專利名稱：：一種有機芳香化合物降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及污染土壤及水的生物修復(fù)，具體地說是利用微生物的方法降解污染環(huán)境中的多環(huán)芳烴污染物，本發(fā)明降解菌適用于石油污染土壤及水的生物修復(fù)。
背景技術(shù)：
：多環(huán)芳烴(PAHs)是一類廣泛分布于環(huán)境中的有機化學(xué)污染物，是石油、煤炭等化石燃料燃燒過程及能源轉(zhuǎn)化過程的副產(chǎn)物，對人體具有潛在的三致危害性，對生物體產(chǎn)生遺傳毒性，國際癌研究中心(IARC)列出的94種對實驗動物致癌的化合物，其中15種屬于多環(huán)芳烴。多環(huán)芳烴是一類難降解有機物污染物，具有較高的穩(wěn)定性，隨著苯環(huán)數(shù)量增加，脂溶性越強，水溶性越低，生物可降解性也隨著降低，在環(huán)境中存在的時間越長。由于多環(huán)芳烴的潛在致癌性、致畸性、致突變性，已引起各國的重視。土壤、水都是多環(huán)芳烴的重要載體，多環(huán)芳烴污染土壤、水的生物修復(fù)技術(shù)由于二次污染少，現(xiàn)在倍受關(guān)注。研究表明，微生物降解是降低多環(huán)芳烴污染的主要技術(shù)手段。芘是多環(huán)芳香族化合物，不溶解于水，揮發(fā)性差、為無色、棱形晶體(不純物為黃色)，別名嵌二萘，其分子式C16H10，可以以土壤、水等作為載體，具有潛在毒性、致癌性及致畸誘變作用，芘本身不具遺傳毒性，但是它的酮類代謝物比母體毒性更大且有致突變性，所以芘常被作為監(jiān)測多環(huán)芳烴污染的指示物和其它多環(huán)芳烴光化學(xué)降解、生物降解的模型分子c121。能夠降解芘的微生物也不少，如分技桿菌、紅球菌、黃桿菌、假單抱茵、糙皮側(cè)耳、白瓶霉菌、雅致小克銀漢霉、黑曲霉等。芘污染以及它的酮類代謝物污染已引起各國環(huán)境科學(xué)家的極大重視。由于其化學(xué)穩(wěn)定性，對芘污染物的凈化和處理一直是一個難題。關(guān)于芘的凈化技術(shù)大多處于研究階段，始終沒有成熟、高效且易行的處理方法。現(xiàn)在世界各國都趨于利用生物過程處理芘的污染物，然而，生物降解多環(huán)芳烴污染物還沒有被證明技術(shù)'上的高效可行性。對于一般的微生物來說，法等多環(huán)芳烴化合物是難以作為營養(yǎng)物質(zhì)利用的。所以選擇利用以芘為營養(yǎng)物質(zhì)的優(yōu)勢特效菌凈化芘是解決芘污染問題的有效方法。因此，展開對芘的優(yōu)勢特效降解細(xì)菌的研究具有一定的實際意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能高效降解芘等高分子量多環(huán)芳烴的有機芳香化合物降解菌菌種，及上述菌種在降解多環(huán)芳烴中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明所提供的高效降解菌^fycokcfer^wsp.SN12來源于遼寧撫順石油三廠污水渠渠首污泥。經(jīng)人工馴化后分離純化得到。該菌一是分子桿菌屬(7l^co6acten'Mwsp.)的菌株SN12，生物學(xué)特性為菌體形態(tài)為短桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏陽性，，在牛肉膏蛋白胨(NR)平板上單菌落呈金黃色，圓形墊狀、邊緣整齊、表面光滑，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固。該菌生長緩慢，經(jīng)3(TC，平均7天培養(yǎng)能形成可見單菌落，30天培養(yǎng)單菌落直徑僅為0.4cm。菌株16SrDNA的Genbank登陸號為DQ512892。于2007年7月20日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNO:M207110;鑒別特征為Myco6acten'wwg"vw附SN12。菌株M;/co6acter/Mwsp.SN1216SrRNA全長序列(1406bp)與GeneBank中已知序列Mycc^a"en'Mwg/Zra附isolateVM0442的序列相jli性為100%。'其基因組中具有芘降解基因nidA。不含有菲降解基因(phnAc)和萘降解基因(ndoB)。該菌最適生長及最佳降解溫度為30°C，在低于l(TC或高于4(TC時不生長；最適生長pH值為7，當(dāng)pH值低于5或高于10時，其生長受到明顯抑制。在好氧條件下高效降解芘，在無機鹽培養(yǎng)基中，7天內(nèi)可將100mg/L的芘降解94.4%，14天芘降解率可達100%;可將600mg/L芘在7天內(nèi)降解56.06%,14天內(nèi)降解95.46%。該菌還能以菲、苊、芴為唯一碳源和能源生長，在無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天可將100mg/L的菲降解99.37%、將100mg/L的苊降解71.80%、將100mg/L的荷降解45.29%。所述無機鹽培養(yǎng)基為(g/L):MgS04'7H20—0.2，MnSOH20—0.02，CaCl—0.15，F(xiàn)eS04-7H20—0.01，NH4.N03—1.0，KH2PO4—0.4，Na2HP04—0.6，蒸餾水一1000，PH—7.0;菌株M3;c06acfen^wsp.SN12的培養(yǎng)基還可為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏一5，蛋白胨一IO，NaCl—5，蒸餾水一1000，PH_7.27.4。本發(fā)明篩選的菌株降解性能穩(wěn)定，降解底物范圍較廣，適用于多環(huán)芳烴污染土壤及水的生物修復(fù)。圖1為溫度對菌株^fyco6acter/Mmsp.SN12生長的影響。圖2為不同溫度對菌株7^coMcfer/Mmsp.SN12降解芘的影響。圖3為菌株7l^cWac^T/Mmsp.SN12對芘的降解曲線。圖4為不同芘濃度對菌株Myco6acten'i/msp.SN12降解芘的影響。圖5為鄰位相連法建立的菌株A^coZ^cten'wmsp.SN12系統(tǒng)發(fā)育進化樹。圖6為瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株7kfyco^cten'Mwsp.SNl2基因擴增結(jié)果；其中，M:DL2000;Lanel,分枝桿菌16SrRNA(578bp);Lane2,芘降解基因nidA(508bp);Lane3,萘降解基岡ndoB(642bp);Lane4,菲降解基因phnAc(462bp)。具體實施例方式實施例1:菌株T^co^cte/^msp.SN12的形態(tài)及生理生化特性Myco6acfen'wmsp.SN12菌體形態(tài)為短桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏陽性，但不易被染色。在NR平板上單菌落呈金黃色，圓形墊狀、邊緣整齊、表面光滑，與培養(yǎng)基結(jié)合不牢固。該菌生長緩慢，經(jīng)3(TC，平均7天培養(yǎng)能形成可見單菌落，30天培養(yǎng)單菌落直徑僅為0.4cm。根據(jù)微生物鑒定手冊設(shè)計生理生化試驗，唯一碳源利用試驗制成含唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基平板。其生理生化特性試驗結(jié)果見附表1表1菌株M少co6flcter/Mmsp.SN12的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2:菌株Mj;cWa"m'Mmsp.SN1216SrDNA序列測序及結(jié)果分析將N12菌體破碎，提取核酸進行PCR擴增，使用試劑盒純化PCR產(chǎn)物，對已純化的PCR產(chǎn)物測序獲得該菌16SrDNA全長序列(1406bp);其具有序列表SEQIDNo:1中的堿基序列。SEQIDNo:l:lTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGG51AAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGT101GATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGA15]ATAGGACCGCATGCTTCAT.GGTGTGTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGG.201ATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTTACCAAGGC251GACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGA301TACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGG351GCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTT401GTAAACCTCTTTCGCCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGGAGAAG451AAGGACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTCCGA501GCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCG551TTGTTCGTGAAAACTCACAGCTTAACTGTGGGCGTGCGGGCGATACGGGC601AGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAAT651GCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGT701AACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCC751TGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTT801GGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGG851CCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGG901AGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGAC951ATGCACAGGACGCCGGCAGAGATGTCGGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAG1001GTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC1051CGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGA1101CTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA1151AGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGG1201TACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGTGGAGCGAATCCTTTCAAAGCCGGT1251CTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCT1301AGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA1351CACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCC1401TAACCC(1)SEQIDNo:l的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度1406堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源菌株M;;coZ7acfen、msp.SN12將該全長序列與GeneBank中已知序列進行比對，結(jié)果表明，其與Tl^co6acten'MWgz7vwm/so/ate,VM0442的序列相似性為100%，與Myco6acfenY/m取TA27等菌株&序列相似性為98%99%，結(jié)合生理生化試驗結(jié)果，確定該菌株為分枝桿菌屬，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見圖5。菌株N12在Genebank登錄號為DQ512892。實施例3:菌株MycoZ^cten'M附sp.SN12特異引物PCR擴增及結(jié)果分析對菌株MycWacten'wmsp.SN12進行分枝桿菌屬16SrRNA和三個降解基因PCR擴增。擴增引物見表2。分枝桿菌16SrRNA擴增反應(yīng)條件為在95。C預(yù)變性15秒后進行50個6循環(huán)94。C變性3秒，5(TC退火10秒，7fC延伸30秒，最后72'C延伸2min;三個降解基因擴增反應(yīng)條件為在94。C預(yù)變性后進行30個循環(huán)94°C變性45秒，52"C退火45秒，72。C延伸50秒，最后72'C延伸8min。擴增結(jié)束后，取10pL擴增產(chǎn)物在P/。的瓊脂糖凝膠上進行電泳(見圖6)?；驍U增結(jié)果表明，菌株N12基因組中含有分枝桿菌屬特有的16SrRNA，進一步說明N12為一株分枝桿菌。由于N12基因組中含有N12芘降解基因(nidA)，但不含有菲降解基因(phnAc)和萘降解基因(ndoB)，所以認(rèn)為N12應(yīng)具有芘降解能力。經(jīng)檢測，未發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在，說明芘降解基因(nidA)位于染色體上。表2基因擴增所用引物序列及擴增片斷大小表l.PCR擴增引物Table1.TCRprimers<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4:菌株Tl^cWacfen'Mmsp.SN12最適生長及最佳芘降解溫度由圖1可以看出3(TC為該菌株的最適生長溫度，在此溫度下，菌濃度峰值最高，在第四天進入平穩(wěn)期；在15C條件下培養(yǎng)也見生長，但生長緩慢；在35。C條件下培養(yǎng)4天便進入平穩(wěn)期，且生物量低。與此同時測定了菌株N12在不同溫度條件下對芘的降解情況，由圖2可知在3(TC條件下降解效率最高，其次分別為25'C、20°C、35。C和15'C。實施例5:菌株Myco6acten'M附sp.SN12對芘的降解通過對lg/L的標(biāo)準(zhǔn)濃度芘-甲醇溶液進行2倍梯度順次稀釋至0.016嗎/mL，并在芘的最大紫外吸收波長240nm處測定吸光度，獲得以濃度為Y值以吸光度為X值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)現(xiàn)當(dāng)芘濃度在0lpg/mL時濃度對吸光度線性關(guān)系十分顯著，通過線性一回歸獲得其方程為Y=2.2276X+0.0067,R2=0.9999。以此對萃取產(chǎn)物進行適當(dāng)稀釋，使之濃度落于上述范圍內(nèi)便可通過吸光度值換算成芘濃度。試驗結(jié)果表明菌株N12具有很強的芘降解能力。對于含芘100mg/L的無機鹽培養(yǎng)基，由其對芘的降解曲線(見圖4-2)可知，其降解曲線與3(TC生長曲線相一致，菌體生長的對數(shù)期(25天)，也是降解效率最高的時期，培養(yǎng)至第4天時，已經(jīng)降解69.44%，但其降解效率也開始有所降低，培養(yǎng)至第10天，還有2.16%殘留芘未被降解。但當(dāng)培養(yǎng)至第14天時可以將芘完全降解。菌株N12也具有很強的芘污染耐受能力，在含較高濃度芘的無機鹽培養(yǎng)基中依然可以生長并將芘降解，但隨著芘濃度的升高，降解水平下降。經(jīng)過7天培養(yǎng)可將200mg/L芘降解93.00%、將400mg/L芘降解56.47%、將600mg/L芘降解56.06%、800mg/L芘降解48.97%、1000mg/L芘降解27.36%;當(dāng)培養(yǎng)至第14天時，可以將600mg/L芘降解95.46%。實施例6:菌株MycoZ)actehwmsp.SN12的降解譜實驗證明菌株N12還能以菲、苊、芴為唯一碳源和能源生長，但不能以蒽、萘、苯并芘為唯一碳源和能源生長。在無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天可將100mg/L的菲降解99.37%、100mg/L的苊降解71.80%、100mg/L的芴降解45.29%。但前文提到該分枝桿菌N12不含有菲降解基因(phnAc)，結(jié)果卻表明該菌株具有很強的菲降解能力。SEQUENCELISTING〈110〉中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所〈120>—種有機芳香化合物降解菌及其應(yīng)用〈130〉〈160〉1<170〉Pat'entlnversion3.1<210〉1<211〉1406<212〉DNA<213〉菌株Mycobact,erium印.SN12<220><221〉r脆〈222〉(1)..(1406)<223><400>1tggctcaggacgaacgctggcggcgtgctt3￡ica_ca_tgc￡iagtcg獄ggaaaggccctt60cggggtactcgagt,ggcgaaCggg"tgdgtdacacgtgggtgatctgccctgcactUggg120at犯gcctgggaaactgggtctaataccgaataggaccgcatgcttcatggtgtgtggtg180gaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcc城cagcttgttggtgaggtaatggc240ttaccaaggcgscggtcgggtagccggcctg卿gggtgaccggccacactgggactg.300tacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgaCgCCgCgtg3gggatgacggccttcgggttgtaaacctctttXgCC3ggg420acgaagcgca_agtgacggtacctggagaagaaggaccggcc朋ctacg"tgccagcagccg480cggtaatac,gtagggtccgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgtaggt,g540gtttgtcgcgttgttcgtgaaaactcacagctt貼ctgtgggcgtgcgggcgatacgggc600agactt,gagta.ctgcaggggagactggaat卞cctggtgtagcggtggaatgcgcagatat660caggagg咖3CCggtggC,gaaggcgggtctCtgggC3gtaac"tgacgctgaggagcgaa720agcgtggggattagataccctggtagt,ccacgccgtaaacggtgggtact780aggtgtgggt"cc;tTccttggg3tCCgtgccgtagctaacgcaltaagtacccc,gcc卞g840ggg敏3CggCCgC33ggCtgaaattgacgggggcccgcacsagcggcgg■agcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccsitgcacagga960cgccggc卿gatgtcggttcccttgtggcctgtgtgcaggtggtgcatggctgtcgtca1020gctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtctcatgttg1080ccagcacgttatggtgg哪ctcgtgagagELCtgCCgggg"lcaactcggag,ggtggg1140gat印cgtcaagtcatcatgCCCCtt3tgtccagggcttc￡LC￡LC3tgCt3caatggccgg1200tacaaagggctgcgatgccgtgaggtggagcgaatcctttcaaagccggtctcagttcgg1260gcaactcgaccccgt,gaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaac1320gctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacscaccgcccgtcacgtcat印aagtcggt1380aacscccgaagccggtggcct33CCC140610權(quán)利要求1.一種有機芳香化合物降解菌，該菌是分子桿菌屬的菌株，于2007年7月20日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNOM207110；鑒別特征為MycobacteriumgilvumSN12。2.—種權(quán)利要求1所述降解菌的應(yīng)用，其特征在于所述降解菌可用于有機芳香化合物的降解。3.按照權(quán)利要求2所述降解菌的應(yīng)用，其特征在于所述有機芳香化合物為多環(huán)芳烴類化合物。4.按照權(quán)利要求3所述降解菌的應(yīng)用，其特征在于所述多環(huán)芳烴類化合物為芘、菲、苊和/或芴，降解過程中，降解菌適用的降解體系中芘、菲、苊或芴的濃度為50-600mg/L。全文摘要本發(fā)明涉及污染土壤及水的生物修復(fù)，具體地說是一種有機芳香化合物降解菌，該菌是分子桿菌屬的菌株，于2007年7月20日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNOM207110；鑒別特征為MycobacteriumgilvumSN12。本發(fā)明篩選的菌株降解性能穩(wěn)定，降解底物范圍較廣，適用于多環(huán)芳烴污染土壤及水的生物修復(fù)。文檔編號C12N1/20GK101423806SQ20071015790公開日2009年5月6日申請日期2007年11月2日優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日發(fā)明者張惠文,張成剛,旭李,李新宇,蘇振成申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所