專利名稱:用于從植物分離dna的非破壞性方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種用于從植物分離DNA的非破壞性方法以及該方法 在植物或植物種群的遺傳分析中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
植物培育依賴于存在于具體作物物種生殖質(zhì)中的遺傳變異的有效 開發(fā),所述遺傳變異決定了植物在特定環(huán)境的表型。然而傳統(tǒng)上,通 過在表型水平觀察到的所期望的性狀組合的挑選來實(shí)現(xiàn),漸增地,可
鎖的分子標(biāo)記的挑選來進(jìn)行。
基于分子標(biāo)記的性狀挑選不依賴于植物的發(fā)育階段,不依賴于環(huán) 境,這顯著提高了挑選過程。包括由多個(gè)基因控制的復(fù)雜性狀在內(nèi)的 可以利用分子標(biāo)記挑選的性狀的數(shù)目大大增加,并且可以想象這一發(fā) 展以漸增的速度持續(xù)。
植物培育領(lǐng)域中的另一個(gè)趨勢起因于反向遺傳學(xué)。反向遺傳學(xué)涉 及到一種方法,其中基因被分離,且基因的功能通過修飾它們的一級(jí) 結(jié)構(gòu)或表達(dá)來確定。隨著目前在基因功能方面認(rèn)識(shí)的增加,尤其是在 模式系統(tǒng)中例如擬南芥(AraMdopsis tholiana),反向遺傳學(xué)方法 現(xiàn)在在作物系統(tǒng)中增加了效力。
為了確定候選基因的等位基因變異性,過量的DNA診斷工具是可 用的并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。大量包含天然的或誘導(dǎo)的等位基因變 異的植物種群需要在感興趣的位點(diǎn)對DM多態(tài)性進(jìn)行篩選,以獲得飽 和的等位基因變異的采集。因而,可以通過關(guān)聯(lián)分析評(píng)價(jià)如此發(fā)現(xiàn)的 基因的等位基團(tuán)型對植物表型的貢獻(xiàn)。
篩選培育的或突變的種群的成本大部分由在研究過程中種植和采 樣種群的個(gè)體植物以及從這些樣本中制備DNA所需的勞力所決定。在
研究過程中,如果一個(gè)種群作為代表存在于種群的個(gè)體植物中的遺傳 變異的種子樣本是可獲得的,大量的勞力用于逐林收獲種子作為家系 中的相關(guān)個(gè)體。而且,這任務(wù)需要對產(chǎn)生的每一個(gè)額外種群進(jìn)行重復(fù), 并時(shí)所述種群在特定遺傳位點(diǎn)對等位基因變異進(jìn)行評(píng)價(jià)。
發(fā)明概述
本發(fā)明的目的是提供一種用于從植物中分離DNA的有效的方法。 本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種有效的DNA分離方法,所述方法允許
針對在特定遺傳位點(diǎn)存在的等位基因變異進(jìn)行植物種群的篩選,其需 要人工解剖組織樣本或需要收獲來自被過量研究的種群的每個(gè)個(gè)體植 物的種子。
根據(jù)本發(fā)明,發(fā)現(xiàn)這樣的方法可以基于根部釋放的分泌液的使用, 優(yōu)選地從很幼小的植物如幼苗的根部或從萌芽的種子暴露出的根部或 生長在組織培養(yǎng)基里的植物的不定根,以從中分離DNA。更具體地, 該方法利用從根尖分離的所謂的根邊緣細(xì)胞作為DNA的主要來源。根 邊緣細(xì)胞是大部分植物物種圍繞根頂端的活細(xì)胞。當(dāng)生長在土壤里以 及生長在液體或者固體培養(yǎng)基時(shí),植物自然地從根部分離根邊緣細(xì)胞。 因此,本發(fā)明的方法被認(rèn)為是非破壞性的。細(xì)胞已經(jīng)以自然的方式從 植物上分離,可以通過溫和的攪動(dòng)和去除圍繞根部且包含根邊緣細(xì)胞 的培養(yǎng)基(通常是液體)而收獲。生長的根部持續(xù)產(chǎn)生根邊緣細(xì)胞, 在稍后的時(shí)期可以再一次收獲根邊緣細(xì)胞。
因此本發(fā)明涉及一種用于從植物分離DNA的方法,包含
a) 從生長的根部收集根邊緣細(xì)胞;和
b) 從根邊緣細(xì)胞提取DNA。
原則上,DNA可以從所有的根邊緣細(xì)胞獲得。但是,很實(shí)用的是 收集源自萌芽種子部分的根部的根邊緣細(xì)胞。種子能夠在液體培養(yǎng)基 如水中被浸漬,此后種子萌芽。因此能夠在植物發(fā)育的很早的階段, 即種子發(fā)育期間,分析植物。沒有必要等到葉子在植物上長出來。但 是,該方法也可以在源自幼苗根部的根邊緣細(xì)胞上進(jìn)行。
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)生長在組織培養(yǎng)基中的植物材料上的不定根產(chǎn)生根邊
緣細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明,這些根邊緣細(xì)胞也可以用于從中分離DNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種用于提取DNA的方法是可利用的,例 如CTAB (Doyle JJ and Doyle JL (1990) Focus 12, 13-15), KingFisher96 (Thermo Labsystems)等等。
如此獲得的DNA可以是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)來源的,并且可以用不同 的核酸分析技術(shù)分析。這些核酸分析技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知, 包括但不僅限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR), Sanger測序法,mini測序法, pyro測序法,GS20測序法,擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP),限制片段長 度多態(tài)性(RFLP),隨機(jī)擴(kuò)增DM多態(tài)性(RAPD) , Invader(侵染探針法), 寡核苷酸連接測定法(OLA),單特征多態(tài)性(SFP)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及新穎的非破壞性DNA分離方法在高效篩選大量 植物種群在特定基因座的遺傳變異中的應(yīng)用。該遺傳變異可以是自然 的或人工誘導(dǎo)的。
因此從植物分離DNA的方法提供了一個(gè)獲得可以用于檢測由化學(xué) 的或物理的誘變產(chǎn)生的植物種群中的特異基因的遺傳變異的DNA的有 效工具??蛇x擇地,所述遺傳變異可以存在于自然種群中。
本發(fā)明的方法的使用消除了建立衍生于發(fā)生突變的Ml植物的M2 家系的需要。大量的M2種群可以被替代使用,使得可以用更加有效和 靈活的方式分析M2種群的特異基因不同等位基團(tuán)型的存在。
本發(fā)明的用于從植物分離DNA的方法也適合于在植物種群的遺傳 分型中使用,這對商業(yè)種子批次的質(zhì)量控制目的以評(píng)價(jià)遺傳純度和同 一性是有用的。
該DM分離方法可進(jìn)一步用于存在于遺傳上截然不同的植物的種 群中植物的鑒定,該鑒定基于檢測多態(tài)分子標(biāo)記的等位基團(tuán)型,其中 所述多態(tài)分子標(biāo)記與決定某一個(gè)表型性狀表達(dá)的基因的等位基團(tuán)型是 連鎖的。
發(fā)明詳述 大范圍測序的成就提供了模式植物物種如擬南芥和作物物種如水 稻的完整基因組序列。而且,對來自大范圍作物物種如番茄,萵苣,
黃瓜,蕓苔,甜瓜,玉米等的不同組織樣本來源的大量的cDNA片段或 ESTs已進(jìn)行了測序。目前的挑戰(zhàn)是闡明單獨(dú)的基因的功能,其表達(dá)的 調(diào)節(jié)及其遺傳交互作用。為了解決這個(gè)挑戰(zhàn),處理每個(gè)單獨(dú)基因的大 量的等位基因變異是重要的。這將為一個(gè)基因產(chǎn)物在細(xì)胞的,器官的 或更高級(jí)別的水平發(fā)揮哪種生化作用和基因產(chǎn)物如何相互作用提供線 索。
為了在植物培育中開發(fā)基因功能的信息,獲得一個(gè)非常有效的, 經(jīng)濟(jì)效益的反向遺傳學(xué)技術(shù)是令人想要的。反向遺傳學(xué)涉及一種方法, 在所述方法中,以基因序列信息開始,針對該基因序列產(chǎn)生等位基因 的或表達(dá)的變異體,隨后對該突變體進(jìn)行功能上分析。這個(gè)術(shù)語是相 對于將表型變異作為起始材料以鑒定潛在的基因的等位基因型的正向 遺傳學(xué)的。
為了在植物培育中應(yīng)用反向遺傳學(xué),基因功能的知識(shí)是先決條件。 當(dāng)前,擬南芥是最廣泛研究的涉及基因功能的植物系統(tǒng),來自擬南芥 研究的結(jié)果在這方面提供了豐富的信息來源。
基于氨基酸序列水平的同源性,可以預(yù)測 一 個(gè)作物物種的同源蛋 白的功能,盡管最終需要直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)以證實(shí)該基因的功能。因此, 基于模式物種的基因的同源性而鑒定的作物物種的基因可以被認(rèn)為是 特異功能的候選基因。物種間的具有類似或相同功能的基因可以,但 不必要,展現(xiàn)高水平的同源性,并且存在于一個(gè)具體模式系統(tǒng)的基因 功能可能只是部分與存在于一個(gè)給定的作物物種的基因功能一致。
可以通過反向遺傳學(xué)開發(fā)的等位基因變異性既自然地在適應(yīng)的種 群中出現(xiàn)又可以通過用化學(xué)的或物理的突變劑,分別例如曱基磺酸乙 酯(ems)或X射線,的隨機(jī)突變獲得。通過用這些突變劑處理植物的器 官,細(xì)胞,花粉或種子,將會(huì)在基因組DM的隨機(jī)位置引入可能導(dǎo)致 基因功能改變的修飾。在基因功能方面迅速增加的知識(shí),許多植物物 種的基因組和cDNA序列的廣泛可獲得性和承載自然的和誘導(dǎo)的遺傳
變異的種群的可獲得性的條件下,反向遺傳學(xué)作為一種在模式或作物 物種中確定基因功能的研究工具具有漸增的重大意義。另外,反向遺 傳學(xué)可以被認(rèn)為是植物改良的有力的技術(shù),用其可以有效鑒定已知的 功能上與特異性狀有關(guān)的基因的等位基因變異。
為了在一個(gè)作物物種中進(jìn)行反向遺傳學(xué),除一個(gè)靼基因之外,明 顯地需要包含給定作物物種的遺傳位點(diǎn)的遺傳變異體的植物種群。在
這些種群里,遺傳變異可以是自然發(fā)生或可以是由突變劑如ems誘導(dǎo) 的。為了獲得帶有誘導(dǎo)突變的種群,可以在包含不同濃度的突變劑如 ems的溶液中溫育例如種子。Ems首先烷基化DNA鏈的G殘基,在DNA 復(fù)制期間導(dǎo)致其與T配對,而非與C配對。因此,GC堿基對以一定頻 率變成AT堿基對,所述頻率由ems的有效劑量和植物的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng) 的活性決定。
Ems的有效劑量依賴于所用的濃度,種子的大小和其他物理性質(zhì) 和在ems溶液中種子的溫育時(shí)間。已用ems處理的種子代表性地稱為 Ml種子。作為一個(gè)處理的結(jié)果,Ml種子的組織在它們細(xì)胞的基因組中 包含隨機(jī)的點(diǎn)突變,那些將形成生殖細(xì)胞系組織的細(xì)胞亞群中的突變 將會(huì)轉(zhuǎn)移到被稱為M2的下一代。單倍機(jī)能不全從而導(dǎo)致不育或者誘導(dǎo) 胚胎致死的突變或它的組合將不能轉(zhuǎn)移到M2代。
和上述的使用ems的類似過程也應(yīng)用于其他突變試劑。
為了利用反向遺傳學(xué)評(píng)價(jià)突變體M2種群特異遺傳位點(diǎn)期望的等 位基因變異的存在,可以采用不同的方法,其基于收獲和儲(chǔ)存M2種子 種群所選擇的方法可以被區(qū)分開。 一方面可以把M2種子作為單一的巨 大的樣本收獲和儲(chǔ)存而另一方面可以把M2種子作為一個(gè)家系收獲和 儲(chǔ)存,其意味著M2種子是通過逐抹收獲并分別保存的。
成批收獲M2種子,與把M2作為家系分別收獲的情況相比,需要 較少的勞力輸入。另一方面,作為家系收獲M2種子允許制備種群的每 一個(gè)家系的M2種子的子集的DNA提取物,其診斷上可以用于分析種群。 一旦鑒定到一個(gè)突變,只需要在溫室或田地種植與陽性診斷樣本相對 應(yīng)的家系的種子,以獲得突變。
如果成批的M2種子是可獲得的,針對每一次執(zhí)行的篩選,需要分 別種植和采樣M2植物用于DNA提取和分析,其需要相當(dāng)大量的資源輸 入。因此,兩種方法都有他們特異的缺點(diǎn),在本技術(shù)領(lǐng)域存在一個(gè)明 確的需要,以提供能解除兩種方法的缺點(diǎn)的解決方案。
當(dāng)M2種子已被成批收獲時(shí),需要非破壞性采樣以鑒定包含有特異 基因的期望的等位基因變異體的個(gè)體植物。通常,通過種植M2種群幼 小的植物,以采葉子樣本的方式對這些植物個(gè)體采樣和從中制備用于 分析的DNA來實(shí)現(xiàn)。這些葉子樣本在DNA提取前可以被混合以達(dá)到由 使用的突變檢測平臺(tái)的動(dòng)態(tài)范圍所確定的程度。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記允許找出 包含期望突變的亞群和最后相應(yīng)的個(gè)體植物的根源。
需要被篩選的M2植物的數(shù)目依賴于Ml植物中突變的頻率和在研 究中植物物種里促成生殖細(xì)胞系的單獨(dú)細(xì)胞的數(shù)目。在一個(gè)代表性的 實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)從5000個(gè)M1植物開始時(shí),在2個(gè)單獨(dú)生殖細(xì)胞/植物的情 況下,需要篩選約10000個(gè)M2植物以捕獲誘導(dǎo)的遺傳變異。
如果M2種子是被逐株收獲的,存在于促成收獲種子的Ml植物生 殖細(xì)胞的細(xì)胞中的誘導(dǎo)的突變在M2家系中是分離的。通過制備源自一 個(gè)M2家系的大量個(gè)體的DNA樣本,可以診斷靶基因中突變的存在,不 需要每次對種群再采樣。換句話說, 一個(gè)單獨(dú)的DNA樣本可以在診斷 上用于它所代表的M2家系。包含特異基因的期望的等位基因變異體的 個(gè)體植物可以通過養(yǎng)育僅僅那些被陽性診斷出期望突變的M2家系的 個(gè)體來獲得。
雖然一旦建立了 M2家系,這個(gè)方法是比較有效的,但是建立這樣 的基于家系的系統(tǒng)是勞動(dòng)密集的,因?yàn)樗枰獑为?dú)收獲和處理生長在 Ml植物上的種子,并建立一個(gè)DNA文庫作為種群的遺傳變異的代表性 的反映。估計(jì)處理5000個(gè)M2家系需要至少250個(gè)人工時(shí)的輸入。重 要地,如果期望的突變沒有出現(xiàn)在種群里,就必須重復(fù)整個(gè)活動(dòng)。
為了檢測從(合并的)植物樣本分離的DNA中的突變,本領(lǐng)域技 術(shù)人員處理了大量的已建立的技術(shù)。Ti 11 ing (尋靶在基因組中被誘導(dǎo) 的局部損傷)是以Cell在錯(cuò)配位置對由PCR產(chǎn)生的被標(biāo)記的異源雙鏈
DNA的特異剪切為基礎(chǔ)的。通過變性膠電泳(即在Licor系統(tǒng)上)分 析消化的樣本,被消化的PCR片段的出現(xiàn)表明在初始的DM庫中DNA 多態(tài)現(xiàn)象的存在(Colbert, T. et al (2001) Plant Physiology 126, 480-484)。
變性高效液相色譜(dHPLC)也可以應(yīng)用于合并的DNA樣本。與 tilling過程類似,突變的存在導(dǎo)致與同源雙鏈分子相比,更快的通 過dHPLC柱的異源雙鏈分子的形成,使得在合并樣本中的突變的檢測 可以進(jìn)4亍(McCallum, C. et al . (2000) Nature Biotechnology 18, 455-457)。
當(dāng)用快中子作為突變試劑時(shí),在基因組中在隨機(jī)位置造成小缺失。 這允許擴(kuò)增突變的基因座,其通過PCR后在大小上被縮小了 (缺失的 后果)。由于這個(gè)PCR反應(yīng)是特異針對突變基因座的,很高水平的樣 本庫變成可實(shí)行的。另一方面,這個(gè)方法只能應(yīng)用于允許針對包含缺 失的基因座而設(shè)計(jì)的特異PCR反應(yīng)的那些突變(Song, X. etal (2001) The Plant Journal 27, 235-242)。
為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的是,基本上任何可用到的核酸分析技 術(shù)都可以;陂應(yīng)用于檢測DNA樣本之間的多態(tài)性。甚至個(gè)體樣本的直接 測序也可以被應(yīng)用。在工業(yè)設(shè)備中,平臺(tái)的選擇大部分由它的穩(wěn)定性
(robustness )和每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的成本所決定。
隨著各種各樣的誘導(dǎo)突變的檢測技術(shù)的可用性和自動(dòng)化和小型化
的發(fā)展,當(dāng)與涉及制備M2種群和有代表性的DNA模板的成本相比時(shí),
每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的成本將會(huì)被減少到 一個(gè)相當(dāng)?shù)偷乃健?br>
因此,植物反向遺傳學(xué)的改良在制備突變種群和它們的代表性 DNA樣本領(lǐng)域里較好的被實(shí)現(xiàn),而不是在誘導(dǎo)的多態(tài)現(xiàn)象的檢測中。 這些改良由本發(fā)明提供。
在任一種情況,即應(yīng)用基于M2成批種群或M2家系的反向遺傳學(xué),
分別在篩選期間或者之前將需要大量的勞力輸入。這嚴(yán)重限制了反向 遺傳學(xué)方法在作物物種的成本效益的適用性。
本發(fā)明的DNA分離方法也可以用于在植物培育期間的植物挑選。通過雜交和從后代種群中挑選植物達(dá)到植物培育的進(jìn)步。
傳統(tǒng)上,在特異的生長條件下,在顯現(xiàn)的植物表型水平進(jìn)行挑選。 例如,基于果實(shí)和葉子的顏色或形狀,對病原體的抵抗力,產(chǎn)量或其 他性狀或其組合挑選植物。
隨著分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn),針對特異性狀的挑選可以在DNA水平 進(jìn)行。技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到允許鑒定和檢測遺傳上與導(dǎo)致某一性狀表達(dá)的 基因的等位基團(tuán)型緊密連接的標(biāo)記等位基因。在理想情況中,標(biāo)記等 位基因與造成某一性狀的基因的等位基團(tuán)型是一致的。在這些情況中, 標(biāo)記等位基因和性狀等位基因不能通過遺傳重組分開。
用于間接挑選性狀的標(biāo)記等位基因的使用有大量的優(yōu)點(diǎn),其提高 了挑選過程的效率。基于標(biāo)記的挑選是獨(dú)立于植物的發(fā)育階段和環(huán)境 的。這允許例如在幼苗階段挑選果實(shí)的性狀或在室溫挑選寒冷耐受性。 目前,使用標(biāo)記等位基因的間接挑選廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代植物培育。最先 進(jìn)的是標(biāo)記在檢測質(zhì)量性狀,即在生殖質(zhì)中表型的變異是由單個(gè)基因 的等位基團(tuán)型所決定的性狀,中的應(yīng)用。
例如,對病原體的特異菌林的抵抗力通常是由顯性R基因的存在 所決定的,其編碼檢測病原體病毒性因子的存在或活性的受體。雖然 抗性表型的表達(dá)涉及許多基因座,存在于生殖質(zhì)的和解釋表型值的遺 傳變異通常由單個(gè)R基因的基因座決定。
但是,許多性狀是定量的或連續(xù)的,其意味著許多基因能貢獻(xiàn)于 經(jīng)常受環(huán)境條件影響的性狀的表型值。這些表型比如植物的高度,開 花時(shí)間或潛在產(chǎn)量。而且,潛在于復(fù)雜性狀下的個(gè)體基因能上位地相 互作用,其使對它們遺傳的分析復(fù)雜化。
隨著高密度遺傳圖譜和有力的統(tǒng)計(jì)工具的可獲得,目前涉及這些 數(shù)量性狀(QTL)的表達(dá)的基因座的檢測是可行的。因此可以預(yù)期,用分 子標(biāo)記能檢測的(復(fù)雜)性狀的數(shù)目將會(huì)在不遠(yuǎn)的將來顯著增加。
為了應(yīng)用間接挑選,目前可以使需要被挑選的個(gè)體植物的種群的 種子在溫室里萌芽生長到組織樣本可以用于DNA提取的階段。取決于 作物物種,這可以在幼苗階段或幼小植物階段進(jìn)行。在進(jìn)行DNA分析
后,可以進(jìn)行植物的挑選。顯然,這一過程需要時(shí)間,空間和勞力,
其消耗了需要的用于執(zhí)行基于分子標(biāo)記的間接挑選的總資源的相對巨
大的部分。
增加獲得足夠質(zhì)量和數(shù)量的DNA提取物的效率,以執(zhí)行DNA分析 的方法的技術(shù)能顯著降低基于分子標(biāo)記的間接挑選的成本。這些技術(shù) 由本發(fā)明提供。
本發(fā)明提供了一種新穎的方法,以用高效的,非破壞性的方式從 植物分離DM。這個(gè)方法寸以被應(yīng)用于例如顯著提高反向遺傳學(xué)以及 間接挑選技術(shù)的總效率。
該DNA分離方法可以有效的應(yīng)用于植物發(fā)育的非常早期的階段, 即在胚根從被浸滲種子暴露出來的階段,并且重要地,不需要任何通 過鉆孔或切割等組織采樣。
當(dāng)種子被置于適合的濕度,光和溫度的條件下,水將被吸收且將 開始萌芽。通常,第一個(gè)可見的萌芽信號(hào)是胚根或根尖的暴露。在生 長時(shí),在根尖后面的區(qū)域丟棄稱為根邊緣細(xì)胞的活細(xì)胞到環(huán)境中 (Hawes, M. et al . (1998) A謂.Rev. Phytopathol . 36, 31卜327)。
雖然根邊緣細(xì)胞的功能還不完全明確,目前的假說是這些細(xì)胞通 過在植物體和它生長的土壤之間形成一個(gè)擴(kuò)散的邊界,保護(hù)植物抵抗 毒性元素如鋁或致病微生物。另外,根邊緣細(xì)胞可能有吸引有益微生 物或建立菌根的功能。因此根邊緣細(xì)胞可能在控制根系統(tǒng)的微環(huán)境中 非常重要。
當(dāng)種子在體外例如在水中萌芽時(shí),也產(chǎn)生根邊緣細(xì)胞,并且根邊 緣細(xì)胞保持松散地附著于根的表面。通過溫和的攪動(dòng),根邊緣細(xì)胞會(huì) 從根的表面釋放出來,散布到液體中,并且能夠被收獲。根據(jù)本發(fā)明, 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)這些根邊緣細(xì)胞可以擔(dān)當(dāng)用于診斷目的的DNA來源。 大部分的作物物種,如果不是全部,是已知產(chǎn)生根邊緣細(xì)胞的,意味
著本發(fā)明的普遍可應(yīng)用性。
當(dāng)種子在水中萌芽到根部已經(jīng)暴露出約l-2厘米的階段時(shí),水里 含有足夠的細(xì)胞物質(zhì)以用于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNA提取過程,為用PCR或其
他DM分析技術(shù)進(jìn)一步分析提供足夠的DNA。
根據(jù)本發(fā)明,體外植物的根部產(chǎn)生根邊緣細(xì)胞。這些根邊緣細(xì)胞 不是源自于萌芽種子或幼苗的根尖,而是來自于組織培養(yǎng)材料的不定 根,因而也可以用于從中分離DNA。
當(dāng)根邊緣細(xì)胞懸浮液用有效濃度的DNase處理1小時(shí)后,在DNase 失活及隨后的MA提取后,仍可以荻得信號(hào)(
圖15)。這確證了從根 分泌液獲得的DNA的確是來源于有DNase抵抗能力的結(jié)構(gòu)例如根邊緣 細(xì)月包的,見念。
能獲得的DNA的數(shù)量足以進(jìn)行許多分析,尤其是當(dāng)使用靈敏的基 于熒光的檢測才支術(shù)如InvaderTM或Invader PlusTM (Third Wave Technologies)。
大部分作物物種,如果不是全部,其有足夠生理質(zhì)量的種子,在 水中幾天里萌芽。已經(jīng)觀察到在這非常早期的階段,根邊緣細(xì)胞已經(jīng) 形成。因此,DNA提取和分析可以令人驚訝地在從千種子開始的幾天 里完成。由于萌芽的種子在體外保持生命力至少2周,正常情況下, 在溫室中種植植物所需的時(shí)間和空間以及收獲組織樣本所需的勞力可 以大部分纟皮省略。
上述情況也適用于組織培養(yǎng)的根。根邊緣細(xì)胞可以從培養(yǎng)基中分 離并且這體外植物能繼續(xù)生長。這個(gè)分析可以在植物發(fā)育的非常早期 的階段進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步展示,源自成批M2種群的種子可以在2 - 5個(gè) 種子的小庫中萌芽,其提供能在檢測平臺(tái)上分析的合并DNA樣本,所 述的檢測平臺(tái)具有在包含有3-9倍于野生型等位基因數(shù)量的庫中檢 測一個(gè)突變體等位基因的動(dòng)態(tài)范圍。
合并也可以在收獲根邊緣細(xì)胞,DNA提取物或PCR產(chǎn)物的水平上
進(jìn)行。實(shí)際采用的合并策略取決于不同過程的技術(shù)性,包括液體中種
子的萌芽行為和作物物種與作物物種可能不同的根邊緣細(xì)胞生成以及 按照每抹成本可以發(fā)現(xiàn)最適度的檢測平臺(tái)的動(dòng)態(tài)范圍。
就效率而言,根據(jù)反向遺傳學(xué)或使用成批M2種子或M2家系或培育種群的間接挑選方法的資源輸入,根據(jù)本發(fā)明的方法有著大量重要
的含意。由于使用根邊緣細(xì)胞的非破壞性DNA提取方法能夠在體外在 種子萌芽后的非常早期的階段進(jìn)行,和已知的幼苗在體外保持生命力 至少幾周的事實(shí),使用成批M2種群的反向遺傳學(xué)方法或間接挑選方 法,不再需要溫室時(shí)間和空間以及制備植物樣本如葉片的密集勞動(dòng)。 這意味著對M2成批種群工作的可選擇性,即需要大量的前期資源輸入 的M2家系的工作不再是必需的。
另外,在培育期間,間接挑選方法不需要在溫室里種植將不會(huì)被 挑選的植物材料。因此,用與本技術(shù)領(lǐng)域目前所知的反向遺傳學(xué)或間 接挑選方法相比,利用本發(fā)明,手邊的任何需要在特異基因座評(píng)價(jià)等 位基因變異性的種群可以以空前的效率和靈活性進(jìn)行篩選。
本發(fā)明的用于植物的分離DNA的方法在最廣泛的意義中是可應(yīng)用 的。在本申請中,涉及了多種情況,在所述的情況中,用于分離DNA 的有效的非破壞性方法是有益的。這些例子是不打算限制的。將會(huì)為 技術(shù)人員所清楚的是,該方法可用于任何DNA分離且在其他本文未提 及的情況里也是同等可應(yīng)用的。
本發(fā)明將在以下的非限制的實(shí)施例中進(jìn)一步用圖說明。這些實(shí)施 例涉及到以下附圖。
圖1:根邊緣細(xì)胞脫落到液體培養(yǎng)基中的黃瓜根尖。左圖展示了 白光下的成像,右圖展示了根邊緣細(xì)胞在DAPI染色后熒光下的細(xì)胞核。
圖2:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由PCR分 析,跟隨進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的DNA提取方法生成的不同的黃瓜DNA樣本 的kom2Q標(biāo)記位點(diǎn)的Mspl消化而獲得。
通道l:分子量標(biāo)記
通道2至11: 10個(gè)個(gè)體黃瓜4艮邊緣細(xì)胞標(biāo)本 通道12:陰性對照萵苣根邊緣細(xì)胞標(biāo)本
通道13:陰性對照水 通道14:陽性對照黃瓜葉片
圖3:在用kom20-探針組分析黃瓜根邊緣細(xì)胞DM提取物后獲得 的表達(dá)為凈Fold Over Zero (FOZ)的FAM和RED值。對于每一個(gè)DNA 樣本,RED信號(hào)標(biāo)繪在X軸上而FAM信號(hào)標(biāo)繪在Y軸上。
圖4:左圖展示了在液體培養(yǎng)基中的萌芽的甜瓜種子及其根尖。 右圖展示了來源于根部的脫落的根邊緣細(xì)胞。
圖5:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由根據(jù)本 發(fā)明的DNA提取方法生成的不同的甜瓜DNA樣本的mlllkl9標(biāo)記基因 座的PCR分析獲得。
通道1:分子量標(biāo)記
通道2至11: 10個(gè)個(gè)體甜瓜根邊緣細(xì)胞標(biāo)本 通道12:來自甜瓜葉片的DNA 通道13:陰性對照萵苣根邊緣細(xì)胞標(biāo)本 通道14:陰性對照水
圖6:在用mlllkl9探針組分析甜瓜根邊緣細(xì)胞DNA提取物后獲 得的表達(dá)為凈Fold Over Zero (FOZ)的FAM和RED值。對于每一個(gè) DNA樣本,RED信號(hào)標(biāo)繪在X軸上而FAM信號(hào)標(biāo)繪在Y軸上。
圖7:根邊緣細(xì)胞脫落到液體培養(yǎng)基中的番茄根尖。
圖8:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由根據(jù)本 發(fā)明的DNA提取方法生成的不同的番茄DNA樣本的側(cè)生抑制因子基因 (lateral suppressor gene)的PCR分析獲得。 通道1:分子量標(biāo)記
通道2至11: IO個(gè)個(gè)體番茄根邊緣細(xì)胞標(biāo)本 通道12:來自番茄葉片的DM 通道13:陰性對照水
圖9:帶有附著的根邊緣細(xì)胞的蕓苔根尖(左)。蕓苜根邊緣細(xì) 胞的詳細(xì)視圖(右)。
圖10:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由根據(jù)本 發(fā)明的DNA提取方法生成的不同的野甘藍(lán)(Brassica oleracea) DM 樣本的BoAC02基因片段的PCR分析獲得。
通道l:分子量標(biāo)記
通道2至12: 11個(gè)個(gè)體野甘藍(lán)根邊緣細(xì)胞標(biāo)本 通道13:陰性對照水
圖11:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由野甘藍(lán) 線粒體基因組的線粒體0RF B區(qū)域的PCR分析獲得。 通道1:分子量標(biāo)記
通道2至7: 6個(gè)個(gè)體野甘藍(lán)根邊緣細(xì)胞標(biāo)本 通道8:源自于蕓苔植物葉片的DNA 通道9:陰性對照水
圖12:甲苯胺藍(lán)染色后從萵苣根部脫落的根邊緣細(xì)胞的光學(xué)顯微 鏡檢查。
圖13:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由根據(jù)本 發(fā)明的DNA提取方法生成的不同的萵苣DNA樣本的與稱為NAS2的 Nasonovia抗性基因連鎖的分子標(biāo)記的PCR分析獲得。
通道1:分子量標(biāo)記
通道2至13: 12個(gè)個(gè)體萵苣根邊緣細(xì)胞標(biāo)本
通道14:分子量標(biāo)記 通道15:陰性對照水
通道16:陽性對照源自于萵苣葉片("ponssla,,)的DNA 通道17:陰性對照源自于黃瓜的DNA
圖14:在用NAS2-探針組分析萵苣根邊緣細(xì)胞DNA提取物后獲得 的表達(dá)為原始值的FAM和RED值。對于每一個(gè)DNA樣本,RED信號(hào)標(biāo) 繪在X軸上而FAM信號(hào)標(biāo)繪在Y軸上。
圖15:展示用DNase處理的黃瓜才艮部分泌液的DNA提取物的PCR 分析的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠。
圖A:使用黃瓜kom24特異引物組合的PCR分析。 圖B:使用萵苣特異的RP引物組合的PCR分析。通道1-18包含 從經(jīng)過以下處理的黃瓜根部分泌液分離的DNA:在通道l-3, 7-9和 13-15中分析的根部分泌液中加入萵苣基因組DNA。通道1 - 6的樣本 不加入DNase。通道7 - 12的樣本加入DNase并立即通過在65°C溫育 5分鐘使其失活。通道13-18,加入DNase,繼之以37°C溫育30分鐘, 隨后失活。在圖A中,水(通道19),萵苣DNA(通道20)和黃瓜DNA (通道21 )用作對照。在圖B中,水(通道19),萵苣DNA (通道20 和21 )和黃瓜DNA (通道22 )用作對照。
圖16:在26。C水中溫育24小時(shí)后體外再生黃瓜植物的不定根的 根尖。在這一階段,根邊緣細(xì)胞的脫落是清楚可見的。
圖17:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由根據(jù)本 發(fā)明的DNA提取方法生成的不同的黃瓜DNA樣本的kora24標(biāo)記基因座 的PCR分析獲得。
通道l:來源于不定根的黃瓜根邊緣細(xì)胞標(biāo)本(BC)。
通道2:源自于黃瓜葉片的DNA
通道3:陰性對照水
圖18:根邊緣細(xì)胞脫落到液體培養(yǎng)基中的胡椒的根尖。
圖19:在用GMS探針組分析胡椒根邊緣細(xì)胞DNA提取物后獲得的 表達(dá)為凈Fold Over Zero (FOZ)的FAM和RED值。對于每一個(gè)DNA樣 本,RED信號(hào)標(biāo)繪在X軸上而FAM信號(hào)標(biāo)繪在Y軸上。在圖中,雜合 信號(hào)用藍(lán)色標(biāo)繪而對照樣本的純合信號(hào)用紅色和綠色符號(hào)標(biāo)繪。
圖20:根邊緣細(xì)胞脫落到液體培養(yǎng)基中的玉米的根尖。
圖21:展示條帶的溴化乙錠染色的瓊脂糖膠,所述條帶由根據(jù)本 發(fā)明的DNA提取方法生成的不同的玉米DNA樣本的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因 Incwl的PCR分析獲得。
通道1:分子量標(biāo)記。
通道2至7:源自于玉米根邊緣細(xì)胞的DNA。 通道8:陰性對照水。
通道9至10:陽性對照源自于玉米葉片的DNA提取物。 圖22:根邊緣細(xì)胞脫落到液體培養(yǎng)基中的苣荬菜根尖。 圖23:根邊緣細(xì)胞脫落到液體培養(yǎng)基中的胡蘿卜根尖。 實(shí)施例
實(shí)施例1源自于黃瓜的根邊緣細(xì)胞的DM提取和分析 黃瓜種子在26。C, 10(^1水中(milliQ)萌芽。取決于目的,可以 使用不同的規(guī)格,如允許易于將樣本轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板以進(jìn)一步 處理的12 x 8 MicronicTM微管規(guī)格。在暴露的根有約1. 5cm的長度的 階段,其取決于種子的種類和質(zhì)量,發(fā)生在約18小時(shí)后,包含有萌芽
種子的管道用渦旋溫和地振動(dòng)15秒,以從根尖釋放根邊緣細(xì)胞。如圖 1所示,通過光學(xué)顯微鏡的評(píng)價(jià)清楚地展示了培養(yǎng)基中黃瓜的根邊緣 細(xì)胞的存在。
主根和根毛沒有被這一過程破壞。包含有根邊緣細(xì)胞的液體通過 添加lOOpl裂解緩沖液(Agowa)用于進(jìn)行DNA提取(植物DNA分離試 劑盒,與King FisherTM 4幾器人技術(shù)組合的Agowa GmbH, Thermo Labsystems )。該混合物在55°C溫育10分鐘。隨后加入300|nlDNA結(jié) 合緩沖液(Agowa)并在3000rp/n將混合物離心5分鐘。隨后,往上清 夜力口入15|il King Fisher粒子懸浮液(Agowa Magnetic Particles (Suspens ion BLM))。
在用120pl洗脫緩沖液(lOmM Tris-HCl緩沖液pH = 7. 6)將結(jié) 合的DNA從粒子上洗脫下來后,該DNA準(zhǔn)備好用于分析。對于黃瓜, 選擇存在于基因組中的名為"kom20,,的隨機(jī)分子標(biāo)記,以分析來自基 于根邊緣細(xì)胞獲得的DNA提取物的DNA。
在這個(gè)實(shí)施例中,所用的種群針對kom20標(biāo)記的等位基因之一分 離為雜合的或純合的。用獲得的DM提取物的總量中的5pl進(jìn)行PCR。 當(dāng)用瓊脂糖膠分析時(shí),預(yù)期PCR反應(yīng)產(chǎn)生372bp的片段。用限制性酶 Mspl對kom2GPCR片段的消化辨別本實(shí)施例中用于實(shí)驗(yàn)的種群中這個(gè) 標(biāo)記基因座的兩個(gè)等位基因。當(dāng)限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)在PCR產(chǎn)物 中時(shí),用Mspl消化產(chǎn)生279和93bp的片段。分析的結(jié)果在圖2中展 示。
為了證實(shí)這一結(jié)果,用kom20-特異熒光探針組(Invader )分析 DNA標(biāo)本,其針對每一個(gè)kom20等位基因(FAM or RED)產(chǎn)生一個(gè)特異 熒光信號(hào)(表達(dá)為凈Fold Over Zero or FOZ)。因此,預(yù)期的是根 據(jù)本發(fā)明從用kom20-探針分析的分離種群的個(gè)體中獲得的DNA樣本 將為標(biāo)記等位基因的任一個(gè)雜合體型產(chǎn)生診斷的熒光信號(hào)(在對角線 上標(biāo)繪,RED + FAM信號(hào))或?yàn)闃?biāo)記等位基因之一的純合體型產(chǎn)生診 斷的熒光信號(hào)(對這個(gè)具體情況用RED標(biāo)記并標(biāo)繪在X軸上)。分析 的結(jié)果在圖3中展示并證實(shí)了預(yù)期值。
發(fā)現(xiàn)與每一抹分析的植物一致。因此,該結(jié)果證明根據(jù)作為本發(fā)明的
主題的方法分離的DNA的數(shù)量足以進(jìn)行使用與瓊脂糖膠電泳組合的 PCR的或作為檢測平臺(tái)的基于焚光的探針系統(tǒng)的DNA標(biāo)記分析。進(jìn)一 步可以推斷標(biāo)記信號(hào)(marker calls)是源自于存在于種子中的雜合 組織來源的DNA,而不是母本組織來源的,因?yàn)樗玫臉?biāo)記是分離的, 其在用于產(chǎn)生用于此分析的雜合種子的母系中不是這種情況。
為了證實(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的DNA分離方法而獲得的數(shù)據(jù),將萌芽 的種子種在溫室中,取葉片組織并用PCR/MspI對kom20標(biāo)記分析。用 葉片DNA獲得的數(shù)據(jù)展示出與用源自于根邊緣細(xì)胞DNA提取物的DNA 獲得的數(shù)據(jù)一致。這證明通過根邊緣細(xì)胞DNA提取物產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)據(jù)
代表著一林既定的由新生幼苗生長而成的植物。
為了確定每一份DNA提取物可以進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的數(shù)量,用兩次重復(fù)
的檢測5個(gè)不同的隨機(jī)標(biāo)記位點(diǎn)的5個(gè)基于熒光的實(shí)驗(yàn)測定了一系列 稀釋度的DNA提取物。發(fā)現(xiàn)每一個(gè)DNA提取物可以被稀釋至少20倍而
不丟失任一個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的信號(hào)。由于每一個(gè)提取物在ioopi體積中制
備,并且每一個(gè)實(shí)驗(yàn)用5pl,每一次分離的每一個(gè)DNA提取物可以進(jìn) 行總數(shù)為400個(gè)的實(shí)驗(yàn)。另外,對于黃瓜,每一個(gè)幼苗可以進(jìn)行至少 2輪的根邊緣細(xì)胞收獲和DNA分離,其意味著使用根邊緣細(xì)胞DNA提 取物每一個(gè)幼苗可以進(jìn)行總數(shù)為800個(gè)的實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)已經(jīng)作為根邊緣細(xì)胞DNA來源的萌芽種子儲(chǔ)存在4°C時(shí),黃瓜 幼苗保持生命力至少3周。這意味著在DNA分析完成后,幼苗有充足 水平的活力以轉(zhuǎn)移到溫室。
因此,只有擁有期望分子標(biāo)記值的植物需要轉(zhuǎn)移到溫室,而其他 沒有期望分子標(biāo)記值的植物可以在非常早的體外時(shí)期拋棄。這可以導(dǎo) 致相當(dāng)多的成本節(jié)約。
實(shí)施例2
源自于甜瓜的根邊緣細(xì)胞的DNA提取和分析
被稱為Danubio的雜交品種的自交后代的種子在26°C, 100|iil水
中(milliQ)萌芽。用于從甜瓜分離DNA的方法與本申請的實(shí)施例1 中針對黃瓜的所述的方法相當(dāng)。圖4展示了在包含甜瓜幼苗的液體培 養(yǎng)基中的根邊緣細(xì)胞的存在。
為了研究該方法是否產(chǎn)生足夠的DNA以用PCR檢測標(biāo)記等位基因, 用5pl的DNA提取物進(jìn)行使用特異針對標(biāo)記等位基因mlllkl9的引物 組合的PCR反應(yīng)。該P(yáng)CR反應(yīng)預(yù)期產(chǎn)生一個(gè)342bp的片段。這一分析 的結(jié)果在圖5中展示。
展示在圖5的結(jié)果證明獲得了足夠的DNA以通過PCR產(chǎn)生期望的 DNA片段。為了證明該片段確實(shí)時(shí)來源于胚,進(jìn)行了基于熒光的 mlllkl9實(shí)驗(yàn),其檢測初始雜種中存在的并預(yù)期在該分析所用的種子 中分離的兩個(gè)等位基因。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖6中展示。
該結(jié)果清楚地證明標(biāo)記等位基因mlllkl9的分離成為三種情況 純合型A ( FAM信號(hào)),純合型B ( RED信號(hào))和雜合型,其表明DNA 是胚來源的。
實(shí)施例3
源自于番茄根邊緣細(xì)胞的DNA提取和分析
番茄種子在26'C, 50^1水中(milliQ)萌芽,當(dāng)暴露的根有平均 1. Ocm長度時(shí),根據(jù)本申請的實(shí)施例1提取DNA。如圖7所示,用光學(xué) 顯微鏡的分析清楚地展示了在液體培養(yǎng)基中番茄的根邊緣細(xì)胞的存在。
用特異針對稱為側(cè)生抑制因子的番茄已知基因的引物組合,用 DNA總量的5pl進(jìn)行PCR反應(yīng),預(yù)期其產(chǎn)生360bp的條帶。該實(shí)驗(yàn)結(jié)
果在如圖8展示。
該結(jié)果清楚地證明了用該方法分離的DNA數(shù)量足以產(chǎn)生能在瓊脂 糖膠上檢測的期望分子量的PCR片段。需要注意的是,在那些沒有觀 察到條帶的情況中(圖8中用星號(hào)標(biāo)記的通道),種子沒有萌芽。這 表明用該方法對PCR片段的檢測依賴于種子的萌芽。
實(shí)施例4
源自于野甘藍(lán)根邊緣細(xì)胞的DNA提取和分析
用源自于蕓苔的萌芽種子實(shí)施了一個(gè)實(shí)驗(yàn)。所用的方法與實(shí)施例
l中所述的方法相當(dāng)。萌芽溫度是2TC。圖9展示了在野甘藍(lán)幼苗根 尖的根邊緣細(xì)胞。
為了證明從根邊緣細(xì)胞獲得的DNA提取物能被用于檢測存在于細(xì) 胞核中的核酸,設(shè)計(jì)了一個(gè)引物組合,其能擴(kuò)增涉及乙烯生物合成的, 稱為BoAC02的基因的片段。
預(yù)期PCR反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)344bp的片段。該分析的結(jié)果在圖10中展示。
如圖IO所示的結(jié)果證明獲得了足夠的DNA以通過PCR產(chǎn)生期望的 細(xì)胞核DNA片段。
進(jìn)行了另一個(gè)實(shí)驗(yàn)以證明除了細(xì)胞核序列外,存在于細(xì)胞質(zhì)基因 組的序列可以在根邊緣細(xì)胞起源的DNA中被檢測。進(jìn)行了一個(gè)PCR反 應(yīng),其擴(kuò)增了位于線粒體基因組中的0RF B基因區(qū)域。0RF B區(qū)域的 片段有1180bp的期望分子量。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖11中給出。
該結(jié)果展示了產(chǎn)生的特異針對0RF B基因區(qū)域的條帶并且證明細(xì) 胞質(zhì)DNA序列可以用所述的DNA分離方法檢測。
實(shí)施例5
源自于萵苣根邊緣細(xì)胞的DNA提取和分析
萵苣種子在21'C, 50|nl水中(milliQ)萌芽。根露出在2天內(nèi)發(fā) 生且通過溫和振動(dòng)根邊緣細(xì)胞從根部脫離。通過光學(xué)顯微鏡顯現(xiàn)的萵 苣的根邊緣細(xì)胞在圖12中展示。
在當(dāng)根部有約1.5cm的平均長度時(shí)的階段進(jìn)行DNA提取。所用的
DM提取方法與實(shí)施例1中所述的針對黃瓜的方法類似。為了評(píng)價(jià)是 否獲得充足的DNA,用稱為NAS2的與Nasonovia抗性基因連鎖的基因 組標(biāo)記進(jìn)行PCR反應(yīng)。該結(jié)果在圖13中給出。
該結(jié)果展示了當(dāng)在PCR反應(yīng)中用了 5^1獲得的DNA提取物時(shí),生 成的針對所用分子標(biāo)記的期望分子量的特異條帶。推斷出根據(jù)本發(fā)明 的DNA分離方法滿足進(jìn)行DNA分析如PCR的需要。
圖13所示的結(jié)果證明獲得足夠的DNA以通過PCR產(chǎn)生期望的DM片段。為了證明該片段確實(shí)是胚來源的,進(jìn)行了基于熒光的NAS2測定, 其檢測出現(xiàn)在初始雜種中的NAS2的兩個(gè)等位基因并且預(yù)期其在該分 析所用的種子中分離。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖14中展示。
該結(jié)果清楚地證明標(biāo)記等位基因NAS2的分離為3種情況純合型 A (FAM信號(hào)),純合型B (RED信號(hào))雜合型,其表明DNA是胚來源 的。
實(shí)施例6
來源于根分泌液的DNA存在于具有DNase抗性的組分中。
為了證明根據(jù)由本發(fā)明所述的方法從根部分泌液獲得的DNA來源 于根邊緣細(xì)胞,實(shí)施了 DNase敏感性實(shí)驗(yàn)。
根邊緣細(xì)胞由如實(shí)施例1所述的黃瓜幼苗產(chǎn)生并且通過使用針對 標(biāo)記基因座koifl24的引物組合的PCR分析DNA。在進(jìn)行DM提取之前 用DNase處理根部分泌液。如果DNA存在于根部分泌液中,如此它將 會(huì)被DNase降解。如果DNA存在于根邊緣細(xì)胞中,DNase將不會(huì)對DNA 提取后的PCR信號(hào)的產(chǎn)生有影響。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖15中展示。該結(jié)果表明外源加入的源自于萵苣 的DNA當(dāng),皮加入到黃瓜才艮部分泌液時(shí)對DNase的處理是敏感的,然而 黃瓜DNA的PCR信號(hào)沒有由于DNase處理而消失。這證明黃瓜根部分 泌液包含黃瓜DNA,其受到保護(hù)不受加入的DNase影響并且因此源自 于存在于分泌液中的根邊緣細(xì)胞。
實(shí)施例7
用源自于體外成年植物的根部分泌液的DM提取 在體外,通過把植物從體外培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到允許它產(chǎn)生根邊緣細(xì)胞 的包含巨孔板(macrowell)的水中,取黃瓜的帶根的芽用于分析。如圖 16所示,在26。C溫育24小時(shí)后,形成的根邊緣細(xì)胞通過光學(xué)顯微鏡 時(shí)清楚可見的。
在收集根邊緣細(xì)胞的階段,提取DNA并用特異針對標(biāo)記基因座 kom24的PCR分析。如圖17所示,用源自于根邊緣細(xì)胞的DNA提取物 獲得了診斷黃瓜基因組DNA存在的清晰的條帶。
圖H所示的結(jié)果證明獲得了足夠的DNA以通過PCR產(chǎn)生期望的 DNA片段,因此可以推斷基于根邊緣細(xì)胞的DNA分離技術(shù)是可以應(yīng)用 于來源于體外成年植物的不定根的分泌液。
實(shí)施例8
源自于胡椒根邊緣細(xì)胞的DNA提取與分析
胡椒種子在26°C, 40nl水中(milliQ)萌芽,當(dāng)露出的根有平均 l.Ocm長度時(shí),根據(jù)本申請的實(shí)施例1提取DM。如圖18所示,通過 光學(xué)顯微鏡的觀察清楚地展示了培養(yǎng)基中胡椒根邊緣細(xì)胞的存在。
用GMS-特異的熒光探針組(Invader )分析DNA標(biāo)本,其針對任 一個(gè)GMS等位基因(FAM或RED)產(chǎn)生一個(gè)特異的熒光信號(hào)(表達(dá)為凈 net Fold Over Zero或net F0Z,即凈Fold Over Zero或凈F0Z)。 在本實(shí)施例中,對已知的GMS標(biāo)記等位基因一致雜合的Fl代雜合種子 進(jìn)行分析。因此預(yù)期的是根據(jù)本發(fā)明從用GMS探針分析的Fl代雜交種 群的個(gè)體中獲得的DM標(biāo)本將會(huì)產(chǎn)生診斷標(biāo)記等位基因雜合體型的熒 光信號(hào)(標(biāo)繪在對角線上,RED + FAM信號(hào))。分析的結(jié)果在圖19中 展示。
用基于熒光的種群分析獲得的GMS基因分型值被發(fā)現(xiàn)是與被分析 的每一株植物的標(biāo)記基因座的已知的表型值一致的。因此,該結(jié)果證 明根據(jù)本發(fā)明的方法分離的DNA的數(shù)量足以進(jìn)行利用基于熒光的探針 系統(tǒng)作為檢測平臺(tái)的DNA標(biāo)記分析。
實(shí)施例9
玉米根邊緣細(xì)胞的形成
玉米種子在21。C, 500ja1水中(milHQ)萌芽,當(dāng)露出的根有平均 2.0cm的長度時(shí),通過光學(xué)顯微鏡的觀察清楚地展示了培養(yǎng)基中玉米 根邊緣細(xì)胞的存在,如圖20所示。
在該階段收集根邊緣細(xì)胞,提取DNA并用特異針對細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶 (Incwl,登記號(hào)AF050129)的PCR進(jìn)行分析。如圖21所示,用源自 于根邊緣細(xì)胞的DNA提取物獲得了診斷玉米基因組DNA存在的6卩0bp 的清晰條帶。
實(shí)施例10
苣荬菜根邊緣細(xì)胞的形成
荬菜苣種子在21'C, 40pl水中(milliQ)萌芽,當(dāng)露出的根有平 均l.Ocm的長度時(shí),通過光學(xué)顯微鏡的觀察清楚地展示了培養(yǎng)基中苦 苣根邊緣細(xì)胞的存在,如圖22所示。
實(shí)施例11
胡蘿卜根邊緣細(xì)胞的形成
胡蘿卜種子在21。C, 40pl水中(railliQ)萌芽,當(dāng)露出的根有平均 1. Ocm的長度時(shí),通過光學(xué)顯微鏡的觀察清楚地展示了培養(yǎng)基中胡蘿卜 根邊緣細(xì)胞的存在,如圖23所示。
權(quán)利要求
1、一種用于從植物獲得DNA的方法包括:a)從生長的根收集根邊緣細(xì)胞;和b)從根邊緣細(xì)胞提取DNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中根邊緣細(xì)胞是包含在生長的根的 根分泌液中。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法,其中根是生長在培養(yǎng)基中。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中培養(yǎng)基是水。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)基。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中培養(yǎng)基是土壤。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其中根是萌芽種子的一部分。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1 - 6中任一項(xiàng)的方法,其中根是幼苗的根。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其中根是組織培養(yǎng)植物或植物部分的不定根。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中種子是萌芽到胚根或根尖出現(xiàn)為止的。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1 - 10中任一項(xiàng)的方法,其中根邊緣細(xì)胞是從 已經(jīng)出現(xiàn)1至2cra的根收集的。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1 - 11中任一項(xiàng)的方法在源自于成批M2突變體 植物種群的遺傳變異的檢測中的應(yīng)用。
13、 根據(jù)權(quán)利要求l-ll中任一項(xiàng)的方法在源自于成批自然植物 種群的遺傳變異的檢測中的應(yīng)用。
14、 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法在培育種群中的遺傳變 異的檢測中的應(yīng)用。
15、 根據(jù)權(quán)利要求l - ll中任一項(xiàng)的方法在商業(yè)種子批次中的遺傳 變異的檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于從植物獲得DNA的方法,包括從生長的根收集根邊緣細(xì)胞;和從根邊緣細(xì)胞提取DNA。根邊緣細(xì)胞包含在生長的根的根分泌液中,所述的根生長在培養(yǎng)基中,如水,組織培養(yǎng)培養(yǎng)基或土壤。適宜地,根是萌芽種子的一部分,或幼苗的根或組織培養(yǎng)植物或植物局部的不定根。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101384717SQ200780005500
公開日2009年3月11日 申請日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者C·M·P·梵鄧恩 申請人:瑞克斯旺種苗集團(tuán)公司