專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼人表皮生長(zhǎng)因子2/neu抗原的合成基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及癌癥的治療。更具體地，本發(fā)明涉及編碼人腫瘤 相關(guān)多肽表皮生長(zhǎng)因子2/neu抗原的合成多核苷酸(文中命名為 hHER2.opt),其中所述多核苷酸經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以在人類(lèi)細(xì)胞環(huán)境 中表達(dá)。本發(fā)明也涉及編碼截短形式的HER2/neu抗原的合成多核苷酸 (文中命名為hHER2ECDTM. opt )，其中所述多核苷酸經(jīng)密碼子最優(yōu) 化，以在人類(lèi)細(xì)胞環(huán)境中表達(dá)。本發(fā)明還涉及包含所述合成多核苷酸 的重組載體和宿主。本發(fā)明也提供了攜帶hHER2.opt的腺病毒載體和 質(zhì)粒構(gòu)建體，以及它們?cè)谟糜陬A(yù)防和治療癌癥的疫苗和藥物組合物中 的用途。
背景技術(shù)：
表皮生長(zhǎng)因子2是由HER2/neu原癌基因編碼的跨膜腫瘤相關(guān)抗原 (也稱(chēng)之為c-erbB-2)，它是細(xì)胞表面受體表皮生長(zhǎng)因子家族的一個(gè) 成員。HER2 基因最初是從大鼠神經(jīng)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 (neuroglioblastoma)中分離的(Shih等，Nature 290: 261-264 (1981))，而后來(lái)從人類(lèi)細(xì)胞中克隆并表征(Coussens等，Science 230: 1132-39 (1985); King等，Science 229: 974-76 (1985))。
HER2/neu被進(jìn)一步歸類(lèi)為受體酪氨酸激酶HER家族的成員，其由 參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的四個(gè)受體組成。HER受體通過(guò)作為二聚體結(jié)合生 長(zhǎng)因子配體而有助于維持正常的細(xì)胞生長(zhǎng)。具體地，人HER2與EGFR 家族的其它成員(HER1、HER3和HER4)形成雜二聚體(Klapper等，Adv Cancer Res 77: 25-79 (2000))。繼hHER2 二聚化和酪氨酸自身磷酸 化之后，產(chǎn)生了胞漿信號(hào)傳導(dǎo)分子的停泊位點(diǎn)，并發(fā)動(dòng)了第二信號(hào)傳 導(dǎo)分子的募集。從而發(fā)動(dòng)了胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，其最終導(dǎo)致了細(xì)胞生 長(zhǎng)中重，的基因的激活。 、
HER2/neu轉(zhuǎn)錄本及所編碼的185 kD蛋白，所述組織包括皮膚和乳房， 以及胃腸組織、生殖組織和泌尿道組織(Press等，Oncogene 5:953-962 (1990))。胚胎發(fā)育期間在相應(yīng)的胎兒組織中也檢測(cè)到較高水 平的HER2/neu表達(dá)(Press等，同前)。
若干觀(guān)測(cè)結(jié)果使得HER2抗原成為吸引人的主動(dòng)特異性免疫療法的 靶。首先，HER2/neu基因在多種惡性腫瘤中是普遍超表達(dá)或擴(kuò)增的， 如乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、結(jié)腸癌和前列腺癌，以及肺腺癌(綜述于 Disis和Cheever， Adv. Cancer Research 71: 343-371 (1997)中)。 HER2/neu的超表達(dá)與癌癥患者差的預(yù)后和較高的復(fù)發(fā)率有關(guān)(Slamon 等，Science 244: 707-712 (1989))。人HER2的擴(kuò)增導(dǎo)致MAP激酶 活性和細(xì)胞增殖增強(qiáng)，并促成了腫瘤細(xì)胞的攻擊性行為(Ben-Levy等 Embo J 13 (14): 3302-11 (1994))。在腫瘤中觀(guān)察到的高表達(dá)水平的 HER2和與正常成人組織相關(guān)的低水平形成直接的對(duì)照。
另外，許多患有與HER2/neu超表達(dá)相關(guān)的惡性腫瘤的癌癥患者業(yè) 已具有針對(duì)HER2蛋白的免疫應(yīng)答。業(yè)已從乳腺癌和卵巢癌患者中分離 到抗一hHER2細(xì)胞毒性T、淋巴細(xì)胞(CTL) (Ioannides等Cell Immunol 151 (1): 225-34 (1993); Peoples等Proc Natl Acad Sci U S A 92 (14): 6547-51 (1995))。業(yè)已闡釋了若干HLA-A2. l-相關(guān)hHER2肽， 并且能夠在體外產(chǎn)生肽特異性的T細(xì)胞(Fisk等，Cancer Res 57(1): 8-93 (1997); Yoshino等，Cancer Res 54 (13): 3387-90 (1994); Lustgarten等，Hum Immunol 52 (2): 109-18 (1997))。
上述發(fā)現(xiàn)證明癌癥患者中抗-ErbB-2免疫效應(yīng)器機(jī)制#:激活，因而 突顯了增強(qiáng)此類(lèi)免疫反應(yīng)性的潛在益處。利用針對(duì)HER2/neu的免疫應(yīng) 答的有效疫苗必須既能將這種免疫性提高到保護(hù)和/或預(yù)防水平，又能 克服自身耐受。
基于以上的敘述，HER2/neu業(yè)已作為開(kāi)發(fā)惡性腫瘤免疫學(xué)治療的 靶而為人們所追隨?？?HER2單克隆抗體業(yè)已作為乳腺癌的療法而被研 究，其中每一抗體途徑都證明了不同水平的成功(討論見(jiàn)Yarden， Oncology 61(suppl 2): 1-13 (2001))。
另夕卜，業(yè)已報(bào)道了基于DNA和肽的HER2/neu靶向疫苗。Amici等(美 國(guó)專(zhuān)利No. 6, 127， 344)公開(kāi)了通過(guò)施用表達(dá)載體誘導(dǎo)針對(duì)HER2/neu 的免疫性的方法，所述表達(dá)載體包含功能性地連接于人巨細(xì)胞病毒啟 動(dòng)子的全長(zhǎng)人HER2/neu cDNA。 Morris等(W0 2004/041065)公開(kāi)了用 樹(shù)突細(xì)胞接種的方法，所述樹(shù)突細(xì)胞由表達(dá)非信號(hào)傳導(dǎo)HER2/neu基因
的腺病毒載體修飾過(guò)。Cheever和Disis公開(kāi)了用HER2肽免疫人抗 HER2/neu相關(guān)的癌癥的方法(美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 846, 538)。另外，業(yè)已 在嚙齒動(dòng)物模型中研究了基于HER2/neu肽的疫苗(綜述見(jiàn)Disis和 Cheever， Adv. Cancer Res. 71:343-71 (1997))。
許多疫苗的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化受到了與在成功轉(zhuǎn)化的宿主生物中獲得 高表達(dá)水平的外源基因相關(guān)的困難的阻礙。因此，盡管已鑒定了編碼 上文所述hHER2蛋白的野生型核苷酸序列，但仍然非常需要開(kāi)發(fā)人 HER2蛋白容易的可再生來(lái)源，該來(lái)源利用經(jīng)最優(yōu)化以便在目的宿主細(xì) 胞中表達(dá)的編碼hHER2的核苷酸序列，所述來(lái)源允許開(kāi)發(fā)有效且不受 自身耐受阻礙的癌癥疫苗。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及引發(fā)或增強(qiáng)針對(duì)由人HER2基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物的免疫 性的組合物和方法，該基因與眾多的腺癌相關(guān)，包括乳腺癌和卵巢癌。 具體地，本發(fā)明提供了編碼人HER2蛋白或截短形式的人HER2蛋白的 多核苷酸，所述截短形式的HER2蛋白包含HER2蛋白的胞外及跨膜結(jié) 構(gòu)域(下文記做hHER2ECDTM)，其中所述多核苷酸經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以 高水平地在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明還提供了包含所述合成多核苷酸 的基于腺病毒和質(zhì)粒的載體，并公開(kāi)了所述載體在用于預(yù)防和/或治療 HER2相關(guān)癌癥的免疫原性組合物和疫苗中的用途。文中所述的多核苷 酸比野生型HER2能更有效地引發(fā)針對(duì)人HER2的細(xì)胞和體液免疫應(yīng) 答。
本發(fā)明也涉及合成核酸分子(多核苦酸)，其包含編碼如SEQ IDN0: 2中所示的人表皮生長(zhǎng)因子2抗原(下文記做hHER2)的核苷酸序列， 其中所述合成核酸分子經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表達(dá) (下文記做hHER2.opt)。本發(fā)明還涉及合成核酸分子(多核苦酸)， 其包含編碼如SEQ ID NO: 14中所示的人HER2ECDTM的核苷酸序列， 其中所述合成核酸分子經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表 達(dá)。可將本文公開(kāi)的核酸分子轉(zhuǎn)染到所選擇的宿主細(xì)胞中，其中所述 重組宿主細(xì)胞在大量水平上為表達(dá)的功能性hHER2蛋白(SEQ ID NO: 2) 或畫(huà)R2EC躍蛋白(SEQ ID N0:14)提供了來(lái)源。
本發(fā)明還涉及合成核酸分子，其編碼表達(dá)人HER2蛋白的mRNA。本 發(fā)明這部分優(yōu)選的方面公開(kāi)在

圖1中，該圖顯示了編碼HER2蛋白(SEQ ID N0:2)的DNA分子(SEQ ID NO: 1)。本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子經(jīng)密碼 子最優(yōu)化以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表達(dá)。這種優(yōu)選多核苷酸的序列也含 有廢除酪氨酸激酶活性的突變(AAA2257GCC， K753A)。不含此突變的 核苷酸序列也考慮在本發(fā)明之中。
本發(fā)明另外涉及合成核酸分子，其編碼表達(dá)人HER2ECDTM蛋白的 mRNA。本發(fā)明這部分優(yōu)選的方面公開(kāi)在圖6A中，該圖顯示了編碼 hHER2ECDTM蛋白(SEQ ID NO: 14)的DNA分子(SEQ ID NO: 9)。本發(fā)明 優(yōu)選的核酸分子經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表達(dá)。
本發(fā)明也涉及重組載體和重組宿主細(xì)胞，既包括原核的又包括真核 的，它們含有本說(shuō)明書(shū)從頭到尾所公開(kāi)的核酸分子。
本發(fā)明還涉及在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的人HER2蛋 白的方法，包括(a)將包含編碼人HER2蛋白的合成多核苷酸的載體 引入到合適的宿主細(xì)胞中，其中所述合成多核苷酸經(jīng)密碼子最優(yōu)化以 在人類(lèi)細(xì)胞中最佳表達(dá)；和(b)在允許表達(dá)所述人HER2蛋白的條件 下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的人 HER2ECDTM蛋白的方法，包括(a)將包含編碼人HER2ECDTM蛋白的
合成多核苷酸的載體引入到合適的宿主細(xì)胞中，其中所述合成多核苷 酸經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在人類(lèi)細(xì)胞中最佳表達(dá)；和(b)在允許表達(dá)所述 人HER2ECDTM蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面為預(yù)防或治療癌癥的方法，包括向哺乳動(dòng)物施用 這樣的疫苗載體，所述疫苗載體包含合成核酸分子，所述合成核酸分 子包含編碼如SEQ ID NO: 2中所示的人表皮生長(zhǎng)因子2抗原(hHER2 ) 蛋白或如SEQ ID NO: 14中所示的人HER2ECDTM蛋白的核苷酸序列， 其中所述合成核酸分子經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表 達(dá)。
本發(fā)明還涉及腺病毒疫苗載體，其包含這樣的腺病毒基因組，所述 腺病毒基因組在E1區(qū)具有缺失，且在El區(qū)中具有插入片段，其中所 述插入片段包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含(a)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編
碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地連 接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
本發(fā)明也涉及疫苗質(zhì)粒，其包含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒部分，所述表達(dá) 盒部分包含(a)編碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的合成多核苷 酸，其中所述合成多核苷酸經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以在人類(lèi)細(xì)胞中最佳表 達(dá)；和(b)可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的另一方面為保護(hù)哺乳動(dòng)物免患癌癥或治療患有HER2相關(guān) 癌癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括(a)向所述哺乳動(dòng)物引入笫一載體， 所述載體包含i)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM 蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子；(b) 允許經(jīng)過(guò)預(yù)定量的時(shí)間；和(c)向所述哺乳動(dòng)物引入第二載體，所述 載體包含i)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋 白的多核苷酸；和ii)可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
如整個(gè)說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所用的，單數(shù)形式的"一個(gè) (a)"、"一種(an)"和"所述(the)"包括復(fù)數(shù)含義，除非上下 文清楚地另有說(shuō)明。
如整個(gè)說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所用的，適用如下定義和縮寫(xiě)
術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"是指DNA鏈上RNA聚合酶與之結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)。啟 動(dòng)子與RM聚合酶形成起始復(fù)合物，以起始并驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性。所述復(fù) 合物可由稱(chēng)之為"增強(qiáng)子"的活化序列或稱(chēng)之為"沉默子"的抑制序 列修飾。
術(shù)語(yǔ)"盒"是指待由載體表達(dá)的核苷酸或基因序列，例如，所述核 苷酸或基因序列編碼HER2蛋白或HER2ECDTM蛋白。通常，將包含基因 序列的盒插入到載體中，所述載體在一些實(shí)施方案中提供表達(dá)所述核 苷酸或基因序列的調(diào)控序列。在其它實(shí)施方案中，所述核苷酸或基因 序列提供了用于其表達(dá)的調(diào)控序列。在另外的實(shí)施方案中，載體提供 了一些調(diào)控序列，而所述核苦酸或基因序列提供了其它調(diào)控序列。例 如，載體可提供用于轉(zhuǎn)錄所述核苷酸或基因序列的啟動(dòng)子，而所述核 苷酸或基因序列提供轉(zhuǎn)錄終止序列?？捎奢d體提供的調(diào)控序列包括， 但不限于增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、剪接受體和供體序列、內(nèi)含子、 核糖體結(jié)合序列和聚腺苷酸添加序列。所述盒在概念上類(lèi)似于盒式錄 音帶；每一個(gè)盒都有其自身的序列。因此通過(guò)互換盒，載體將會(huì)表達(dá) 不同的序列。由于5，和3，端的限制位點(diǎn)，盒能夠被容易地插入、除去 或?yàn)榱硪缓兴鎿Q。
術(shù)語(yǔ)"載體"是指可通過(guò)其將DNA片段引入到宿主生物或宿主組織
中的某些工具。存在多種類(lèi)型的載體，包括質(zhì)粒、病毒(包括腺病毒)、 噬菌體和粘粒。
就腺病毒載體所用的術(shù)語(yǔ)"第一代，，形容所述腺病毒載體是復(fù)制缺 陷型的。第一代腺病毒載體一般具有缺失或失活的E1基因區(qū)，并且優(yōu) 選具有缺失或失活的E3基因區(qū)。
名稱(chēng)"pVlJ-hHER2. opt"是指文中公開(kāi)的質(zhì)粒構(gòu)建體，其包含具有 內(nèi)含子A的人CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子、經(jīng)密碼子最優(yōu)化的全長(zhǎng)人 HER2基因、源于牛生長(zhǎng)激素的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列、以及最小 pUC主鏈(見(jiàn)實(shí)施例2)。
名稱(chēng)"pVlJ-hHER2ECDTM. opt"是指文中公開(kāi)的質(zhì)粒構(gòu)建體，其包含 具有內(nèi)含子A的人CMV立即早期(IE)啟動(dòng)子、經(jīng)密碼子最優(yōu)化的包含 HER2基因胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的截短型人HER2基因、源于牛生長(zhǎng)激素 的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列、以及最小pUC主鏈(見(jiàn)實(shí)施例2)。
名稱(chēng)"pVlJ-hHER2.wt"是指如上文所述的構(gòu)建體，只是除了所述構(gòu) 建體包含野生型全長(zhǎng)人HER2基因而非經(jīng)密碼子最優(yōu)化的人HER2基 因。
名稱(chēng)"pVlJ-hHER2ECDTM.wt"是指如上文所述的構(gòu)建體，只是除了 所述構(gòu)建體包含野生型截短的人HER2基因，其中所述截短的基因包含 編碼HER2蛋白胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，而不是經(jīng)密碼子最優(yōu) 化的全長(zhǎng)人HER2基因。
名稱(chēng)"MRKAd5-hHER2. opt，，、'窗Ad5-hHER2ECDTM. opt，，和 "MRKAd5-hHER2. wt"是指文中公開(kāi)的三種構(gòu)建體，它們包含缺失El和 E3區(qū)的Ad5腺病毒基因組。在所述"MRKAd5-hHER2. opt"構(gòu)建體中，El 區(qū)被替換為與El處于平行方向的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的全長(zhǎng)人HER2基 因，所述基因處于無(wú)內(nèi)含子A的人CMV啟動(dòng)子的控制之下，接下來(lái)是 牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)。所述"MRKAd5-hHER2ECDTM. opt"構(gòu)建體 基本上如上所述，只是除了 Ad5基因組El區(qū)被替換為經(jīng)密碼子最優(yōu)化 的截短形式的人HER2基因之外，所述截短型HER2基因包含編碼HER2 受體胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。所述"MRKAd5-hHER2. wt"構(gòu)建體
基本上如上所述，只是除了 Ad5基因組El區(qū)被替換為野生型全長(zhǎng)人 HER2序列之外(見(jiàn)實(shí)施例11)。
術(shù)語(yǔ)"有效量，，是指引入足夠的疫苗組合物，以產(chǎn)生足夠水平的多 肽，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到這種水平是可變的。
術(shù)語(yǔ)"治療，，既指治療性治療又指預(yù)防性或防范性措施。需要治療 的那些包括已經(jīng)患有紊亂的以及傾向患有有所述紊亂的或有待預(yù)防所 述紊亂的那些。
"紊亂，，是任何將得益于文中所述方法或疫苗和免疫原性組合物治 療的狀況。該術(shù)語(yǔ)包括慢性和急性紊亂或疾病，包括使得哺乳動(dòng)物易 患所研究紊亂的那些病理狀況。本發(fā)明的方法和疫苗旨在治療與異常 HER2/neu相關(guān)的表達(dá)或信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的紊亂或狀況，包括但絕不限于 乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、卵巢癌和肺癌。
"保守氨基酸取代"是指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)化學(xué)上相似的氨 基酸殘基所替換。此類(lèi)保守取代的實(shí)例有用一個(gè)疏水殘基(異亮氨 酸、亮氨酸、纈氨酸或曱硫氨酸)取代另一個(gè)；用一個(gè)極性殘基取代 具有相同電荷的另一個(gè)極性殘基(如精氨酸取代賴(lài)氨酸；谷氨酸取代 天冬氨酸)。
"hHER2.wt"和"hHER2. opt"分別指人表皮生長(zhǎng)因子2抗原和經(jīng)密 碼子最優(yōu)化的人表皮生長(zhǎng)因子2抗原。
"hHER2ECDTM.wt"和"hHER2ECDTM. opt"分別指截短型人表皮生長(zhǎng) 因子2抗原和經(jīng)密碼子最優(yōu)化的截短型人表皮生長(zhǎng)因子2抗原。截短 形式的HER2、"畫(huà)R2EC躍.wt，，和"固R2EC躍.opt，，包含人HER2蛋 白的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域。
術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物，，是指任何哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)。
縮寫(xiě)"Ag"是指抗原。
縮寫(xiě)"Ab"和"血Ab"分別是指抗體和單克隆抗體。 縮寫(xiě)"ORF，，是指基因的可讀框。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了編碼人HER2蛋白的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的多核苷酸 (hHER2.opt, SEQ ID N0:1)的核苷酸序列。見(jiàn)實(shí)施例1。圖表B顯示 了人HER2蛋白推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)。
圖2顯示了通過(guò)ELISPOT和胞內(nèi)染色(ICS)分析鑒定人HER2蛋白 中的免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位。分析了用Ad5-hHER2免疫的BALB/c小鼠對(duì) HER2特異性的細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)。分泌IFN-y的抗-人HER2 T細(xì)胞的數(shù) 目是利用肽庫(kù)或單個(gè)肽通過(guò)對(duì)來(lái)自小鼠組別(示于第 一欄)的脾細(xì)胞進(jìn) 行ELISPOT測(cè)定的。所示數(shù)據(jù)代表數(shù)個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。值表達(dá)為斑點(diǎn)形成 集落數(shù)(SFC) /106總脾細(xì)胞減去在肽不存在時(shí)所測(cè)定背景值( 一般小于 10 SFC/106總脾細(xì)胞)。相當(dāng)于沒(méi)有抗原肽的對(duì)照試驗(yàn)中所測(cè)背景的 三倍以上的數(shù)字被認(rèn)為是陽(yáng)性值，并以粗體標(biāo)示。分泌IFN-y的CD4+ 或CD8+T細(xì)胞的頻率由ICS測(cè)量。所示數(shù)據(jù)代表數(shù)個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。值表 達(dá)為1 OOOx [ (IFNi CD3+和CD4+或CD8+) / (CD3+和CD4+或CD8"]。 高于1 %的值被認(rèn)為是陽(yáng)性的，并以粗體標(biāo)示。測(cè)定中所用肽庫(kù)或單個(gè) 肽所含序列示于左側(cè)。數(shù)字是指人HER2蛋白的氨基酸殘基位置。
圖3顯示了在(A)人胚腎HEK-293細(xì)胞和(B)小鼠成肌細(xì)胞C2C7 中轉(zhuǎn)染后hHER2的體外表達(dá)。數(shù)據(jù)表達(dá)為減去了由空pVlJnsA質(zhì)粒所 產(chǎn)生的信號(hào)的通道熒光幾何平均值。對(duì)于C2C7細(xì)胞，數(shù)據(jù)根據(jù)pEGFP DNA的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。
圖4顯示了 BALB/c小鼠中針對(duì)人HER2的免疫應(yīng)答。圖表(A)顯示 經(jīng)密碼子最優(yōu)化的HER2與野生型HER2相比，產(chǎn)生了顯著提高的 ELISP0T值。顯示了用質(zhì)粒pVlJ-hHER2. wt或pVlJ-hHER2. opt (5 0/ig/ 劑，四頭肌電注射(electroinject))免疫四組每組兩只小鼠的結(jié)果。 末次注射后兩周，利用肽hNeu15.3 (aa 63-71, 包括CD8+表位)、 hNeu301 (aa 1202-1214，包括CD8+表位)和hNeu42 (aa 165-179，包 括CD4+表位)介由IFNi ELISPOT測(cè)定確定了小鼠脾細(xì)胞中分泌IFN-y的T細(xì)胞的頻率。顯示了來(lái)自2.5 x 105和5 x 105個(gè)脾細(xì)胞、各測(cè) 試量重復(fù)兩份的結(jié)果。平均值通過(guò)減去不存在肽時(shí)所測(cè)的背景水平計(jì) 算(一般小于IO SFC/1()6總脾細(xì)胞)。結(jié)果表達(dá)為SFC數(shù)/1()6總脾細(xì) 胞。圖表(B)顯示pVlJ-hHER2. opt與pVlJ-hHER2. wt相比引發(fā)了顯著 提高的IgGl和IgG2a體液應(yīng)答。在第6周(首次免疫前一天，放血前) 和第14周(末次注射后兩周)從用pVlJ-hHER2. wt或pVlJ-hHER2. opt 質(zhì)粒DNA免疫的4只小鼠的組中收集血清樣品。利用hHER2二聚體胞 外結(jié)構(gòu)域(HER2-ECD)作為靶抗原通過(guò)ELISA測(cè)量了來(lái)自各組小鼠的血 清集合庫(kù)的抗-hHER2抗體滴度。利用AP綴合的山羊抗-小鼠IgGl或 IgG2a檢測(cè)結(jié)合的小鼠抗體。
圖5顯示了由pVlJ-HER2和Ad5-HER2免疫小鼠所引發(fā)的p185特 異性T細(xì)胞應(yīng)答的比較。于6和9周齡用pVlJ-hHER2. wt DNA (50|iig/ 劑，四頭肌注射)，接著進(jìn)行電刺激，或用Ad5-hHER2.wt免疫野生型 BALB/c小鼠和超表達(dá)大鼠HER2的BALB/c轉(zhuǎn)基因小鼠(標(biāo)示為NeuT， 見(jiàn)Lucchini等，Cancer Lett 64 (3): 203-9 (1992))。在12周齡 時(shí)，利用所示的肽由小鼠庫(kù)通過(guò)ELISPOT分析測(cè)定分泌IFN-y的抗-人 細(xì)胞的數(shù)目。所示數(shù)據(jù)代表數(shù)個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。值如圖1中那樣表達(dá)。
圖6圖表A顯示了編碼截短型人HER2蛋白的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的多 核苷酸(hHER2ECDTM. opt, SEQ ID N0:9)的核苷酸序列，所述蛋白包 含HER2蛋白的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域。圖表B顯示了編碼HER2蛋白胞外 和跨膜結(jié)構(gòu)域的第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含"野生型"核 苷酸序列，其未經(jīng)密碼子最優(yōu)化(hHER2ECDTM. wt， SEQ ID NO: 10)。
圖7顯示了在用表達(dá)人抗原HER2、 CEA和EpCAM的三種質(zhì)?；旌?物免疫的獼猴中所誘導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的分析，所述質(zhì)粒包含經(jīng)密 碼子最優(yōu)化以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表達(dá)的核苷酸序列。然后用表達(dá)三 種抗原中每一種的野生型序列的三種Ad5載體的混合物免疫相同的動(dòng) 物。 一年內(nèi)每個(gè)月通過(guò)IFN-y ELISPOT測(cè)量針對(duì)高度同源(98. 2%序列 相似性)的獼猴HER2蛋白的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。值表達(dá)為SFC/106 PBMC減去不存在肽時(shí)測(cè)定的背景值。與在無(wú)抗原肽的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中所測(cè) 背景顯著不同(p < 0.05)、且比隨意選取的閾值55 SFC/106 PBMC更 高的值以粗體標(biāo)示。
圖8顯示了通過(guò)pVlJ-hHER2opt和pVl J-hHER2ECDTM. opt免疫在 小鼠中所引發(fā)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的比較。值是指通過(guò)ELISP0T所 測(cè)的分泌IFNy的脾細(xì)胞的頻率。所示數(shù)據(jù)來(lái)源于三只動(dòng)物，并代表數(shù) 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。值表達(dá)為SFC/1(^總脾細(xì)胞減去不存在肽時(shí)測(cè)定的背景值 (一般小于5 SFC/1()6總脾細(xì)胞)。與在無(wú)抗原肽的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中所測(cè)背 景顯著不同(p < 0.05)、且比隨意選取的閾值25 SFC/106脾細(xì)胞更高 的值以粗體標(biāo)示。
發(fā)明詳述
人表皮生長(zhǎng)因子2 (hHER2)通常與許多不同類(lèi)型的胂瘤相關(guān)，包 括乳腺癌、卵巢癌、胃癌和結(jié)腸癌。本發(fā)明涉及引發(fā)或增強(qiáng)對(duì)hHER2 基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法，其中異常hHER2表達(dá) 與癌或其發(fā)展有關(guān)。異常hHER2表達(dá)與癌的相關(guān)并不要求hHER2蛋白 在腫瘤組織發(fā)育的所有時(shí)間點(diǎn)都在其中表達(dá)，因?yàn)楫惓HER2表達(dá)可 能在肺瘤起始之時(shí)存在，而到腫瘤進(jìn)程后期不可檢測(cè)，或者反之亦然。
為此，提供了編碼全長(zhǎng)人HER2蛋白或文中稱(chēng)之為HER2ECDTM的截 短型人HER2蛋白的合成DNA分子。所述截短型HER2包含人HER2蛋白 的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域。設(shè)計(jì)所述合成DNA分子的密碼子，以便利用計(jì) 劃宿主細(xì)胞偏好的密碼子，該宿主細(xì)胞在優(yōu)選的實(shí)施方案中為人類(lèi)細(xì) 胞。所述合成分子可用于開(kāi)發(fā)基于質(zhì)粒的疫苗或重組腺病毒，它們通 過(guò)中和性抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性提供抗HER2相關(guān)癌癥的有效免疫預(yù) 防。所述合成分子可用作為免疫原組合物。本發(fā)明提供了這樣的多核 苷酸，當(dāng)將其直接在體內(nèi)引入到脊推動(dòng)物(包括哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)和 人)中時(shí)，在動(dòng)物中誘導(dǎo)所編碼蛋白的表達(dá)。
業(yè)已才艮道過(guò)野生型人HER2核苷酸序列(Coussens等，Science 230: 1132-39 (1985); King等，Science 229: 974-76 (1985))。 本發(fā)明提供了編碼全長(zhǎng)人HER2蛋白或包含HER2蛋白胞外和跨膜結(jié)構(gòu) 域的截短型人HER2蛋白HER2ECDTM的合成DNA分子。本發(fā)明的合成分 子包含這樣的核苷酸序列，其中改變了至少一個(gè)核苦酸，以便使用人 類(lèi)細(xì)胞偏好的密碼子，從而允許hHER2或hHER2ECDTM在人宿主細(xì)胞中 高水平表達(dá)。所述合成分子可用作為hHER2或hHER2ECDTM蛋白的來(lái) 源，其可用在癌癥疫苗中，以通過(guò)中和性抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性提 供抗hHER2相關(guān)癌的有效免疫預(yù)防。備選地，所述合成分子可用作為 DNA疫苗或腺病毒疫苗的基礎(chǔ)。
四個(gè)可能核苷酸堿基的"三聯(lián)體"密碼子能夠以超過(guò)60種變體形 式存在。由于這些密碼子提供僅僅20個(gè)不同氨基酸(以及轉(zhuǎn)錄起始和 終止)的信息，所以有些氨基酸可由不止一個(gè)密碼子編碼，即一種稱(chēng)之 為密碼子冗余的現(xiàn)象。由于尚不完全清楚的原因，備選密碼子并非均 一地存在于不同類(lèi)型細(xì)胞的內(nèi)源DNA中。事實(shí)上，對(duì)于特定類(lèi)型細(xì)胞 中的某些密碼子，似乎存在著可變的天然的等級(jí)體系或"偏好，，。作
為一個(gè)實(shí)例，氨基酸亮氨酸受包括CTA、 CTC、 CTG、 CTT、 TTA和TTG 在內(nèi)的六個(gè)DM密碼子中的任何一個(gè)指令。微生物基因組密碼子頻率 的詳盡分析已揭示大腸桿菌(A c0/2')的內(nèi)源DNA最常見(jiàn)地含有CTG 亮氨酸指令密碼子，而酵母和粘菌的DNA最常見(jiàn)地包括TTA亮氨酸指 令密碼子?？紤]到這種等級(jí)體系，通常認(rèn)為實(shí)現(xiàn)大腸桿菌宿主高水平 表達(dá)富含亮氨酸的多肽的可能性將在某種程度上取決于密碼子使用的 頻率。例如，很可能富含TTA密碼子的基因在大腸桿菌中將不佳地表 達(dá)，而富含CTG的基因或許將會(huì)在此宿主中高度表達(dá)。類(lèi)似的，在酵 母宿主細(xì)胞中表達(dá)富含亮氨酸的多肽的偏好密碼子將會(huì)是TTA。
密碼子偏好現(xiàn)象對(duì)于重組DNA技術(shù)的意義是一目了然的，且此現(xiàn) 象可用來(lái)解釋許多以前未能在成功轉(zhuǎn)化的宿主生物中實(shí)現(xiàn)外源基因高 表達(dá)水平的失敗，即不怎么"偏好"的密碼子可能重復(fù)的存在于插入 基因之中，且宿主細(xì)胞表達(dá)機(jī)器可能不那么有效地運(yùn)作。這種現(xiàn)象提 示經(jīng)設(shè)計(jì)以包括計(jì)劃宿主細(xì)胞的偏好密碼子的合成基因?yàn)橹亟MDNA技 術(shù)實(shí)踐提供了最佳形式的外來(lái)遺傳材料。從而，本發(fā)明的一個(gè)方面為 經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表達(dá)的人HER2基因。在本發(fā)明 優(yōu)選的實(shí)施方案中，業(yè)已發(fā)現(xiàn)使用編碼相同蛋白序列的備選密碼子可 以克服在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)外源hHER2蛋白的約束。本發(fā)明的另一個(gè)方 面是截短型人HER2基因hHER2ECDTM，它經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在人宿主 細(xì)胞中高水平表達(dá)，所述截短型HER2基因包含編碼人HER2胞外和跨 膜結(jié)構(gòu)域的核香酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，人HER2基因序列和人HER2ECDTM基因序列被轉(zhuǎn)換成 與野生型等同體相比具有相同翻譯序列、但具有備選密碼子使用的多 核苦酸序列，如 Lathe, "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations" J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985) 所述，特此并入作為參考。所述方法通常由以下步驟組成鑒定野生 型序列中一般與高表達(dá)的人類(lèi)基因無(wú)關(guān)的密碼子，并把其替換為最佳 密碼子，以在人類(lèi)細(xì)胞中高表達(dá)。所述最佳密碼子在這里稱(chēng)之為"人 類(lèi)偏好的"密碼子。然后檢查所述新基因序列中由密碼子替換所產(chǎn)生 的不期望的序列(如"ATTTA"序列、無(wú)意產(chǎn)生的內(nèi)含子剪接識(shí)別位點(diǎn)、 不必要的限制酶位點(diǎn)、高GC含量等)。不期望的序列通過(guò)用編碼相同
氨基酸的不同密碼子取代既有的密碼子而消除。然后測(cè)試合成的基因 片段提高的表達(dá)。
利用上文所述的方法創(chuàng)建合成的人HER2和人HER2ECDTM的基因序 列，得到了包含最優(yōu)化密碼子以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表達(dá)的全長(zhǎng)和截 短型基因。盡管上述方法提供了我們?cè)O(shè)計(jì)密碼子最優(yōu)化基因以用于癌 癥疫苗的方法學(xué)的概述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可通過(guò)所述方法的微 小變動(dòng)或所述序列的微小變動(dòng)而實(shí)現(xiàn)相似的疫苗功效或提高的基因表 達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將會(huì)認(rèn)識(shí)到可以構(gòu)建另外的DM分子，以提供 人類(lèi)細(xì)胞中hHER2或hHER2ECDTM的高水平表達(dá)，其中僅僅一部分所述 DNA分子的密碼子是經(jīng)密碼子最優(yōu)化的。本發(fā)明的核酸分子基本上不含 其它核酸。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及包含編碼人HER2蛋白(例如，SEQ ID NO: 2 中所示人HER2蛋白或人HER2蛋白的生物學(xué)活性片段或突變體形式) 的核苷酸序列的合成多核苷酸，所述多核苷酸序列包含經(jīng)最優(yōu)化以在 人類(lèi)宿主中表達(dá)的密碼子。所述突變體形式的hHER2蛋白包括但不限 于保守氨基酸取代、氨基末端截短、羧基末端截短、缺失或添加。 任何這樣的生物學(xué)活性片段和/或突變體將編碼至少基本上模擬如SEQ ID NO: 2中所示hHER2蛋白的免疫學(xué)性質(zhì)的蛋白或蛋白片段之一。本 發(fā)明的合成多核苷酸編碼表達(dá)功能性人HER2蛋白的mRNA分子，從而 可用于開(kāi)發(fā)治療性或預(yù)防性癌癥疫苗。
本發(fā)明優(yōu)選的多核苷酸是包含編碼截短型人HER2ECDTM蛋白(SEQ ID N0: 14)的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列包含經(jīng)最優(yōu)化 以在人類(lèi)宿主中表達(dá)的密碼子。本發(fā)明尤其優(yōu)選的多核苷酸包含如SEQ ID NO: 9中所示的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及合成核酸分子(多核苷酸)，其包含編碼表達(dá)人HER2 蛋白(例如，SEQ ID NO: 2中所示的全長(zhǎng)人HER2蛋白，或截短型 HER2ECDTM蛋白，例如，SEQ ID N0: 14中所示的HER2ECDTM序列)的 mRNA的核苦酸序列。本發(fā)明的合成核酸分子經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在人類(lèi) 宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)。
同樣包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的是密碼子最優(yōu)化了的多核苷酸，其 包含編碼與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少90%同一性的變體 HER2多肽的核苷酸序列，所述變體HER2多肽在SEQ ID NO: 2的整個(gè)長(zhǎng)度范圍內(nèi)可包括最多達(dá)Na個(gè)氨基酸改變，其中Na為最大氨基酸改變
數(shù)，并由如下公式計(jì)算 Na = Xa - (XaY)，
其中Xa為SEQ ID NO: 2中的氨基酸總數(shù)，而Y值為0. 90，其中 在從Xa中減去Xa和Y的乘積之前，將任何這樣非整數(shù)的乘積四舍五入 為最接近的整數(shù)。同樣地，本發(fā)明也考慮經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼如SEQ ID NO: 14中所示的HER2ECDTM多肽的變體的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及重組載體和重組宿主細(xì)胞，既包括原核的又包括真 核的，它們含有本說(shuō)明書(shū)從頭到尾所公開(kāi)的核酸分子。本發(fā)明的合成 DNA分子、相關(guān)載體和宿主可用于開(kāi)發(fā)癌癥疫苗。
本發(fā)明優(yōu)選的DNA分子包含文中公開(kāi)的如SEQ ID N0:1 (示于圖 l)所示的核苷酸序列，其編碼示于圖2且如SEQ ID N0:2中所示的人 HER2蛋白。如SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在 人類(lèi)細(xì)胞中最佳表達(dá)。為避免PCR擴(kuò)增問(wèn)題，在本發(fā)明的這種實(shí)施方 案中，對(duì)hHER2序列3601和3805位之間采取不太嚴(yán)格的最優(yōu)化設(shè)計(jì)， 這降低了GC含量，而同時(shí)保留了相同的氨基酸組成。見(jiàn)實(shí)施例5。
本發(fā)明另外優(yōu)選的DNA分子包含文中公開(kāi)的如SEQ ID NO:9 (示 于圖6A)所示的核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO:14中所示的人 HER2ECDTM蛋白。如SEQ ID NO: 9中所示的核苷酸序列經(jīng)密碼子最優(yōu) 化以在人類(lèi)細(xì)胞中最佳表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到可設(shè)計(jì)經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在人類(lèi)細(xì)胞 中高水平表達(dá)的其它HER2序列，前提是將一個(gè)或多個(gè)密碼子改變成人 類(lèi)偏好的密碼子。優(yōu)選構(gòu)成本發(fā)明的合成HER2核苷酸序列的至少大約 80%的密碼子是人類(lèi)偏好的密碼子。更優(yōu)選至少大約85%的密碼子是人 類(lèi)偏好的，并且甚至更優(yōu)選至少大約90%的密碼子是人類(lèi)偏好的。
本發(fā)明也包括SEQ ID NO:l的生物學(xué)活性片段或突變體，其編碼 表達(dá)人HER2蛋白的mRNA。任何這樣的生物學(xué)活性片段和/或突變體將 編碼至少基本上模擬hHER2蛋白(包括但不限于如SEQ ID N0:2中所 示的hHER2蛋白)的藥理學(xué)性質(zhì)的蛋白或蛋白片段之一。任何這樣的 多核苷酸包括但不必然限于核苷酸取代、缺失、添加、氨基末端截 短和羧基末端截短。本發(fā)明的突變編碼在真核細(xì)胞中表達(dá)功能性hHER2 蛋白的mRNA分子，從而可用于癌癥疫苗開(kāi)發(fā)。
本發(fā)明也涉及合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼hHER2蛋白或 hHER2ECDTM蛋白的DNA分子，其中所述合成DNA的核苷酸序列顯著不 同于SEQ ID N0: 1或SEQ ID NO: 9的核苷酸序列，但仍然編碼如SEQ ID NO: 2中所示的hHER2蛋白或如SEQ ID NO: 14中所示的hHER2ECDTM 蛋白。這樣的合成DNA旨在落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明公 開(kāi)了可產(chǎn)生表達(dá)相同蛋白的眾多DNA分子的密碼子冗余。同樣包括在 本發(fā)明范圍之內(nèi)的是DNA序列中基本上不改變所表達(dá)蛋白的最終物理 性質(zhì)的突變。例如，用纈氨酸取代亮氨酸、用精氨酸取代賴(lài)氨酸、或 用天冬酰胺取代谷氨酰胺可能并不導(dǎo)致多肽功能的變化。
已知可以改變編碼肽的DM序列，以使之編碼具有不同于天然存 在的肽的性質(zhì)的肽。改變DNA序列的方法包括但不限于定點(diǎn)誘變。改 變的性質(zhì)的實(shí)例包括但不限于酶對(duì)底物或受體對(duì)配體的親和力的改 變。
本發(fā)明也涉及函R2opt和hHER2ECDTMopt的融合構(gòu)建體，包括 但不限于表達(dá)連接于各種標(biāo)記的部分人HER2蛋白的融合構(gòu)建體，所述 標(biāo)記包括但絕不限于GFP (綠色熒光蛋白)、MYC表位、GST和Fc。任 何這樣的融合構(gòu)建體可在目的細(xì)胞系中表達(dá)，并用于篩選文中公開(kāi)的 人HER2蛋白的調(diào)節(jié)劑。同樣考慮的是經(jīng)構(gòu)建以增強(qiáng)對(duì)人HER2的免疫 應(yīng)答的融合構(gòu)建體，包括但不限于DOM、 hsp70和LTB。
本發(fā)明還涉及包含本說(shuō)明書(shū)從頭到尾公開(kāi)的合成核酸分子的重組 載體。這些載體可由DNA或RAN組成。對(duì)于多數(shù)克隆目的，優(yōu)選DNA 載體。 一般的載體包括質(zhì)粒、修飾的病毒、桿狀病毒、噬菌體、粘粒、 酵母人工染色體以及能夠編碼hHER2蛋白或hHER2ECDTM蛋白的其它形 式的游離型或整合的DNA。確定用于特定基因轉(zhuǎn)移或其它用途的合適載 體是充分落入技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)的。
含有經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼hHER2蛋白的DNA的表達(dá)載體可用于 在重組宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)hHER2。另外，含有經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編 碼hHER2ECDTM蛋白的DNA的表達(dá)載體可用于在重組宿主細(xì)胞中高水平 表達(dá)hHER2ECDTM。表達(dá)載體可包括但不限于克隆載體、修飾的克隆 載體、特定設(shè)計(jì)的質(zhì)?；虿《?。同樣，如果需要，許多細(xì)菌表達(dá)載體 可用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)重組hHER2或hHER2ECDTM。另外，許多真菌
細(xì)胞表達(dá)載體可用于在真菌細(xì)胞中表達(dá)重組hHER2或hHER2ECDTM。此 外，許多昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體可用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白。
本發(fā)明也涉及用包含本發(fā)明的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主 細(xì)胞。重組宿主細(xì)胞可以是原核或真核的，包括但不限于細(xì)菌如大 腸桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于牛、豬、猴 及嚙齒動(dòng)物起源的細(xì)胞系；以及昆蟲(chóng)細(xì)胞，包括但不限于果蠅 (/ roso;7力/h)和蠶來(lái)源的細(xì)胞系。這樣的重組宿主細(xì)胞可在合適的 條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生hHER2、 hHER2ECDTM或其生物學(xué)等同形式。在本發(fā) 明優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為人的。如文中所定義的，術(shù)語(yǔ)"宿 主細(xì)胞，，并不旨在包括處于轉(zhuǎn)基因人類(lèi)、轉(zhuǎn)基因人胎兒或轉(zhuǎn)基因人胚 胎體中的宿主細(xì)胞。
如上文所指出的，含有編碼hHER2蛋白或hHER2ECDTM蛋白的DNA 的表達(dá)載體可用于在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)hHER2或hHER2ECDTM。因 此，本發(fā)明的另一個(gè)方面是在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)人HER2蛋白或人 HER2ECDTM蛋白的方法，包括(a)將包含經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2 或人HER2ECDTM的核酸的載體引入到合適的人類(lèi)宿主細(xì)胞中；和(b) 在允許表達(dá)所述人HER2蛋白或所述人HER2ECDTM蛋白的條件下培養(yǎng)所 述宿主細(xì)胞。
本發(fā)明這方面優(yōu)選的實(shí)施方案提供了在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)人 HER2蛋白的方法，包括(a)將包含如SEQ ID N0: 1中所示的核酸的載 體引入到合適的人類(lèi)宿主細(xì)胞中；和(b)在允許表達(dá)所述人HER2蛋 白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
本發(fā)明這方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了在重組宿主細(xì)胞中表 達(dá)人HER2ECDTM蛋白的方法，包括(a)將包含如SEQ IDN0:9中所示 的核酸的載體引入到合適的人類(lèi)宿主細(xì)胞中；和(b)在允許表達(dá)所述 人HER2ECDTM蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
繼在宿主細(xì)胞中表達(dá)hHER2或hHER2ECDTM之后，可將hHER2或 hHER2ECDTM蛋白回收為活性形式的蛋白。存在著若干的蛋白純化方法 并適合于使用?？赏ㄟ^(guò)各種組合或單獨(dú)應(yīng)用的鹽分級(jí)分離、離子交換 層析、大小排阻層析、羥基辯灰石吸附層析和疏水相互作用層析從細(xì) 胞裂解物和提取物中純化重組hHER2蛋白或HER2ECDTM蛋白。另外，
可使用由特異于全長(zhǎng)hHER2蛋白或hHER2蛋白多肽片段的單克隆或多 克隆抗體制備的免疫親和柱從其它細(xì)胞蛋白中分離重組蛋白。
可以將本發(fā)明的核酸組裝到表達(dá)盒中，所述表達(dá)盒包含設(shè)計(jì)用以 在人類(lèi)細(xì)胞中提供所述蛋白有效表達(dá)的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案中，所述盒含有全長(zhǎng)經(jīng)密碼子最優(yōu)化的hHER2基因，連同與之可操 作地連接的相關(guān)轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列如啟動(dòng)子以及終止序列。在本發(fā) 明的笫二實(shí)施方案中，所述盒含有截短型HER2基因HER2ECDTM，其編 碼人HER2蛋白的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為 不含內(nèi)含子A序列的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員將 會(huì)認(rèn)識(shí)到可以使用許多其它已知的啟動(dòng)子如強(qiáng)免疫球蛋白或其它真核 基因啟動(dòng)子的任何一個(gè)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是牛生長(zhǎng)激素終止子，盡 管也可以使用其它已知的轉(zhuǎn)錄終止子。尤其優(yōu)選CMV-BGH終止子組 合。
才艮據(jù)本發(fā)明，將hHER2opt或hHER2ECDTMopt表達(dá)盒插入到載體 中。載體優(yōu)選為腺病毒載體，盡管也可以使用連接于啟動(dòng)子的線(xiàn)性DNA 或者其它載體，如腺伴隨病毒或修飾的痘苗病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病 毒載體。
如果所選的載體為腺病毒，則所述載體優(yōu)選為所謂的第一代腺病 毒載體。這些腺病毒載體特征在于具有非功能性的El基因區(qū)，且優(yōu)選 具有缺失的腺病毒E1基因區(qū)。在有些實(shí)施方案中，將表達(dá)盒插入到腺 病毒E1基因正常定位于此的位置上。另外，這些載體任選地具有有非 功能性或缺失的E3區(qū)。優(yōu)選所用的腺病毒基因組在E1和E3區(qū)都缺失 (AE1AE3)。所述腺病毒可在已知的表達(dá)病毒El基因的細(xì)胞系如293 細(xì)胞或PERC. 6細(xì)胞、或在由293或PERC. 6細(xì)胞衍生的被瞬時(shí)或穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化以表達(dá)附加蛋白的細(xì)胞系中增殖。例如，當(dāng)使用具有可控基因表 達(dá)的構(gòu)建體，如四環(huán)素可調(diào)控的啟動(dòng)子系統(tǒng)時(shí)，細(xì)胞系可表達(dá)參與此 調(diào)控系統(tǒng)的組分。這樣的細(xì)胞系的一個(gè)實(shí)例是T-Rex-293;其它的是 本領(lǐng)域7>知的。
為便于操縱腺病毒載體，所述腺病毒可以是穿梭質(zhì)粒的形式。本 發(fā)明也涉及包含質(zhì)粒部分和腺病毒部分的穿梭質(zhì)粒載體，所述腺病毒 部分包含具有缺失的El和任選地E3缺失的腺病毒基因組，并具有插 入的包含經(jīng)密碼子最優(yōu)化的人HER2或經(jīng)密碼子最優(yōu)化的hHER2ECDTM 的表達(dá)盒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在側(cè)接所述質(zhì)粒的腺病毒部分的 限制位點(diǎn)，從而能夠容易地除去所述腺病毒載體。所述穿梭質(zhì)?？梢?在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中復(fù)制。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，將所述表達(dá)盒插入到pMRKAd5-HVO 腺病毒質(zhì)粒(見(jiàn)Emini等，W0 02/22080，特此并入作為參考)中。該 質(zhì)粒包含缺失了 El和E3區(qū)的Ad5腺病毒基因組。所述pMRKAd5-HV0 質(zhì)粒的設(shè)計(jì)較之于現(xiàn)有的腺病毒載體(adenovector )得到了改善，其 通過(guò)將5，順式作用包裝區(qū)進(jìn)一步延伸到El基因中，以整合入發(fā)現(xiàn)對(duì)于 最優(yōu)化病毒包裝重要的元件，從而導(dǎo)致增強(qiáng)病毒擴(kuò)增。有利地，這種 增強(qiáng)的腺病毒載體繼高度傳代繁殖后能夠維持遺傳穩(wěn)定性。
用于制備和純化DNA構(gòu)建體的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使得制備本發(fā) 明的腺病毒、穿梭質(zhì)粒和DM免疫原成為可能。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)確定文中所述的經(jīng)密碼子最優(yōu)化以在人類(lèi)細(xì)胞 中高水平表達(dá)的合成cDNA分子(如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 9)，比 相應(yīng)的野生型序列以更高的效率表達(dá)。另外，本文顯示hHER2opt比 hHER2更具免疫原性，并且在引發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答方面更為有效。
因此，上文所述的載體可用在免疫原性組合物和疫苗中，以用于 預(yù)防與異常HER2表達(dá)相關(guān)的腺癌的發(fā)展和/或治療既有的癌癥。本發(fā) 明的載體通過(guò)排除在成功轉(zhuǎn)化的宿主生物中獲得高表達(dá)水平的外源 HER2的困難，允許疫苗開(kāi)發(fā)和商業(yè)化。為此，本發(fā)明的一個(gè)方面是預(yù) 防或治療HER2相關(guān)癌癥的方法，包括向哺乳動(dòng)物施用包含合成的經(jīng)密 碼子最優(yōu)化的核酸分子的疫苗載體，所述合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的核 酸分子包含編碼如SEQ IDN0: 2中所示的人HER2蛋白或如SEQ IDN0: 14中所示的人HER2ECDTM蛋白的核苷酸序列.
根據(jù)上文所述的方法，可在任何哺乳動(dòng)物中施用所述疫苗載體以 治療或預(yù)防癌癥。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物為人。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇任何類(lèi)型的載體以用于所述的治 療和預(yù)防方法。優(yōu)選地，所述栽體為腺病毒載體或質(zhì)粒載體。在本發(fā) 明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體為腺病毒載體，其包含在腺病毒E1區(qū) 具有缺失且在腺病毒E1區(qū)具有插入片段的腺病毒基因組，其中所述插 入片段包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含(a)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編
碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地連 接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
本發(fā)明還涉及腺病毒疫苗載體，其包含在El區(qū)具有缺失且在El 區(qū)具有插入片段的腺病毒基因組，其中所述插入片段包含表達(dá)盒，所 述表達(dá)盒包含(a)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2蛋白或人 HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和(b)可操作地連接于所述多核苷酸的 啟動(dòng)子。
在本發(fā)明這方面優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腺病毒載體為Ad 5載體。
在本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體為Ad6載體或Ad24載體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒部分的疫苗質(zhì) 粒，所述表達(dá)盒包含(a)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2蛋白 的多核苷酸；和(b)可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
本發(fā)明也涉及包含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒部分的疫苗質(zhì)粒，所述表達(dá) 盒包含(a)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2ECDTM蛋白的多核苷 酸；和(b)可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的重組腺病毒疫苗與基于 質(zhì)粒的多核苷酸疫苗用于多種致敏(prime) /加強(qiáng)組合，以誘導(dǎo)增強(qiáng) 的免疫應(yīng)答。在這種情況下，兩個(gè)載體以"致敏和加強(qiáng)"方案施用。 例如，施用第一類(lèi)型的載體，然后在預(yù)定量的時(shí)間后，例如2周、l個(gè) 月、2個(gè)月、6個(gè)月或其它合適的間隔，施用第二類(lèi)型的載體。優(yōu)選所 述載體攜帶編碼相同多核苷酸或多核苷酸組合的表達(dá)盒。在也使用質(zhì) 粒DNA的實(shí)施方案中，優(yōu)選所述載體含有一個(gè)或多個(gè)為哺乳動(dòng)物或昆 蟲(chóng)細(xì)胞所識(shí)別的啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒將含有強(qiáng)啟 動(dòng)子，例如但不限于CMV啟動(dòng)子。待表達(dá)的合成人HER2基因、HER2ECDTM 基因或其它基因?qū)⑴c這樣的啟動(dòng)子相連。這種質(zhì)粒的實(shí)例將是所述的 哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒VlJns (J. Shiver等in ■ Vaccines, M. Liu 等編輯，N.Y. Acad. Sci. , N. Y. ， 772:198-208 (1996)，特此并入 作為參考)。
如上所述，腺病毒載體疫苗和質(zhì)粒疫苗可作為單一治療方案的一 部分施用于脊推動(dòng)物，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。為此，本發(fā)明涉及保護(hù)哺乳 動(dòng)物免患癌癥的方法，包括(a)向所述哺乳動(dòng)物引入第一栽體，其包 含i)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM的 多核苷酸；和ii)可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子；(b)允許 經(jīng)過(guò)預(yù)定量的時(shí)間；和(c)向所述哺乳動(dòng)物引入笫二載體，其包含 i)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM的多核 苷酸；和ii)可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
在上文所述保護(hù)方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第一栽體為質(zhì)粒而第二
載體為腺病毒載體。在備選的實(shí)施方案中，第一載體為腺病毒載體而 第二載體為質(zhì)粒。
本發(fā)明還涉及治療患有HER2相關(guān)癌癥的哺乳動(dòng)物的方法，包括(a) 向所述哺乳動(dòng)物引入第一載體，其包含i)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的 編碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地 連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子；(b)允許經(jīng)過(guò)預(yù)定量的時(shí)間；和(c)向 所述哺乳動(dòng)物引入第二載體，其包含i)合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編 碼人HER2蛋白或人HER2ECDTM蛋白的多核苷酸；和ii)可操作地連 接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
在上文所述治療方法的一個(gè)實(shí)施方案中，第一載體為質(zhì)粒而第二
載體為腺病毒載體。在備選的實(shí)施方案中，笫一載體為腺病毒載體而 笫二載體為質(zhì)粒。
待引入疫苗受體的可表達(dá)DNA或轉(zhuǎn)錄的RNA的量將部分地取決于 所用啟動(dòng)子的強(qiáng)度和所表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性。 一般而言，將大 約1 ng到100 mg且優(yōu)選大約10 fig到300 pg免疫或預(yù)防有效劑量 的質(zhì)粒疫苗載體直接施用于肌肉組織。重組腺病毒的有效劑量為大約 106 - 10'2顆粒，且優(yōu)選大約107—IO"顆粒。也考慮皮下注射、皮內(nèi) 引入、透皮按壓以及其它施用方式如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或吸入遞送。也 考慮可提供加強(qiáng)接種。腸胃外施用，如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或與腸胃
白的其它施用方式也是有利的。
本發(fā)明的疫苗載體可以是棵露的，即未與任何影響受體免疫系統(tǒng) 的蛋白、佐劑或其它試劑結(jié)合。在這種情況下，期望疫苗載體處于生 理學(xué)可接受的溶液之中，例如但不限于無(wú)菌鹽水或無(wú)菌緩沖鹽水中。 備選地，與本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物一起施用免疫刺激劑如佐
劑、細(xì)胞因子、蛋白或其它載體可能是有利的。因此，本發(fā)明包括此 類(lèi)免疫刺激劑與本發(fā)明的組合物和方法聯(lián)合的用途。如本文所用的免 疫刺激劑實(shí)質(zhì)上是指增強(qiáng)或加強(qiáng)針對(duì)外源抗原的免疫應(yīng)答(抗體和/或
細(xì)胞介導(dǎo)的)的任何物質(zhì)。所述免疫刺激劑可以以DNA或蛋白的形式 施用。可采用許多免疫刺激劑的任何一種與本發(fā)明的疫苗和免疫原性 組合物聯(lián)合，所述免疫刺激劑包括但不限于GM-CSF、 IFNa、破傷風(fēng) 類(lèi)毒素、IL12、 B7.1、 LFA-3和ICAM-1。所述免疫刺激劑是本領(lǐng)域所 熟知的。也可以使用有助于DNA細(xì)胞吸收的試劑，例如但不限于鈣離 子。這些試劑一般稱(chēng)為轉(zhuǎn)染促進(jìn)試劑和藥學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域 技術(shù)人員將能夠確定特定的免疫刺激劑或藥學(xué)上可接受的載體，以及 合適的施用時(shí)間和施用方式。
為描述和公開(kāi)就本發(fā)明而言可能用到的方法學(xué)和材料，特此將文 中提及的所有出版物并入作為參考。此處絕不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明無(wú) 權(quán)借助于優(yōu)先權(quán)發(fā)明而早于這些公開(kāi)內(nèi)容。
盡管已參照附圖描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā) 明不限于那些確切的實(shí)施方案，且其中本領(lǐng)域技術(shù)人員可實(shí)現(xiàn)多種變 動(dòng)和修飾而不會(huì)偏離如所附權(quán)利要求書(shū)中所限定的本發(fā)明的范圍或精神。
如下實(shí)施例闡釋但并非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
人HER2最優(yōu)化的密碼子序列
全長(zhǎng)函R2. opt編碼序列由BIONEXUS (Bionexus Inc. Oakland CA.)合成和組裝，并克隆進(jìn)pCR-平端載體(Invitrogen,荷蘭)中。利 用寡核苷酸構(gòu)建hHER2. opt cDNA，并通過(guò)PCR組裝。對(duì)于文中描述的 許多實(shí)驗(yàn)，所用的hHER2. opt核苷酸序列在其5，-末端攜帶最優(yōu)化了的 Kozak序列，完整的核苷酸序列示于SEQ ID N0:11之中。
另外，通過(guò)用GCA替換密碼子AAA，用丙氨酸取代結(jié)合ATP的賴(lài) 氨酸殘基753 (K753A)。該突變廢除了相應(yīng)蛋白的酪氨酸激酶活性， 并取消了人(Messerle等Mol Cell Endocrinol 105(1): 卜10 (1994))或大鼠HER2 (Ben Levi等，同前)下游的信號(hào)傳導(dǎo)事件及其所
致的致癌活性。另外，激酶缺陷型K756A突變體能夠滅活共表達(dá)的致 癌性hHER2. wt的信號(hào)傳導(dǎo)活性。
實(shí)施例2
質(zhì)粒構(gòu)建體
pVlJ-hHER2. wt: 人HER2野生型編碼序列是通過(guò)PCR由質(zhì)粒 pLTR-2/erb-B2 (由P. DiFiore饋贈(zèng)，歐洲肺瘤學(xué)研究所(European Institute of Oncology )，米蘭，意大利j DiFiore等Science237 (4811): 178-82 (1987))利用引物hNeu. fori (5，一C C A G T T T A AACATTTAA ATGCCGCCACCATGGAGCTGG C G G C C T-3，； (SEQ ID NO: 3，編碼序列以下劃線(xiàn)標(biāo)出)和hNeu. rev2 (5，- GCCGTCGACTTT ACACTGGCACGTCCAG A C C C A-3， (SEQ ID NO: 4)以及TaKaRa U Taq聚合酶(TaKaRa Otsu， Shiga,日本)擴(kuò)增的。擴(kuò)增產(chǎn)物整合了最優(yōu)化的翻譯起始位點(diǎn)(Kozak, M. , J Mol Biol 196 (4): 947-50 (1987); Kozak, M. , Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987))，其用和Sa/I限制酶消化，并 克隆進(jìn)哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pVlJnsA (見(jiàn)Montgomery等DNA Cell Biol 12 (9): 777-83 (1993))的ScoRV和位點(diǎn)中。這樣產(chǎn)生的質(zhì)粒 pVlJ-hHER2含有全長(zhǎng)野生型人HER2序列，其處于具有其內(nèi)含子A序 列的人類(lèi)巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子的控制之下。人野生型HER2編碼 序列接下來(lái)是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)序列。
pVlJ-畫(huà)R2. opt: 從質(zhì)粒pCR-hHER2opt上切下3793bp的 fcoRI-&71片段，并克隆進(jìn)質(zhì)粒pVlJnsB (Montgomery等，同前)的 相應(yīng)位點(diǎn)中，產(chǎn)生了 pVlJ-hHER2. opt質(zhì)粒。
pVlJ-hHER2ECDTM. opt: 通過(guò)PCR (使用TaKaRa taq )利用引物 EcoRV-for (5，-C CAGATATCGAATTCTAGAGCCG CCACCATGGA-3， (SEQ ID NO: 12))和Sail-rev (5，-G C T GTCGACTTTATCAGATCAGGATGCCGAACA CCACGCCC - 3， (SEQ ID NO: 13"由pVlJ-hHER2. opt擴(kuò)增2168bp 的片段。所得片段用fcoRV和5^/1限制酶消化，并克隆進(jìn)質(zhì)粒pVlJnsB (Montgomery等，同前)的相應(yīng)位點(diǎn)中，產(chǎn)生了 pVl J-hHER2ECDTM. opt 質(zhì)粒。
實(shí)施例3 密碼子最優(yōu)化了的hHER2 cDNA
設(shè)計(jì)合成的人HER2基因(hHER2. opt，圖1)以整合入每一個(gè)氨基 酸(下文作aa)殘基的人類(lèi)偏好的(人源化)密碼子。在基因組裝期間， PCR擴(kuò)增一貫地刪除自3642位起的86 bp序列，這歸因于該區(qū)序列的 高GC含量。為克服此問(wèn)題，對(duì)hHER2序列3601和3805位之間采取不 太嚴(yán)格的最優(yōu)化設(shè)計(jì)，這降低了GC含量，而同時(shí)保留了相同的氨基酸 組成。
修飾密碼子最優(yōu)化了的cDNA,以維持與原始克隆83.9%的核苷酸 同一性。將密碼子最優(yōu)化了的cDNA克隆進(jìn)pVl J載體(Montgomery等， 同前)中，置于Kozak最優(yōu)化序列(5，-GCCGCCACC-3，， SEQ ID NO: 8) 之前，并處于人類(lèi)巨細(xì)胞病毒(CMV)/內(nèi)含子A啟動(dòng)子外加牛生長(zhǎng)激素 (BGH)終止信號(hào)的控制之下。所述構(gòu)建體被命名為pVlJ-hHER2opt (見(jiàn) 實(shí)施例2)。
實(shí)施例4
質(zhì)粒構(gòu)建體的體外表達(dá)
pVl J-hHER2. wt和pVl J. hHER2. opt構(gòu)建體的體外表達(dá)通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染人胚腎HEK-293或小鼠成肌細(xì)胞C2C7細(xì)胞系、并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢 測(cè)人HER2表達(dá)來(lái)評(píng)估。用于免疫的編碼人HER2表達(dá)盒的超螺旋的不 含內(nèi)毒素的質(zhì)粒腿pVlJ-hHER2-wt是通過(guò)Qiagen endo-free plasmid Giga試劑盒(Qiagen， Hilden,德國(guó))從大腸桿菌DH12S細(xì) 胞(Invitrogen， Groningen, 荷蘭)純化的。
將質(zhì)粒 pVlJ-hHER2. wt 或 pVlJ-hHER2. opt 用脂轉(zhuǎn)染胺 (1 ipofectamine ) (Gibco BRL Invitrogen， Groningen, 荷蘭)轉(zhuǎn) 染到HEK-293細(xì)胞中。類(lèi)似地，將小鼠成肌細(xì)胞C2C7細(xì)胞用1:1或 10: 1混合的質(zhì)粒pHygEGFP (BD Biosciences Clontech, PaloAlto， CA)和pVl J-hHER2. wt或pVl J-固R2. opt轉(zhuǎn)染。
HEK-293或C2.7細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染表明與野生型序列相比，密碼子 最優(yōu)化了的序列顯著地提高了 hHER2的表達(dá)(圖3A和3B)。
實(shí)施例5
小鼠免疫
六周齡近交雌性BALB/c小鼠01-2、由都靈大學(xué)(University of Turin) G. Forni饋贈(zèng))在標(biāo)準(zhǔn)條件下祠養(yǎng)。小鼠按照歐共體和公共機(jī) 構(gòu)指導(dǎo)方針(European union and institutional guidelines)處 理。具體地，當(dāng)對(duì)于方法必要的時(shí)候，用氯胺酮(Imalgene 500; Merial Italia, Milano，意大利)以100 mg/kg體重和曱苯壘溱(Xi lor， BIO 98; S. Lazzaro， Bologna,意大利)以5. 2 mg/kg對(duì)小鼠實(shí)施全身麻 醉。
將50 jul體積的5 0微克質(zhì)粒DNA于6、 8和10周齡電注射到小鼠 的四頭肌中，如先前所描述的那樣(Rizzuto等Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (11): 6417-22 (1999))。將最優(yōu)化或未最優(yōu)化的50pg pCMV —hNeu注射到雙側(cè)四頭肌(25 (ig溶于50^1生理溶液/注射劑)中 而無(wú)需切開(kāi)皮膚，并如先前所述(Zucchelli等 J. Virol. 74 (24): 11598-607 (2000); Rizzuto等，同前)進(jìn)行電刺激(ES)。簡(jiǎn)要地， 電擊由10串1000雙極脈沖(130V， 75mA, 200ns/相位)組成。
在小鼠四頭肌中用50卩il體積進(jìn)行Ad注射。在7周(首次免疫前 1周，放血前)和12周(末次免疫后兩周)收集血清。
實(shí)施例6
小鼠IFN-y EL I SPOT測(cè)定
利用標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(immunospot) (ELISPOT)測(cè)定檢測(cè)以抗原 特異性方式分泌IFNi的小鼠脾細(xì)胞(Miyahira等，J Immunol Methods 181 (1): 45—54 (1995))。多屏(mult iscreen )96孑L MAIP過(guò)濾板(cat-No. MAIPS4510; Millipore， Bedford, MA)用在無(wú)菌PBS中稀釋的 親和純化的大鼠抗-小鼠IFN-y抗體((IgGl，克隆R4-6A2, cat No. 18181D, Pharmingen， San Diego, CA)涂覆。過(guò)夜溫育后，板子用 PBST (0.005% Tween溶于PBS)洗滌，并與Rl 0培養(yǎng)基于37 TC溫育2 小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合。
通過(guò)以無(wú)菌方式從麻醉小鼠中取出脾臟而獲得脾細(xì)胞。通過(guò)在金 屬網(wǎng)格上磨碎切碎的脾臟進(jìn)行脾臟的破裂。通過(guò)向細(xì)胞沉淀中添加1 ml 0. IX PBS并渦旋不超過(guò)15秒通過(guò)滲透裂解除去紅細(xì)胞。然后加入lml2XPBS，并用1XPBS將體積補(bǔ)至4ml。通過(guò)在室溫下以1200 rpm 離心IO分鐘沉淀細(xì)胞，并將沉淀重懸于1 ml R10培養(yǎng)基(RPMI 1640， 補(bǔ)充有10。/。胎牛血清，2 mM L-谷氨酰胺，50 U青霉素/ml， 50 ng鏈 霉素/ml, lOmMHEPES, 50 2-巰基乙醇)中。存活細(xì)胞利用Tfirks 染色計(jì)數(shù)。
將來(lái)源于兩個(gè)或更多個(gè)免疫小鼠脾臟的脾細(xì)胞以2. 5 - 5 105細(xì)胞 /孔的密度，在6 |ng/ml單個(gè)肽或肽庫(kù)的存在下溫育15小時(shí)。利用5 )Lig/ml的伴刀豆球蛋白A (ConA)作為每只小鼠的陽(yáng)性?xún)?nèi)部對(duì)照。在用 PBST徹底洗滌后，添加生物素化的大鼠抗-小鼠IFN-y抗體(cat No. 18112D, PharMingen; San Diego， CA)。將板子于4X:溫育過(guò)夜，隨 之用PBST洗滌，之后添加鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(Cat No. 13043E， PharMingen; San Diego， CA)。室溫下溫育2小時(shí)后，將板 子用PBST徹底洗滌，并通過(guò)與一步氮藍(lán)四唑-5-溴-4-氧-3-吲哚磷酸 底物(cat. No. 34042， Pierce, Rockford, IL)溫育5至15分鐘顯 色，以使斑點(diǎn)顯現(xiàn)。在水中沖洗所述板以終止反應(yīng)。DMS0和伴刀豆球 蛋白A (10 pg/inl)被包括進(jìn)來(lái)作為每個(gè)樣品的背景和陽(yáng)性對(duì)照。通 過(guò)計(jì)算機(jī)輔助成像分析(AID ELR02外加AID ELISP0T 2.6軟件， Strassberg,德國(guó))計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。
將每孔鋪平板的每細(xì)胞總數(shù)的陽(yáng)性產(chǎn)生IFNi的脾細(xì)胞頻率計(jì)算 為得自于兩不同細(xì)胞濃度的一式兩份的斑點(diǎn)平均值減去類(lèi)似地得自于 在含有非脈沖脾細(xì)胞的對(duì)照孔中測(cè)量的斑點(diǎn)的平均值之差。產(chǎn)生IFN-Y的細(xì)胞頻率的變化定義為超過(guò)95%置信界限(confidence bound)， 所述置信界限由對(duì)照的測(cè)量值計(jì)算。認(rèn)為p值< 0.05的差異是顯著 的。
實(shí)施例7
人HER2蛋白中免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位的鑒定
將312種彼此重疊11個(gè)氨基酸的15個(gè)氨基酸的肽設(shè)計(jì)成跨越整 個(gè)人HER2序列。這些肽也包括設(shè)計(jì)用于克服不溶性問(wèn)題的七肽，是通 過(guò)SynPep (Dublin, CA)合成的。所有的肽經(jīng)HPLC證明〉90°/。純，因 而無(wú)需HPLC純化而使用。將肽以35 mg/ml在DMS0中重構(gòu)。將并不立 即溶解的那些肽于371C搖動(dòng)以助其溶解。如有必要，再加入1到3 體積的DMS0以充分溶解經(jīng)數(shù)小時(shí)搖動(dòng)后依然不溶的那些肽。組合重構(gòu) 的肽，從而每一種肽都等同地在混合物中呈現(xiàn)。混合物中每一種肽的 終濃度經(jīng)計(jì)算為1 mg/ml。將每一種混合物等分試樣并貯存于80TC。
為鑒定BALB/c小鼠(H-2d遺傳背景)中人HER2基因的免疫優(yōu)勢(shì)T 細(xì)胞表位，將6周齡雌性BALB/c小鼠通過(guò)在四頭肌中注射10' vp Ad5-hHER2進(jìn)行免疫。二次注射于3周后進(jìn)行。將第二組小鼠類(lèi)似地 用生理鹽水溶液注射，作為陰性對(duì)照。二次注射后三周，處死動(dòng)物， 并通過(guò)干擾素-y酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(IFNi ELISPOT)測(cè)定評(píng)價(jià)小鼠脾細(xì)胞 中分泌IFN-y的T細(xì)胞的頻率。
將跨越整個(gè)人HER2蛋白序列、彼此重疊ll個(gè)殘基、各自長(zhǎng)15個(gè) 氨基酸的311種肽自N末端到C末端組合到以字母表字母A到K標(biāo)示 的11個(gè)庫(kù)中。對(duì)這些庫(kù)中的每一個(gè)都測(cè)試其刺激IFNi脾T細(xì)胞的能 力。對(duì)于肽庫(kù)A、 B和M，與不存在肽的對(duì)照相比，IFN-y ELISP0T測(cè) 量到用Ad5-hHER2免疫的小鼠具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的IFN-y生產(chǎn)。為鑒定 負(fù)責(zé)所述活性的個(gè)體肽，將來(lái)自庫(kù)A、 B和M的肽劃分成亞庫(kù)，其中Am 和AIV、 Bm及M,得分為正。然后對(duì)來(lái)自這些陽(yáng)性亞庫(kù)的單個(gè)肽測(cè)試其 觸發(fā)IFN-y釋放的能力。重疊肽hNeu-15和hNeu-16展示出高且相當(dāng) 的反應(yīng)性。而重疊肽hNeu-41和hNeu-42展示出低得多的反應(yīng)性。另 一種肽hNeu-301也證明含有T細(xì)胞表位。
為證實(shí)這些數(shù)據(jù)并鑒定負(fù)責(zé)IFNi生產(chǎn)的CD4+或CD8+ T細(xì)胞亞 型，通過(guò)胞內(nèi)染色(ICS)表征了分泌IFN-y的T細(xì)胞。將小鼠脾細(xì)胞與 單個(gè)肽在分泌抑制劑布雷菲爾德菌素A的存在下溫育12小時(shí)，固定， 滲透，然后進(jìn)行胞內(nèi)IFN-y、 CD3和CD4或CD8標(biāo)記染色，并通過(guò)流式 細(xì)胞術(shù)分析。ICS證實(shí)了肽hNeu-15的反應(yīng)性，從而將其鑒定為能夠 活化CD8+細(xì)胞的表位。肽hNeul5和hNeul6在ELISPOT分析中等同地 起反應(yīng)，提示CD8+表位應(yīng)當(dāng)包含在這兩個(gè)肽所共有的11個(gè)氨基酸殘基 中。
為鑒定靶九聚體序列，我們測(cè)試了跨越hNeul5和hNeul6之間的 重疊區(qū)的三種長(zhǎng)9個(gè)氨基酸的肽。hNeul5.3經(jīng)證明是最具反應(yīng)性的， 與15個(gè)氨基酸長(zhǎng)的肽hNeul5和hNeul6相比，表現(xiàn)出略微增大的反應(yīng) 性。有意思的是，對(duì)于hNeul5. 1也檢測(cè)到大約一半的反應(yīng)性，從而表 明兩個(gè)重疊但截然不同的CD8+表位共存于這11個(gè)氨基酸序列之中。
IFN-y ICS分析也證實(shí)了 hNeu301的反應(yīng)性，并將其類(lèi)型測(cè)定為 CD8+表位。通過(guò)IFN-y ELISPOT對(duì)這些CD8+表位的分析證實(shí)了由ICS 獲得的結(jié)果。最后，對(duì)于hNeu41和hNeu42肽，檢測(cè)到低反應(yīng)性，它 們的低水平應(yīng)答主要地為CD4+。
實(shí)施例8
胞內(nèi)細(xì)胞因子染色
胞內(nèi)IFN-y產(chǎn)生根據(jù)BDPharmingen標(biāo)準(zhǔn)方案測(cè)量。簡(jiǎn)要地，在6 pg/ml單個(gè)肽或肽庫(kù)和作為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的布雷菲爾德菌素A的存 在下，將2 x 106脾細(xì)胞在RIO培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時(shí) (Cytof ix/CytopermPlusTM連同GolgiPlugTM試劑盒；BD Pharmingen; San Diego, CA)。將10 |ng/ml的葡萄球菌腸毒素B (SEB) (cat. No. S4881, SIGMA, Saint Louis, MI)和DMS0分別作為陽(yáng)性和背景對(duì)照 與脾細(xì)胞一起進(jìn)4亍測(cè)試。
在表面抗原染色之前，利用Ab抗-小鼠CD16/CD32降低非特異性 免疫萸光信號(hào)(cat No. 553142， BD PharMingen， San Diego， CA)。 特異性信號(hào)是用APC-抗-小鼠CD3e、 PE-抗-小鼠CD4和PerCP-抗-小 鼠CD8a (cat. No. 553066， 553653和553036， BD Pharmingen; San Diego, CA)獲得的。然后洗滌細(xì)胞，固定，滲透，并利用FITC-綴合 的mAb (cat. No. 554411， BD Pharmingen San Diego， CA)進(jìn)行胞 內(nèi)IFN-y染色。T淋巴細(xì)胞IFN-y計(jì)算為1000 x [ (IFN-y+、 CD3+和CD4+ 或CD8+)/(CD3+和CD4+或CD8+)]。通常，通過(guò)同時(shí)門(mén)控CD3+事件和 小淋巴細(xì)胞，收集至少50， 000個(gè)CD3+淋巴細(xì)胞。所有的樣品都是利 用FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest軟件(Becton Dickinson, San Jose， CA)在染色24小時(shí)內(nèi)荻取的。
實(shí)施例9
抗體滴定和同種型分型
用于抗體滴定的血清是通過(guò)眶后放血獲得的。將ELISA板(Nunc MaxisorpTM， Roskilde,丹麥)于4匸用2 |ng/ml濃度溶于50mM NaHC03 (pH 9. 6)之中的山羊抗-人IgG Fc-特異性(Pierce; Cat. n. 31123) 涂覆過(guò)夜。除去過(guò)量抗體，并通過(guò)在PBBST5緩沖液(BSA 5%. Tween 0. 05%)中于371c溫育60分鐘來(lái)封閉非特異性結(jié)合。洗滌后，加入飽 和條件的IgB2細(xì)胞上清液，并于室溫(RT)溫育2小時(shí)(Chen等，JBiol Chem 271 (13): 7620-9 (1996))。 IgB2細(xì)胞(由Dr. Y. Yarden饋贈(zèng)， Weizmann Institute of Science, Rehovot， 以色列)是分泌HER2 胞外結(jié)構(gòu)域和人Ig Fc部分之間的二聚體融合物的HEK-293細(xì)胞。洗 滌板子，并將PBBST1緩沖液(BSA 1%, Tween 0. 05%)中的血清系列稀 釋物(從1: 4， 000到1: 25， 600)于41c溫育過(guò)夜。將免疫前血清用作為 背景。洗滌用PBBST1進(jìn)行。將二抗(山羊抗-小鼠IgGl或IgG2a， AP-綴合的(Pharmingen， 557272和553389))于PBBST5中以1:40,000 進(jìn)行稀釋?zhuān)⒃趽u動(dòng)器上于室溫溫育2-3小時(shí)。洗滌后，將板子通過(guò) 與Sigma 106磷酸酶底物(Sigma; cat.n. A106)在二乙醇胺中溫育顯 色。板子通過(guò)自動(dòng)化ELISA讀數(shù)器(Labsistems Multiskan Bichromatic， Helsinki,芬蘭)讀數(shù)，且結(jié)果表達(dá)為A = A4。5n - A62。nm。 對(duì)于每一個(gè)樣品，都減去用免疫前血清檢測(cè)到的背景信號(hào)。
抗-hHER2血清滴度計(jì)算為產(chǎn)生比相同稀度下自體免疫前血清的吸 收值大至少3倍的吸收值的血清有限稀度的倒數(shù)。
實(shí)施例10
hHER2opt提高的免疫原性
為研究由野生型和密碼子最優(yōu)化了的hHER2表達(dá)載體所誘導(dǎo)的體 內(nèi)免疫應(yīng)答，將BALB/c小鼠用pVlJ-hHER2. wt或pVlJ-hHER2. opt質(zhì) 粒DM進(jìn)行肌內(nèi)免疫，接著進(jìn)行ES (如實(shí)施例5中所述)。對(duì)小鼠于6、 8和IO周齡進(jìn)行三次注射。末次免疫后兩周，從各小鼠中分離脾細(xì)胞。 為定量通過(guò)質(zhì)粒DNA免疫所產(chǎn)生的分泌IFNy的hHER2特異性CD8 T細(xì) 胞前體的頻率，使用了對(duì)H-2、艮制的T細(xì)胞表位hNeul5. 3和hNeu42 的ELISPOT測(cè)定。用HER2野生型序列免疫引發(fā)了剛剛可檢測(cè)的CD8+ 應(yīng)答，且不存在與CD4+肽的反應(yīng)性。相反，最優(yōu)化的HER2序列誘導(dǎo) 針對(duì)CD8+肽增強(qiáng)10倍的應(yīng)答，從而得到最多達(dá)286個(gè)特異于所測(cè)表 位的IFNy斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC，平均值)。也檢測(cè)到較低的CD4+活性。 在pVlJ-nsB免疫小鼠中未檢測(cè)到肽特異性的IFNy SFC (數(shù)據(jù)未顯 示)。
利用IgB2蛋白作為底物通過(guò)ELISA測(cè)試了來(lái)自相同小鼠的血清(圖 4B)。在所有pVlJ-hHER2. opt免疫小鼠中檢測(cè)了 hHER2特異性的抗體 滴度，且Ab滴度的幾何平均值對(duì)于IgGl或IG2a為46, 000或78， 000。 相反，pVlJ-hHER2.wt免疫組表現(xiàn)出低大約100倍的hHER2特異性抗 體的幾何平均滴度。從而，這些結(jié)果證明經(jīng)密碼子最優(yōu)化的hHER2 cDNA 在引發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答方面比野生型序列更為有效。
實(shí)施例11
腺病毒栽體
MRKAd5-hHER2. wt:將來(lái)自含有人HER2 cDNA的pVU_hHER2的 5Val-^71 MA片段克隆在穿梭質(zhì)粒polyMRKAEl的相應(yīng)位點(diǎn)中(Bett 等，Proc Natl Acad Sci U S A 91 (19): 8802-04 (1994))。所得 質(zhì)粒pMRKAEl-函R2含有驅(qū)動(dòng)人HER2 cMA表達(dá)的人CMV啟動(dòng)子，接 下來(lái)是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化信號(hào)。將質(zhì)粒pMRKAEl_hHER2與腺病毒 主鏈質(zhì)粒pAd5_HV0重組以產(chǎn)生前腺病毒質(zhì)粒pAd5-hHER2wt。
MRKAd5-h腿2EC證.opt:將質(zhì)粒pCR-hHER2opt用細(xì)RI消化。 純化所得的2156 bp插入片段，并克隆到polyMRK-Ad5穿梭質(zhì)粒的 fcoRI中(見(jiàn)Emini等，W0 02/22080,特此并入作為參考)。
將質(zhì)粒pAd5-hHER2. wt和pMRKAd5-hHER2. opt通過(guò)消化而 線(xiàn)性化，并轉(zhuǎn)染到PerC6細(xì)胞中以產(chǎn)生Ad5-hHER2重組腺病毒。病毒 通過(guò)多輪擴(kuò)增進(jìn)行大量生長(zhǎng)，并通過(guò)氯化銫梯度超速離心純化 (Fallaux等，Hum Gene Ther 9 (13): 1909-17 (1998))。病毒DM 通過(guò)蛋白酶K消化提取，并通過(guò)限制酶切分析證實(shí)基因組的完整性。
將HEK 293細(xì)胞由MRKAd5-固R2. wt或MRKAd5-hHER2EC畫(huà).opt 使用多種感染復(fù)數(shù)(m. o. i.)感染。由蛋白印跡分析監(jiān)控的表達(dá)揭示了 由密碼子最優(yōu)化了的序列表達(dá)的截短蛋白與由野生型HER2序列表達(dá)的 全長(zhǎng)蛋白之間超過(guò)10倍的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例12
免疫方案的比較
將腺病毒誘導(dǎo)抗-人HER2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效率同與電刺激 相關(guān)的質(zhì)粒DNA的效率進(jìn)行了比較，兩者都攜帶有CMV-HER2表達(dá)盒。
于6和9周齡將50 pg質(zhì)粒pVlJ-HER2注射到野生型BALB/c小鼠或 超表達(dá)大鼠HER2的BALB/c轉(zhuǎn)基因小鼠(記做NeuT，見(jiàn)Lucchini等， Cancer Lett 64 (3): 203-9 (1992))的四頭肌中，接著進(jìn)行ES。加 強(qiáng)免疫后兩周，處死動(dòng)物，收集脾細(xì)胞并用含免疫優(yōu)勢(shì)pl85表位的肽 刺激。繼用人肽刺激后，在BALB/c和neuT小鼠中都檢測(cè)到極低的斑 點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)(圖5)。平均起來(lái)，所述應(yīng)答比由Ad5-HER2免疫所 誘導(dǎo)的低50倍。上述數(shù)據(jù)表明對(duì)于每一種方案而言，用質(zhì)粒pVlJ-HER2 免疫小鼠在BALB/c和neuT小鼠中誘導(dǎo)相當(dāng)?shù)膽?yīng)答。
實(shí)施例13
用人HER2聯(lián)合人CEA和EpCAM抗原免疫獼猴(rhesus macaques )
為評(píng)估用人腫瘤抗原HER2聯(lián)合其他肺瘤抗原免疫獼猴(邁acaca 邁Wa〃a)的效率，將一組4只獼猴(2雄和2雌)用表達(dá)密碼子最優(yōu)化 了的人腫瘤抗原Ep-CAM、 CEA和HER2/neu序列的質(zhì)粒DNA載體混合 物進(jìn)行免疫。
免疫研究在生物醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)動(dòng)物研究中心(Biomedical Primate Research Centre) (BPRC， Rijswijk，荷蘭)進(jìn)行。設(shè)計(jì)這些免疫 研究以評(píng)價(jià)由人類(lèi)抗原誘導(dǎo)的針對(duì)相同抗原的獼猴同系物的T細(xì)胞應(yīng) 答。
于第0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14和16周由注射對(duì)猴子進(jìn)行肌內(nèi) 接種，接著進(jìn)行電刺激。在麻醉狀態(tài)下，對(duì)于體重2-5千克的動(dòng)物用 含6 mg質(zhì)粒DNA的1 ml溶液(分至兩個(gè)注射部位，0.5 ml/部位)注 射動(dòng)物。
對(duì)于電刺激，每隔1秒遞送2串100方形雙級(jí)脈沖(每次1秒)， 總治療時(shí)間為3秒。脈沖寬度為2毫秒/相位，脈沖頻率和振幅分別為 100 Hz和lOO mA (恒流方式)。
將相同的猴子隨后于第27和31周用分別表達(dá)人HER2野生型序 列、人CEA或人EpCAM的三種腺病毒5 (AE1-AE3，"第一代，，，P2水 平)的混合物接種。
為測(cè)量針對(duì)使用上述免疫方案的人HER2獼猴同系物的免疫應(yīng)答， 每四周一次收集血樣，總持續(xù)時(shí)間為l年。通過(guò)IFNyElispot測(cè)定測(cè) 量細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在圖7中報(bào)告的結(jié)果顯示上文所討論的免疫
方案在誘導(dǎo)針對(duì)人HER2/neu的內(nèi)源性獼猴同系物的特異性免疫應(yīng)答 方面是有效的。
實(shí)施例14
用pVlJ-HER2opt和pVlJ-HER2ECDTM. opt免疫在小鼠中所引發(fā)的 p185-特異性T細(xì)胞應(yīng)答的比較
評(píng)價(jià)了保留胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的C-末端缺失突變體p185 (HER2ECDTM)的免疫效率。于第10和12周電注射表達(dá)密碼子最優(yōu)化了 的全長(zhǎng)(pVlJ-HER2. opt)或截短型蛋白(pVlJ-HER2ECDTM. opt)序列的 質(zhì)粒DNA，并于第14周進(jìn)行分析。正如由IFN-y ELISPOT分析所測(cè)量 的那樣，作為CD4+和CD8+反應(yīng)性?xún)烧?，截短型蛋白HER2ECDTM誘導(dǎo)的 抗-pl85細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答比由全長(zhǎng)p185蛋白誘導(dǎo)的更高(圖8) 。 C2. 7 小鼠成肌細(xì)胞中的體外表達(dá)分析未揭示這兩個(gè)質(zhì)粒之間表達(dá)上的差異 (數(shù)據(jù)未顯示)。
〈110〉 Merck & Co. ， Inc. Monaci, Paolo Gallo， Pasqimle Nuzzo， Maurizio
<120>編碼人表皮生長(zhǎng)因子2/NEU抗原的合成基因及其用途
<130〉 ITR0065Y-PCT
<150〉 60/489,237 <151> 2003-07-21
<160> 14
〈170〉 Fast,SEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211〉 3768
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<223〉冊(cè)R2opt
<400> 1
ccgccctgtgccgctggggcctgctgctggGCCtgGtgCCccccggcgcc60
gccagcacccaggtgtgcaccggcaccgacatgaagctgcgcctgcccgccagccccgag120
acccacctggacatgctgcgccacctgtacgggcaacctg180
gagctgacctacctgcccaccaacgccagcctgagcttcctgcaggacatccaggaggtg240
cagggctacgtgctgatcgcgtgcgcc郷tgcccctgcagcgcctgcgc300
atcgtgcgcggcacccagctgttcgaggactggccgtgctggacaacggc360
ga,ccccctgaccccgtgaccggcgccagccccggcggcct,gcgcgagctg420
cagctgcgcagcct,gaccgagat,cctga,agggcggcgtgctgatccagcgcaacccccag480
ctgtgctaccaggacaccat,cctgt,ggaagccagctggcc540
ctgaccctgatcgacaccaaccgcagccgcgcctgccacccctgcagccccatgtgcaag600
ggca.gccgctgctggggcga.gagcagcgaggactgccaga.gcctgacccgcaccgtgtgc660
gccggcggct,gcgcccgctgcaagggccccctgcccaccgactgctgccacgagcagtgc720
gccgccggctgcaccggcccc肌gcacagcgactgcctggcctgcctgcacttcaaccac780
a.gcggcatctgcgagctgcactgccccgccctggtgacctacaacaccgacaccttcgag840
agcatgcccaaccccgagggccgctacaccttcggcgccagctgcgtgaccgcctgcccc900
t,acaactacctgagcaccgacgtgggcagctgcaccctggtgtgccccctgcacaaccag960
gaggtgaccgccgaggacggcacccagcgctgcgagaagtgcagcaagccctgcgcccgc1020
gtgtgctacggcctgggcatggagcacctgcgcgaggtgcgcgccgtgaccagcgccaac1080
atccEiggagttcgccggctgcaagaagatcttcggcagcctggccttcctgcccgagagc1140
ttcgacggcgaccccgccagcaacaccgcccccctgcagcccgagcagctgcaggtgttc1200
gagaccctgg汪ggagat,caccggctacctgtacatcagcgcctggcccgacagcctgccc1260
gacctgagcgtgttccagaacctgcaggtgatccgcggccgcatcctgcacaacggcgcc1320
t,a,cagcctgaccctgcagggcctgggcatcagctggctgggcctgcgcagcctgcgcgag1380
ct,gggca.gcggcct,ggccctgatccaccactgtgcttcgtgcacaccgtg1440
ccct,ggga.ccagct,gtt,ccgcaacccccaccaggccctgctgcacaccgccaaccgcccc1500
gcgtgggcga.gggcctggcct,gccaccagctgtgcgcccgcggccactgc1560
tggggccccggCCCC3CCC3tgcagccagttcctgcgcggcc柳agtgc1620
gtggaggagtgccgcgtgctgcagggcctgccccgcgagtacgtgaacgcccgccactgc1680
ctgccctgccaccccgagtgccagccccagaacggcagcgtgacctgcttcggccccgag1740
gccgaccagtgcgtggcctgcgcccactacaaggacccccccttctgcgtggcccgctgc1800
cccagcggcgtgaagcccgacctgagctacatgcccatctggaagttccccgacgaggag1860
ggcgcctgccagccctgccccat,caactgcacccacagctgcgtggacctggacgacaag1920
ggctgccccgccga,gca,gcgcgccagccccct,gaccagcatcatcagcgccgtggtgggc1980
at,cctgctggtggt,ggtgct,gggcgt,ggt,gttcggcatcctgatcaagcgccgccagcag2040
a,a.gat,ccgca.a.gt,aca.ccat,gcgccgcct,gctgcaggagaccgagctggtggagcccct,g2100
a.cccccagcggcgccat,gcccaaccaggccca.ga,t,gcgcatcctgaaggagaccgagctg2160
cgcaaggtga,aggtgct,gggcagcggcgcct,tcggcaccgtgtacaagggcatctggatc2220
cccgacggcgagaacgtgaagatccccgtggccatcgccgtgctgcgcgagaacaccagc2280
ccc朋ggccaacaaggagatgcctacgtgatggccggcgtgggcagcccc2340
tacgtgagccgcctgctgggcatctgcctgaccagcaccgtgcagctggtgacccagctg2400
atgccct,acggctgcctgctggaccacgtgcgcgagaaccgcggccgcctgggcagccag2460
ga,cctgctgaactggtgcat,gcagatcgccaagggcatgagctacctggaggacgtgcgc2520
ct,ggtgcaccgcgacctggccgcccgcaa,cgtgctggtgaagagccccaaccacgtgaag2580
atcaccgact,tcggcctggcccgcctgctggacatcgacgagaccgagtaccacgccgac2640
ggcggca,aggt,gcccatcaagtggat,ggccctggagagcatcctgcgccgccgcttcacc2700
cacca,ga,gcga,cgtgt,ggagctacggcgtgaccgtgtgggagctgatgaccttcggcgcc2760
a,agccctacga.cggcatccccgcccgcgagatccccgacctgctggagaagggcgagcgc2820
ctgccccagccccccatctgcaccatcgacgtgtacatgatcatggtgaagtgctggatg2880
atcgacagcgagtgccgcccccgcttccgcgagctggtgagcgagttcagccgcatggcc2940
cgcgacccccagcgcttcgtggtgatccagaacgaggacctgggccccgccagccccctg3000
gacagcaccttctaccgcagcctgctggaggacgacgacatgggcgacctggtggacgcc3060
t,ggtgccccagcagggcttct,tct,gccccgaccccgcccccggcgccggc3120
ggca.t,ggtgcccgca,gca.gcgcggcggcggcgacctgacc3180
ctgggcctgga,gcccagcgaccccgcagccccctggcccccagcgagggc3240
gccggca.gcga,cgt,gt.tcgacggcgacctgggca,tgggcgccgccaagggcctgcagagc3300
ct,gcccacccacgaccccagccccctgcagcgctacagcgaggaccccaccgtgcccctg3360
ccca.gcgagaccgacggctacgtggcccccctgacctgcagcccccagcccgagtacgtg3420
aaccagcccgac.gtgcgccccca,gccccccagcccccgcgagggccccctgcccgccgcc3480
cgccccgccggcgcca.ccctggagcgccccaagaccctgagccccggcaagaacggcgtg3540gtgaaggacg tgttcgcctt cggcggcgcc gtggagaacc ccgagtacct gaccccccag 3600
ggcggagctg ctcctcagcc tcaccctcca cctgctttca gccctgcttt cgacaacctg 3660
tactactggg accaggaccc tcctgagagg ggtgctcctc ctagcacctt caagggcacc 3720
cccaccgccg agaaccccga gt.acctgggc ctggacgtgc ccgtgtaa 3768
<210〉 2
<211> 1255
<212〉 PRT
<213〉智人(Homo s鄰iens) ， HER2
<400〉 2
Met, Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
15 10 15
Pro Pro Gly Ala. Ala Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gin Gly Cys Gin Val Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gin Asp lie Gin Glu Val 65 70 75 80
Gin Gly Tyr Val Uu lie Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro Leu
85 90 95
Gin Arg Leu Arg lie Va.l Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala. Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu lie Leu Lys Gly Gly Val Leu lie Gin Arg Asn Pro Gin 145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gin Asp Thr lie Leu Trp Lys Asp lie Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gin Leu Ala Leu Thr Leu lie Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gin Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gin Cys 225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly lie Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
Thr
Tyr
Ser 305 Glu
Pro
Va.l
Lys
Pro 385 Glu
Asp
Gly
Gly
Leu 465 Pro
Ala
Gin
Val
Arg 545 Leu
Phe
Pro
Ser
Tyr
Thr 290 Thr
Val
Cys
Arg
lie 370 Ala
Thr
Ser
Arg
lie 450 Ala
Trp
Asn
Leu
Asn 530 Val
Pro
Gly
Pro
Tyr
Asn 275 Phe
Asp
Thr
Ala
Ala 355 Phe
Ser
Leu
Leu
lie 435 Ser
Leu
Asp
Arg
Cys 515 Cys
Leu
Cys
Pro
Phe 595 Met
260 Thr
Gly
Val
Ala
Arg 340 Val
Gly
Asn
Glu
Pro 420 Leu
Trp
lie
Gin
Pro 500 Ala
Ser
Gin
His
Glu
580
Cys
Pro
Asp
Ala
Gly
Glu 325 Val
Thr
Ser Thr
Glu
艦 Asp
His
Leu
Thr
Ser
Ser 310 Asp
Cys
Ser
Leu
Ala. 390 lie
Leu
Asn Gly
His His 470
Leu 485 Glu
Arg
Gin
Gly
Pro 565 Ala
Val
lie
Phe
Asp
Gly
Phe
Leu 550 Glu
Asp
Ala
Trp
Phe
Cys 295
Cys
Gly
Tyr
Ala
Ala 375 Pro
Thr
Ser
Gly
Leu 455 Asn
Arg
Glu
His
Leu 535 Pro
Cys
Gin
Arg
Lys
Glu 280 Val
Thr
Thr
Gly
Asn 360 Phe
Leu
Gly
Val
Ala 440 Arg
Thr
Asn
Cys
Cys 520 /\rg
Arg
Gin
Cys
Cys 600 Phe
265 Ser
Thr
Leu
Gin
Leu 345 lie
Leu
Gin
Tyr
Phe 425 Tyr
Ser
His
Pro
Val 505 Trp
Gly
Glu
Pro
Val 585 Pro
Met
Ala
Val
Arg 330 Gly
Gin
Pro
Pro
Leu 410 Gin
Ser
Leu
Leu
His 490 Gly
Gly
Gin
Tyr
Gin
570 Ala
Ser
Pro Asp
Pro
Cys
Cys 315
Cys
Met Glu Glu
Glu
395 Tyr
Asn
Leu
Arg
Cys 475 Gin
Glu
Pro
Glu
Val 555 Asn
Cys
Gly
Glu
Asn
Pro 300 Pro
Glu
Glu
Phe
Ser 380 Gin
lie
Leu
Thr
Glu
460 Phe
Ala
Gly
Gly
Cys 540 Asn
Gly
Ala
Val
Glu
Pro 285 Tyr
Leu
Lys
His
Ala 365 Phe
Leu
Ser
Gin
Leu 445 Leu
Val
Leu
Leu
Pro 525 Val
Ala
Ser
His
Lys 605 Gly
270 Glu
Asn
His
Cys
Leu 350 Gly
Asp
Gin
Ala
Val 430 Gin
Gly
His
Leu
Ala 510 Thr
Glu
Arg
Val
Tyr 590 Pro
Ala
Gly
Tyr
Asn
Ser 335 Arg
Cys
Gly
Val
Trp 415 lie
Gly
Ser
Thr
His 495 Cys
Gin
Glu
His
Thr 575 Lys
Asp
Cys
Arg Leu
Gin
320 Lys
Glu
Lys
Asp
Phe 400 Pro
Arg
Leu
Gly
Val 480 Thr
His
Cys
Cys
Cys 560 Cys
Asp
Leu
Gin
Pro 625 Gly
Ala
lie
Arg
Ala 705 Arg
Gly
Ala
Asp
Leu 785 Met
Leu
Met
Arg
Gly 865 Gly
Arg
Trp
Arg
Pro 945 lie
610
Cys
Cys
Val
Leu
Leu 690 Met
Lys
lie Va
Glu
770 Leu
Pro
Gly
Ser
Asn 850 Leu
Gly
/\rg
Glu
Glu
930 lie
Asp
Pro
Pro
Val
lie 675 Leu
Pro
Val
Trp
Leu 755 Ala
Gly
Tyr
Ser
Tyr 835 Val
Ala
Lys
Phe
Leu 915 lie
Cys
Ser
lie
Ala
Gly 660 Lys
Gin
Asn
Lys
lie 740 Arg
Tyr
lie
Gly
Gin
820 Leu
Leu
Arg
Val
Thr
恥O Met
Pro
Thr
Glu
Asn
Glu 645 lie
iVrg
Glu
Gin
Val 725 Pro
Glu
Val
Cys
Cys 805 Asp
Glu
Val
Leu
Pro 885 His
Thr
Asp
lie
Cys
Cys 630 Gin
Leu
Arg
Thr
Ala 710 Leu
Asp
Asn
Met
Leu 790 Leu
Leu
Asp
Lys
Leu 870 lie
Gin
Phe
Leu
Asp 950 Arg
615 Thr
Arg
Leu
Gin
Glu 695 Gin
Gly
Gly
Thr
Ala. 775 Thr
Leu
Leu
Val
Ser 855 Asp
Lys
Ser
Gly
Leu 935 Val
Pro
His
Ala
Val
Gin 680 Leu
Met,
Ser
Glu
Ser 760 Gly
Ser
Asp
Asn
/\rg 840 Pro
lie
Trp
Asp
Ser
Ser
Val 665 Lys
Val
Arg
Gly
Asn 745 Pro
Val
Thr
His
Trp 825 Leu
Asn
Asp
Met
Val 905 Ala Lys 920
Glu Lys Tyr Met Arg Phe
Cys
Pro 650 Val
lie
Glu
lie
Ala 730 Val
Lys
Gly
Val
Val 810
Cys
Val
His
Glu
Ala 890 Trp
Pro
Gly
lie
Arg
Val 635 Leu
Leu
Arg
Pro
Leu 715
Phe
Lys
Ala
Ser
Gin 795 Arg
Met
His
Val
Thr 875 Leu
Ser
Tyr
Glu
Met 955 Glu
620 Asp
Thr
Gly
Lys
Leu 700 Lys
Gly
lie
Asn
Pro 780 Leu
Glu
Gin
Arg
Lys 860 Glu
Glu
Tyr
Asp
Arg 940 Val
Leu
Leu
Ser
Val
Tyr 685 Thr
Glu
Thr
Pro
Lys 765 Tyr
Val
Asn
lie
Asp 845 lie
Tyr
Ser
Gly
Gly 925 Leu
Lys
Val
Asp
lie
Val 670 Thr
Pro
Thr
Val
Val 750 Glu
Val
Thr
Arg
Ala 830 Leu
Thr
His
lie
Val 910 lie
Pro
Cys
Ser
Asp Lys 640 lie Ser 655
Phe Gly
Met Arg
Ser Gly
Glu Leu 720 Tyr Lys 735
Ala lie
lie Leu
Ser Arg
Gin Leu ■ Gly Arg 815
Lys Gly
Ala Ala
Asp Phe
Ala Asp 880 Leu Arg 895
Thr Val
Pro Ala
Gin Pro
Trp Met 960 Glu PheSer Arg Met Ala 980 Pro
Asp Leu Gly 995
Leu Glu Asp
1010 Val Pro Gin 1025
Gly Met Val
Asp Gin His
965
Arg Asp Pro Gin Arg 985
Ala Ser Pro Leu Asp 1000
Asp Met Gly Asp Leu 1015
Gly Phe Phe Cys Pro 1030
His Arg His Arg Ser 1045
Leu Gly Leu Glu Pro
970 975 Phe Val Val lie Gin Asn Glu 990
Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu 1005
Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu 1020
Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly
1035 1040 Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly 1050 1055 Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg
Gly Asp Leu Thr
1060 1065 1070
Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp VaPhe Asp Gly
1075 1080 1085
Asp Leu Gly Met, Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gin Ser Leu Pro Thr His
IO恥 1095 1100
Asp Pro Ser Pro Leu Gin Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu 1105 1110 1115
Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala. Pro Leu Thr
1125 1130 Pro Glu Tyr Val Asn Gin Pro Asp Val Arg Pro Gin
1145
Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly 1160
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val
1175 1180 Ala Va.l Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gin 1190 1195 1200
Gin Pro His Pro Pro Pro Ala. Phe Ser Pro Ala 1210 1215
1140
Arg Glu Gly Pro Leu 1155
Arg Pro Lys Thr Leu 1170
Pile Ala Phe Gly Gly 1185
Gly Gly Ala. Ala. Pro 1205
1120 Cys Ser Pro Gin 1135
Pro Pro Ser Pro
1150 Ala Thr Leu Glu 1165
Val Lys Asp Val
Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gin Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala
1220 1225 1230
Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gy Leu Asp Va.l Pro Val 1250 1255
<210〉 3
<211〉 43
<212〉 DNA <213>人工序列<220>
<223〉 PCR引物 <400〉 3
ccagtttaaa catttaaatg ccgccaccat ggagctggcg gcc 43
<210> 4 <211> 33 <212> DNA <213〉人工序列
<220〉
<223> PCR引物 <400〉 4
gccgtcga.ct tt,aca.ctggc acgtccagac cca 33
<210〉 5 <211〉 19 <212〉 PRT <213>人工序列
<220>
<223> HER2肽 <400> 5
Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala. Ser Leu Ser
15 10 15
Phe Leu Gin
<210> 6 <211> 19 <212〉 PRT <213>人工序列
<220>
<223> HER2肽 <400〉 6
Leu Cys Tyr Gin Asp Thr lie Leu Trp Lys Asp lie Phe His Lys Asn
15 10 15
Asn Gin Leu
<210> 7 <211〉 15 <212〉 ra丁 <213>人工序列
<220>
<223> HER2肽 <400> 7
Gly Gly Ala Ala Pro Gin Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro 15 10 15
<210〉 8 <211〉 9 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223> Kozak序列 <400> 8
gccgccacc 9
<210> 9 <211〉 2028 <212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223> HER2ECDTMopt
<400> 9
a.t,gga.gctgg ccgccctgtg ccgctggggc ct,gct,gct,gg ccctgctgcc ccccggcgcc 60
gccagcaccc aggt,gt,gcac cggcaccga.c atga.a.gctgc gcctgcccgc cagccccgag 120
accca.cct,gg acatgctgcg ccacctgtac cagggctgcc aggtggtgca gggcaacctg 180
gagctgacct a.cctgcccac caacgccagc ctgagct.tcc tgcaggacat ccaggaggtg 240
cagggct,acg t,gctgat,cgc cca.caaccag gtgcgccagg tgcccctgca gcgcctgcgc 300
atcgtgcgcg gcaccca.gct gt,tcgaggac aa.ct,acgccc tggccgtgct ggacaacggc 360
gaccccct,ga aca.a.caccac ccccgtgacc ggcgccagcc ccggcggcct gcgcgagctg 420
ca.gctgcgca gcctgaccga gatcctgaag ggcggcgtgc tgatccagcg caacccccag 480
ctgtgctaccaggacaccatcctgtggaaggacatcttccccagctggcc540
ctgaccctgatcgacaccaaccgcagccgcgcctgccacccctgcagccccatgtgcaag 600ggcagccgctgctggggcgagagcagcgaggactgccagagcctgacccgcaccgtgtgc 660gccggcggctgcgcccgctgcaagggccccctgcccaccgactgctgccacgagcagtgc 720gccgccggctgcaccggcccc肌gcacagcgactgcctggcctgcctgcacttcaaccac780
agcggcatct,gcgagctgca,ctgccccgccctggtgacctacaacaccgacaccttcgag 840agcatgcccaccgctacaccttcggcgccagctgcgtgaccgcctgcccc900
t,acaact,a,cctgagcaccgacgtgggcagctgcaccctggtgtgccccctgcacaaccag960
gaggtgaccgccgaggacggcacccagcgctgcgagaagtgcagcaagccctgcgcccgc1020
gtgtgctacggcctgggcatggagcacctgcgcgaggtgcgcgccgtgaccagcgccaac1080
atccaggagttcgccggctgttcggcagcctggccttcctgcccgagagc1140
ttcgacggcgaccccgcca,gcccctgcagcccgagcagctgcaggtgttc1200
g卿ccct,ggaggagatcaccggcta.cctgta.catcagcgcctggcccgacagcctgccc1260
ga,cct,ga.gcgtgttccagaacctgcaggt,ga,tccgcggccgcat'cctgcacaacggcgcc1320
ta,cagcctgaccct,gcagggcctgggcatca.gctggctgggcctgcgcagcctgcgcgag1380
ctgggcagcggcctggccctgatccaccactgtgcttcgtgcacaccgtg]440
ccct.gggaccagctgttccgcaacccccaccaggccctgctgcacaccgcca^ccgcccc1500
gaggacgagt,gcgtgggcga,gggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgcggccactgc1560
t,ggggccccggccccacccagtgcgtgaactgcagccagttcctgcgcggccaggagtgc1620
gtggaggagtgccgcgtgctgcagggcctgccccgcgagtacgtgaacgcccgccactgc1680
ctgccct,gccaccccga,gtgccagccccagaacggcagcgtgacctgcttcggccccgag1740
gccgaccagtgcgtggcctgcgcccactacaaggacccccccttctgcgtggcccgctgc1800
cccagcggcgcctgagctaca,tgc)cca.tctggaagttccccgacgaggag1860
ggcgcctgcca.gccct,gcccca,tcaactgcacccacagctgcgtggacctggacgacaag1920
ggctgccccgccg，a,gcgctgac'cagcatca.tcagcgccgtggtgggc1980
at,cctgct,ggt.ggtggtgctgggcgt,ggtgt,tcggcatcctgatctga2028
<210〉 10
〈211〉 2028
<212〉 DNA
<213〉人工序列
<220>
<223〉鵬2ECDTMwt
<400〉 10
a,tggagctggcggcct,tgtgccgctgggggctcct,cctcgccctcttgccccccggagcc60
gcgagca.cccaagtgtgcaca.tgaagctgcggctccctgccagtcccgag120
acccacctggacatgct,ccgccacct,cta.ccagggctgccaggtggtgcagggaaacctg180
ga,actcaccta.cctgcccaccaa/tgccagcct,gtcctt,cctgcaggatatccaggaggtg240
cagggct,a.cgt,gct,cat,cgcgtga,ggcaggtcccactgcag鄉(xiāng)ctgcgg300
attgt,gcga.ggca.cccagctctttgaggaca,actat,gccctggccgtgctagacaatgga360
gacccgctgaccctgtca,ca.ggggcct,ccccaggaggcctgcgggagctg420
cagct,t,cgaa,gcctcacagatgatccagcggaacccccag480
ctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatct'tccaca3gaacaaccagctggct540
ctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgtaag 600ggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtctgt660
gccggtggctgtgcccgctgctgcccactgactgctgccatgagcagtgt720
gctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaaccac780
agt,ggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctcacgtttgag 840tccatgcccaatcccgagggttcggcgccagct.gtgtgactgcctgtccc 900tacaacta,cct,ttct,etcggacgtggga,t,cctgcaccctcgtctgccccct960
ga,ggt.ga,ca,gca,ga,gga,t,ggaaca,ca,gcggtgtga,gaagt,gcagcaagccctgtgcccga1020
gt,gt,gct,atggtctgggca.tggag謡ttgcgagaggtgagggcagttaccagtgccaat1080
at,cca,gga.gtttgctggctgt,ttgggagcctggcattt,ctgccggagagc1140
t,t,t,gatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagceigctccaagtgttt1200
ga,ga,ct,ctgga,ggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcct1260
gacctcagcgtct,t,ccagaacctgcaagt,aatccggggacgaattctgcacaatggcgcc1320
tact,cgctga.ccctgca,agggct,gggcat,ca.gctggctggggctgcgctcactgagggaa1380
ga,ctggccctcat'ccaccattctgcttcgtgcacacggtg1440
ccctgggacca,gctctt,tcggaa,cccgcaccaagct,ctgctcca.cactgccaaccggcca1500
g鄉(xiāng)acgagtgtgtgggcgagggcct,ggcct,gccaccagctgtgcgcccgagggcactgc1560
t,ggggtccagggccca,ccca,gtgtgtca,actgcagccagttccttcggggccaggagtgc1620
gtggaggaatgccga,gtactgcaggggctccccagggagtatgtgaatgccaggcactgt1680
ttgccgtgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggag1740
gctgaccagtgtgt,ggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgc1800
cccagcggtgtgaaacct,ga,cctct,cct,acatgccca,tctggaagtttccagatgaggag1860
ggcgcatgccagccttgccccatcaactgca,cccactcctgtgtggacctggatgacaag1920
ggctgccccgccga.gcagagctgacgtcca.t,catctctgcggtggttggc1980
attctgctggt,cgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatctga2028
<210〉 11
<211〉 3778
<212〉 DNA
<213〉人工序列
<220〉
<223〉 h服R2opt + Kozak
〈400〉 11
gccgccaccatggagctggccgccctgtgccgctggggcctgctgctggccctgctgccc 60cccggcgccgccagcaccca ggtgtgcaccggcaccgacatgaagctgcgcctgcccgcc120
agccccgagacccacctggacatgctgcgccacctgtaccagggctgccaggtggtgcag180
ggcaacctggagctga,cctacctgcccaccaacgccagcct,gagcttcctgcaggacatc240
caggaggtgcagggct,acgt,gctgatcgcccacaaccaggtgcgccaggtgcccctgc鄧300cgcctgcgcat,cgtgcgcggcacccagctgt,t,cgaggacaactacgccctggccgtgctg360
cccgtgaccggcgccagccccggcggcctg420
cgcgagct,gcagctgcgcagcctgaccgagatcctgaagggcggcgtgctgatccagcgc480
aacccccsgc cagctggccc
accgtgtgcg gagcagtgcg ttcaacca.ca accttcgaga gcctgcccct cacaaccagg tgcgcccgcg agcgcca,a.ca. cccgagagct, caggtgtt,cg agcctgcccg a.acggcgcct ctgcgcgagc cacaccgtgc aaccgccccg ggccactgct, ca.ggagtgcg cgcca.ctgcc ggccccgagg gcccgctgcc gacgaggagg
gtggtgggca cgccagcaga ga,gcccctga. a,ccga,gct,gc a.tctggat,cc
ggcagcccct acccagctga ggca,gccagg ga.cgtgcgcc cacgtgaaga. cacgccgacg cgct,tcaccc t,tcggcgcca, ggcgagcgcc t,gctgga.tga cgcatggccc a.gccccctgg gtggacgccg
tgt,gctacca tgaccctgat gcagccgctg ccggcggctg ccgccggctg gcggcatctg gcatgcccaa acaactacct aggtgaccgc tgtgct,acgg tcca.gga.gtt tcgacggcga, agaccctgga, acctgagcgt acagcct,gac tgggcagcgg cctggga.cca aggacgagt,g ggggccccgg tggaggagtg tgccctgcca ccgaccagtg cca.gcggcgt gcgcctgcca gctgccccgc tcctgctggt aga.tccgcaa cccccagcgg gcaaggt,ga,a ccgacggcga
acgtgagccg tgccctacgg acctgctgaa t,ggt,gcacGg tcaccgactt, gcggcaaggt acca.gagcga agccctacga tgccccagcc tcgaca.gcga. gcgaccccca. acagca,cctt aggagtacct.
ggacaccatc cga^caccaac ctggggcgag cgcccgctgc caccggcccc cgagctgcac ccccgagggc gagcaccgac cgaggacggc cctgggcat,g cgccggctgc ccccgcca.gc ggagat,cacc gt,tccagaac cct,gcagggc cctggccctg gct,gt,t,ccgc cgtgggcgag ccccaccca,g ccgcgtgctg ccccgagtgc cgtggcctgc gaagcccgac gccctgcccc cgagcagcgc ggtggtgct,g gtacaccat,g cgccatgccc ggtgctgggc g,gt,ga,a,g caaggagatc cctgctgggc ctgcctgctg ctggtgcatg cgacctggcc cggcctggcc gcccat,caag cgt'gtggagc cggcatcccc ccccatctgc gtgccgcccc gcgcttcgtg ctaccgcagc ggtgccccag
ctgtggaagg cgcagccgcg agcagcgagg aagggccccc aagcacagcg tgccccgccc cgctacacct gtgggcagct a,cccagcgct gagcacctgc a縛a,a.ga.tct, aa,ca.ccgccc ggctacctgt ctgcaggtga ctgggcatca
aacccccacc ggcctggcct tgcgtgaact cagggcctgc cagccccaga gccca,ctaca ctgagctaca
gccagccccc ggcgtggtgt cgccgcctgc a,accaggccc agcggcgcct atccccgtgg ctggacgagg atctgcctga gaccacgtgc cagatcgcca gcccgcaacg cgcctgctgg tggatggccc t,acggcgtga gcccgcgaga accatcgacg cgcttccgcg gtgatccaga ctgctggagg cagggcttct
acatcttcca cctgccaccc actgccagag tgcccaccga actgcctggc tggtgaccta tcggcgccag gcaccctggt gcgagaagtg gcg鄉(xiāng)tgcg tcggcagcct ccctgcagcc acatcagcgc tccgcggccg gctggctggg acacccacct aggccctgct gccaccagct gcagccagtt cccgcgagta acggcagcgt aggacccccc tgcccatctg cccacagctg tgaccagcat tcggcatcct
agatgcgcat tcggcaccgt ccatcgccgt cctacgtgat ccagcaccgt gcgagaaccg agggcatgag tgctggtgaa
tggagagcat ccgtgtggga tccccgacct tgtacatgat agctggtgag acgaggacct acgacgacat t,ctgccccga
caagaacaac 540 ctgcagcccc 600 cctgacccgc 660 ctgctgccac 720 ctgcctgcac 780 caacaccgac 840 ctgcgtgacc 900 gtgccccctg 960 cagcaagccc 1020 cgccgt,gacc 1080 ggccttcctg 1140 cgagcagctg 1200 ctggcccgac 1260 catcctgcac 1320 cct,gcgcagc 1380 gtgcttcgtg 1440 gcacaccgcc 1500 gtgcgcccgc 1560 cctgcgcggc 1620 cgtgaa.cgcc 1680 gacctgcttc 1740 cttctgcgtg 1800 gaagttcccc 1860 cgt卿,cctg 1920 catcagcgcc 1980 gatcaagcgc 2040 cgagctggtg 2100 cctga.aggag 2160 gtacaagggc 2220 gctgcgcgag 2280 ggccggcgtg 2340 gcagctggt,g 2400 cggccgcctg 2460 ctacctggag 2520 gagccccaac 2580 ga.ccgagtac 2640 cctgcgccgc 2700 gctgatgacc 2760 gctggagaag 2820 catggtgaag 2880 cgagttcagc 2940 gggccccgcc 3000 gggcgacctg 3060 ccccgccccc 3120
ggcgccggcg gacctgaccc
ctgcagagcc gtgcccctgc gagtacgtga cccgccgccc aacggcgtgg accccccagg gacaacctgt aagggca.ccc
gcatggtgca tgggcctgga ccggcagcga tgcccaccca ccagcgagac accagcccga gccccgccgg tgaaggacgt gcggagctgc actactggga ccaccgccga
ccaccgccac gcccagcgag cgtgttcgac cgaccccagc cgacggctac cgtgcgcccc cgccaccctg gttcgccttc tcctcagcct ccaggaccct gaaccccgag
cgcagcagca gaggaggccc ggcgacctgg cccctgcagc gtggcccccc cagcccccca gagcgcccca ggcggcgccg caccctccmc cctg柳ggg tacctgggcc
gcacccgcag cccgcagccc gcatgggcgc gctacagcga tgacctgcag gcccccgcga agaccctgag tggagaaccc ctgctttcag gtgctcctcc tggacgtgcc
cggcggcggc cctggccccc cgccaagggc ggaccccacc cccccagccc gggccccctg ccccggcaag cgagtacctg ccctgctttc tagcaccttc cgtgtaaa
3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3778
<210〉 <211〉 <212〉 〈213〉
12
33 麗
人工序列
<220〉
<223〉 PCR引物
〈400〉 12
ccaga.tat,cg aattct,agag ccgccaccat gga
33
<210〉 <211〉 <212〉 <213〉
13 41 DNA
人工序列
<220〉
<223> PCR引物
<400> 13
gct,gt,cga.ct, tta.tca.ga.t,c aggatgccga acaccacgcc
41
<210〉 <211> <212> <213〉
14
675 PRT
人工序列
〈220〉
<223> HER2ECDTM多肽
<400〉 14
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1
Pro
Leu
Leu
Leu
65
Gin
Gin
Ala
Val
Leu 145 Leu
Asn
His
Ser
Ala 225 Ala
His
Thr
Tyr
Ser 305 Glu
Pro
Val
Pro
Arg
Tyr
50
Pro
Gly
Arg
Leu
Thr 130 Thr
Cys
Gin
Pro
Glu 210 Arg
Ala
Phe
Tyr
Thr 290 Thr
Val
Cys
Arg
5
Gly Ala Ala Ser 20
Leu Pro Ala Ser 35
Gin Gly Cys Gin
Thr Asn Ala. Ser 70
Tyr Val Leu lie 85
Leu Arg lie Val 100
Ala. Va,] Leu Asp 115
Gly Ala Ser Pro
Glu lie Leu Lys 150
Tyr Gin Asp Thr 165
Leu Ala Leu Thr 180
Cys Ser Pro Met 195
Asp Cys Gin Ser
Cys
Gly
Asn
Asn 275 Phe
Asp
Thr
Ala
Ala
Cys
His 260 Thr
Gly
Val
Ala
Arg 340 Val
Gly
Thr 245 Ser
Asp
Ala.
Gly
Glu 325 Val
Pro 230 Gly
Gly
Thr
Ser
Ser 310 Asp
Thr
Pro
Val
55
Leu
Ala
Arg
Asn
Gly 135 Gly
lie
Leu
Cys
Leu 215 Leu
Pro
lie
Phe
Cys 295 Cys
Gly Tyr
Thr Ser Ala.
Gin
Glu
40 Val
Ser
His
Gly
Gly 120 Gly
Gly
Leu
lie
Lys 200 Thr
Pro
Lys
Cys
Glu 280 Val
Thr
Thr
Gly
Asn
Val
25
Thr
Gin
Phe
Asn
Thr 105
Asp
Leu
Val
Trp
Asp 185 Gly
Arg
Thr
His
Glu 265 Ser
Thr
Leu
Gin
Leu 345 lie
10
Cys
His
Gly
Leu
Gin
90
Gin
Pro
Arg
Leu
lys 170 Thr
Ser
Thr
Asp
Ser 250 Leu
Met,
Ala
Val
Arg 330 Gly
Thr Leu
Asn
lie 155
Asp
Asn
Arg
Val
Cys 235 Asp
His
Pro
Cys
Cys 315 Cys
Gly
Asp
Leu 60 Asp
Thr
Met
45
Glu
Asp
30
Leu
Leu
15 Met
Arg
Thr
Lys His Tyr
Gin Asp lie Gin Glu Val 75 80 Val Arg Gin Val Pro Leu 95
Leu Phe Glu Asp Asn Tyr 110
Leu Asn Asn Thr Thr Pro 125
Glu Leu Gin Leu Arg Ser
Leu 140 Gin
lie
Arg
Cys
Cys 220 Cys
Cys
Cys
Asn
Pro 300 Pro
Arg
Phe
Ser
Trp 205 Ala
Asn
His
Arg 190 Gly
Gly
Pro
Lys 175 Ala
Glu
Gly
Gin 160 Asn
Cys
Ser
Cys
His Glu Gin Cys 240
Leu Ala Cys Leu 255
Pro Ala Leu Val 270
Pro Glu Gly Arg 285
Tyr Asn Tyr Leu
Glu Glu Gin Glu Phe
Met,
Leu Lys His Ala
His
Cys
Leu 350 Gly
Asn
Ser 335 Arg
Cys
Gin 320
Glu Lys
Pro 385 Glu
Asp
Gly
Gly
Leu
465 Pro
Ala
Gin
Val
Arg 545 Leu
Phe
Pro
Ser
Pro 625 Gly
lie 370 Ala
Thr
Ser
Arg
lie 450 Ala
Trp
Asn
Leu
Asn 530 Val
Pro
Gly
Pro
Tyr 610
Cys
Cys Ala. Val lie Leu
355 Phe
Ser
Leu
Leu
lie
435 Ser
Leu
Asp
Arg
Cys 515 Cys
Leu
Cys
Pro
Phe 595 Met
Pro
Pro
Val
lie 675
Gly
Asn
Glu
Pro 420 Leu
Trp
lie
Gin
Pro 500
Ala.
Ser
Gin
His
Glu 580 Cys
Pro
lie
Ser Thr
Glu
405 Asp
His
Leu
His
Leu 485 Glu
Arg
Gin
Gly
Pro 565 Ala
Val
lie
Asn
Ala. Glu 645 Gly lie 660
360
Leu Ala Phe Leu 375
Ala Pro Leu Gin 390
lie Thr Gly Tyr
Leu Ser Val Phe 425
Asn Gly Ala Tyr 440
Gly Leu Arg Ser 455
His Asn Thr His 470
Phe Arg Asn Pro
Asp Glu Cys Va,l 505
Gly His Cys Trp 520
Phe Leu Arg Gly 535
Leu Pro Arg Glu 550
Glu Cys Gin Pro
Asp Gin Cys Va
585
Ala Arg Cys Pro 600
Trp Lys Phe Pro 615
Cys Thr His Ser 630
Gin Arg Ala Ser
Leu Leu Val Va.l 665
Pro
Pro
Leu 410 Gin
Ser
Leu
Leu
His 490 Gly
Gly
Gin
Tyr
Gin 570 Ala
Ser
Asp
Cys
Pro 650 Val
Glu
Glu
395 Tyr
Asn
Leu
Arg
Cys 475 Gin
Glu
Pro
Glu
Val 555 Asn
Cys
Gly
Glu
Val 635 Leu
Leu
Ser 380 Gin
lie
Leu
Thr
Glu 460 Phe
Ala
Gly
Gly
Cys 540 Asn
Gly
Ala
Val
Glu
620 Asp
Thr
Gly
365 Phe
Leu
Ser
Gin
Leu 445 Leu
Val
Leu
Leu
Pro 525 Val
Ala
Ser
His
Lys 605 Gly
Leu
Ser
Val
Asp
Gin
Ala
Val 430 Gin
Gly
His
Leu
Ala 510 Thr
Glu
Arg
Val
Tyr 590 Pro
Ala
Asp
lie
Val 670
Gly
Val
Trp 415 lie
Gly
Ser
Thr
His 495
Cys
Gin
Glu
His
Thr 575 Lys
Asp
Cys
Asp
lie 655 Phe
Asp
Phe 400 Pro
Arg
Leu
Gly
Val 480 Thr
His
Cys
Cys
Cys 560 Cys
Asp
Leu
Gin
Lys 640 Ser
Gly
權(quán)利要求
1、一種合成核酸分子，其包含編碼如SEQ ID NO2中所示的人HER2/neu蛋白的核苷酸序列，所述合成核酸分子經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以在人類(lèi)細(xì)胞中高水平表達(dá)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的合成核酸分子，其中所述核苷酸序列包含如 SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列。
3、 包含權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
4、 包含權(quán)利要求3的載體的宿主細(xì)胞。
5、 一種在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)人HER2/neu蛋白的方法，其包括(a) 將包含權(quán)利要求1的核酸的載體引入到合適的宿主細(xì)胞中；和(b) 在允許表達(dá)所述人HER2蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
6、 疫苗載體在制備用于治療HER2相關(guān)癌癥的藥物中的用途，所述 疫苗載體包含合成的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的核酸分子，所述核酸分子包含 編碼如SEQ ID NO: 2中所示的人HER2/neu蛋白的核苷酸序列。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述載體為腺病毒載體或質(zhì)粒載體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述載體為腺病毒載體，其包含 在腺病毒E1區(qū)具有缺失，且在腺病毒E1區(qū)中具有插入片段的腺病毒 基因組，其中所述插入片段包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含(a) 經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼如SEQ ID NO: 2中所示的人HER2蛋 白的多核苷酸；和(b) 可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述載體為質(zhì)粒疫苗栽體，其包 含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含(a) 經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼人HER2蛋白的多核苷酸；和(b) 可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
10、 一種腺病毒疫苗栽體，其包含這樣的腺病毒基因組，其在El 區(qū)具有缺失，且在El區(qū)中具有插入片段，其中所述插入片段包含表達(dá) 盒，所述表達(dá)盒包含(a) 經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼如SEQ ID NO: 2中所示的人HER2蛋 白的多核苷酸；和(b) 可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10的腺病毒載體，其為Ad 5載體。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10的腺病毒載體，其為Ad 6載體或Ad 24載體。
13、 一種疫苗質(zhì)粒，其包含質(zhì)粒部分和表達(dá)盒部分，所述表達(dá)盒部 分包含(a) 經(jīng)密碼子最優(yōu)化的編碼如SEQ ID NO: 2中所示的人HER2蛋 白的多核苷酸；和(b) 可操作地連接于所述多核苷酸的啟動(dòng)子。
全文摘要
提供了編碼人HER2/neu或其截短形式的合成多核苷酸，該合成多核苷酸經(jīng)密碼子最優(yōu)化，以在人類(lèi)細(xì)胞環(huán)境中表達(dá)。編碼hHER2的基因通常與人類(lèi)癌的發(fā)展有關(guān)。本發(fā)明提供了引發(fā)或增強(qiáng)對(duì)由hHER2腫瘤相關(guān)抗原所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物的免疫性的組合物和方法，其中異常的hHER2表達(dá)與癌或其發(fā)展有關(guān)。本發(fā)明具體地提供了攜帶密碼子最優(yōu)化了的人HER2以及密碼子最優(yōu)化了的截短型HER2的腺病毒載體和質(zhì)粒構(gòu)建體，并公開(kāi)了它們?cè)谟糜陬A(yù)防和治療癌癥的疫苗和藥物組合物中的用途。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101173282SQ200710167979
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者M·努佐, P·加洛, P·莫卡茨 申請(qǐng)人:P.安杰萊蒂分子生物學(xué)研究所