專利名稱：：革蘭陰性需氧菌鑒定板及其制備方法革蘭陰性需氧菌鑒定板及其制備方法僅小'狄喂本發(fā)明涉及生物制劑。具體涉及一種革蘭陰性需氧菌鑒定板及其制備方法。
背景技術(shù)：
：近20年來(lái)，由于臨床上廣泛大量地使用種類繁多的抗菌藥物，細(xì)菌的耐藥性越來(lái)越普遍，有的細(xì)菌可同時(shí)耐2-7種藥物，耐藥菌株的廣泛傳播給臨床治療帶來(lái)很大困難，特別是對(duì)于醫(yī)院內(nèi)感染的細(xì)菌。醫(yī)院內(nèi)感染的特點(diǎn)在于是出現(xiàn)在醫(yī)院環(huán)境中的感染，并發(fā)生流行，故又可將其稱為醫(yī)院獲得性感染(Hospitalacquiredinfection)。雖然發(fā)生醫(yī)院感染的病情有輕有重，但都給病人增加了額外的痛苦、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和不幸，同時(shí)也會(huì)由于延長(zhǎng)住院時(shí)間而加重醫(yī)療和護(hù)理工作的負(fù)擔(dān)，影響病床周轉(zhuǎn)。嚴(yán)重的醫(yī)院感染往往使病人所患的疾病不能達(dá)到預(yù)期的療效，甚至產(chǎn)生難以治療的后遺癥或死亡。據(jù)美國(guó)的一次不完全統(tǒng)計(jì)資料報(bào)告，其住院病人中約有5%發(fā)生醫(yī)院感染，平均延長(zhǎng)住院45d，每年約有10萬(wàn)人死亡于醫(yī)院感染，估計(jì)每年由于醫(yī)院感染要多消耗20余億美元。從引起醫(yī)院感染的微生物來(lái)看，固然有些仍是我們所熟悉的致病性很強(qiáng)的微生物，但是近年來(lái)醫(yī)院感染的病原體種類有明顯變化的趨勢(shì)，革蘭氏陰性菌已取代了原來(lái)為主要病原的革蘭氏陽(yáng)性球菌，其中腸桿菌科及假單胞菌約占醫(yī)院感染的60%-65%，并且主要為多耐藥性細(xì)菌。由于廣泛地應(yīng)用抗生素，細(xì)菌的不斷變遷，助長(zhǎng)了醫(yī)院內(nèi)感染的存在和發(fā)展，今日的臨床微生物學(xué)最重要的特點(diǎn)是向醫(yī)院感染方面轉(zhuǎn)變。微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)是主要應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室的高科技體外診斷產(chǎn)品，對(duì)輔助臨床各科室診斷治療具有重要意義。目前在國(guó)際上，對(duì)細(xì)菌的快速鑒定和藥敏分析巳經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，微生物自動(dòng)化檢測(cè)產(chǎn)品逐步替代了手工檢測(cè)，而國(guó)內(nèi)的同類研究尚處在探索階段。目前，國(guó)際上同類產(chǎn)品主要有法國(guó)生物-梅里埃公司的VITEK-AMS微生物分析系統(tǒng)、美國(guó)Dade-MicroScan公司的MicroScan自動(dòng)微生物鑒定和藥敏測(cè)試系統(tǒng)以及英國(guó)TrekDiagnosticSystemLtd.的SENSTITRE熒光法快速微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)。它們的工作原理相近，主要是根據(jù)細(xì)菌理化性質(zhì)的差異，采用光電比色，測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)分解底物導(dǎo)致PH值改變而產(chǎn)生的不同顏色和濁度變化來(lái)判斷反應(yīng)情況，從而給出鑒定藥敏結(jié)果。國(guó)內(nèi)也有少數(shù)廠家正在研究開(kāi)發(fā)類似產(chǎn)品，如湖南天地人的微生物系統(tǒng)等。但是由于此類項(xiàng)目技術(shù)含量較高，資金投入大，尤其是菌庫(kù)的積累耗時(shí)耗力，所以目前國(guó)內(nèi)類似產(chǎn)品還很不成熟。在臨床推廣上，微生物鑒定主要存在以下幾個(gè)方面的問(wèn)題(1)鑒定時(shí)間偏長(zhǎng)，需要16-24小時(shí)給出結(jié)果；(2)鑒定范圍比較狹窄，可以鑒定的細(xì)菌只有300余種。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)一種快速準(zhǔn)確革蘭陰性需氧菌鑒定板。本發(fā)明的鑒定檢測(cè)實(shí)驗(yàn)基于下列原理根據(jù)目前微生物鑒定領(lǐng)域權(quán)威的伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)，細(xì)菌的鑒定主要通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況，即通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌生化反應(yīng)特性來(lái)鑒定細(xì)菌。而細(xì)菌利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生生化反應(yīng)的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生一系列的氧化還原反應(yīng)，這些氧化還原反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生NADH，而NADH能夠把四唑紫(2，3，5-triphenyltcuazAJiiuiiii丄i/]曰/j、刀'jm乂LtC^tnj羊V!Kj王^r7又yv糸tTitnj^bJ眾生okuiHj仏們使用四唑紫作為細(xì)菌發(fā)生生化反應(yīng)的指示劑，來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的生化反應(yīng)特性，從而達(dá)到細(xì)菌鑒定的目的。不同細(xì)菌利用不同碳源或氮源進(jìn)入新陳代謝過(guò)程，而對(duì)其他一些碳源或氮源則無(wú)法利用，這些特性是細(xì)菌的遺傳物質(zhì)所決定的。目前現(xiàn)有的微生物鑒定板最多只有30個(gè)生化反應(yīng)，因此對(duì)于鑒定細(xì)菌的種類方面比較狹窄，可以鑒定的革蘭陰性菌種類最多只有200余種,且不同種類的細(xì)菌需要使用不同種類的板條進(jìn)行鑒定，同時(shí)需要通過(guò)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證才能得出鑒定結(jié)果，操作比較繁瑣。一方面為了克服上述不足之處，達(dá)到鑒定我們要求細(xì)菌的目的，需要選擇一組合適的碳源和氮源。因此本發(fā)明人選擇了500多種碳源和氮源，對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)對(duì)這些數(shù)據(jù)的分析整理,最終確定目前板條的碳源和氮源的組合(見(jiàn)下表)。該種鑒定板上的47個(gè)碳源和氮源組合可鑒定的革蘭陰性菌種類有300余種，可以鑒定陰性腸桿菌科、弧菌科、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、窄食單胞菌屬、陰性苛養(yǎng)菌等多種不同種類的細(xì)菌，且不需要進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)就可以得出鑒定結(jié)果，操作簡(jiǎn)單。革蘭陰性需氧菌鑒定板底物表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>所述肉湯培養(yǎng)基由下列成分組成(V/V)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</tabl本發(fā)明的另一目的是提供了革蘭陰性需氧菌鑒定板的制備方法。由于革蘭陰性需氧菌鑒定板可以鑒定不同種類的細(xì)菌，包括一些營(yíng)養(yǎng)成分要求比較高的苛養(yǎng)菌，因此必須有一種合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)滿足各種不同種類細(xì)菌生長(zhǎng)的需要。本發(fā)明人通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)對(duì)混合試劑中的成分組成進(jìn)行了選擇，研制發(fā)明了一種混合試劑，該混合試劑有多種細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合組成。1、實(shí)驗(yàn)方法選取無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)、氨基酸、磷酸緩沖液、維生素、蛋白胨、牛肉膏、麥芽膏等多種細(xì)菌生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按不同的組合方式和適當(dāng)?shù)谋壤旌吓渲贸稍噭?，然后選取不同種類的細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)，以確定合種組合方式可以滿足各種不同種類細(xì)菌的生長(zhǎng)。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)選取了大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、木糖氧化產(chǎn)堿桿菌、、腦膜炎奈瑟菌、副溶血弧菌、嗜血桿菌不同種類細(xì)菌加入不同混合試劑配置的鑒定板條中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下-<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)表明組合5的混合試劑可能滿足不同種類細(xì)菌生長(zhǎng)的需要，因此本發(fā)明人確定了混合試劑的組合方式，該混合試劑的各物質(zhì)按下列比例混合配置<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>本發(fā)明方法包括下列步驟1、配置鑒定板反應(yīng)底物原液根據(jù)下列配置濃度要求配置各反應(yīng)底物的原液(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、配置肉湯培養(yǎng)基(1)、下列各物質(zhì)的按比例混合配置GN/MT(革蘭陰性菌鹽貯液)(重量%濃度)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)、按下列物質(zhì)配置濃度要求配置GN(革蘭陰性)混合貯液(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(3)、根據(jù)下列配置濃度要求配置以下幾種物質(zhì)的水溶液(g/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>、按下列各物質(zhì)的比例混合配置肉湯培養(yǎng)基(V/V)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3、分裝(1)根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將合適的步驟1配置的反應(yīng)底物原液分裝到96支試管中。(2)根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將合適的步驟2配置的肉湯培養(yǎng)基加入到(1)的試管中。4、加樣分裝板條使用分裝系統(tǒng)在96孔的相應(yīng)位置對(duì)指定的鑒定板條加樣，每孔加50ul;5、板條干燥上述板條常溫干燥16-18小時(shí)；6、包裝7、板條存IC由于本發(fā)明鑒定板上的47個(gè)碳源和氮源組合可鑒定的革蘭陰性菌種類有300余種，可以鑒定陰性腸桿菌科、弧菌科、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、窄食單胞菌屬、陰性苛養(yǎng)菌等多種不同種類的細(xì)菌，且不需要進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)就可以得出鑒定結(jié)果，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，因而，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施例方式革蘭陰性需氧菌鑒定板，批量生產(chǎn)375塊產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝流程如下1、配置鑒定板反應(yīng)底物原液<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>硫酸銨[(NH4)2S04]8.456g十水合焦磷酸鈉[Na4P2O7-10H20]0.071g(2)、根據(jù)配置濃度要求配置GN混合貯液物質(zhì)名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)GN混合試劑250.18425(3)、根據(jù)配置濃度要求配置以下幾種水溶液物質(zhì)名稱純水本批所需量(ml)藥物本批所需量(g)0.5mM葉酸100.0022結(jié)晶紫750.6-0.825蛋白酶17.51.75-2.1酵母膏50.25(4)將下列各物質(zhì)混合配置肉湯培養(yǎng)基物質(zhì)名稱藥物本批所需量純水643.75mlGN/MT219.5mlGN混合C液21.95ml0.5mM葉酸水溶液8.75ml的蛋白酶水溶液14.625ml酵母膏水溶液1.025ml結(jié)晶紫水溶液70.25ml3、分裝(1)將配置的反應(yīng)底物原液分裝到相對(duì)應(yīng)的96支試管中，每管加入6.675ml。(2)將配置的肉湯培養(yǎng)基加入到96支試管中，每管加入8.95ml。4、加樣分裝板條將配置好的％根試管裝在加樣機(jī)上，使用加樣機(jī)對(duì)指定的鑒定板條加樣，每孔加50ul。(在這之前要先運(yùn)行分裝系統(tǒng)；整個(gè)程序大約需要3個(gè)小時(shí))。5、板條干燥將加樣好的板條放入干燥間進(jìn)行常溫干燥，24小時(shí)后板條可干燥完畢。6、板條包裝'將干燥好的板條從干燥間經(jīng)傳遞窗送到包裝間進(jìn)行包裝。7、板條存貯包裝完畢的板條放入2-8'C冰箱進(jìn)行保存。19權(quán)利要求1、一種革蘭陰性需氧菌鑒定板，其特征在于該鑒定板由反應(yīng)底物原液和肉湯培養(yǎng)基組成，所述反應(yīng)底物原液在鑒定板上的位置及其各成分的濃度為g/ml位置溶液名稱濃度A1，A7水100％A2，A8吐溫806％A3，A9N-乙?；?D-半乳糖胺2％A4，A10L-樹(shù)膠醛糖4％A5，A11D-阿糖醇4％A6，A12D-纖維二糖4％B1，B7D-果糖8％B2，B8D-半乳糖4％B3，B9α-D-葡萄糖10％B4，B10甘油2％B5，B11α-D-乳糖4％B6，B12麥芽糖4％C1，C7D-甘露醇8％C2，C8D-蜜二糖4％C3，C9β-甲基-D-配糖物4％C4，C10D-阿洛酮糖4％C5，C11D-棉子糖4％C6，C12D-山梨糖醇4％D1，D7蔗糖4％D2，D8松二糖4％D3，D9丙酮酸甲基脂4％D4，D10單甲基琥珀酸4％D5，D11順式烏頭酸2％D6，D12二水合檸檬酸三鈉2％E1，E7蟻酸鈉2％E2，E82％DL-α-羥基丁酸鈉2％E3，E9DL-β-羥基丁酸鈉2％E4，E10γ-羥基丁酸鈉2％E5，E112％P-羥基苯乙酸2％E6，E12D，L-乳酸鈉2％F1，F(xiàn)7丙二酸2％F2，F(xiàn)8D-砂糖酸2％F3，F(xiàn)9L-丙氨酸氨基鹽酸鹽4％F4，F(xiàn)10L-丙胺酸2％F5，F(xiàn)11L-丙氨酰甘氨酸2％F6，F(xiàn)12L-天冬酰胺酸4％G1，G7L-谷氨酸鈉4％G2，G8L-組氨酸鹽酸鹽2％G3，G9羥基-L-脯氨酸2％G4，G10L-亮氨酸3％G5，G11L-焦谷氨酸2％G6，G12D-絲氨酸2％H1，H7γ-氨基丁酸2％H2，H8肌苷2％H3，H9胸腺嘧啶脫氧核苷2％H4，H10腐胺二鹽酸鹽2％H5，H11D，L-α-甘油磷酸二鈉2％H6，H12α-D-葡萄糖-1-磷酸鹽2％所述肉湯培養(yǎng)基由下列成分組成v/v物質(zhì)名稱所占比例純水65.8％GN/MT22.4％GN混合貯液2.24％0.5mM葉酸水溶液0.89％10％-12％蛋白酶水溶液1.49％5％酵母膏水溶液0.1％0.8％-1.1％結(jié)晶紫水溶液7.17％。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述一種革蘭陰性需氧菌鑒定板，其特征在于所述肉湯培養(yǎng)基中的GN/MT由下列成分組成重量％濃度物質(zhì)名稱所占比例純水[1120]61.082%二水合磷酸二氫鈉[NaH2P04-2H20]10.6%磷酸氫二鈉[Na2HP04]18.7%氯化鉀[KC1]7.5%硫酸銨[(NH4)2S04]2.1%十水合焦磷酸鈉[Na4P2O7-10H20]0.018%。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述一種革蘭陰性需氧菌鑒定板，其特征在于所述肉湯培養(yǎng)基中的GN混合貯液由下列成分組成的GN混合試劑加水配置而成重量％濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>4、根據(jù)權(quán)利要求1所述一種革蘭陰性需氧菌鑒定板，其特征在于所述革蘭陰性需氧菌鑒定板的底物及其在鑒定板上的位置為:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>5、一種革蘭陰性需氧菌鑒定板的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟:(1)配置鑒定板反應(yīng)底物原液根據(jù)下列配置濃度要求配置各反應(yīng)底物的原液g/ml位置溶液名稱濃度Al,A7水100%A2,A8吐溫806%A3,A9N-乙?；?D-半乳糖胺2%A4，A10L-樹(shù)膠醛糖4%A5，AllD-阿糖醇4%A6，A12D-纖維二糖4%Bl，B7D-果糖8%B2，B8D-半乳糖4%B3，B9a-D-葡萄糖10%B4，B10甘油2%B5，Blla-D-乳糖4%B6，B12麥芽糖4%Cl，C7D-甘露醇8%C2，C8D-蜜二糖4%C3，C9e-甲基-d-配糖物4%C4，C10D-阿洛酮糖4%C5，CllD-棉子糖4%C6，C12D-山梨糖醇4%Dl，D7蔗糖4%D2,D8松二糖4%D3，D9丙酮酸甲基脂4%D4，D10單甲基琥珀酸4%D5，Dll順式烏頭酸2%D6,D12二水合檸檬酸三鈉2%El,E7蟻酸鈉2%E2，E82呢DL-a-羥基丁酸鈉2%E3，E9DL-e-羥基丁酸鈉2%E4,E10Y-羥基丁酸鈉—2%E5，Ell2%P-羥基苯乙酸2%E6，E12D，L-乳酸鈉2%Fl，F(xiàn)7丙二酸2%F2，F(xiàn)8D-砂糖酸2%F3，F(xiàn)9L-丙氨酸氨基鹽酸鹽4%F4，F(xiàn)10L-丙胺酸2%<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>,0.8°/。-1.1°/。的結(jié)晶紫7.17%;(3)分裝①根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將合適的步驟1配置的反應(yīng)底物原液分裝到96支試管中；②根據(jù)板條批量生產(chǎn)的數(shù)量要求將合適的步驟2配置的肉湯培養(yǎng)基加入到①的試管中；(4)加樣分裝板條使用分裝系統(tǒng)在96孔的相應(yīng)位置對(duì)指定的鑒定板條加樣，每孔加50ul;(5)板條干燥上述板條常溫干燥16-18小時(shí)；(6)包裝(7)板條存貯。全文摘要本發(fā)明提供了革蘭陰性需氧菌鑒定板。本發(fā)明鑒定板上的47個(gè)碳源和氮源組合可鑒定的革蘭陰性菌種類有300余種，可以鑒定陰性腸桿菌科、弧菌科、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、窄食單胞菌屬、陰性苛養(yǎng)菌等多種不同種類的細(xì)菌，且不需要進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)就可以得出鑒定結(jié)果，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，因而，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明提供了革蘭陰性需氧菌鑒定板的制備方法。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101469341SQ20071017306公開(kāi)日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者朱駿娜,鄒艷芳,陳弛宇申請(qǐng)人:上海復(fù)星佰珞生物技術(shù)有限公司;上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司