專利名稱：：白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。更具體地，本發(fā)明涉及從白念珠菌的基因組中克隆到編碼白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll的基因6kSFZ7及其用途。
背景技術(shù)：
：白念珠菌也稱為白色念珠菌(C朋力Was^/c朋s)，它是一種臨床上分離到的一種機會性人體致病真菌，在免疫下調(diào)的病人屮，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起廣泛的淺部和深部系統(tǒng)感染，感染部位包括口腔，女性陰道等，引起鵝口瘡，陰道炎等疾病，也可以侵入表皮和內(nèi)皮細胞進入血液到達內(nèi)臟器官，如腎臟，腦部等，導(dǎo)致敗血癥，嚴重可以導(dǎo)致死亡(0dds，F(xiàn).C.1994.JAmAcadDermatol.31:S2-S5.)。白念珠菌在不同的生長條件下，呈現(xiàn)不同的生長形態(tài)，包括菌體(yeastform),假菌絲(pseudohyphae)和菌絲(hyphae)。各種形態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)化能力直接影響白念珠菌的致病能力(0dds，F(xiàn).C.1985.CritRevMicrobiol.12:45-93;Brown,A.J.P.etal.1999.TrendsMicrobiol.7:334-338.)，菌絲生長缺陷的菌株其系統(tǒng)感染能力下降或消失(Lo，H.J.etal'1997.Cell.90:939—949;Braun，B.R.etal.2001.EMB0J.20:4753—61;Hwang，C.S.etal.2003.MolMicrobiol.47:1029-43.)。許多培養(yǎng)條件可以引起白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換，包括血清，溫度，pH值，氮源利用以及氧壓等等。細胞內(nèi)調(diào)節(jié)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的分子機制主要有MAPK途徑(mitogen-activaiedproteinkinasepathway)禾口cAMP/PKA途徑(cAMP-dependentproteinkinaseApathway)。同時還發(fā)現(xiàn)Cph2介導(dǎo)的，Efgl介導(dǎo)的以及pH應(yīng)答的信號途徑也都和白念珠菌的形態(tài)發(fā)生相關(guān)(Lane，S.etal.2001.MolCellBiol.21:6418-28;Stoldt，V.R.,etal.1997.EMB0J.16:1982-1991;ElBarkani，A.etal.2000.MolCellBiol.20:4635-4647.)。在白念珠菌屮還存在抑制效應(yīng)的信號途徑，主要是T卯l介導(dǎo)的信號途徑，依靠特異性DNA結(jié)合抑制因子Rfgl，Nrgl等來發(fā)揮作用(Kadosh，D.etal.2001.MolCellBiol.21:2496—2505;Braun，B.R.etal.2001.EMB0J.20:4753—4761.)。由于白念珠菌會嚴重威脅人們的身體健康，因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)與白念珠菌的生長或毒性有關(guān)的各種蛋白或因子，以便更好地防治白念珠菌的引起的感染。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的與白念珠菌生長有關(guān)的菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll蛋白生物。本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的CaSfll多肽，它包括具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDN0:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-100個，較佳地l-50個，更佳地1-20個，最佳地i-io個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有抑制白念珠菌菌絲形成的功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，該多肽是具有SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸的核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)編碼上述白念珠菌CaSfll多肽的多核苷酸；禾n(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDN0:1中1-2415位的序列;(b)具有SEQIDNO:1中1-2418位的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞(包括含有上述載體或染色體中整合有上述多核苷酸的宿主細胞)。在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有白念珠菌CaSfll蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達白念珠菌CaSfll蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞(b)從培養(yǎng)物中分離出具有白念珠菌CaSfll蛋白活性的多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的白念珠菌CaSfll多肽特異性結(jié)合的抗體。在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗白念珠菌CaSfll多肽活性的化合物，以及抑制白念珠菌CaSfll多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是白念珠菌CaSfll多肽的編碼序列或其片段的反義序列。在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CaSfll蛋白的方法，它包括將樣品與CaSfll蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品屮存在CaSfll蛋白。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種篩選調(diào)控白念菌菌絲形成的候選物質(zhì)的方法，該方法包括(a)將測試物與白念菌進行接觸，并觀察白念珠菌CaSfll多肽的表達情況，其中如果白念珠菌CaSfll多肽的表達上調(diào)，則表示所述測試物是抑制白念菌菌絲形成的候選物質(zhì)；如果白念珠菌CaSfll多肽的表達下調(diào)，則表示所述測試物是促進白念菌菌絲形成的候選物質(zhì)。在另一優(yōu)選實施例中，所述的篩選方法還包括將觀察結(jié)果與對照組進行比較，其中所述的對照組是不添加所述測試物的白念菌培養(yǎng)物。在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明多肽可被用于篩選促進白念珠菌CaSfll多肽活性的激動劑，或者篩選抑制白念珠菌CaSfll多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的白念珠菌CaSfll蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。在一個優(yōu)選例中，白念珠菌CaSfll多肽或基因被用于制備檢測白念珠菌的試劑，或者篩選抑制CaSfll表達或活性的抑制劑或拮抗劑，或作為篩選抑制CaSfll表達或活性的靶點。在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如0.001-99.99wt%)的本發(fā)明的白念珠菌CaSfll多肽的拮抗劑或抑制劑(如抗體)以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療白念珠菌感染等病癥。在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種白念珠菌CaSfll多肽或其拮抗劑或激動劑的用途，其中所述的白念珠菌CaSfll多肽或其激動劑被用于制備抑制白念菌菌絲形成的組合物；或者所述的白念珠菌CaSfll多肽的拮抗劑被用于制備促進白念菌菌絲形成的組合物。較佳地，所述的組合物還被用于降低白念菌的毒性(尤其是當組合物含有白念珠菌CaSfll多肽的激動劑或拮抗劑時)。在本發(fā)明的第十一方面，提供了白念珠菌CaSfll多肽的激動劑或拮抗劑的用途，所述的白念珠菌CaSfll多肽的激動劑或拮抗劑被用于制備降低白念菌毒性的組合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1A顯示了白念珠菌CaSfll蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。圖IB顯示了白念珠菌CaSfll蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖1C顯示了白念珠菌CaSfll因子與釀酒酵母Sf11因子的結(jié)構(gòu)域比較。圖2A顯示了白念珠菌Cs57^7基因能夠校正釀酒酵母s/77單倍體缺失株的絮凝反應(yīng)。圖2B顯示了白念珠菌Cs5FZ7基因能夠校正釀酒酵母s/77雙倍體缺失株的強菌絲生長表型。圖3A顯示了白念珠菌CkS7^/基因的敲除策略及其在基因組內(nèi)的物理圖譜。圖3B顯示了在白念珠菌Ca5T^/基因的敲除過程中相關(guān)菌株的Southern雜交圖譜。圖4A顯示了白念珠菌cas/77/cas/77缺失株在SD培養(yǎng)基中促進菌絲發(fā)育。圖4B顯示了白念珠菌cas/77/cas/77缺失株中菌絲特異性基因州F尸/和況S7去抑制表達。圖5顯示了白念珠菌Ca57^7基因的過表達在菌絲誘導(dǎo)條件下抑制菌絲發(fā)育。圖6顯示了白念珠菌&571/基因的缺失和過表達都降低白念珠菌的毒性。圖7顯示了白念珠菌CaSfll-GFP融合蛋白在酵母態(tài)和菌絲態(tài)都定位在細胞核內(nèi)。具體實施例方式本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，首次在白念珠菌中克隆了一種編碼白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll的基因Ck5T^/。具體地，本發(fā)明人利用同源重組原理，在白念珠菌中敲除&57^/基因，構(gòu)建了^^/7//^5/77基因缺失株，該缺失株在非菌絲誘導(dǎo)條件下促進菌絲發(fā)育，并且降低白念珠菌菌絲誘導(dǎo)所需閥值。在白念珠菌中過表達"571/能夠抑制菌絲的發(fā)育，說明CaSfll是一個新的白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子。小鼠系統(tǒng)感染實驗證明cm/77/cm/77缺失株和Cs5"化/高表達菌株的毒性都是減弱的，表明CaSfll在白念珠菌中的表達量與其毒性表現(xiàn)直接相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，術(shù)語"CaSfll蛋白"、"CaSHl多肽"或"菌絲發(fā)育抑制因子CaSf11"可互換使用，都指具有白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll氨基酸序列(SEQIDN0:2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll。在本發(fā)明中，術(shù)語"編碼菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll的基因6k57^,'、"。57^/基因"、"CkS7^7或CaSfll編碼DNA"可互換使用，都是指編碼白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子CaSfll的基因Cs57^Z/。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境屮分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，"分離的CaSfll蛋白或多肽"是指CaSfll多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化CaSfll蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括白念珠菌CaSfll蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然白念珠菌CaSfll蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語"白念珠菌CaSfll多肽"指具有白念珠菌CaSfll蛋白活性的SEQIDN0:2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與白念珠菌CaSfll蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括白念珠菌CaSfll蛋白的活性片段和活性衍生物。該術(shù)語還包括與SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%,較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%序列相同性，并且具有抑制白念珠菌菌絲發(fā)育或形成的功能的多肽。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與白念珠菌編碼CaSfll的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗白念珠菌CaSfll多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含白念珠菌CaSfll多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了白念珠菌CaSfll多肽的可溶性片段。通常，該片段具有白念珠菌CaSfll多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約IOO個連續(xù)氨基酸。本發(fā)明還提供白念珠菌CaSfll蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然白念珠菌CaSfll多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，"白念珠菌CaSfll蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或脂A形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDN0:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDN0:2的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:l所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。編碼SEQIDN0:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%,較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS,60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQIDN0:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼CaSfll蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。本發(fā)明的編碼白念珠菌CaSfll多肽的核苷酸全長序列或相應(yīng)片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞屮分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明的CaSfll蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的CaSfll蛋白序列中。應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki，etal.Science1985;230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或CaSfll蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science,1984;224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的CaSfll多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼白念珠菌CaSfll多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，編碼白念珠菌CaSfll的多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語"重組表達載體"指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg,etal.Gene,1987，56:125);在哺乳動物細胞屮表達的pMSXND表達載體(LeeandNathans,JBioChem.263:3521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含白念珠菌CaSfll編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,etal.MolecularCloning,aLaboratoryManual,coldSpringHarborLaboratory.NewYork,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導(dǎo)raRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；入噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞屮表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。重組的白念珠菌CaSfll蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選促進或?qū)笴aSfll蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組白念珠菌CaSfll蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制白念珠菌CaSfll蛋白功能的多肽分子。另一方面，本發(fā)明還包括對白念珠菌CaSfll編碼DNA或其DNA片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。"特異性"是指抗體能結(jié)合于白念珠菌CaSfll蛋白或片段。較佳地，指那些能與白念珠菌CaSfll蛋白或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制白念珠菌CaSfll蛋白的分子，也包括那些并不影響白念珠菌CaSfll蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的白念珠菌CaSfll蛋白結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員巳知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的白念珠菌CaSfll蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達白念珠菌CaSfll蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256;495，1975;Kohler等人，Eur..T.Immunol.6:511，1976;Kohler等人,Eur.,J.Immunol.6:292，1976;Hammer1ing等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷白念珠菌CaSfll蛋白功能的抗體以及不影響白念珠菌CaSfll蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用白念珠菌CaSfll蛋白的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與白念珠菌CaSfll蛋白的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如￡CbW)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。抗白念珠菌CaSfll蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標本中的白念珠菌CaSfll蛋白。本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與白念珠菌CaSfll蛋白相關(guān)的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷白念珠菌CaSfll蛋白的產(chǎn)生或活性。抗體也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如白念珠菌CaSfll蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅表達CaSfll蛋白的白念珠菌。多克隆抗體的生產(chǎn)可用白念珠菌CaSfll蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。利用本發(fā)明的CaSfll蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CaSfll蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抗體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。本發(fā)明的CaSfll蛋白的抗體、抑制劑、或拮抗劑等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)屮，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)口腔內(nèi)、陰道內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。例如，本發(fā)明的CaSfll蛋白的抗體、抑制劑、或拮抗劑可直接用于疾病治療，例如，用于抑制白念珠菌的正常生長，進而減輕白念珠菌造成的感染。在使用本發(fā)明CaSfll蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如其他抗真菌劑氟康唑等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的抗CaSfll多肽的抗體或其拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的CaSfll蛋白的拮抗劑或抗體施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。能與白念珠菌CaSfll蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，宜對白念珠菌CaSfll蛋白分子進行標記。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測白念珠菌CaSfll蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的白念珠菌CaSfll蛋白水平，可以用作判斷白念珠菌是否會造成嚴重的感染。一種體外非診斷性檢測樣品中是否存在CaSfll蛋白的方法是利用CaSfll蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與CaSfll蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CaSfll蛋白。CaSfll蛋白的多聚核苷酸可用于CaSfll蛋白相關(guān)疾病的診斷。在診斷方面，CaSfll蛋白的多聚核苷酸可用于檢測CaSfll蛋白的表達與否。如編碼CaSfll的DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷CaSfll蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用CaSfll蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測CaSfll蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測編碼CaSfll的基因的突變也可用于診斷CaSfll蛋白相關(guān)的疾病。CaSfll蛋白突變的形式包括與正常野生型CaSfll編碼DNA序列相比的點突變、缺失、和其它任何異常等。可用己有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從白念珠菌基因組DNA中分離出的。其序列如SEQIDN0:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為2418個堿基，其開放讀框位于1-2415位，編碼全長為805個氨基酸的白念珠菌CaSfll蛋白(SEQIDNO:2)。CaSfll蛋白為治療白念珠菌感染提供新的治療途徑，具有潛在的應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例材料限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、探針標記試劑盒均購自美國Invitrogen公司；消解酶(Zymolyase100T)購自日本Seikagaku公司；酸洗玻璃珠(425600fxm)，CalcoflourWhite熒光染料，F(xiàn)LAGM2抗體，蛋白酶抑制劑均購自Sigma公司，proteinG-bead懸液購自Roche公司，GFP抗體購自SantaCruz公司，ECL試劑購自Pierce公司，用于PCR擴增的K0Dplus購自日本的Toyobo公司。通用方法(l)白念珠菌基因組DNA抽提白念珠菌培養(yǎng)過夜用ddH20洗1次，懸浮在500^1溶液A中(1M山梨醇，lOOmMEDTApH8.0)，加入5|ll20mg/ml的Zymolase，37°C放置1小時后，高速離心去上清，細胞用500|xlofTEbuffer(20mMTris.HClpH7.5，lmMEDTA)洗一次，懸浮在350^1ofTEbuffer中，并加入90plof溶液B(250mMEDTApH8.0，400mMTris.HClpH8.0，2%SDS)，65。C放置30分鐘，加入80|Lllof5MKAc，冰上放置1小時，高速離心5分鐘，吸取上清并加入lml的無水乙醇，-20°(]放置20分鐘，高速離心5分鐘，沉淀用70%乙醇洗一次，離心后烘干。(2)Southern分析基因組DNA用,p/2l/^a[完全酶切，電泳完成后的瓊脂糖膠分別用變性液和中和液浸泡45min,尼龍膜用雙蒸水或10xSSC浸透，搭好轉(zhuǎn)膜平臺，膠與膜間用Parafilm封閉，加一個500g砝碼。，以10xSSC為轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)移過夜，第二天漂洗晾干交聯(lián)。交聯(lián)后的膜裝入雜交管，加入10ml預(yù)雜交液(6xSSC，5xdenhardt'sReagent,0.5%SDS，100(ig/ml魚精DNA于65'C預(yù)雜交lh，探針在IO(TC變性5min，加入150(^1(約1/3所標記的探例)65。C雜交10-16h。0.lxSSC，0.1。/。SDS洗兩到三次，每次30min，取出膜，晾干，磷屏顯影5h。探例標記用invitrogene的隨機引物標記試劑盒，并按照其說明操作。將含25ngDNA的溶液于100°C加熱變性5-10min，置于冰浴中，再依次加入RandomPrimersBufferMixture,2|LildCTP，2|ildGTP，2^1dTTP，3|il[oc-32P]_dATP(10|LiCi/|il)，混勻后加入l^llKlenow酶，于25。C保溫lh，以S印hadexG-25柱以3000rpm離心4min，收集離心液，即為純化后的探例溶液。探例于100°C變性5min冰上冷卻后加入雜交體系中。(3)Northern分析用常規(guī)的熱酚法抽提白念珠菌總RNA。各菌株在YPD，3(TC中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，轉(zhuǎn)接至SD培養(yǎng)基中，起始0D二0.2，并在相應(yīng)溫度下培養(yǎng)指定時間，用熱酚法抽提白念珠菌總RNA。20^1上樣量包括RNA樣品12nl(25嗎)，4^1甲醛，2|il10xM0PS，2^1上樣緩沖液、65。C加熱10min，(TC冷卻2min，離心5s，上樣。電泳在含甲醛的變性膠上進行(lg瓊脂糖，l(M10xM0PS，87mlDEPC處理水，加熱融化稍冷后加入2.7ml37%甲醛)。電泳條件為100mA，50-70V，5-7h電泳完成后同樣用毛細法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜液用5xSSC。轉(zhuǎn)膜過夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-RaGSGeneLinkerC3protocol紫外交聯(lián)，加入10ml預(yù)雜交液，65°C，2h后更換為10ml雜交液，加入探針65'C雜交過夜，用2xSSC，0.1%SDS，65'C洗膜兩次，每次30min。雜交好的膜不要晾干，用保鮮膜包好后磷屏顯影。重雜交洗膜用0.5%SDS，90-100°C加熱5-10min，或按照Clontech推薦用0.5%SDS，90-100'C加熱10min后讓其自然冷卻10min后取出備用，若不立即位用，用保鮮膜包好后置于-20'C保存。(4)白念珠菌和釀酒酵母的轉(zhuǎn)化準備PEG/LiAc溶液(pH7.5)10ml;在1.5mlEppendof管中依次加入質(zhì)粒(如果轉(zhuǎn)釀酒酵母，質(zhì)粒O.(ig，如果轉(zhuǎn)白念珠菌，線形化質(zhì)粒大約5|ig)，10^110mg/ml魚精DNA，混勻；加入O,lml感受態(tài)細胞和O.6mlPEG/LiAc，votex混勻;30°C200rpm培養(yǎng)30min;加入70|xlDMS0，輕輕混勻；42'C熱沖擊15min，期間不時輕輕搖勻；冰浴2min:高速離心15s，吸掉上清，用0.2mlTE重懸細胞；涂布于適當?shù)臓I養(yǎng)篩選SD平板上。(5)絮凝沉淀反應(yīng)所需菌在SD液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)過夜，使之達到飽和狀態(tài)。轉(zhuǎn)至試管中劇烈搖晃后，靜置15分鐘，觀察照相。(6)雙倍體酵母菌的假菌絲生長及細胞形態(tài)觀察挑取單個酵母菌落，均勻的劃線涂于SLAD平板，3(TC培養(yǎng)3-5天觀察單個細胞形成的克隆形態(tài)并拍照記錄。(7)小鼠系統(tǒng)感染實驗以體重在18-21gICR雄性小鼠為實驗對象，通過尾靜脈注射IO(HU白念珠菌各菌株，并培養(yǎng)觀測25天。各個菌株注射濃度為5x106細胞/毫升。實施例l編碼白念珠菌CaSfll蛋白的基因的獲得及結(jié)構(gòu)分析利用同源序列搜索的方法從白念珠菌(C朋WAs"ica/s)基因組序列中(http:〃genolist.pasteur.fr/CandidaDB/，http:〃w麗.candidagenome.org/)得至U—個與釀酒酵母Sfll(ScSfll，5"acc力arCT7^cescerew'w'aeSfll)同源性最高的蛋白CaSf11。根據(jù)搜索結(jié)果，合成以下引物上游引物ATGAGTCATTTGGTACTGTCT(SEQIDNO:3)下游引物:TTATTCTAATTTTCTCTTTTTATG(SEQIDNO:4)以野生型白念珠菌基因組DNA為模板，通過常規(guī)的PCR反應(yīng)獲得長度約2.42Kb的擴增產(chǎn)物。通過合成一系列引物對擴增產(chǎn)物所含的DNA序列進行雙向測定。計算機分析表明，該擴增產(chǎn)物所含的全長DNA是一個新的DNA序列(如SEQIDNO:1和圖1A所示)，編碼一個新的805個氨基酸的蛋白質(zhì)(如SEQIDNO:2和圖IB所示)。此蛋白質(zhì)被命名為CaSfll(C朋力'cfea^/ca/sSfll)蛋白，其編碼基因命名為6^67^7基因。CaSfll蛋白全長805aa(圖1B)，分子量90.2KD，等電點9.54。與ScSf11類似，在CaSfll蛋白的N端部分(113-223位)含有一個HSF結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域可以與啟動子上稱為熱休克元件的反向重復(fù)序列GAAnnTTC特異結(jié)合(Conlanetal..JMolBiol309:1007-1015);CaSfll中間部分(363-383位)含有一個coiledcoil結(jié)構(gòu)，此外CaSfll還具有4個釀酒酵母Sfll不具有的多聚谷氨酰胺序列(圖1C)。由于釀酒酵母的5FZ7基因以及Sfll蛋白最早命名，白念珠菌中的同源基因和同源蛋白也是以相同的名字命名，這是白念珠菌的命名規(guī)則之一。為了區(qū)別白念珠菌(Candidaalbicans)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的SFL1基因及其對應(yīng)的Sf11蛋白，我們有時在名稱前加上前綴Ca代表白念珠菌(Candidaalbicans)(caSFL1,CaSfll)，Sc代表釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(ScSFL1，ScSfll)，斜體表示基因，正體表示蛋白。在不引起誤解的地方，也可直接用5FZ/表示白念珠菌57=17基因而用Sfll表示白念珠菌Sfll蛋白，這是沿用了白念珠菌研究領(lǐng)域的慣例。實施例2白念珠菌CkS7^7互補釀酒酵母5b57^的功能釀酒酵母57^/最初是作為能夠抑制酵母細胞的絮凝作用而被發(fā)現(xiàn)的。它的缺失能夠增強絮凝反應(yīng)，以至于在雙倍體缺失株中都能觀察到細胞下沉的絮凝現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象卻無法在野生型雙倍體菌株中觀察到。Sfll也參與對釀酒酵母細胞假菌絲形成的調(diào)控，在氮源缺乏條件下，s/77/9/77缺失株解除抑制呈現(xiàn)強烈的假菌絲生長。為了檢測"57^Z7是否可以互補釀酒酵母57^/基因的功能，將6k5FZ/基因克隆到載體pVTU102(Vernetetal.Gene.198752:225-233)的5awHIA&I位點上，形成pVTU-CaSFLl，并將這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母s/7/缺失株。試驗菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和狀態(tài)，靜置。結(jié)果表明外源表達6kS7^7能校正s/77缺失株的絮凝表型回復(fù)到野生型狀態(tài)(圖2A);試驗菌株在低氮源的SLAD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，s/77/9/77缺失株形成邊緣具有濃密假菌絲的菌落，而表達的s/77/s/7/缺失株生成邊緣光滑的菌落(圖2B)，說明Ck5Z7也能校正s/〃/s/77缺失株的假菌絲強烈形成表型。以上結(jié)果證明6k5KU是釀酒酵母5FZ/的同源基因，表達的CaSfll是ScSfll的同源蛋白。實施例3白念珠菌CaSFLl基因的敲除為了研究6k57^/基因在白念珠菌形態(tài)發(fā)生中的作用及其機制，采用PCR同源重組法構(gòu)建css/77/c"/77缺失株。基因敲除示意圖如圖所示(圖3A)。合成的上下游引物分別為5DR:5-ATGAGTCATTTGGTACTGTCTTCACTTGGTACGACAACGACTGCTACTCCAACTTCAAGAGTTTTCCCAGTCACGACGTT(SEQIDNO:5);和TGTGGAATTGTGAGCGGATA(SEQIDNO:6)。其中每個引物的5'端的60個堿基和6kSFZ7同源，3'端的20個堿基和用于PCR擴增模板質(zhì)粒中的DNA配對。分別以質(zhì)粒pGEM-HISl(Wilsonetal.JBacteriol1999181:1868-1874)和pRS-ARG4ASpeI(Wilsonetal.JBacteriol1999181:1868-1874)為模板，以5DR和3DR為引物，通過PCR擴增得到片段用于轉(zhuǎn)化白念珠菌。首先用pGEM-HIS1擴增出的片段轉(zhuǎn)化受體菌HLY1902(力i's-,"rs-arg-)，在SD(Ai's-)平板上篩選得到24個克隆，挑取12個克隆用Southern雜交進行鑒定。鑒定結(jié)果顯示正確插入#/57的菌株為單拷貝敲除株CaLl。再把CaLl作為受體菌進行第二拷貝CkS7^/的敲除，PCR合成的/!/ft^片段用于轉(zhuǎn)化，經(jīng)過營養(yǎng)篩選和Southern雜交鑒定得到^f+，#/5+的sf11雙拷貝缺失株CaL2(圖3B)。將含有一段1.3kb啟動子和全長開放閱讀框的6k5FZ7片段插入到質(zhì)粒pBES116(Fengetal.J.Bacteriol1999181:6339-6346)上，形成pBES116-CaSFLl。利用限制性內(nèi)切酶順el酶切線性化該質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化cas/77/c^/77缺失株CaL2，得到^57=1/整合回到本身基因位置的回復(fù)菌株用于表型分析。實施例4CkSFZ/基因的缺失增強白念珠菌菌絲的形成觀察cas/77/cs^77缺失株在酵母生長條件下的表型，發(fā)現(xiàn)cm/7Z/cm/77缺失株促進菌絲的形成。在SD固體培養(yǎng)基30。C生長6天，Ck57^7缺失株解除對菌絲生長的抑制，形成干燥褶皺的菌落，在顯微鏡下觀察菌落內(nèi)的部分細胞呈伸長的菌絲狀。野生型和回復(fù)菌株都形成表面濕潤光滑的菌落，鏡檢細胞也都呈橢圓型的酵母態(tài)。css/77/cas/7/缺失株在液體SD培養(yǎng)基屮也表現(xiàn)出了類似的表型，大約有30%的細胞呈菌絲態(tài)生長，而野生型和回復(fù)菌都呈酵母態(tài)生長(圖4A)。這些結(jié)果證明CaSfll是個形態(tài)發(fā)生的抑制因子，在白念珠菌中抑制菌絲生長，與釀酒酵母Sfll功能類似。然而，css/7力/css/7/缺失株在豐富培養(yǎng)基YPD中卻沒有促進菌絲生長，"57^7的缺失株可能只有在營養(yǎng)貧瘠的信號激活下才能表現(xiàn)出去抑制表型。白念珠菌的形態(tài)發(fā)生伴隨著菌絲特異性基因如州『厶^G57的特異表達(Birseetal.Infect.Imniun.199361:3648-3655;Staabetal.J.Biol.Chem.1996271:6298-6305)。我們檢測了cas/77/cas/"缺失株中和￡T￡7的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明在SD培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)6小時后，6kS"凡/雙拷貝缺失株中州f/3/，被大量的誘導(dǎo)，而野生型和單拷貝缺失株以及^67^7回復(fù)菌株都沒有檢測到這兩個基因的表達(圖4B)，證明CaSfll是菌絲特異性基因轉(zhuǎn)錄的抑制因子。實施例5Ca57^基因的過表達抑制白念珠菌的菌絲形成為了研究CaSfll的表達劑量對菌絲形成的影響，將Ca5FiJ基因克隆到質(zhì)粒pBAl(FangCaoetal.MolBiolCell.200617:295-307)上，在啟動子下過表達Ck5F〃，觀察在菌絲誘導(dǎo)條件下菌株的形態(tài)變化。在含有血清的固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)3天，6k5FZ7過表達菌形成圓形的邊緣帶有少量短菌絲的菌落，而野生型菌形成長長的邊緣帶有濃密菌絲的菌落，表明Ca57^/的過表達抑制菌絲的形成。在固體Lee's培養(yǎng)基中更明顯，野生型形成褶皺的菌落，邊緣環(huán)繞的菌絲能侵入到瓊脂里，而^571/過表達菌形成光滑的菌落(圖5)。在液體培養(yǎng)基中過表達Cs5FZ7同樣抑制菌絲的形成，在YPD+10y。血清或者Lee's中性pH培養(yǎng)條件下，Ca5F〃過表達菌只有10%的細胞形成粗短的菌絲，而90%的細胞以酵母態(tài)生長。Ck5Z7基因的缺失增強絲狀生長，把Cs57^7整合到本身基因座內(nèi)在內(nèi)源啟動子控制下表達能回復(fù)css/77/css/77缺失株強絲狀生長的表型，在c^/7M^/77缺失株中過表達Ck5FZ7則又能抑制絲狀生長(圖5)，表明CaSfll對菌絲的抑制作用是劑量依賴型的，這表明CaSfll蛋白是一種白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子。實施例6Ca5FZ7基因的缺失和過表達都能減弱白念珠菌的毒性酵母-菌絲形態(tài)之間轉(zhuǎn)換的能力與白念珠菌的致病能力密切相關(guān)。一些正調(diào)控因子FloS，Crkl，Efgl等的缺失株不能形成菌絲同時也喪失了毒性，一些負調(diào)控因子Tupl，Nrgl，Ssn6等的缺失株能組成型形成菌絲但其毒性或喪失或大幅下降。目前認為一些重要的毒性因子只在白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中被釋放，鎖定在任何一種的形態(tài)，都會阻斷這些毒性因子的表達釋放，因而毒性下降。本實施例中，通過小鼠系統(tǒng)感染試驗來檢測基因?qū)Π啄钪榫亩拘曰蛘吒腥灸芰Φ挠绊?。?8-20克的ICR雄性小鼠作為實驗對象，通過尾靜脈對每個小鼠注射5xl05個細胞，然后觀察小鼠的存活率來判斷菌株的致病能力。已有文獻報道，^A的拷貝數(shù)目影響了菌株的毒性。t/27^缺失菌株不能形成菌絲，也沒有毒性。由于本發(fā)明人改造過的菌株都只有一個拷貝的^A基因，所以為了避免WA的拷貝數(shù)干擾6k57^/對毒性的影響，改用只有一個拷貝"^A基因的野生型菌株CAF2-1作為陽性對照。結(jié)果顯示，注射CAF2-1的小鼠和注射^57^7回復(fù)菌的小鼠在第14天全部死亡，而注射css"7/ras/77缺失株和Ck57^Z2高表達菌株的小鼠在第25天分別還有38%和25%的存活，說明Ck57^7基因的缺失和過量表達使白念珠菌的致病能力下降，CaSfll的表達量影響白念珠菌的毒性表現(xiàn)(圖6)。實施例7CkSFZ7基因的缺失降低白念珠菌菌絲誘導(dǎo)的閾值在實驗室條件下，多種環(huán)境信號影響白念珠菌的形態(tài)發(fā)生。血清是誘導(dǎo)菌絲形成最強的外界刺激因子，它不僅能夠促進菌絲芽管的生成還能抑制菌絲生長成酵母態(tài)細胞。此外，高溫(37。C)、屮性pH，營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)條件也能促進菌絲的生成。相反，低溫(25。C或者30°C)，酸性pH，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)條件則有利于酵母態(tài)細胞生長。通常情況下，一種誘導(dǎo)信號并不足以使野生型白念珠菌形成菌絲，而需要兩種或多種信號的組合。比如豐富培養(yǎng)基YPD要加入10%血清并在高溫下誘導(dǎo)才能形成菌絲，高溫中性pH的Lee's或者高溫Spider培養(yǎng)基誘導(dǎo)才可以形成菌絲。我們初步觀察到c^/77/c^/W缺失株在營養(yǎng)相對貧瘠的SD培養(yǎng)基中形成菌絲而在豐富培養(yǎng)基YPD中形成酵母細胞，說明CaSfll受到營養(yǎng)信號的調(diào)控。為了分析CaSfll是否受某種專一的菌絲誘導(dǎo)信號調(diào)控，我們檢測了該缺失株在不同溫度、不同pH、不同營養(yǎng)、以及有無血清的培養(yǎng)基中形成菌絲的能力(表1)。在高溫37。C，cas/77/cas/7/缺失株在所有檢測的液體培養(yǎng)基中都能形成菌絲，包括營養(yǎng)豐富的YPD培養(yǎng)基，低氮源的SLAD培養(yǎng)基，低碳源的SLCD培養(yǎng)基，酸性pH的Lee's培養(yǎng)基。而野生型對照菌SC5314在YPD中只能形成短的菌絲，在酸性pH的Lee's培養(yǎng)基屮不能形成菌絲，說明c^/7厶/css/7/缺失株具有菌絲生長的去抑制作用，在高溫下降低了pH閾值使白念珠菌在pH4.0就能誘導(dǎo)形成菌絲在中等溫度30°C，野生型菌株SC5314在所有檢測的液體培養(yǎng)基中都不能被誘導(dǎo)形成菌絲。然而，cas/77缺失株卻能夠在除了YPD之外的所有培養(yǎng)基中都能形成菌絲，形成菌絲的比例從在酸性pH培養(yǎng)基中的10%到營養(yǎng)限制培養(yǎng)基(Spider)中的100%變化。血清的添加不能促進野生型細胞生成菌絲，但卻能足夠的促進C3S/W缺失株形成更高比例的菌絲。這些結(jié)果表明，Ca^Z/的缺失降低了白念珠菌感應(yīng)營養(yǎng)限制信號和血清刺激的閾值。低溫25。C是酵母態(tài)細胞生長的最佳溫度，cas/77/cas/77缺失株在豐富培養(yǎng)基中以酵母態(tài)生長，但是在營養(yǎng)貧瘠的SCLD，SLAD，Spider培養(yǎng)基中有2-5%的細胞能夠形成短的菌絲。在營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中添加10-30%的血清能夠提高菌絲形成的比例達到30-50%。這種聯(lián)合效應(yīng)在其它的營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基沒有觀察到，說明CkSFU的缺失使白念珠菌在營養(yǎng)缺乏或加入血清的條件下，降低了感應(yīng)溫度的閾值。表1cas/77/cas/77缺失株在各種培養(yǎng)基中的絲狀生長表型。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例8.CaSfll定位于細胞核CaSfll具有與HSF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能結(jié)合于靶基因啟動子區(qū)的DNA元件，PS0RTII軟件分析表明在其N端210-224位有一個NLS核定位序列。為了確認CaSfll蛋白定位在細胞核內(nèi)發(fā)揮功能，本實施例中利用重疊PCR的方法將GFP蛋白融合在CaSfll蛋白的C末端，在J/W/強啟動子下表達該融合蛋白。在酵母態(tài)培養(yǎng)條件和菌絲誘導(dǎo)條件下觀察，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白的定位沒有發(fā)生改變，說明CaSfll的核定位不受形態(tài)調(diào)控，組成型地分布在細胞核內(nèi)，而表達對照GFP的菌株其GFP均勻分布在整個細胞中(圖7)。此外，還檢査了CaSfll-GFP融合蛋白在&々2缺失株和外源加入cAMP條件下的定位情況，結(jié)果顯示，CaSfll依然定位在細胞核內(nèi)，表明CaSfll的定位不受cAMP/PKA信號通路的調(diào)控。白念珠菌CaSfll的核定位進一步支持了它在白念珠菌中是作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子來調(diào)節(jié)白念珠菌的形態(tài)發(fā)生。實施例9CaSfll蛋白重組表達和純化在該實施例中，以實施例1中的PCR擴增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5'和3'端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得白念珠菌CaSfll編碼DNA作為插入片段。PCR反應(yīng)中使用的5'端寡核苷酸引物序列為5'-CTGGGATTCATGAGTCATTTGGTACTGTCT-3'(SEQIDNO:7)該引物含有5sMH限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3'端引物序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>該引物含有Sa/zin限制性內(nèi)切酶的酶切位點、翻譯終止子和白念珠菌CaSfll的部分編碼序列。白念珠菌CaSfll編碼DNAPCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamHI酶切再與質(zhì)粒pGEX-2T(購自美國Irwitrogen公司)按常規(guī)方法重組形成載體pGEX_2T-CaSfll并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5oc，挑取陽性克隆用EcoRI酶切鑒定插入方向，酶切產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDyeTerminator試劑盒，PE公司)。經(jīng)測序證實，已插入了完整的CaSfll編碼序列。挑表達CaSfll的陽性DH5oc克隆接種于100ml2xYTA培養(yǎng)基中，37°C300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1:10稀釋于預(yù)熱的2xYTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr,加100mMIPTG至0.lmM后30。C誘導(dǎo)2-6hr，5，000g4°C離心10min去上清，置冰上用50mllxPBS(0.14MNaCl，2.7mMKCl，10.lmMNa2HP04,1.8mMKH2P04，pH7.3)重懸，超聲(B.BraunLabsonicU)破碎后再加入20%TritonX-100至1%輕搖30min，然后12,000g4。C離心10min，上清用0.8(im濾膜過濾后，過lml50%谷胱甘肽S印harose4B層析柱，lxPBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mMTris-HC1，pH8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到白念珠菌CaSfll蛋白。實施例10抗CaSfll蛋白抗體的產(chǎn)生將實施例9中獲得的重組白念珠菌CaSfll蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund's佐劑乳化。用50-100pg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freimd's佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100|ig/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀白念珠菌CaSfll蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明的CaSfll蛋白發(fā)生結(jié)合。實施例11篩選調(diào)控白念菌菌絲形成的候選物質(zhì)在白念菌的培養(yǎng)物中，添加測試物質(zhì)(Cs57^7基因的反義核酸片段)，作為測試組(每組有5個培養(yǎng)物)；在另一白念菌的培養(yǎng)物中，不添加測試物質(zhì)，作為對照組(每組有3個培養(yǎng)物)。觀察測試組和對照組中觀察白念珠菌CaSfll多肽的表達情況。結(jié)果表明，與對照組相比，測試組中白念珠菌CaSfll多肽的表達下調(diào)，因此所述測試物是促進白念菌菌絲形成的候選物質(zhì)。這提示，所述的"57^7基因的反義核酸片段通過抑制CaSfll多肽的表達，進而促進了白念菌菌絲的發(fā)育和形成。討論由于釀酒酵母和白念珠菌在許多細胞過程中的保守性，通常用其來研究白念珠菌的形態(tài)相關(guān)基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。釀酒酵母Sfll是調(diào)控酵母形態(tài)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄抑制因子。57^/的缺失能夠增強酵母細胞的絮凝反應(yīng)、侵入瓊脂的能力以及形成假菌絲的能力(Fujita.Aetal.1989.Gene85,321-8;Pan,Xetal.1999.MolCellBiol22,3981-93)。Sfll通過其N端的熱休克因子結(jié)構(gòu)域(HSFdomain)結(jié)合到耙基因啟動子的特異DNA序列上，然后通過與Ssn6蛋白的相互作用，募集T叩l/Ssn6抑制復(fù)合物，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響酵母的形態(tài)發(fā)生(Conlanetal.JMolBiol2001:309，1007-15)。在氮源缺乏條件下，缺失株解除其對假菌絲生長的抑制作用，呈現(xiàn)強烈的絲狀生長，即使在調(diào)控假菌絲生長的重要激酶Tpk2(PKA的一個催化亞基)缺失時，s/7/Zs/7/缺失株仍然能夠生成菌絲。釀酒酵母Flo8是cAMP/PKA途徑下游的一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，也參與酵母細胞的絮凝作用，侵入生長和假菌絲形成(R叩pSetal.EMBOJ.1999Mar1;18(5):1257-69)。下游耙基因化肌的轉(zhuǎn)錄需要Flo8的激活，凡^9的缺失會阻斷FZW/的表達，從而抑制酵母細胞的侵入生長和假菌絲形成。有證據(jù)表明，F(xiàn)lo8蛋白能夠結(jié)合到尸ZW7啟動子的特異元件上，而這種結(jié)合依賴PKA催化亞基Tpk2的磷酸化作用(Pan，Xetal.1999.MolCellBiol22,3981-93)。Sfll與Flo8結(jié)合于凡W7啟動子上的區(qū)域相同，兩者對該區(qū)域的結(jié)合呈競爭關(guān)系。上游激酶Tpk2通過磷酸化作用來調(diào)控Sfll或Flo8對^ZW/啟動子的競爭結(jié)合Tpk2磷酸化Sf11，使Sfll蛋白解聚并從f!W7啟動子解離，抑制解除；同時FloS被Tpk2磷酸化后結(jié)合到相同的啟動子區(qū)域激活凡W7的轉(zhuǎn)錄。白念珠菌(C朋力Wss^yc朋s)是一種人體機會性致病真菌，可以引起廣泛的感染，多種調(diào)控因子與其致病相關(guān)。利用生物信息學(xué)比較分析，我們在白念珠菌的基因組序列中找到一個基因，該基因編碼的產(chǎn)物和釀酒酵母(5"scc力aro扱ycescereWw'se)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sfll(ScSfll)具有最高的序列同源性和結(jié)構(gòu)域相似性，因此把該基因稱為白念珠菌5FZ7基因(Ca67^7)，對應(yīng)的蛋白稱為白念珠菌Sfll因子(CaSfll)。在釀酒酵母s/77缺失株中表達CkSFZ7能夠互補s/77缺失株的過絮凝反應(yīng)和強菌絲形成表型，說明"57^Z7在功能上也是&571/的同源物。在白念珠菌中表達CaSfll-GFP融合蛋白，該融合蛋白定位于細胞核內(nèi)。在白念珠菌中敲除Ck57^厶構(gòu)建cas/77/c^/77缺失株，該缺失株在非菌絲誘導(dǎo)條件下促進菌絲發(fā)育，并且降低白念珠菌菌絲誘導(dǎo)所需閥值。在白念珠菌中過表達"5FZ/能夠抑制菌絲的發(fā)育，說明CaSfll是一個新的白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子。另外，小鼠系統(tǒng)感染實驗證明cas/77/cas/77缺失株和&57=17高表達菌株的毒性都是減弱的，表明CaSf11在白念珠菌中的表達量與其毒性表現(xiàn)直接相關(guān)。至于cas/77/cas/7/缺失株和6k5^Z7高表達菌株的毒性都減弱的原因，是因為白念菌的毒性與白念菌的"菌絲一酵母"轉(zhuǎn)化能力有關(guān)，轉(zhuǎn)化能力越強，則毒性越強。抑制菌絲發(fā)育，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化能力下降，故白念菌毒性下降；而促進菌絲發(fā)育，也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化能力下降，故白念菌的毒性也下降。因此，基于本發(fā)明，白念珠菌CaSfll多肽的激動劑或拮抗劑可被用于制備降低白念菌毒性的組合物。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子及其用途<130>074592〈160>8<170>Patentlnversion3.4〈210〉1<211>2418<212>隨<213〉白念珠菌(Candidaalbicans)<220〉<221〉CDS<222>(1)..(2415)〈400〉1atg叫tcatttggtactgtctteacttggtacgacgactgetact48MetSerHisLeuValLeuSerSerLeuGlyThrThrThrThrAlaThr151015acttea卿agtccacat3CC331catageaccccctacaatca396ProThrSerArg20SerProHisThrAsn25HisSerThrProTyr30AsnGintctateactteaaat卿agetecCC3gttcct犯g犯tteagtc144AsnSerlie35ThrSerAsnArgSer40SerProValProLys45AsnSerValtea卿attatac犯atgaatCC3cctatagatatgsag192AsnSer50Arglie工leProGin55ThrMetAsnProPro60lieAspMetLystcg肌catattaaatccag犯gacgatacttctgga240SerAsnAsnlieLeuAsnProGluLysAspThrAspThrSerArgGly65707580gaccatctgteaaaa_gettctsgt已ttagt3gCgccsgcgga288AspHisLeuGluSer85LysAlaSerSerlie90SerSerAlaSerGly95Thractaacaataacgttagt犯t犯caatteaacggggaaa336ThrThrThrAsn100AsnAsnAsnValSer105AsnAsnAsnSerThr110GlyLysactattgttmateC3Cttatatgacatgttgcatgacgag384ThrGinlie115ValPhelieHisLys120LeuTyrAspMetLeu125HisAspGlutcg3t3teccatcttatatggtggtctCC3agtttggatteatttUt432Serlie130SerHisLeulieTrp135TrpSerProSerLeu140AspSerPheTyrgtaacgggag肌gsgttttctcgagtgttgtectatttcaag480ValThrProGlyGluGluPheSerArgValLeuSerGinTyrPheLys145150155160C3Cacg犯tattgcateatttata卿c犯tu犯catgtatggattc528HisThrAsnlieAla165SerPhelieArgGin170LeuAsnMetTyrGly175Phecataaagtaaatgagtutta犯cc肌gacgatc肌c犯c犯576HisLysValAsn180GluProPheLeuAsn185GinAspAspGinGin190GinGinttac犯teaaat卿tggg3attt卿tct3CC犯cc犯624GinGinLeu195GinSerAsnArgTrp200GluPheArgHisSer205ThrAsnGinttt柳犯3ggcgacactg3￡Ltcgtta卿atacga卿age672PheArg210LysGlyAspThrGlu215SerLeuLysAsnlie220LysArgArgSertec犯gttg犯tgcacaagttgtca_atataaaatcttta720SerLysThrLeuAsnAlaGinLysGluValValAsnlieLysSerLeu225230235240CC3ccgacttctcatatgg肌tacaacactggctactcttatc￡ia768ProProThrSerHis245ProMetGluTyrAsn250ThrGlyTyrSerTyr255GinaatgatagtgetcattattttgttcaccatC3Cagtacc3CC816AsnGluAspSerAlaHisTyrPheValHisHisHisSerlieThrThr260265270c肌teacctgetgacagacctcgttcttctactcct3t3864MetGinSerProAlaAspMetArgProArgSerProSerThrProlie275280285atgcaaCC3ttagcacaacagcagc犯cagcagcagcag912ProMetGinProLeuAlaGinGinGinGinGinGinGinGinGinGin290295300cagcagcagcagcaaetccctteccagcctgtscctggcCC3960GinGinGinGinGinGinLeuProSerGinProValProAsnGlyPro305310315320cctgtttttggaCC3attCC3ggtgccgtgaatc犯tctCC31008ProValPheSerGlyProlieProProGlyAlaValAsnGinSerPro325330335caggagtatcttacg卿teaattttasacgtcggatct1056GinGluTyrLeuThrArgProSerlieLeuAsnAsnValGinGlySer340345350ttt33tgetaatttt,tttgttgaattgact犯tCM1104PheGluAsnAlaThrAsnPheLysPheValGluLeuThrAsnGinlie355360365ttattgcgaastgacttttttatgsat331cgatatgag1152AsnLeuLeuArgAsnAspPhePheThrMetAsnAsnArgTyrGlulie370375380ctt肌tgageta肌gtacc犯gcagattctatggcagttttg1200LeuGinAsnGluLeuLys丁yrGinThrAlaAspSerMetAlaValLeu385390395400sttcttgag犯sUgtct犯tgac卿attgcaactgat1248GlulieleuGluLysLeuSerAsnAsplieAlaThrAspHe405410415cgagatUga^a_aatgtggtaage卿atgcaa柳tta犯t犯t1296ArgAspLeuLysAsnValValSerGinAr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ll多肽或其激動劑被用于制備抑制白念菌菌絲形成的組合物；或者(b)所述的白念珠菌CaSfll多肽的拮抗劑被用于制備促進白念菌菌絲形成的組合物；或者(C)所述的白念珠菌CaSfll多肽的激動劑或拮抗劑被用于制備降低白念菌毒性的組合物。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的菌絲發(fā)育抑制因子-CaSfl1蛋白，編碼CaSfl1蛋白的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種CaSfl1蛋白的方法。本發(fā)明還公開了這種CaSfl1蛋白及其編碼序列的用途。實驗證明，CaSfl1蛋白是白念珠菌菌絲發(fā)育抑制因子。小鼠系統(tǒng)感染實驗證明，CaSfl1在白念珠菌中的表達量與其毒性表現(xiàn)直接相關(guān)。文檔編號C12N15/31GK101362798SQ20071004467公開日2009年2月11日申請日期2007年8月8日優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日發(fā)明者李硯東,陳江野申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院