳細(xì)說明可更好地理解本發(fā)明。
圖1A-1B: 100bp的Dv49靶標(biāo)節(jié)段與來自其它代表多個(gè)屬、目和門 的生物的相關(guān)序列的比對。不同于Dza^o"ca Wrg,/era Wrgz/era ( Dv49 ) 的序列被突出。Dv49概念性翻譯的氨基酸比對(a.a.)在核苦酸序列下 示出。對Dv49序列計(jì)算Reynolds分?jǐn)?shù)并在氨基酸比對下示出-分?jǐn)?shù)位置對 應(yīng)于反義鏈21 mer的核苷酸19。在Reynolds分?jǐn)?shù)下顯示來自嵌入的26mer 效力篩查(scan)的數(shù)據(jù)??蓮母骱Y查節(jié)段產(chǎn)生的可能21mer被加上下劃 線,每個(gè)篩查節(jié)段下示出在人工的飲食生物檢測中飼以0.2ppm每種嵌入 節(jié)段時(shí)產(chǎn)生的WCR死亡率。*與未處理對照顯著不同,P值0.05, Planned Contrasts 。
圖2:與多D&^o"ca spp.比對的來自Na/K-交換ATPase (推定的 Drosophila基因,CG9261,直系同源物)的編碼序列的節(jié)段。符合群共 有性(group consensus)的序列被框出并且加陰影。測序顯示在一些情況下
存在等位基因(例如NCR序列位置49處的"R")。
圖3:利用559bp的Dv26節(jié)段和DNASTAR軟件包中的ClustalW算法 (Madison, WI)確定的系統(tǒng)發(fā)育樹。
圖4:降低基因轉(zhuǎn)錄本和生成的dsRNA轉(zhuǎn)錄本之間的直接連續(xù)序列
同一性的轉(zhuǎn)基因的設(shè)計(jì)。轉(zhuǎn)錄單元可以由來自非豐裕地(productively)
摻入RISC的siRNAs的合成序列終止。
圖5:用于在指定位點(diǎn)插入表達(dá)盒的小的有效dsRNA節(jié)段。
圖6:用于在WCR飲食生物檢測中作為dsRNA分析的300 bp
D/Wra"cav,>g,y^aV-ATPase A亞基節(jié)段。UTC二未處理對照。EST-缺
少片段l和2的短V-ATPase A亞基cDNA克隆。
圖7:以lppm飼食時(shí)Dv^嵌入的約^mer效力篩查。
圖8:以0.2ppm飼食時(shí)Dv^嵌入的約2Gmer效力篩查。
圖9:以21mers篩查的Dv49篩查14 27mer節(jié)段并在0.2ppm檢測效力。
發(fā)明概述
一方面,本發(fā)明提供獲得提供所需靶基因抑制水平的核酸節(jié)段 (segment)的方法,包括a)獲得與耙基因基本上互補(bǔ)的起始核酸分子; b)由起始核酸分子制備多個(gè)核酸節(jié)段;c)當(dāng)核酸節(jié)段在包括該靶基因 的細(xì)胞中作為dsRNA表達(dá)時(shí),檢測其抑制靶基因表達(dá)的能力;和d)從 在作為dsRNA表達(dá)時(shí)提供所需靶基因抑制水平的多個(gè)核酸節(jié)段中鑒定 至少第一核酸節(jié)段。在該方法中,核酸節(jié)段可包括約21至約26個(gè)所述起 始核酸分子的連續(xù)核苷酸部分,包括約22、 23、 24和25個(gè)核苷酸部分。 在某些實(shí)施方式中,節(jié)段包括所述起始核酸分子的重疊部分而在具體實(shí) 施方式中可能是鄰近節(jié)段。另外的實(shí)施方式中,核酸節(jié)段可定義為包括 約0.1%至約98%的所述靶基因,例如包括約0.2%、 0.4%、 0.75%、 2%、 5%、 10%、 15%、 25%、 40%、 60%、 75%和90%。
在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,可根據(jù)核酸節(jié)段作為dsRNA表達(dá)時(shí)獲得 的粑基因抑制水平對所述核酸節(jié)段分等(rank)。所需的耙基因抑制水平可 以是所述靶基因表達(dá)的約1%至約100%的抑制。某些實(shí)施方式中,所需 的抑制水平可以是靶基因的完全抑制或不完全抑制。
具體實(shí)施方式
中, 靶基因可以是植物、昆蟲、真菌、細(xì)菌或脊推生物,包括作物害蟲(crop pest)或病原體基因。檢測核酸節(jié)段抑制靶基因的能力可包括在包含該靶
個(gè)實(shí)施方式中,這可包括計(jì)算核酸節(jié)段的Reynolds分?jǐn)?shù)。另一實(shí)施方式 中,檢測核酸節(jié)段抑制靶基因的能力包括在包含該耙基因的生物的飲食 中以dsRNA分子提供所述節(jié)段并確定該耙基因的抑制水平。確定耙基因 的抑制水平可包括觀察所述生物的發(fā)病率、死亡率或生長遲緩(stunting)。
另一方面,本發(fā)明提供在細(xì)胞中抑制粑基因表達(dá)的方法,包括a)根 據(jù)本文提供的方法獲得核酸節(jié)段;和b)將由核酸表達(dá)的dsRNA提供至 包含該靶基因的宿主細(xì)胞以抑制耙基因的表達(dá)。在該方法中,提供由核 酸節(jié)段表達(dá)的dsRNA至宿主細(xì)胞可包括在宿主細(xì)胞中以正義和反義方 向表達(dá)核酸節(jié)段。提供由核酸節(jié)段表達(dá)的dsRNA至宿主細(xì)胞可包括提供 包括ds RNA的飲食至細(xì)胞或包括該細(xì)胞的生物并允許細(xì)胞攝入該 dsRNA。在一個(gè)實(shí)施方式中,宿主細(xì)胞是害蟲細(xì)胞并且提供由核酸表達(dá) 的dsRNA至害蟲細(xì)胞包括在植物細(xì)胞中表達(dá)該dsRNA并允許包括該細(xì) 胞的害蟲以該植物細(xì)胞為食。
具體實(shí)施方式
中,通過對所述細(xì)胞或包括 該細(xì)胞的害蟲的表型效應(yīng)顯示害蟲細(xì)胞中乾基因表達(dá)的抑制。該表型效 應(yīng)可以是程序性細(xì)月包死亡。
又一方面,本發(fā)明提供調(diào)節(jié)生物中至少第一基因表達(dá)的方法,包括 (a )將由本發(fā)明的方法獲得的至少第 一核酸節(jié)段作為dsRNA提供至所述 生物,其中所述dsRNA節(jié)段在所述生物中對所述基因特異;和(b)觀 察所述生物的表型效應(yīng)。在該方法中,所述表型效應(yīng)可選自由營養(yǎng)生長 停止、生殖生長停止、攝食停止、死亡率、發(fā)病率、生長遲緩、癱瘓、 有性生殖抑制、蛻皮抑制、不能飛行和不能從蛹期羽化(failuretoemerge from pupal stage)組成的組。
又一方面,本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)植物害蟲中基因表達(dá)水平的方法, 包括在所述害蟲的飲食中提供至少第一dsRNA分子,并觀察所述害蟲中 一種或更多種基因抑制的表型效應(yīng)(phenotypic effect),其中所述dsRNA 分子由顯示與所述害蟲的一種或更多種必要基因的相應(yīng)DNA序列基本 上同源的核苷酸序列產(chǎn)生,并且其中所述核苷酸序列是根據(jù)本文提供的 方法鑒定的核酸節(jié)段。
又一方面,本發(fā)明提供用于抑制植物害蟲侵染(infestation)的方法,
該植物或其部分或其組織至一種或更多種包括所述核苷酸序列的害蟲,
以及觀察所述生物中的表型效應(yīng),其中該表型效應(yīng)足以抑制所述害蟲侵 染所述轉(zhuǎn)基因植物。
又一方面,本發(fā)明提供保護(hù)植物免于害蟲侵染的方法,包括在轉(zhuǎn)基
因植物中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明獲得的dsRNA分子并提供該植物或其部分或 其組織至一種或更多種包括所述核普酸序列的害蟲,以及觀察所述生物 中的表型效應(yīng),其中該表型效應(yīng)足以抑制所述害蟲侵染所述轉(zhuǎn)基因植物。 本發(fā)明還提供根據(jù)本文所述任意方法被保護(hù)免于害蟲侵染的植物,以及 從該細(xì)胞中再生的植物,還有從該植物產(chǎn)生的種子或后代,其中所述種 子或后代包括根據(jù)本發(fā)明獲得的核苷酸序列。
又一方面,本發(fā)明提供生產(chǎn)用于在植物細(xì)胞中表達(dá)具有降低的轉(zhuǎn)基 因沉默的dsRNA的表達(dá)構(gòu)建體的方法,包括(a)制備包括第一序列、 第二序列和第三多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體,其中第三多核苷酸序列通 過第二多核苷酸序列與第一多核苷酸序列相連并且第三多核苷酸序列基
本上是第一多核苷酸序列的反向互補(bǔ)物;和(b)導(dǎo)入內(nèi)含子至第一和第 三多核苷酸序列的至少一個(gè)中或?qū)胨霰磉_(dá)構(gòu)建體至內(nèi)含子中,其中 第一和笫三多核苷酸序列在轉(zhuǎn)錄成RNA時(shí)雜交并在內(nèi)含子剪接后形成 由第二多核苷酸序列穩(wěn)定的dsRNA分子,其中表達(dá)構(gòu)建體在用該表達(dá)構(gòu) 建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中相比于缺乏該內(nèi)含子的表達(dá)構(gòu)建體顯示降低的轉(zhuǎn) 基因沉默。 一個(gè)實(shí)施方式中,內(nèi)含子導(dǎo)入第一和第三多核苷酸序列的至 少一個(gè)之中。另一實(shí)施方式中,內(nèi)含子導(dǎo)入第一和第三多核苷酸序列。 在另外的實(shí)施方式中,表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入內(nèi)含子中。
又 一 方面,本發(fā)明提供控制靶作物害蟲或病原體或其后代對植物的 攝食的方法,包括將利用本文公開的任何方法制備的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入植 物。該構(gòu)建體可例如通過直接遺傳轉(zhuǎn)化或通過親本植物和/或祖細(xì)胞的轉(zhuǎn) 化而導(dǎo)入。本發(fā)明還提供根據(jù)本文公開的任何方法制備的表達(dá)構(gòu)建體。 再進(jìn)一步提供由本文公開的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞。
又 一 方面,本發(fā)明提供提高dsRNA的害蟲或病原體-抑制活性的方 法,包括(a)獲得起始核酸分子,其在作為dsRNA表達(dá)并被耙作物害 蟲或病原體攝入時(shí)抑制由靶作物害蟲或病原體或其后代的攝食;和(b) 連接第一核酸節(jié)段至第二核酸節(jié)段以產(chǎn)生更長的核酸節(jié)段,其中第二核 酸節(jié)段是在作為dsRNA表達(dá)時(shí)不抑制由靶作物害蟲或病原體或其后代 攝食的核酸,且其中相比于單從第一核酸節(jié)段表達(dá)的dsRNA,由更長的
核酸表達(dá)的dsRNA顯示對于靶作物害蟲或病原體或其后代攝食的提高 的抑制效力。 一個(gè)實(shí)施方式中,通過下述方法獲得第一核酸節(jié)段,包括 步驟I)獲得第一核酸節(jié)段,其在作為dsRNA表達(dá)并被靶作物害蟲或病 原體攝入時(shí)抑制由靶作物害蟲或病原體或其后代的攝食;II)選擇至少 起始核酸分子的第一部分,其在攝入由所述部分表達(dá)的dsRNA后抑制由 靶作物害蟲或病原體或其后代的攝食;和III)使用該部分作為步驟a)所 述的第一核酸節(jié)段。該起始核酸分子可以是cDNA。 一個(gè)實(shí)施方式中, 步驟II)包括從起始核酸分子制備一系列重疊或連續(xù)部分并從所述部分 鑒定至少第一部分,其在作為dsRNA表達(dá)并由靶作物害蟲或病原體攝入 時(shí)抑制由靶作物害蟲或病原體或其后代的攝食。
在具體實(shí)施方式
中,提高dsRNA的害蟲或病原體抑制活性的方法可 進(jìn)一步包括產(chǎn)生包括笫一、第二和第三多核苷酸序列的重組載體,其中 第一多核苷酸序列包括更長的核普酸節(jié)段而其中第三多核苷酸序列通過 第二多核苷酸序列與第一多核苷酸序列相聯(lián),其中第三多核苷酸序列基 本上是第一多核苷酸序列的反向互補(bǔ)物,從而第一和第三多核苷酸序列 在轉(zhuǎn)錄成核糖核酸時(shí)雜交以形成被連接的第二核糖核苷酸序列所穩(wěn)定的 雙鏈核糖核苷酸分子。在具體實(shí)施方式
中,第二核苷酸節(jié)段不與靶作物 害蟲或病原體的核苷酸序列基本上互補(bǔ)。另外的實(shí)施方式中,第一核酸 節(jié)段和第三核酸節(jié)段之一或二者包括內(nèi)含子。該方法還可包括導(dǎo)入內(nèi)含 子至所述第一核酸節(jié)段。另外的實(shí)施方式中,第一核酸節(jié)段可包括約19 至約80,約19至約50和約21至約30個(gè)與耙作物害蟲或病原體的編碼序列 基本上互補(bǔ)的連續(xù)堿基。更長的核酸節(jié)段可包括至少約80個(gè)堿基,包括 至少約100個(gè)堿基和約80bp至約250個(gè)堿基。 一個(gè)實(shí)施方式中,耙作物害 蟲或病原體是昆蟲并且可以是鞘翅目(coleopteran )、鱗翅目 (lepidopteran)、 同翅目(Homopteran)或半翅目(Hemipteran),例 如D/a6n3"ca 。在其它實(shí)施方式中,革巴作物害蟲或病原體是線蟲 (nematode)。
另 一方面,本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于表達(dá)具有提高的害蟲或病原體抑 制活性的特異性的dsRNA的表達(dá)構(gòu)建體的方法,包括(a)獲得與粑作 物害蟲或病原體至少第 一編碼序列基本上互補(bǔ)的起始核酸分子;(b )在 起始分子內(nèi)選擇這樣的區(qū)域,其在靶作物害蟲或病原體或其后代攝入由 該區(qū)域表達(dá)的dsRNA后,抑制靶作物害蟲或病原體或其后代的攝食;(c )
連接該區(qū)域至第二核酸分子以產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體,其中第二核酸分子在作
為dsRNA表達(dá)時(shí),不抑制由靶作物害蟲或病原體或其后代在攝入該 dsRNA后的攝食。該方法使用的起始核酸分子可以是來自靶作物害蟲或 病原體(例如昆蟲或線蟲)的cDNA。
具體實(shí)施方式
中,昆蟲可以是鞘 翅目、鱗翅目、同翅目或半翅目昆蟲,包括選自由下述組成的組的昆蟲 Z). vz>gz/enat v/廣gz/en2; Z). v/尸gzy^nat ; Z). wwt^ec/^7/ wwc^a^a; Z). 6a/feafa; Z). 6aMen';和Z). ^ecz'osa。另外的實(shí)施方式中,第一核酸節(jié)段可包括約 19至約80,約19至約50和約21至約30個(gè)基本上與靶作物害蟲或病原體的 編碼序列互補(bǔ)的連續(xù)堿基。更長的核酸節(jié)段可包括至少約80個(gè)堿基,包 括至少約100個(gè)堿基和約80bp至約250個(gè)堿基。
本發(fā)明的又一方面提供方法,包括在起始分子中筌定至少第二區(qū)域, 其在作為dsRNA表達(dá)時(shí),抑制由耙作物害蟲或病原體或其后代的攝食, 并連接該第二區(qū)域至第二核酸分子或第三核酸分子,其在作為dsRNA表 達(dá),并隨后被靶作物害蟲或病原體攝入由第三核酸分子表達(dá)的dsRNA 時(shí),不抑制由靶作物害蟲或病原體或其后代的攝食。 一些實(shí)施方式中, 該區(qū)域與非靶作物害蟲或病原體的核酸不是基本上互補(bǔ)(is not substantially complementary)。其它實(shí)施方式中,該區(qū)域與革巴作物害蟲或 病原體被分類入其中的種特有的核酸互補(bǔ)。其它實(shí)施方式中,該區(qū)域與 靶作物害蟲或病原體被分類入其中的屬特有的核酸互補(bǔ)。其它實(shí)施方式 中,該區(qū)域是D/a6ra"ca spp.特有的,包括那些選自由Z)&Z^o"ca wwc/e"'w/ wwc似fa/zowaniz'z'(南部玉米才艮蟲(SCR ) ) 、 Z)/a6ro〃'ca vz'rgz/era w>gz/em (西部玉米才艮蟲(WCR) ) 、 Z)&Z^o"ca 6w6en'(北部玉米才艮 蟲(NCR) ) 、 Z)/a6ra"cavz>gz/eraMae (墨西哥玉米才艮蟲(MCR))、 D勵(lì)ro"'ca 6a/feaM、 Z)勵(lì)n^ca vWc/w/(3和Z)^^c^ca《/ ec/osa (巴西玉 米根蟲(BZR))組成的組。
另 一方面,本發(fā)明提供控制由靶作物植物害蟲或病原體或其后代攝 食植物的方法,包括向植物中導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體或由前述方法制備的 dsRNA。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)化有前述方法制備的表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞。
又 一 方面,本發(fā)明提供提高植物中對靶作物害蟲或病原體的控制的 方法,包括在植物的細(xì)胞中表達(dá)至少兩dsRNA序列,其在^皮害蟲或病原 體攝入時(shí)發(fā)揮作用以抑制耙作物害蟲或病原體中至少第 一耙編碼序列的 表達(dá),其中兩dsRNA序列與第 一靶編碼序列的兩非連續(xù)部分或靶作物害
蟲或病原體的兩不同編碼序列基本上互補(bǔ)。另外的實(shí)施方式中,本發(fā)明
提供方法,其中兩dsRNA序列包括長度約19bp至約80bp,或約19bp至約 50bp,或約21bp至約30bp。另一實(shí)施方式中,兩dsRNA序列與靶作物害 蟲或病原體的至少兩靶編碼序列基本上互補(bǔ)。本方法還可包括在植物細(xì) 胞中表達(dá)至少第三dsRNA序列,其在由害蟲或病原體攝入時(shí)發(fā)揮作用以 抑制耙作物害蟲或病原體中第三把編碼序列的表達(dá),其中第三dsRNA序 列與第三粑編碼序列的一部分基本上互補(bǔ)。其它實(shí)施方式中,提供了方 法,其中兩dsRNA序列/人選自起始核酸分子(其在作為dsRNA表達(dá)隨后 被耙作物害蟲或病原體攝入dsRNA時(shí),抑制由靶作物害蟲或病原體或其 后代的攝食)的區(qū)域所表達(dá)。該起始核酸分子還可是來自靶作物害蟲或 病原體的cDNA。
其它實(shí)施方式中,提供的方法還包括在細(xì)胞中表達(dá)選自由馬鈴薯塊 莖蛋白(patatin)、 蘇云金芽孢桿菌(5ac/〃w f/mn力gz'eww、 j殺蟲蛋白、 X(gnor/za6c/ws殺蟲蛋白、尸/zofor/ia6c/ws殺蟲蛋白、Sac"/us /a^os/ orus殺 蟲蛋白和^ "〃m ^/ /^en'c2^殺蟲蛋白組成的組的多核苷酸序列。其它實(shí) 施方式中,示例性的多核苷酸可編碼選自由Cryl、 Cry2、 Cry3組成的組 的蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白,或選自由TIC851、 CryET70、 ET29組成的 組的鞘翅目毒蛋白,雙價(jià)殺蟲蛋白(binary insecticidal protein)CryET33和 CryET34,雙價(jià)殺蟲蛋白CryET80和CryET76,雙價(jià)殺蟲蛋白ET29和 TIC810,雙價(jià)殺蟲蛋白TIC100和TIC101和雙價(jià)殺蟲蛋白PS149B1或其它 鞘翅目毒蛋白(例如deMaagd等,2003 )。其它針對控制其它植物害蟲 的殺蟲組合物是可能的,例如,如在下述網(wǎng)址lifesci.sussex.ac.uk/home/ Neil一Crickmore/Bt/index.html中羅列的全部毒素,并且也可以包括如其 中所述的一種或更多種VIP毒素。因此,某些實(shí)施方式中,控制劑(control agent)的組合包括一種或更多種本發(fā)明的表達(dá)dsRNA的多核苷酸以及至 少一種對植物害蟲(例如昆蟲或線蟲)有毒性的其它試劑。
本發(fā)明還提供方法,其中靶編碼序列編碼蛋白,其預(yù)測的功能選自 由肌肉生成、保幼激素形成、保幼激素調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、消化酶 的合成、細(xì)胞膜電勢的維持(maintenance of cell membrane potential)、才聶 食部位的形成、攝食部位的發(fā)育、攝食部位的維持、感染、蛻皮、氨基 酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信息素感應(yīng)、觸角 形成、翼形成、腿形成、發(fā)育及分化、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形成、
血淋巴合成、血淋巴維持、神經(jīng)傳遞、細(xì)胞分裂、能量代謝、呼吸和凋 亡組成的組。另一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供方法,其中兩編碼序列被粑
向。該兩耙編碼序列可刊"使至少兩種對于4皮dsRNA序列抑制的#巴作物害 蟲或病原體存活所必需的功能,該功能選自由害蟲或病原體攝食、細(xì)胞 凋亡、細(xì)胞分化和發(fā)育、有性生殖的能力或欲望、肌肉生成、肌肉抽搐、 肌肉收縮、保幼激素形成、保幼激素調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞膜電 勢的維持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信 息素感應(yīng)、觸角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼蟲成熟、消化酶形 成、血淋巴合成、血淋巴維持、神經(jīng)傳遞、幼蟲期過渡(larval stage transition)、蛹4匕、從蛹羽4匕(emergence from pupation)、細(xì)胞分裂、能量 代謝、呼吸和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的形成組成的組。
本發(fā)明還提供抗性管理的方法,包括使耙生物接觸至少本發(fā)明的笫 一核酸節(jié)段,以及選自由馬鈴薯塊莖蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、 ^^wor/^Z^z^y殺蟲蛋白、尸/zo/or/^6(iws殺蟲蛋白、5ac/〃ws /a^ro^s/7orz^y殺 蟲蛋白 、 5ac/〃ws s/ /2aen'cws 殺蟲蛋白、 或 io 網(wǎng) i止 lifesd.sussex.ac.uk/home/Neil—Crickmore/Bt/index.html所述的其它殺蟲 Bt毒素、生物控制劑和殺蟲劑組成的組中的一種或更多種試劑。
發(fā)明詳細(xì)說明
本文描述了用于提高調(diào)節(jié)植物害蟲和病原體中基因表達(dá)的dsRNA 分子的效力和表達(dá)的方法和組合物。該方法提高由編碼dsRNA的植物轉(zhuǎn) 基因產(chǎn)生的小干擾RNA (siRNA)或相關(guān)節(jié)段的特異性,并提供植物害 蟲和植物病原體中dsRNA-介導(dǎo)的耙基因表達(dá)抑制。優(yōu)化轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體和 轉(zhuǎn)基因序列大小以生產(chǎn)并遞送在特定靶物種的細(xì)胞中有效的一種或更多 種核糖核苷酸,而避免產(chǎn)生相反可能以不想要的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非 特異性siRNAs。同時(shí),通過優(yōu)化靼序列的排列,本發(fā)明通過用內(nèi)含子打 斷連續(xù)的靶序列降低了植物中轉(zhuǎn)基因沉默的可能,從而防止識別該基因 并導(dǎo)致植物中沉默的反饋。
特異靶向害蟲或病原體種的序列可工程化入植物表達(dá)構(gòu)建體,例如 用反向重復(fù)的那些方法或通過使用誘發(fā)dsRNA形成的其它方法。利用克 隆siRNA或利用通過呈遞dsRNA片段至篩查(scan)耙序列的細(xì)胞或整 個(gè)害蟲而憑經(jīng)驗(yàn)確定,可以確定有效導(dǎo)致耙信息(message)降解的21 -24mers 。使用該信息,可以產(chǎn)生用于植物內(nèi)原位表達(dá)的新型序列結(jié)構(gòu)。 該序列結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步設(shè)計(jì)以產(chǎn)生dsRNA分子,其編碼一種或更多種凈皮 耙物種有效攝入的siRNA分子,同時(shí)導(dǎo)致形成對調(diào)節(jié)耙物種中耙基因的 特定直系同源物、同系物或等位基因表達(dá)特異的siRNAs?;诨蚣易?成員間序列多態(tài)性,通過設(shè)計(jì)靶向該成員的dsRNA構(gòu)建體可抑制基因家 族特定成員的表達(dá)。因此,基于其對特定耙種、群或亞群憑經(jīng)驗(yàn)確定或 預(yù)測的效力,dsRNA構(gòu)建體中可包括特定耙序列(例如siRNA大小的 (siRNA-sized),長度約20-25個(gè)堿基對),并且可不包括特異性差或非特 異序列,而仍舊實(shí)現(xiàn)將有效的轉(zhuǎn)基因編碼的dsRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至靶生物的細(xì) 胞。特異siRNA大小的核糖核酸序列的效力可以通過生物^f全測法的實(shí)際 評估或通過使用考慮生物物理參數(shù)(對于有效或無效siRNAs是相同的) 的預(yù)測工具(例如Reynolds評分;Reynolds等,2004)而確定。
對用外源性(例如轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的)RNA靶向害蟲種所需的特定 要求的理解提高生產(chǎn)高效且特異的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的能力。在西部玉米根 蟲(WCR)中,確定WCRV-ATP酶A亞基的50bp片段在串聯(lián)重復(fù)5次(總 計(jì)250bp)時(shí)足以誘發(fā)死亡,但作為50bp單體則是無效的。該50bp片段 嵌入中性載體序列以產(chǎn)生1 OObp的總dsRNA也是有效的。因此對于高效 攝入至RNAi易感生物存在最優(yōu)大小。該觀察指明對于害蟲控制需要"穩(wěn) 定"近似大小的dsRNA的產(chǎn)生。
使用載體概念,可以在更長序列中嵌入一種或更多種siRNA序列用 于轉(zhuǎn)錄。該序列可用于證明任何候選siRNA (獨(dú)立于相鄰的天然發(fā)生序 列)的效率,允許在設(shè)計(jì)編碼dsRNA的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體時(shí)提高靈活性。天 然發(fā)生的相鄰序列(其證明效力或特異性更差)可從dsRNA構(gòu)建體除去, 然而該構(gòu)建體編碼必需序列和序列長度,以便在在植物宿主內(nèi)表達(dá)并在 耙生物細(xì)胞中攝取和加工后產(chǎn)生有效的siRNA。這一知識使得建立將編 碼siRNAs的被選序列整合至高效初級表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的新型嵌合序列。
利用本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)基因也可具有編碼siRNA序列(通過放 置內(nèi)含子而打斷)的dsRNA片段。耙序列中一種或更多種內(nèi)含子序列的 包涵體可提高最終產(chǎn)生有效siRNA的初級轉(zhuǎn)錄本的生產(chǎn)和穩(wěn)定性,而顯 示將在植物細(xì)胞中沉默的降低的傾向。諸如5和3,非翻譯區(qū)(UTRs)和 其它序列的附加序列,例如產(chǎn)生至少植物加工所需的最小尺寸的外顯子, 可通過組合不誘發(fā)有效siRNAs的序列(例如直接串聯(lián)正義序列)而產(chǎn)生。
導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默(例如通過曱基化和在植物宿主細(xì)胞的最終轉(zhuǎn)錄沉默)
的可能性降低,因?yàn)樵摶蛟谛蛄猩吓c產(chǎn)生siRNAs的加工的轉(zhuǎn)錄本(其 可相反通過染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變造成轉(zhuǎn)基因沉默)不同。初級轉(zhuǎn)錄本的 siRNA區(qū)中內(nèi)含子的存在也可減緩整體加工并提高因此得到的dsRNA的 存活力或穩(wěn)定性(圖4)。
其它靶序列可通過用上述設(shè)計(jì)的多種內(nèi)含子和外顯子延伸該初級轉(zhuǎn) 錄單元而添加。有效siRNAs的重疊和在重疊內(nèi)放置內(nèi)含子可擴(kuò)大靶序列 的數(shù)量而最小化構(gòu)建體內(nèi)所需內(nèi)含子的數(shù)量(圖5)??梢耘渲靡环N或更 多種不同的序列,每種編碼siRNA (針對于一種或更多種輩巴基因的表達(dá)) 并調(diào)節(jié)粑生物中的基因表達(dá)。
兩種或多種靶基因的表達(dá)抑制允許通過dsRNA-介導(dǎo)的基因抑制向 靶生物提供多種作用;f莫式。也可通過結(jié)合一種或更多種dsRNA-介導(dǎo)的方 法與諸如源自芽孢桿菌的殺蟲肽(例如晶體蛋白)的其它方法在轉(zhuǎn)基因 植物中實(shí)現(xiàn)多種作用模式以干擾耙生物的生長和發(fā)育。結(jié)合幾種或多種 編碼有效siRNAs的序列,可能地于其它方法結(jié)合也允許產(chǎn)生持久的害蟲 抗性管理方案。
A、核酸組合物和構(gòu)建體
本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體以用于實(shí)現(xiàn)宿主植物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可表達(dá)有效水平的優(yōu)選的dsRNA分子和因此來自重組 DNA構(gòu)建體的siRNA以調(diào)節(jié)靶細(xì)胞中的基因表達(dá)??蓮腸DNA和/或基因 組文庫提供分離并純化的核普酸片段。推導(dǎo)的核苷酸序列信息允許鑒定 成對核苷酸序列(其可源自任何優(yōu)選的無脊推害蟲,例如昆蟲)以用作 熱擴(kuò)增引物而產(chǎn)生本發(fā)明的dsRNA和siRNA分子。
如本文所使用,術(shù)語"核酸"指單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苦酸或核糖 核苷酸堿基的聚合物。該"核酸"也可以任選地含有非天然生成或改變的 核糖核苷酸堿基,其允許聚合酶正確通讀并且不減少由該核酸編碼的多 肽的表達(dá)。術(shù)語"核苷酸序列,,或"核酸序列"指單個(gè)單鏈或雙鏈核酸的正 義和反義鏈。術(shù)語"核糖核酸"(RNA )包括RNAi (抑制性RNA ) 、 dsRNA (雙鏈RNA) 、 siRNA (小干擾RNA) 、 mRNA (信4吏RNA) 、 miRNA (微小RNA) 、 sRNA (小RNA) 、 tRNA (轉(zhuǎn)移RNA,帶有或者不帶有 相應(yīng)的?;被?和cRNA(互補(bǔ)RNA),而術(shù)語"脫氧核糖核酸"(DNA)
包括cDNA和基因組DNA以及DNA-RNA雜交體。措辭"核酸節(jié)段"、"核 苷酸序列節(jié)段"或更普遍地,"節(jié)段"(segment)將被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為 包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉(zhuǎn)移RNA序列、信使RNA序列、操 縱子序列和更小的工程化的核苦酸序列(其表達(dá)或可適于表達(dá)多核苷酸、 蛋白、多肽或肽)的功能性術(shù)語。
根據(jù)本發(fā)明提供核苷酸序列,其表達(dá)產(chǎn)生與靶生物中靶基因的RNA 分子基本上同源的RNA序列。因此,攝入穩(wěn)定的RNA序列后,可以獲得 靶生物的細(xì)胞中靶基因核苦酸序列表達(dá)的下調(diào),導(dǎo)致耙生物在維持、攝 食、生存力、繁殖或再生上的有害效應(yīng)。
如本文所使用,對于核酸序列的術(shù)語"基本上同源的"(substantially homologous)或"基本的同源性"(substantial homology)包括在嚴(yán)謹(jǐn)條件下 雜交至如序列表中所述的編碼序列的核苷酸序列,或其互補(bǔ)物。在嚴(yán)謹(jǐn)
序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與相對鏈上的相應(yīng)堿基形成氬鍵以形成:^謹(jǐn)條 件下足夠穩(wěn)定至利用本領(lǐng)域公知的方法可檢測的雙鏈分子?;旧贤?的序列優(yōu)選地具有與如序列表所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)物約70%至約 80%的序列同一性,或更優(yōu)選約80%至約85%的序列同一性,或更優(yōu)選 約90%至約95%的序列同一性,至約99%的序列同一性。
如本文所使用,術(shù)語"序列同一性"、"序列相似性"或"同源性,,用于 描述兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列間的序列關(guān)系。通過在對比窗比較兩個(gè)優(yōu)化 比對的序列確定兩序列間的"序列同 一性"百分?jǐn)?shù),其中對比窗中的序列 部分相比于參照序列(其不包括添加或缺失)可包括添加或缺失(即缺 口 )用于兩序列的優(yōu)化比對。這樣計(jì)算百分?jǐn)?shù)確定在兩序列中出現(xiàn)相 同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以獲得匹配位置的數(shù)量,將該匹配位 置的數(shù)量除以對比窗中位置總數(shù),并將結(jié)果乘以100得到序列同一性的百 分?jǐn)?shù)。在比較的每個(gè)位置都與參照序列相同的序列被認(rèn)為與參照序列相 同,反之亦然。如果第一多核苷酸序列顯示與第二或參照序列完全互補(bǔ), 則認(rèn)為從5,到3,方向觀察時(shí)的第一多核苷酸序列是從3,到5,方向觀察時(shí) 的第二或參照核苷酸序列的互補(bǔ)體或與其互補(bǔ)。如本文所使用,當(dāng)一個(gè)
序列的每個(gè)核苷酸從5,到3,閱讀與其它序列的每個(gè)核苷酸從3,到5,閱讀 時(shí)互補(bǔ),認(rèn)為核酸序列分子顯示"完全互補(bǔ)性"。與參照核苷酸序列互補(bǔ) 的核苷酸序列將顯示與參照核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列相同的序列。這
些術(shù)語和說明在本領(lǐng)域^艮好地定義并且易于被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解。
如本文所使用,"對比窗"指至少6個(gè)連續(xù)位置的概念性節(jié)段,通常約 50至約100,更通常約100至約150個(gè)位置,其中序列與連續(xù)位置數(shù)相同 的參照序列在兩序列優(yōu)化比對后相比較。對比窗相比于參照序列(其不 包括添加或缺失)可包括約20%或更少的添加或缺失(即缺口 )用于兩 序列的優(yōu)化比對。例如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)參考Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, ( Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA )用于序列比對的具體方法。
本發(fā)明提供能夠在細(xì)胞或微生物中表達(dá)為RNA以抑制靶生物的細(xì) 胞、組織或器官中靶基因表達(dá)的DNA序列。該序列可包括編碼一種或更 多種不同核苷酸序列的DNA分子,其中不同核苷酸序列的每個(gè)包括正義 核苷酸序列和反義核普酸序列。該序列可通過間隔序列連接。該間隔序 列可組成正義核苷酸序列或反義核苷酸序列的一部分并且發(fā)現(xiàn)位于正義 和反義序列間的dsRNA分子內(nèi)。正義核苷酸序列或反義核苷酸序列與靶 基因或其衍生物的核香酸序列或其互補(bǔ)序列基本上相同。dsDNA分子可 在于表達(dá)dsDNA的宿主的細(xì)胞、組織或器官中起作用的啟動(dòng)子序列的控 制下可操作地放置以產(chǎn)生dsRNA分子。如本文所使用,術(shù)語"植物表達(dá)構(gòu) 建體"指重組DNA分子,其包括在植物細(xì)胞中可操作地連接至編碼 dsRNA的DNA序列的功能性啟動(dòng)子,以及3 ,轉(zhuǎn)錄末端的多核苷酸分子。
本發(fā)明還提供用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列,其在DNA表達(dá)為 RNA并被耙生物(例如植物病原體或植物害蟲)攝入時(shí),實(shí)現(xiàn)靶生物的 細(xì)胞、組織或器官中的耙基因抑制。dsRNA可包括一種或更多種結(jié)構(gòu)基 因序列,其中每種結(jié)構(gòu)基因序列包括可以被間隔序列(其在互補(bǔ)正義和 反義序列內(nèi)形成環(huán))連接的正義核苷酸序列和反義核普酸序列。具有適 當(dāng)剪接位點(diǎn)的內(nèi)含子序列可置于至少正義和反義核苷酸序列之一 。沒有 任何內(nèi)含子存在的正義核苷酸序列或反義核苷酸序列與耙基因、其衍生 物的核苦酸序列或其互補(bǔ)序列基本上相同。 一種或更多種結(jié)構(gòu)基因序列 可在一種或更多種啟動(dòng)子序列的控制下可操作地放置,至少其一在宿主 生物的細(xì)胞、組織或器官中對轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)是可操作的。
根據(jù)本發(fā)明,用于控制靶生物中基因表達(dá)的基因序列或片段可克隆 于兩組織特異性啟動(dòng)子(其在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中是可操作的)之間,并在轉(zhuǎn)
基因植物細(xì)胞中表達(dá)以產(chǎn)生mRNA,其與它形成dsRNA分子。植物組織 中含有的dsRNA分子可被乾生物攝入從而實(shí)現(xiàn)想要的耙基因表達(dá)抑制。
本發(fā)明提供的核苷酸序列可包括由"間隔序列"分開的反向重復(fù)。該 間隔序列可以是包括促進(jìn)每個(gè)重復(fù)間形成二級結(jié)構(gòu)(在需要的地方)的 任何核苷酸序列的區(qū)域。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,間隔序列是mRNA 的正義或反義編碼序列的一部分?;蛘唛g隔序列可包括能夠共價(jià)連接至 核酸分子的核苷酸或其同源物的任何組合。例如,間隔序列可包括長度 至少約10-100個(gè)核苷酸,或者長度至少約100-200個(gè)核苷酸,長度至少約 200-400個(gè)核苷酸,或長度至少約400-500個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
核酸分子或核酸分子的片段或序列表中的其它核酸分子能夠在某些 條件下特異地雜交其它核酸分子。如本文所使用,認(rèn)為如果兩分子能形 成反相平行、雙鏈核酸結(jié)構(gòu),那么兩核酸分子能夠相互特異雜交。如果 核酸分子與又一核酸分子顯示完全互補(bǔ),則認(rèn)為它們互補(bǔ)。如果兩分子 能夠以允許它們在至少常規(guī)"低嚴(yán)謹(jǐn)性"條件下保持相互退火的足夠穩(wěn)定 性而相互雜交,則認(rèn)為其是"最小互補(bǔ)"。類似地,如果它們能夠以允許 它們在至少常規(guī)"高嚴(yán)謹(jǐn)性,,條件下保持相互退火的足夠穩(wěn)定性而相互雜 交,則認(rèn)為其互補(bǔ)。Sambrook等(1989 )和Haymes等(1985 )描述了 常規(guī)嚴(yán)謹(jǐn)條件。
因此允許并非完全互補(bǔ),只要其不完全阻礙分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能 力。因此,為了核酸分子或核酸分子的片段用作引物或探針,其只需要 序列充分互補(bǔ)以能夠在使用特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
促進(jìn)DNA雜交的適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)性條件是例如,在約45。C, 6.0 x氯化 鈉/檸檬酸鈉(SSC),隨后在50。C用2.0 x SSC沖洗,這是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的或者可以在Current Protocols in Molecular Biology ( 1989 ) 中找到。例如,沖洗步驟的鹽濃度可以選擇從50。C時(shí)約2.0xSSC的低嚴(yán) 謹(jǐn)性至50。C時(shí)約0.2x SSC的高嚴(yán)謹(jǐn)性。另外,沖洗步驟的溫度可以從室 溫約22。C的低嚴(yán)謹(jǐn)性條件提高至約65。C的高嚴(yán)謹(jǐn)性條件。溫度和鹽都可 以變化,或者溫度或鹽濃度可以保持恒定而改變其它變量。優(yōu)選地,用 于本發(fā)明的核酸將顯示與如序列表中所述一種或更多種核酸分子至少約 80%,或至少約90%,或至少約95%,或至少約98%或甚至約100%的序 列同一性。
也可利用本領(lǐng)域已知的方法全部或部分(特別是在需要提供植物偏
愛的序列時(shí))合成本發(fā)明的核酸。因此,利用所選擇的宿主偏愛的密碼 子可以合成本發(fā)明的核酸的全部或部分。例如,物種偏愛的密碼子可以 從在具體宿主物種中所表達(dá)蛋白最常用的密碼子來確定。核苷酸序列的 其它修飾可導(dǎo)致具有略微改變的活性的突變體。
dsRNA或siRNA核苷酸序列包括聚合的核糖核苷酸的雙鏈并且可以 包括對磷酸-糖骨架或核苷的修飾??稍O(shè)計(jì)RNA結(jié)構(gòu)的修飾以允許特異的 基因抑制。在一個(gè)實(shí)施方式中,dsRNA分子可通過酶解修飾以便可產(chǎn)生 siRNA分子。siRNA可有效介導(dǎo)一些耙生物的一些耙基因的下調(diào)效應(yīng)。 該酶解可通過使用存在于昆蟲、脊推動(dòng)物、真菌或真核RNAi途徑的植物 (Elbashir等,2002; Hamilton和Baulcombe, 1999 )的細(xì)胞中的RNAse III 酶或DICER酶完成。該過程也可使用通過易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員獲知的 重組DNA技術(shù)導(dǎo)入生物細(xì)胞中的重組DICER或RNAse III。生物中天然存 在的,或者通過重組DNA技術(shù)制造的DICER酶和RNAse III將較大dsRNA 鏈切割成更小的寡核苷酸。DICER酶特異地將dsRNA分子切成每個(gè)長度 是約19-25個(gè)核苷酸的siRNA片段,而RNAse III酶通常將dsRNA分子切 成12-15個(gè)堿基對的siRNA。由上述任一種酶產(chǎn)生的siRNA分子具有2-3 個(gè)核苦酸3'突出(overhang)以及5'磷酸和3'羥基末端。在真核RNAi途 徑中由RNAse III酶產(chǎn)生的siRNA分子與由Dicer酶產(chǎn)生的那些相同,并 因此在其隨后展開后通過固有的細(xì)胞RNA-降解機(jī)制被靶向并降解,分離 成單鏈RNA并與由耙基因轉(zhuǎn)錄的RNA序列雜交。該過程產(chǎn)生靶生物中由 把基因的核苷酸序列編碼的RNA序列被有效降解或除去。結(jié)果是靶生物 中特定耙核苷酸序列的沉默??梢栽贖annon (2002)中找到酶解的詳細(xì) 說明。
本發(fā)明的核苷酸序列可以在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上記錄。如本文所使用, 計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì),,指任何可以被計(jì)算機(jī)直接讀取和存取的有形的表達(dá)介 質(zhì)。該介質(zhì)包括但不限于磁性存儲(chǔ)介質(zhì),例如軟盤、硬盤、存儲(chǔ)介質(zhì) 和磁帶;光存儲(chǔ)介質(zhì),例如CD-ROM;電存儲(chǔ)介質(zhì),例如RAM和ROM; 光字符識別格式的計(jì)算機(jī)文件,以及這些類型的混合,例如磁/光存儲(chǔ)介 質(zhì)。熟練的技術(shù)人員可以容易地理解任何目前已知的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可 以用于生產(chǎn)其上包括記錄了本發(fā)明的核苷酸序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的產(chǎn)
口P e
如本文所使用,"記錄"指在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上存儲(chǔ)信息的過程。熟
練的技術(shù)人員可以容易地采用任何目前已知的用于在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上 記錄信息的方法以產(chǎn)生包括本發(fā)明核苷酸序列信息的介質(zhì)。熟練的技術(shù) 人員可以獲得多種數(shù)據(jù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生在其上記錄了本發(fā)明的核苷酸序 列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。數(shù)據(jù)存儲(chǔ)結(jié)構(gòu)的選擇通常將基于所選擇的用來訪 問存儲(chǔ)信息的方法。此外,多種數(shù)據(jù)處理程序和格式可用于在計(jì)算機(jī)可 讀介質(zhì)上存儲(chǔ)本發(fā)明的核苷酸序列信息。序列信息可以用文字處理文本
文件(釆用市售可得的軟件格式(例如WordPerfect和MicrosoftWord)) 表示,或者以ASCII文本文件的形式(存儲(chǔ)于諸如DB2, Sybase, Oracle 等的數(shù)據(jù)庫應(yīng)用中)表示。熟練的技術(shù)人員可以容易地采用任何數(shù)量的 數(shù)據(jù)處理的結(jié)構(gòu)化形式(例如文本文件或數(shù)據(jù)庫)以便獲得于其上記錄 了本發(fā)明的核苷酸序列的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
計(jì)算機(jī)軟件是公眾可得的,其允許熟練的技術(shù)人員存取計(jì)算機(jī)可讀
介質(zhì)所提供的序列信息。在Sybase系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了 BLAST ( Altschul等,1990 ) 和BLAZE (Brutlag等,1993 )檢索算法的軟件可被用于鑒定本文提供 的和來自含有與其它生物的ORFs或蛋白同源序列的序列(例如Unigenes 和EST,s)內(nèi)的開放讀碼框(ORFs)。該ORFs是本發(fā)明的序列中編碼蛋 白的片段并且對生產(chǎn)商業(yè)上重要的蛋白是有用的,該蛋白例如用于氨基 酸生物合成、代謝、轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白修 飾和DNA復(fù)制、限制、修飾、重組和修復(fù)的酶。
本發(fā)明進(jìn)一 步提供系統(tǒng),尤其是含有本文所述序列信息的基于計(jì)算 機(jī)的系統(tǒng)。設(shè)計(jì)該系統(tǒng)以鑒定在商業(yè)上重要的本發(fā)明核酸分子的片段。 如本文所使用,"基于計(jì)算機(jī)的系統(tǒng),,指用于分析本發(fā)明的核苷酸序列信 息的硬件工具、軟件工具、和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)工具。最小硬件指包括中央處理 單元(CPU)、輸入工具、輸出工具和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)工具的本發(fā)明的基于計(jì) 算機(jī)的系統(tǒng)。熟練的技術(shù)人員可以容易地理解任何一種目前可得的基于 計(jì)算機(jī)的系統(tǒng)適合用于本發(fā)明。
如本文所使用,"靶結(jié)構(gòu)模體"或"耙模體"(targetmotif)指任何被合理 選擇的序列或序列的組合,其中基于粑模體折疊時(shí)形成的三維構(gòu)型選擇 序列或一條序列。存在多種本領(lǐng)域已知的靶模體。蛋白耙模體包括但不 限于酶活性位點(diǎn)和信號序列。核酸靶模體包括但不限于啟動(dòng)子序列、順 式元件、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、siRNAs、以及誘導(dǎo)型表達(dá)元件(蛋白結(jié)合序列)。
B、重組載體和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化
例如,重組DNA載體可以是線性或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體系統(tǒng)可以 是一個(gè)載體或質(zhì)?;蛘咭黄鸷写龑?dǎo)入到細(xì)菌宿主基因組的總DNA的 兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒。另外,細(xì)菌載體可以是表達(dá)載體。如序列表中 所述的核酸分子或其片段可以例如,在適當(dāng)啟動(dòng)子(其在一種或更多種
控制下,適當(dāng)?shù)夭迦胼d體:許多載體對此目^是可獲得的,并且適當(dāng)載 體的選擇將主要取決于待插入載體中的核酸大小以及待用該載體轉(zhuǎn)化的 特定宿主細(xì)胞。每個(gè)栽體根據(jù)其功能(DNA擴(kuò)增或DNA表達(dá))以及與其 相容的特定宿主細(xì)胞而含有不同組分。用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化的載體組分通常包 括但不限于,下述一種或更多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、 一種或更多種 選擇標(biāo)記基因以及允許表達(dá)外源DNA的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
表達(dá)和克隆載體可含有選擇基因(也稱作選擇標(biāo)記)。該基因編碼 生長于選擇培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞存活或生長所必需的蛋白。典型 的選擇基因編碼這樣的蛋白(a)賦予抗生素、除草劑或其他毒素,例如 氨芐青霉素、新霉素、甲氨喋呤、草甘膦或四環(huán)素抗性,(b)補(bǔ)充營養(yǎng) 缺陷,或(c)供給不能從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營養(yǎng),例如編碼桿菌 D-丙氨酸消旋酶的基因。被外源蛋白或其片段成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞產(chǎn)生 賦予藥物抗性的蛋白并因此在選擇方案中存活。
產(chǎn)生mRNA的表達(dá)載體也可以含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,其被宿主生物識 別并可操作地連接至編碼目的核酸分子或其片段的核酸。適合與細(xì)菌宿 主一起使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括p-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子、大腸桿菌x噬菌體PL 和PR啟動(dòng)子,大腸桿菌半乳糖啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟 動(dòng)子、色氨酸(trp)啟動(dòng)子,和乳糖操縱子啟動(dòng)子及其變異以及雜合啟 動(dòng)子例如tac啟動(dòng)子。然而,其它已知的細(xì)菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子是適合的。下面 "i寸i侖纟直物啟動(dòng)子。
在述及調(diào)控序列和結(jié)構(gòu)核苷酸序列時(shí)使用的術(shù)語"可操作地連接,,指 調(diào)控序列造成連接的結(jié)構(gòu)核苦酸序列的調(diào)控表達(dá)。"調(diào)控序列,,或"控制元 件"指位于結(jié)構(gòu)核苷酸序列上游(5,非編碼序列),其中,或下游(3,非 翻譯序列)的核苷酸序列,其影響轉(zhuǎn)錄的時(shí)序和水平或數(shù)量、RNA加工 或穩(wěn)定性或相關(guān)結(jié)構(gòu)核苷酸序列的翻譯。調(diào)控序列可包括啟動(dòng)子、翻譯 前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、阻遏蛋白結(jié)合序列以及多聚腺
苷酸化識別序列等。
或者,表達(dá)構(gòu)建體可以通過整合載體整合到宿主細(xì)胞基因組。整合 載體通常含有至少一個(gè)與允許載體整合的染色體同源的序列。在細(xì)菌的
情況下,整合似乎由載體和染色體的同源DNA之間的重組而產(chǎn)生。例如 用來自各種芽孢桿菌(Sa"'〃M)株系的DNA所構(gòu)建的整合載體整合到 芽孢桿菌染色體(EP 0 127,328 )。整合載體也可由細(xì)菌噬菌體或轉(zhuǎn)座 子序列所組成。自殺性質(zhì)粒載體也是本領(lǐng)域已知的。
使用標(biāo)準(zhǔn)重組DN A技術(shù)構(gòu)建含有 一 種或更多種上述羅列組分的適 宜載體。可以以產(chǎn)生需要的質(zhì)粒所需的形式切割、加工和重連接分離的 質(zhì)粒或DNA片段。有效的細(xì)菌表達(dá)載體的實(shí)例包括但不限于多功能大腸 桿菌克隆和表達(dá)載體,例如BluescdptTM(Stratagene,LaJolla,CA) ; pIN 載體(Van Heeke和Schuster, 1989 )等。
酵母重組構(gòu)建體可通常包括下述一種或更多種啟動(dòng)子序列、融合 伙伴序列、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、選擇標(biāo)記。這些元件可以結(jié)合到 表達(dá)盒,其可于復(fù)制子中保持,例如能夠在諸如酵母或細(xì)菌的宿主中保 持的染色體外元件(例如質(zhì)粒)。復(fù)制子可具有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng),從而允 許其被保持例如,在酵母中(用于表達(dá)和)在原核宿主中(用于克隆和 擴(kuò)增)。該酵母-細(xì)菌穿梭載體的實(shí)例包括YEp24 (Botstein等,1979 ), pC1/1 (Bmke等,1984 ),和YRpl7 (Stinchcomb等,1982 )。另外, 復(fù)制子可為高或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒將通常具有拷貝數(shù)在約5 至約200的范圍,且通常約100至約150。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主將優(yōu) 選具有至少約IO,更優(yōu)選至少約20個(gè)拷貝。
有用的酵母啟動(dòng)子序列可以源自在代謝途徑中編碼酶的基因。該基 因的實(shí)例包括乙醇脫氫酶(ADH) (EP0284044)、烯醇化酶、葡糖激 酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP或GAPDH)、 己糖激酶、;舞酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶和丙酮酸激酶(PyK) (EP 0 3215447)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也提供有用的啟動(dòng)子序 列(Myanohara等,1983 )。此外,天然不存在的合成啟動(dòng)子也起酵母 啟動(dòng)子的作用。該雜合啟動(dòng)子的實(shí)例包括與GAP轉(zhuǎn)錄活化區(qū)相聯(lián)的ADH 調(diào)控序列(美國專利No. 4,876,197和4,880,734)。轉(zhuǎn)錄終止子序列和其 它酵母識別的終止序列(例如編碼糖酵解酶的那些)的實(shí)例是本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的。
或者,表達(dá)構(gòu)建體可以用整合載體整合到酵母基因組。整合載體通 常含有至少一種與允許載體整合的酵母染色體同源的序列,并優(yōu)選含有 表達(dá)構(gòu)建體的兩個(gè)同源側(cè)翼序列。整合似乎產(chǎn)生于載體和酵母染色體的
同源DNA之間的重組(Orr-Weaver等,1983 )。通過選擇載體中適于包 涵體的同源序列可將整合載體整合到酵母中的特定座位。參見 Orr-Weaver等,上文。可整合一種或更多種表達(dá)構(gòu)建體,可能影響產(chǎn)生 的重組蛋白的水平(Rine等,1983 )。
本發(fā)明還考慮轉(zhuǎn)化本發(fā)明的核苷酸序列到植物中以實(shí)現(xiàn)一種或更多 種dsRNA分子表達(dá)水平的抑制。轉(zhuǎn)化載體通常包括一種或更多種能夠被 轉(zhuǎn)錄成與靶生物基因組編碼的 一種或更多種核苷酸序列基本上同源和/ 或互補(bǔ)的RNA分子的核苷酸序列,并且可在其它同源或互補(bǔ)的序列中包 括內(nèi)含子序列以至于從一種或更多種核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和加工的RNA被 生物攝入導(dǎo)致靶生物基因組分別的核苷酸序列中至少其一的表達(dá)下調(diào)。
轉(zhuǎn)化載體可定義為dsRNA構(gòu)建體并且也可定義為重組分子、害蟲或 疾病控制劑、遺傳分子或嵌合基因構(gòu)建體。本發(fā)明的嵌合基因構(gòu)建體可 包括,例如編碼一種或更多種反義轉(zhuǎn)錄本、 一種或更多種正義轉(zhuǎn)錄本、 一種或更多種前述每種核苷酸序列,其中因此形成的轉(zhuǎn)錄本的全部或部 分與靶生物基因組中包括由核苷酸編碼的RNA序列的RNA分子的全部 或部分同源。
一個(gè)實(shí)施方式中,植物轉(zhuǎn)化載體包括分離并純化的DNA分子,其包 括可操作地連接至 一種或更多種本發(fā)明的核苷酸序列的同源啟動(dòng)子。核 苷酸序列可選子序列表中所述的那些或其片段。核苷酸序列可包括編碼 存在于耙生物內(nèi)的全部或部分RNA的片段。RNA轉(zhuǎn)錄本可包括耙RNA的 全部或部分的反向重復(fù)。包括表達(dá)載體的DNA分子也可含有位于編碼序 列上游或甚至在編碼序列內(nèi)的功能性內(nèi)含子序列,并且也可在啟動(dòng)子和 翻譯起始點(diǎn)之間含有五個(gè)主要(5,)非翻譯前導(dǎo)序列(即UTR或5,-UTR)。
植物轉(zhuǎn)化載體可含有來自 一種或更多種基因的序列,因此使得產(chǎn)生 一種以上的用于抑制靶生物細(xì)胞中基因或多個(gè)基因表達(dá)的dsRNA。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將容易地理解與不同基因中存在的序列相應(yīng)的DNA片段可 以結(jié)合至一個(gè)復(fù)合DNA片段以在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)?;蛘?,已經(jīng)含有至 少一個(gè)DNA片^殳的本發(fā)明質(zhì)粒可以在增強(qiáng)子和啟動(dòng)子和終止子序列之 間通過按順序插入其它DNA片段而修飾。在本發(fā)明設(shè)計(jì)用于抑制多基因
的疾病或害蟲的控制劑中,可以從相同的耙物種中獲得待抑制的基因以 便增強(qiáng)控制劑的效力。在某些實(shí)施方式中,基因可以源自不同病原體或 害蟲生物以便拓寬病原體(試劑對其是有效的)的范圍。當(dāng)針對于多基
因的抑制或表達(dá)和抑制的組合時(shí),可以按照美國申請
發(fā)明者G·R·赫克, J·C·戈利, J·K·羅伯茨, S·C·約翰遜, T·R·I·蒙伊克瓦, T·T·沃恩 申請人:孟山都技術(shù)有限公司