專利名稱：腸毒素c2超抗原突變蛋白基因的克隆和異源表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體說是腸毒素C2超抗原突變蛋白基因及 克隆表達(dá)和制備方法。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen, SAg)是一組由細(xì)菌或病毒編碼的蛋白質(zhì)分子， 可以極低濃度(l 10ng/mL)刺激大部分T細(xì)胞增生，具有超強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī) 體免疫反應(yīng)功能和一定的抗腫瘤活性。因此，超抗原是一種極好的免疫調(diào) 節(jié)劑和增效劑，可望被開發(fā)成潛在的新型抗腫瘤藥物，用于腫瘤治療。
金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是一類 具有代表性的微生物外毒素。由于其極強(qiáng)的T細(xì)胞激活功能，成為一類典 型微生物超抗原，受到人們的廣泛重視。近年來，.人們在對金黃色葡萄球 菌腸毒素(SE)結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)功能及其抗腫瘤等進(jìn)行了大量研究工作，其 中主要集中在對TSST1、 SEA、 SEB等的研究方面。
然而，腸毒素C2 (SEC2)作為金黃色葡萄球菌腸毒素家族中的一員， 國內(nèi)外對其結(jié)構(gòu)與功能方面的研究至今不多，且已有的研究結(jié)論尚不明確。 我所首次對SEC2的基因進(jìn)行了克隆、測序并在靶向融合蛋白研究方面取得 了開創(chuàng)性成果，為進(jìn)一步開展SEC2分子改造及其靶向融合蛋白的研發(fā)奠定 了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種腸毒素C2超抗原突變蛋白基因及克隆表達(dá)和 制備方法。
為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下
腸毒素C2超抗原突變蛋白基因具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中堿基序列。
腸毒素C2超抗原突變蛋白基因的克隆方法以金黃色葡萄球菌基因組 DNA為模板，
SEQ ID N0:1序列表中基因，釆用F: 5， CCgAATTCCACAAATCAAgTgA3， 和R: 5， TCgCTCgAgTTATCCATTCTTTg TTg 3，的引物.通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出 SEQ ID NO: 1序列表中基因片段;
SEQ ID NO: 2序列表中基因，釆用F: 5， CCAgACCCTCACAAATCAAgT 3， 和R: 5， TcgCTCgAgTTATCCATTCTTTgTTg3，或F:5， CCAgACCCTCACAAATCAAgT 3，和R: 5，CggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTCAC3，的引物，通過PCR技術(shù) 擴(kuò)增出SEQ ID N0:2序列表中基因片段；
SEQ ID NO: 3序列表中基因，采用F: 5， CCAgACCCTggTACgATgg 3，和R: 5， TcgCTCgAgTTATCCATTCTTTgTTg3，或F: 5， CCAgACCCTggTACgATgg 3， 和R:5， CggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTg3，的引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出 SEQ ID NO: 3序列表中基因片段；
SEQ ID NO: 4序列表中基因,釆用F: 5， CggAATTCgATCATTATgTATCAgC 3，和R: 5， TCgCTCgAgTAATCCATTCTTTgT Tg 3，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEQ ID N0:4序列表中基因片段。
腸毒素C2超抗原突變蛋白基因的異源表達(dá)方法:將所述具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中堿基序列的腸毒素 C2超抗原突變蛋白基因分別克隆入表達(dá)載體pET-28a,以大腸桿菌BL21 (DE3)
為宿主菌，構(gòu)建成異源表達(dá)超抗原活性基因工程肽的基因工程菌，在培養(yǎng) 基中異源表達(dá)腸毒素C2超抗原突變蛋白基因編碼蛋白。
本發(fā)明所具有如下優(yōu)點
1. 本發(fā)明為人工構(gòu)建的系列編碼超抗原突變蛋白的核苷酸序列，獲知 其基因全序列的組成。
2. 本發(fā)明利用PCR技術(shù)，克隆一系列編碼超抗原突變蛋白的核苷酸基 因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的一系列超抗原突變蛋白經(jīng)檢驗具有超抗 原的生物學(xué)活性；應(yīng)用本發(fā)明，可提供直接用于生產(chǎn)該一系列超抗原突變 蛋白的基因工程菌株。
3. 本發(fā)明基因的異源表達(dá)提供了腸毒素C2在抗腫瘤方面的開發(fā)潛力， 本發(fā)明在SEC2的基礎(chǔ)上對其氨基端進(jìn)行了刪除突變，其氨基端對其生物活 性的影響，同時在此基礎(chǔ)上希望獲得保留超抗原活性的突變蛋白。其制備 超抗原抗腫瘤生物制劑，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)穩(wěn)定，方便純化的特點。
4. 本發(fā)明提供具有超抗原活性的SEC2突變蛋白，以及提供分別編碼其 突變蛋白的核苷酸序列及其相應(yīng)的蛋白表達(dá)，并且利用人工控制的條件下， 大量獲得高純度的具有超抗原活性的上述突變蛋白。


圖l為本發(fā)明SEC2四種突變蛋白基因的PCR產(chǎn)物核酸電泳圖譜。(其中 M代表DL2000 marker, 1、 2、 3、 4依次代表具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4四種基因的PCR產(chǎn)物。)
圖2為本發(fā)明SEC2四種突變蛋白基因編碼蛋白純品的電泳圖譜。(其中 M代表蛋白marker, 1、 2、 3、 4依次代表具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4四種基因編碼的蛋白。)
圖3為本發(fā)明SEC2四種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白的超抗原活性檢 測實驗結(jié)果圖。(橫坐標(biāo)為本發(fā)明超抗原突變蛋白基因編碼蛋白和陽性對照 腸毒素C2,縱坐標(biāo)為增值指數(shù)。)
圖4為本發(fā)明SEC2四種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白的抑瘤活性檢測 結(jié)果圖。(其中縱坐標(biāo)為陰性對照牛血清白蛋白(BSA)、系列突變蛋白和陽 性對照SEC2;橫坐標(biāo)為抑瘤率。)
具體實施例方式
實施例l
1 )具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4 中堿基序列的SEC2四種超抗原突變蛋白基因
具有序列表SEQ ID NO: l堿基序列的超抗原突變蛋白基因 001 cacaaatcaa gtgagtttac tggtacgatg ggtaatatga aatatttata
051 tgatgatcat
101 tggcacatga
151 gacaaagtga
201 agatgaagta
251 tttcatccaa
301 tatggaggaa
351 acaaaatgta
401 ttgaagtgca
451 aaagctagga
501 ttcaccatat
551 ctttttggta
601 aaatatttaa
651 gaagatagaa
tatgtatcag tttaatttat aaacagagt t gttgatgtgt agataatgta taacaaaaca cttataagag aactgataag attttttaat gaaacaggat tgatatgatg tgatgtacaa gtccacctta SEQ ID NO. 1的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長度687堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 分子類型cDNA 假設(shè)否
caactaaagt aacattagtg attaaatgaa atggatcaaa ggtaaagtta tgaaggaaac t Uatgaaaa aaaagtgtaa
atataaaat t cctgcaccag cgacaataaa caacaaagaa
tatgtctgta ataaaaaact gatttagcaa ttactatgta caggtggtaa cactttgata taaaagaaac cagctcaaga aatttgtatg tattgaaaat gcgataagtt acggttgatt tggataa
gataaatttt aaaaaat tat agaagtacaa aactgctatt aacttgtatg atgggaactt acaatttctt actagacata agtttaacag aacggcaata tgaccaatct ctaaaagtgt
(b)
(c)
(d)
(e)
反義否
最初來源金黃色葡萄球菌(StapAWococctis aureus) 具有序列表SEQ ID NO:l堿基序列編碼的蛋白結(jié)構(gòu)為二級結(jié)構(gòu)由5 個完整的a螺旋和12個p折疊構(gòu)成。其中氨基酸殘基13-17, 21-29, 70-78, 156-172， 209-220分別形成五個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘基32-39, 47-53， 62-68, 8H7, 108-118, 129-137, 139-150, 152-154， 180-190， 194-200, 222-225, 228-237分別形成12個(3折疊結(jié)構(gòu)。而第83位和9位 天冬氨酸，以及118位和122位組氨酸殘基形成1個Zn原子結(jié)合位點。
具有序列表SEQ ID NO:2堿基序列的超抗原突變蛋白基因 001 g.agagtcaac cagaccctca caaatcaagt gagtttactg gtacgatggg 051 taatatgaaa tatttatatg atgatcatta tgtatcagca actaaagttagcacatgatt caaagtgaaa atgaagtagt tcatccaaag tggaggaata aaaatgtact gaagtgcaaa agctaggaat caccatatga ttttggtatg atatttaatg agatagaagt
二見序列表)
taat ttataa acagagttat tgatgtgtat ataatgtagg acaaaacatg tataagagtt ctgataagaa tttttaatta aacaggatat atatgatgcc atgtacaacg ccaccttaca
cattagtgat taaatgaaga ggatcaaatt taaagt taca aaggaaacca tatga^iaata aagtgtaaca ataaaaaaaa ataaaattta tgcaccaggc acaataaaac acaaagaatg
101 tgtctgtaga taaatttttg 151 aaaaaactaa aaaattatga 201 tttagcaaag aagtacaaag 251 actatgtaaa ctgctatttt 301 ggtggtaaaa cttgtatgta 351 ctttgataat gggaacttac 401 aaagaaacac aatttctttt 451 gctcaagaac tagacataaa 501 tttgtatgag Utaacagtt 551 ttgaaaataa cggcaatact 601 gataagtttg axcaatctaa 651 ggttgattct aaaagtgtga 701 gataa
SEQ ID NO. 2的信息
(a) 序列特征
*長度705堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA (c )假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Wapitiococci;s aureus) 具有序列表SEQ ID NO: 2堿基序列編碼的蛋白結(jié)構(gòu)為二級結(jié)構(gòu)由5
個完整的a螺旋和12個(3折疊構(gòu)成。其中氨基酸殘基13-17， 21-29， 70-78, 156-172， 209-220分別形成五個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘基32-39, 47-53, 62-68， 81-87， 108-118, 129-137， 139-150, 152-154, 180-190, 194-200, 222-225， 228-237分別形成12個(3折疊結(jié)構(gòu)。而第71、 81、 119 位谷氨酸和第47位組氨酸殘基形成1個Zn原子結(jié)合位點。
具有序列表SEQ ID NO: 3堿基序列的超抗原突變蛋白基因 gagagtcaac cagaccctgg tacgatgggt aatatgaaat atttatatga
ctaaagttat attagtgata aaatgaagat gatcaaatta aaagttacag aggaaaccac atgaaaataa
001 051 101 151 201 251 301 351
tgatcattat cacatgattt aaagtgaaaa tgaagtagtt catccaaaga ggagga"aa aaatgtactt
gtatcagcaa aatttataac cagagttatt gatgtgtatg taatgtaggt caaaacatga ataagagttt
gtctgtagat aaaaactaaa ttagcaaaga ctatgtaaac gtggtaaaac tttgataatg aagaaacaca
aaatttttgg aaattatgac agtacaaaga tgctattttt ttgtatgtat ggaacttaca atttcttttg401 aagtgcaaax tgataagaaa agtgtaacag ctcaagaact agacataaaa 451 gctaggaatt ttttaattaa taaaaaaaat ttgtatgagt ttaacagttc 501 accatatgaa acaggatata taaaatttat tgaaaataac ggcaataxtt 551 tttggtatga tatgatgcct gcaccaggcg ataagtttga ccaatctaaa 601 tatttaatga tgtacaacga caataaaacg gttgattcta aaagtgtgaa 651 gatagaagtc caccttacaa caaagaatgg ataa SEQ ID NO. 3的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長度684堿基對 *類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(S帥/3一coccus aur面) 具有序列表SEQ ID NO: 3堿基序列編碼的蛋白結(jié)構(gòu)為二級結(jié)構(gòu)由4
個完整的oc螺旋和12個p折疊構(gòu)成。其中氨基酸殘基21-29, 70-78,156-172, 209-220分別形成四個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘基32-39, 47-53, 62-68, 81-87, 108-118， 129-137, 139-150， 152-154, 180-190， 194-200, 222-225， 228-237分別形成12個p折疊結(jié)構(gòu)。而第71、 81、 119位谷氨酸和第47位 組氨酸殘基形成1個完整的Zn原子結(jié)合位點。
具有序列表SEQ ID N0:4堿基序列的超抗原突變蛋白基因 gatcattatg tatcagcaac taaagttatg tctgtagata aatttttggc
001
051 acatgattta
101 aagtgaaaac
151 gaagtagttg
201 atccaaagat
251 gaggaataac
301 aatgtactta
351 agtgcaaact
401 ctaggaattt
451 ccatatgaaa
501 ttggtatgat
551 atttaatgat
601 atagaagtcc SEQ ID NO.4〖 (a)序列特征
atttataaca agagttatta atgtgt"gg aatgtaggta aaaacatgaa taagagttta gataagaaaa tttaattaat caggatatat atgatgcctg gtacaacgac accttacaac
ttagtgataa aatgaagatt a t caaa 11 ac aagttacagg ggaaaccact tgaaaataaa gtgtaacagc
aaaatttatt caccaggcga aataaaacgg aaagaatgga
aaaactaaaa tagcaaagaa tatgtaaact tggtaaaact ttgataatgg agaaacacaa tcaagaacta tgUtgagtt gaaaatEiacg taagtttgac ttgattctaa taa
aat tatgaca gtacaaagat gctatttttc tgtatgtatg gaacttacaa tttcttttga gacataaaag taacagttca gcaataxttt caatctaaat aagtgtgaag
息(參見序列表)*長度633堿基對 *類型核酸
*鏈型雙鏈 ' *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè):否
(d) 反義否
(e) 最初來源金黃色葡萄球菌(Stapi3y2ococcus aureus) 具有序列表SEQ ID NO: 3堿基序列編碼的蛋白結(jié)構(gòu)為二級結(jié)構(gòu)由3
個完整的a螺旋和12個p折疊構(gòu)成。其中氨基酸殘基70-78, 156-172, 209-220分別形成三個完整的a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘基32-39, 47-53， 62-68， 8卜87, 108-118， 129-137, 139-150, 152-154, 180-190， 194-200, 222-225, 228-237分別形成12個(3折疊結(jié)構(gòu)。而第71、 81、 119位谷氨酸和第47位 組氨酸殘基形成1個完整的Zn原子結(jié)合位點。
2 )腸毒素C2超抗原突變蛋白基因的PCR擴(kuò)增
① 金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取
接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37'C搖床過夜培 養(yǎng)，取l. 5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA(基 因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D. D.穆爾， J.G.塞德曼，J.A.史密斯，L斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》美 國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40 )。
② PCR引物設(shè)計及反應(yīng)條件
分別設(shè)計合成PCR引物用來擴(kuò)增SEC2四種超抗原突變蛋白基因片斷， 以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板；
具有SEQ ID NO: 1序列表中基因，釆用F: 5， CCgAATTCCACAAATCAAgTgA3， 和R: 5， TCgCTCgAgTTATCCATTCTTTg TTg 3，的引物.通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出 SEQ ID NO:l序列表中基因片段；
SEQ ID NO: 2序列表中基因，釆用F: 5， CCAgACCCTCACAAATCAAgT 3， 和R: 5， TcgCTCgAgTTATCCATTCTTTgTTg3，或F: 5， CCAgACCCTCACAAATCAAgT 3，和R:5，CggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTCAC3，的引物，通過PCR技術(shù) 擴(kuò)增出SEQ ID N0:2序列表中基因片段；
SEQ ID NO: 3序列表中基因，釆用F: 5， CCAgACCCTggTACgATgg 3，和 R: 5， TcgCTCgAgTTATCCATTCTTTgTTg3，或F: 5， CCAgACCCTggTACgATgg 3， 和R:5， CggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTg3，的引物,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出 SEQ ID NO: 3序列表中基因片段；
SEQ ID NO: 4序列表中基因，釆用F: 5， CggAATTCgATCATTATgTATCAgC 3，和R: 5， TCgCTCgAgTAATCCATTCTTTgT Tg 3，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEQ ID N0:4序列表中基因片段。各基因片斷的PCR反應(yīng)體系均為10 x PfuDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5 jul、 dNTP 4uL、上下游引物各20pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA 100ng、 Pfu DNA聚合酶2U,無菌超純水補(bǔ)齊體積至50 n 1 。
各基因片斷的PCR反應(yīng)條件均為
第一階段95°C, 5分鐘；
第二階段94。C, 30秒；55°C, 30秒；72°C, 90秒；共30個循環(huán)； 第三階段72。C, IO分鐘；
③SEC2四種超抗原突變蛋白基因的鑒定各片斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(參見附圖1,如圖所示通過PCR擴(kuò)增分別得到 了四種突變蛋白的基因產(chǎn)物，大小與理論值相符)，切下四種突變蛋白的基 因產(chǎn)物中相應(yīng)大小基因片段，分別為687bp、 705bp、 684bp、 633bp的基因 片段，按博大泰克生物技術(shù)公司膠回收試劑盒使用說明書進(jìn)行膠回收；回 收產(chǎn)物分別與pGEM-T克隆載體連接，構(gòu)建成SEC2四種超抗原突變蛋白基 因克隆載體pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 1、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 2、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 3、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 4。連接反應(yīng)按 Promega公司產(chǎn)品pGEM-T試劑盒使用說明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 oc感受態(tài)細(xì)胞，(轉(zhuǎn)化搡作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆 爾，J.G.塞德曼，J. A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實驗指南》 美國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40 )，篩選陽性克 隆并以Sanger雙脫氧末端終止法測定DNA序列。
實施例2
超抗原突變蛋白的表達(dá)
1) SEC2四種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建分別將 基因克隆載體pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 1、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 2、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 3、 pGEM-T- SEC2- SEQ ID NO: 4質(zhì)粒DNA以Ecoi J、 XijoJ雙酶切，膠回收試劑盒分別回收具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中的四種超抗原突變蛋白基因。以T4 MA連 接酶分別連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建成表達(dá)載體 pET-28a- SEC2- SEQ ID NO: 1、 pET-28a- SEC2- SEQ ID NO: 2、 pET-28a- SEC2-SEQ ID NO: 3、 pET-28a- SEC2- SEQ ID NO: 4。轉(zhuǎn)化co" BL21 (DE3)感受 態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Sanger雙脫氧末端終止法測序鑒定正確重組克隆。
2) 超抗原突變蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化分別接種轉(zhuǎn)化了各表達(dá)載體質(zhì) 粒的BL21 (DE3)單菌落于含50 |ug/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活 化培養(yǎng)，以1% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接下一級，37。C搖床培養(yǎng)至OD鋼為0.6, 加入終濃度1. 0mmol/L的IPTG(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)， 3(TC誘導(dǎo)表達(dá)4小時。
分別離心收集菌體，并將各收集的菌體與重懸于1/5體積的平衡緩沖 液(10mM Tirs-HC1, 0. 5M NaCl， 20mM咪唑，pH7. 9 )，分別釆用Ni親和層析柱進(jìn)行純化，將逐依洗脫下目的產(chǎn)物既SEC2四種超抗原突變蛋白基因編 碼蛋白；
純化時以0. 5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親和層析柱；以含 40mM咪唾(imidazole)的平衡緩沖液洗滌10個柱體積，洗去非特異性結(jié) 合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液(20mMTirs-HCl,O. 5MNaCl， 250mM咪唑, pH7.9)洗脫下目的產(chǎn)物，并對洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。通過SDS-PAGE 電泳鑒定蛋白大小及純度(參見附圖2所示)(參見圖2，如圖所示通過M 親和層析柱純化，獲得了 SEC2四種超抗原突變蛋白純品，能夠滿足后續(xù)生 物學(xué)活性實驗要求)。
實施例3
刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性檢測
取SPF級純系小鼠Balb/c，通過頸推處死后在無菌條件下取其脾臟， 輕輕壓碎后過200目篩網(wǎng)。然后將過篩網(wǎng)后的細(xì)胞懸液在1000rpm/min轉(zhuǎn)速 下離心5min收集細(xì)胞沉淀，用5mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置5min后于 1000rpm/min離心5min。再以不含血清的1640培養(yǎng)基(購自Gibco公司)清 洗細(xì)胞1一2次，最后用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(購自Gibco公 司)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，以8xl()5cells/孔加到96孔板中。分別將經(jīng)純化的各具 有序列表SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6和SEQ ID N0:8中氨基 酸序列的SEC2四種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白分別以40pmol/mL的終濃 度加入各孔。以BSA作為陰性對照，SEC2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，每個濃度 設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)72h后，加入30ul/孔的MTT液(購自遼寧博奧春天生物科 技有限公司)。繼續(xù)培養(yǎng)4h, 1500r/min離心5分鐘后棄上清培養(yǎng)液，收集細(xì) 胞，加入濃度為120ul/we11的二甲基亞砜溶液(DMSO)，溶解15min后，酶 標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值(參見附圖3所示)(參見圖3，如圖所示
四種超抗原突變蛋白基因編碼蛋白均保留了一定的超抗原活性，其中具有 序列表SEQ ID NO: l核苷酸序列編碼的蛋白超抗原活性最高。)。
所述SPF級BALB/c純系小鼠為體內(nèi)外均無寄生蟲和特殊病原菌的近交 系小鼠。
實施例4
SEC2突變蛋白的抗腫瘤活性檢測
將小鼠纖維瘤細(xì)胞L929 (購自ATCC)傳代培養(yǎng)后用胰蛋白酶-EDTA消 化液消化，將消化后的細(xì)胞用含10% (V/V) FBS (購自天津巿灝洋生物制品 科技有限責(zé)任公司)的1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為2xl()5cells/mL的單細(xì)胞 懸液，然后以lxl(Tcells/孔培養(yǎng)在96孔板。將按實施例3中方法分離獲得 的小鼠脾淋巴細(xì)胞以2 x 105cells/well加入到上述含有L929細(xì)胞的96孔板 中，使效靶比達(dá)到20: l(細(xì)胞數(shù)之比)。然后將純化的各具有序列表SEQID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中核苷酸序列的編碼的蛋 白分別以終濃度40pmol/mL加入各孔。以BSA作為陰性對照，SEC2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，并設(shè)腫瘤細(xì)胞對照孔、淋巴細(xì)胞自然釋放孔及調(diào)零孔，每個
濃度設(shè)3個復(fù)孔。按常規(guī)條件培養(yǎng)72h，加入30ul/we11的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng) 4h, 1000r/min離心收集細(xì)胞，加入濃度為120ul/wel 1的二甲基亞砜溶液 (腿SO),溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測定各孔的吸光值(參見附圖4 ) (參見圖4，實驗結(jié)果顯示微量的本發(fā)明中的四種超抗原突變蛋白基因編碼 蛋白即可有效地抑制小鼠纖維瘤細(xì)胞的生長。與SEC2標(biāo)準(zhǔn)品相比其抑瘤率 未有大幅度的降低，其中具有序列表SEQ ID NO: l核苷酸序列編碼的蛋白顯 示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性，與SEC2標(biāo)準(zhǔn)品相比未顯著降低，具有較大的應(yīng)用 價值。同時也為今后SEC2的研究應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。)。序列表
SEQUENCE LISTING
〈110〉中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
<120>腸毒素C2超抗原突變蛋白基因的克隆和異源表達(dá)方法
<130〉
<160〉 8
<170〉 Patentln version 3. 1
<210〉 1
〈211〉 687
〈212〉 DNA
<213〉 Staphylococcus aureus <220>
<221> CDS
<222〉 (1)..(687)
<223〉
〈400〉 1 cac aaa His Lys 1
tea Ser
agt Ser
g叫 Glu 5
Phe
act Thr
ggt Gly
acg Thr
Met 10
Gly
Asn
atg Met
aaa tat tts Lys Tyr Leu ' 化
48
tat gat gat cat tat gta tea gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa Tvr A_sp Asp His Tyr Val Ser Ala Thr Lys寸al Met Ser Val Asp Lvs 20 25 30
96
ttt ttg gc￡i cat gst tta att tst aac 3tt agt印t犯a aa￡i eta a犯 Phe Leu Ala His人sp Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys 35 4b 4
144
aat tat gac aaa gtg aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta. gca aag Asn Tyr Asp Lys Val Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys 5b 55 60
192
aag tac aaa gat g肌gta gtt gat gtg tat gga tea aat tac tat gta_ Lys Tyr Lys Asp 6lu Val Val Asp Val Tyr &v Ser Asn Tyr Tyr Val 65 70 75 80
240
aac tgc tat. t,tt tea tec aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt Asn Cys Tvr Phe Ser Ser Lys Asp Asn Val 6iv Lys Val Thr 6iy 6iv 85 90 ' 95
288
aaa act tgt atg tat gga gga ata aca. aaa cat gaa gga aac cac ttt Lvs Thr Cys Met Tvr Gly G1y lie Thr Lvs His Glu G1y Asn His Phe 100 105 110
336
gat aat ggg aac tta caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa Asp Asn Gly Asri Leu Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asri Lys
384<formula>formula see original document page 13</formula>序列表 125
aga aac aca att tct "tt"t gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca Arg Asn Thr lie Ser Phe Glu Val Gin Thr Asp Lvs Lys Ser Val Thr 130 135 1^0
432
get c犯gaa cts gac ata a貼get agg aat ttt tta att朋t a肌a肌 Ala Gin Glu Leu Asp lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys 145 150 155 l右O
■
aat ttg tat gag ttt aac agt tea cca tat gaa aca gga tat ata aaa Asn Leu Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Glv Tvr lie Lys 165 1^0 ''175 '
528
ttt att gaa aat aac ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca Phe lie Glu Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala 180 185 190
576
cca ggc gat aag ttt gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac Pro Gly人sp Lys Phe人sp Gin Ser Lvs Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp 195 200 205 '
624
aat aaa acg gtt gat tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca Asn Lys Thr Val人sp Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr 2'10 215 220
672
sea sag gga Thr Lys Asn Gly 225
687
<210〉 2
<211〉 228
<212〉 PRT
〈213> Staphylococcus aureus
〈400〉 2
His Lys Ser 1
Ser
Glu 5
Phe Thr Gly Thr
Met 10
Gly Asn Met
Lys Tyr Leu 15
Tyr Asp Asp His Tyr Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys 20 25 30
Phe Leu Ala His Asp Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys 35 4b 4
Asn Tyr Asp Lys Val Lvs Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys 5b 55 60
Lys Tyr Lys Asp Glu Val Val Asp Val Tvr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val 6^ 70 75 80
Asn Cvs Tvr Phe Ser Ser Lys Asp Asn Val Glv Lys Val Thr Glv Glv 85 90 95
Lvs Thr Cys Met T>r Glv G1y lie Thr Urs His Glu Glv Asn His Phe 100 105 110
Asp Asn Glv Asn Leu Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lvs 115 120 &5序列表
Arg Asn Thr lie Ser Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr 130 135 140
Ala Gin Glu Leu Asp lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lvs 145 150 155 化O
Asn Leu Tvr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tvr Glu Thr Gly Tyr lie Lys ' 165 1^0 ' 175
Phe lie Glu Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala 180 185 190
Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tvr Leu Met Met Tyr Asn Asp '195 ' 200 ' 205 '
Asn Lys Thr Val Asp Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr 210 215 220
Thr Lys Asn Gly 225
<210〉 3
<211〉 705
〈212〉 腿
<213〉 Staphylococcus aureus
〈220〉
<221〉 CDS <222> (l)., <223〉
(705)
<400> 3
gag agt caa cca gac Glu Ser Gin Pro Asp 1 5
cct cac aaa tea agt gag ttt act ggt acg atg Pro His Lys Ser Ser &lu Phe Thr Gly Thr Met 10 15
ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat gta tea gca act aaa
Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr Val Ser Ala Thr Lvs
' 2J) 25 30
gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat tta att tat aac att
Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His isp Leu lie Tvr Asn lie
35 ' 40 45
agt gat aaa aaa eta aaa aat tat gac aaa gtg aaa aca gag tta tta
Ser Asp Lvs Lys Leu Lvs Asn Tvr Asp Lys Val Lys Thr Glu Leu Leu
50 ' 55 6i3
aat gaa gat tta gca aag aag tac aaa gat gaa. gt.a gtt gat gtg tat
Asir Glu Asp Leu Ala Lvs Lvs Tvr Lvs Asp &lu Val Val Asp Val Tvr
65 . 7b ' .75 8i)
gga tea aat tac tat gta aac tgc tat ttt tea tec aaa gat aat gta
Glv Ser Asn Tyr Tvr Val Asn Cvs Tyr Phe Ser Ser Lvs Asp Asn Val '85 90 95
ggt aaa gtt aca. ggt ggt aaa act tgt atg tat. gga gga ata aca aaa
Gly Lys Val Thr (^y Gly Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly lie Thr Lys
48
96
144
192
240
288
336<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula>序列表
85
90
95
act tgt atg tat, gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat
Thr Cvs Met Tyr Gly Gly lie Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp
' lbO li)5 110
aat ggg aac tta caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga
Asn Gly Asn Leu Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tyr Glu Asn Lvs Arg
115 120 125
a_ac aca att tct ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca get
Asn Thr lie Ser Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala
130 135 1^10
caa gaa eta gac ata aaa get agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat
Gin Glu Leu Asp lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lvs Asn
145 150 155 160
ttg tat gag ttt aac agt tea cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt
Leu Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe
'165 170 1^5
att gaa aat aac ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca
lie Glu Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro
180 185 190
ggc gat aag ttt gac caa tct aaa tst tta atg atg tac aac gac aat
Gly Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn人sp Asn
&5 200 2b5
336
384
432
■
528
576
624
a_aa acg gtt gat tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt aca aca Lys Thr々al Asp Ser Lys Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr '210 '215 220
672
aag aat gga taa Lys Asn Glv 2^5
684
<210〉 6
<211> 227
〈212〉 PRT
<213〉 Staphylococcus aureus
〈400〉 6
Glu 1
Ser Gin Pro
Asp 5
Pro Gly Thr Met
Gly Asn 10
Met Lys Tyr Leu Tyr 15
Asp Asp His Tyr Val Ser Ala Thr Us Val Met Ser Val Asp Us Phe 2b 2^ 30
Leu Ala His Asp Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lvs Lys Leu Lys Asn 35 '40 4
Tyr Asp Lvs Val Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys '50' ' 55 60
Tvr Iys Asp Glu Val Val Asp Val Tyr Glv Ser Asn Tvr Tvr Val Asn 65 — 70 75 ' 80
Os Tyr Phe Ser Ser Lys Asp Asn Val Glv Lys Val Thr Gly.Glv Lys ' ' 85 ' 90 95<image>image see original document page 18</image>序列表
65 70 75 80
tgt atg tat gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat 288
Cvs Met Tyr Gly Gly lie Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn 85 90 95
ggg aac tta caa aat gta_ ctt ata aga gtt tat gaa aat肌a aga aac 336
。lv Asn Leu Gin Asn Val Leu lie Arg卩al Tyr Glu Asn Lys Arg Asn
100 105 ' 110
aca att tct ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca get caa 384
Thr lie Ser Phe Glu Val Gin Thr Asp Lys Lvs Ser Val Thr Ala Gin 115 120' 125
g肌eta ga_c ata_ aaa_ get鄧g朋t ttt tta att犯t犯3 aaa朋t ttg 432
Glu Leu Asp lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu
130 135 140
tat gag ttt aac agt tca_ cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att 480
Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tvr Glu Thr Gly Tyr lie Lvs Phe lie 1^5 150 15^ 160
gaa aat aac ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cca ggc 528
Glu Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met. Pro Ala Pro Glv 165 170 175
gat aag ttt gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa 576
Asp Lvs Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys
180 185 190
acg gtt gat tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt a_ca aca aag 624
Thr Val Asp Ser Lys Ser Val Lvs lie Glu Val His Leu Thr Thr Lys 195 2i)0 205
aat gga taa 633 Asn G1y 2lb
<210〉 8
〈211〉 210
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
〈400> 8
Asp 1
His Tyr Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp
5
10
Lys Phe Leu 15
Ala His Asp Leu lie Tyr Asn lie Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr
20
25
30
Asp Lys Val Lvs Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr 35 40 45
Lys Asp Glu Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys
50
55
60
Tyr Phe Ser Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr
65
70
75
80
Cvs Met Tyr Glv Gly lie Thr Lys His Glu Glv Asn His Phe Asp Asn 85 90 95序列表
Glv Asn Leu Gin Asn Val Leu lie Arg Val Tvr Glu Asn Lys Arg Asn 100 105 110
Thr lie Ser Phe Glu Val Gin Thr Asp Us Lvs Ser Val Thr Ala Gin 115 120 125
Glu Leu Asp lie Lys Ala Arg Asn Phe Leu lie Asn Lys Lys Asn Leu 130 ' 135 140
Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr lie Lys Phe lie 150 15^ 160
Glu Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tvr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly '165 170 175
Asp Lys Phe Asp Gin Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lvs 180 185 190
Thr Val Asp Ser Lvs Ser Val Lys lie Glu Val His Leu Thr Thr Lvs 195 2b0 205
Asn Gly
2ib
權(quán)利要求
1. 一種腸毒素C2超抗原突變蛋白基因，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中堿基序列。
2. —種按權(quán)利要求1所述的腸毒素C2超抗原突變蛋白基因的克隆方法, 其特征在于以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，SEQ ID N0:1序列表中基因，釆用F: 5， CCgAATTCCACAAATCAAgTgA3， 和R: 5， TCgCTCgAgTTATCCATTCTTTg TTg 3，的引物.通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出 SEQ ID NO:l序列表中基因片段；SEQ ID NO: 2序列表中基因，釆用F: 5， CCAgACCCTCACAAATCAAgT 3， 和R: 5， TcgCTCgAgTTATCCATTCTTTgTTg3，或F: 5， CCAgACCCTCACAAATCAAgT 3，和R:5，CggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTCAC3，的引物，通過PCR技術(shù) 擴(kuò)增出SEQ ID N0:2序列表中基因片段；SEQ ID NO: 3序列表中基因,釆用F: 5， CCAgACCCTggTACgATgg 3,和 R: 5， TcgCTCgAgTTATCCATTCTTTgTTg3，或F: 5， CCAgACCCTggTACgATgg 3， 和R:5， CggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTg3，的引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出 SEQ ID NO: 3序列表中基因片段；SEQ ID N0:4序列表中基因，釆用F: 5， CggAATTCgATCATTATgTATCAgC 3，和R: 5， TCgCTCgAgTAATCCATTCTTTgT Tg 3，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEQ ID N0:4序列表中基因片段。
3. —種按權(quán)利要求1所述的腸毒素C2超抗原突變蛋白基因的異源表達(dá) 方法，其特征在于將所述具有序列表SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中堿基序列的腸毒素C2超抗原突變蛋白基因分別克隆 入表達(dá)載體pET-28a,以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建成異源表達(dá)超 抗原活性基因工程肽的基因工程菌，在培養(yǎng)基中異源表達(dá)腸毒素C2超抗原 突變蛋白基因編碼蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體說是腸毒素C2超抗原突變蛋白基因及克隆表達(dá)和制備方法。具體為具有序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3和SEQ ID NO4中堿基序列。本發(fā)明基因的異源表達(dá)提供了腸毒素C2在抗腫瘤方面的開發(fā)潛力，本發(fā)明在SEC2的基礎(chǔ)上對其氨基端進(jìn)行了刪除突變，其氨基端對其生物活性的影響，同時在此基礎(chǔ)上希望獲得保留超抗原活性的突變蛋白。其制備超抗原抗腫瘤生物制劑，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)穩(wěn)定，方便純化的特點。
文檔編號C12P21/02GK101423834SQ20071015785
公開日2009年5月6日 申請日期2007年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者張惠文, 張成剛, 徐明愷, 王小剛, 蘇振成 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所