專利名稱：：尿沉淀dna甲基化譜式分析診斷膀胱癌的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過檢測從正常(亦可非膀胱癌者)和膀胱癌(包括癌前階段)個體的尿沉淀中基因的啟動子區(qū)CpG島中特定序列的甲基化譜式的差異來診斷膀胱癌的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
：人類和越來越多的模式生物基因組全測序的完成使對發(fā)育和疾病過程中基因組成和功能闡明進(jìn)入了新的以對非DNA序列的為基礎(chǔ)的表觀遺傳學(xué)信息層面的分析和詮釋為中心的時代。表觀遺傳由DNA甲基化(胞嘧啶[CpG]甲基化)，非編碼RAN，組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑所組成。該信息界面介于存儲的遺傳藍(lán)圖基因組DNA序列和表達(dá)模式?jīng)Q定的表型性之間。與遺傳物質(zhì)相比，它更容易受到環(huán)境的影響[l]。5'-CpG-3，序列中的胞嘧啶環(huán)(圖l)上的甲基的添加是由三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1，DNMT3a，和DNMT3b)中的一種以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基的供體來實現(xiàn)的。親本細(xì)胞中的甲基化譜式可以一種類似遺傳信息的半保留復(fù)制機(jī)制的形式被如實地復(fù)制并且分配到子細(xì)胞中。甲基化是決定轉(zhuǎn)錄層面的記憶的關(guān)鍵機(jī)制。在早期胚胎細(xì)胞發(fā)育和生殖細(xì)胞成熟過程中(表觀遺傳的改編過程)兩次重大變化期之間，DNA甲基化譜式的變化持續(xù)發(fā)生在整個個體生命過程中持續(xù)發(fā)生。表觀遺傳狀態(tài)的穩(wěn)控機(jī)制的異常會導(dǎo)至表觀遺傳損傷的積累，最終將導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)多種疾病[2]。癌癥是一受累于廣泛的表觀遺傳缺陷和遺傳缺陷的復(fù)雜疾病。這些缺陷模式隨疾病和患病個體的不同而迥異[3]。DNA甲基化是建立在酶促反應(yīng)的基礎(chǔ)上在5'-CpG-3'二核苷酸回文序列內(nèi)的胞嘧啶的五號碳原子上加上甲基(DNA甲基化)(圖l)，是研究的最為清楚且是癌癥表觀遺傳研究的焦點。85%以上的CpG二核苷酸散布位于具有轉(zhuǎn)錄依賴性的轉(zhuǎn)座潛能的重復(fù)序列中。在正常細(xì)胞中，它們處于高度甲基化/轉(zhuǎn)錄沉默的狀態(tài)，是基因組的完整性所必須。腫瘤細(xì)胞基因組的廣泛低甲基化的狀態(tài)，導(dǎo)致重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)座活動上揚(yáng)[2,4]，繼而基因組的非穩(wěn)定性和原癌基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)[5,6]。其余的CpG成簇的分布于短的DNA區(qū)域(長度大約在0.2至ljlkb)，被稱為"CpG島"。約40-50n/。的基因在啟動子區(qū)域或其附近有CpG島，提示該類基因的轉(zhuǎn)錄可受著DNA甲基化介導(dǎo)的機(jī)制的調(diào)控。在正常細(xì)胞中它們多處于未甲基化的狀態(tài)，但是，在腫瘤細(xì)胞中處于高度甲基化的狀態(tài)導(dǎo)致的抑癌基因，DNA修復(fù)基因，細(xì)胞周期控制基因，抗凋亡基因等的轉(zhuǎn)錄沉默。在癌癥發(fā)生早期表觀遺傳異常的重要作用可表現(xiàn)為遺傳印記丟失(LOI)。如，遺傳印記基因IGF2基因的過表達(dá)則會促進(jìn)細(xì)胞增殖，它的LOI可見之于結(jié)腸癌患者的正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞，若其在循環(huán)的白細(xì)胞發(fā)生是患結(jié)腸癌的易感者的重要特征[7]。抑癌基因和DNA修復(fù)基因的高甲基化/轉(zhuǎn)錄沉默是一很常見的癌前病變的現(xiàn)象[8，9]。例如，在肺癌被診斷前的35周時，在痰中的DNA中可以檢測到的pl6ink4A(抑癌基因)和MGMT(DNA修復(fù)基因)高度甲基化[8]。表觀遺傳狀態(tài)異常也可導(dǎo)致干細(xì)胞的不正常增殖，繼而促進(jìn)癌癥形成。H.pyrio感染和一些特定基因的異常甲基化之間有關(guān)系提示DNA甲基化狀態(tài)的檢測有一定的預(yù)警作用[IO]。因此，對高危人群的外周DNA(血清，大便，痰和尿沉淀作為樣品源)甲基化分析的腫瘤預(yù)警價值已被提到議事日程。最后，DNA甲基化譜式的異?？砂l(fā)生在癌癥的任一階段(異性增生，良性，局部和轉(zhuǎn)移灶等)，可用于腫瘤分子分期和分型。膀胱癌是美國在男性中發(fā)病率第四，女性中發(fā)病率第八的癌癥http:〃www.cancer.gov/cancertopics/types/bladder)[ll]。在迅速工業(yè)化的中國，膀胱癌發(fā)病率急速上升[12]。盡管70%以上的潛表病變可經(jīng)手術(shù)治愈，其中50—70%的患者會患有更為嚴(yán)重的病患接受治療，其預(yù)后兇險[13,14]。另外，病理分期和分型相似的膀胱癌的臨床行為迥異[15]，顯示現(xiàn)有系統(tǒng)的明顯不足。膀胱癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是膀胱鏡鏡檢，附以病理檢查。但其誤診率人高達(dá)10—40%[16-18]。尿沉淀細(xì)胞學(xué)分析是高特異，無損性檢測手段，但無法有效地?fù)斐鎏幱赥a,Gl,和Tl期的膀胱癌[19]。對尿沉淀細(xì)胞DNA的遺傳性檢測來診斷膀胱癌的嘗試已涉及導(dǎo)TP53基因的突變，雜合性的丟失，微衛(wèi)星的不穩(wěn)定和E-cadherin啟動子的多態(tài)性[20,21]。尿沉淀細(xì)胞原位雜交來尋找染色體異常的方法可以特異性77.7%，檢出68.6%的膀胱癌(h加:〃www.urowsion.com)。對蛋白性標(biāo)志物的嘗試已有很多[22,23]。對尿液中MNP22蛋白定量雖比尿沉淀細(xì)胞學(xué)更靈敏，但有在患有良性泌尿生殖系統(tǒng)疾病(血尿癥，膀胱炎，腎結(jié)石或者泌尿管感染)的患者的尿中水平亦很高的嚴(yán)重不足[24]。因此，仍然需要一種更靈敏更特異性的檢測膀胱癌和其他類型的泌尿生殖系統(tǒng)癌癥的方法，尤其是患病的早期檢測。DNA甲基化分析方法通常依賴于在任何放大步驟之前的原始基因組DNA的甲基化修飾，包含使用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化和bisuphite處理[25]。后者研究了胞嘧啶和甲基化的胞嘧啶殘基之間對于bisuphite調(diào)控的脫氨基作用(從C到U)的敏感性的巨大差別，從而可以104個正常細(xì)胞中檢測出少至1一10個的腫瘤細(xì)胞[25]。檢測包括支氣管灌洗液，糞便，血清或血漿和尿沉淀等體液中的基因甲基化模式來在體外檢測癌癥努力已有很多。其他檢測DNA甲基化譜式的方法包括甲基化的特異性酶消化，甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)[26]，限制酶界標(biāo)基因組掃描(RLGS)[27]，差異性甲基化雜交(DMH)[28]，BeadArray平臺技術(shù)(Illumina,USA)[29]，和堿基特異性切割/質(zhì)譜分析(Sequenom，USA)[30]而測定的，以及還在或?qū)㈤_發(fā)出的新方法。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明者通過系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者與非膀胱癌者之間的DNA甲基化模式差異，檢測其可判定受檢對象是否患有膀胱癌。該方法包括以下步驟1.提供受檢對象尿沉淀的樣本。2.測定此尿沉淀中一或多個基因的甲基化的模式。所述基因選自下組ABCC13,ABCC6，ABCC8,ALX4,APC,BCAR3，BCL2，BMP3B,BNIP3,BRCA1,BRCA2,CBR1,CBR3,CCNA1,CDH1,CDH13,CDKN1C,CFTR,C0X2,DAPK1,DRG1,D腹，EDNRB,FADD,GALC,GSTP1,麗F3B,HPP1,HTERT,ICAM1,ITGA4,LAMA3,LITAF,MAGEA1,MDR1,MGMT,MINT1,MINT2,MT1GMT,MINT1，MINT2，MT1A,MTSS1,MY0D1,OCLN,pl4ARF,pl6INK4aRASSF1A:RP腹，RUNX3,SALL3，SERPINB5，SLC29A1,STAT1,TMS1，TNFRSF10A,TNFRSF10C,TNFRSF10D,TNFRSF21和WWOX。3.將受檢對象與正常研究對象的尿沉淀樣品中所述基因的甲基化譜式進(jìn)行比較，如果有一或多個基因處于高甲基化狀態(tài)則說明上述受檢對象患有膀胱癌。本發(fā)明還提供了甲基化譜式分析和判定受檢對象是否患膀胱癌的程序和標(biāo)準(zhǔn)。此方法和準(zhǔn)則將被用于復(fù)發(fā)的診斷，預(yù)測和監(jiān)控；以及決定腫瘤是否已經(jīng)在外科手術(shù)中被移除。此發(fā)明的其他優(yōu)點和特性已在下文結(jié)合附圖的具體介紹中進(jìn)一步闡明。圖l是胞嘧啶(CpG)甲基化過程的示意圖。在圖1A中，由S腺苷甲硫氨酸作為甲基的供體，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)1,3a或者3b催化加一個甲基(于圖中圈出)到胞嘧啶核苷酸嘧啶環(huán)的5號位上。在圖1B中，胞嘧啶的磺化(1，胞嘧啶變?yōu)榘奏せ撬?，然后水解脫氨作用(2，胞嘧啶磺酸變?yōu)槟蜞奏せ撬?，最后堿的脫磺酸基作用(3，尿嘧啶磺酸變?yōu)槟蜞滓?促使了C到T的轉(zhuǎn)變。甲基化的胞嘧啶不受此化學(xué)處理作用，因此，相對于未甲基化的CpG，甲基化的CpG可以在接下來的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，包括甲基化特異性的PCR中被檢測出來。圖2示出了20個基因的甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)分析結(jié)果及其測序驗證。該圖顯示了在尿沉淀和細(xì)胞系中代表性的甲基化狀態(tài)的MSP數(shù)據(jù)的電泳圖譜及其序列驗證。(泳道上方的數(shù)字為病人識別號碼)，細(xì)胞系(5637，T24和SCaBER)。MSssl，表示以試管內(nèi)甲基化修飾了的正常肝臟組織DNA作為陽性對照的結(jié)果。分圖上方為基因名字。野生型(wild-type)的序列和由T載體克隆的代表性的PCR產(chǎn)物的序列并排。圖3顯示11個有價值的基因在15例腫瘤組織和9例尿沉淀中的MSP分析結(jié)果。圖3A顯示了MSP結(jié)果的電泳圖，所涉及的基因在每個圖的左上角示出。作為上樣量的參照，CFTR基因的非甲基化的MSP產(chǎn)物的電泳圖(標(biāo)志為CFTRu)示出。注釋Ur:尿沉淀，和T:腫瘤組織；GXX:臨床樣品的編號，BJ，亞硫酸氫鹽處理的源于一株正常纖維母細(xì)胞系DNA，用作為非甲基化DNA模版的對照。H20:無DNA模版對照.M.SssI:用M.SssI在試管內(nèi)甲基化的源于正常肝組織DNA的甲基化模版的陽性對照。圖3B顯示了9對匹配的腫瘤組織和尿沉淀的MSP分析結(jié)果的小結(jié)。黑框示甲基化耙點，白框示去甲基化的耙點。圖3C以繪圖的方式顯示了腫瘤組織和匹配的尿沉淀中DNA甲基化譜式匹配情況。Y坐標(biāo)亞組中甲基化靶點的百分率T/Ur:組織和尿沉淀共有的；僅有T:組織僅有的；和僅有Ur:尿沉淀僅有的。在圖柱頂部的是件數(shù)和(百分比)。圖4顯示了膀胱癌中以及非癌性的泌尿系統(tǒng)病變對照的尿沉淀DNA中基因甲基化狀態(tài)。圖中繪出了在膀胱癌患者的尿沉淀中(欄2)和非腫瘤泌尿病變病例中(欄3，圖4A)的每個基因(x軸)的甲基化頻率(y軸，％)。CI(ConfidentialIndex)，每個基因的置信度為95%的值在圖上用垂直線表示出。圖中也示出其甲基化狀態(tài)可作為膀胱癌標(biāo)記的基因的p值〈0.01和O.05的位置。圖5顯示了有價值的膀胱癌檢測的基因群(l到ll個基因)敏感性和特異性的綜合值(RECEIVEROPERATINGCHARACTERISTICS(ROC)。每個基因組設(shè)置的靈敏性(％，欄4，圖5A)和特異性(％，欄5，圖5A)都已計算并制圖。具體實施例方式在一方面，此發(fā)明提供了一種檢測試驗者是否患有膀胱癌的方法，包括以下步驟1.提供受檢對象的尿沉淀的樣本。2.測定尿沉淀中一或多個基因的甲基化的模式的方法。所述基因有ABCC13,ABCC6，ABCC8,ALX4,APC,BCAR3,BCL2,BMP3B，BNIP3,BRCA1,BRCA2,CBR1，CBR3，CCNA1，CDH1,CDH13,CDKN1C，CFTR,COX2，DAPK1,DRG1,D腹，EDNRB，F(xiàn)ADD,GALC,GSTP1,HNF3B,HPP1,HTERT,ICAM1,ITGA4,LAMA3,LITAF，MAGEA1，MDR1,MGMT,MINT1,MINT2，MT1GMT,MINT1,MINT2,MT1A,MTSS1，MYOD1,OCLN,pl4ARF,pl6INK4a，PTCHD2，RASSF1A，RP脂，RUNX3，SALL3,SERP腿5，SLC29A1,STAT1,TIMP3，TMS1，TNFRSF10A,TNFRSF10C,TNFRSF10D,TNFRSF21和WWOX。3.將受檢與正常對象的尿沉淀樣品中所述基因的甲基化譜式進(jìn)行比較，如果在其中存在一或多個基因處于高甲基化狀態(tài)則說明受檢對象患有膀胱癌。"樣本"或"樣品"一詞在此發(fā)明中被定義為包括從任何個體(如有泌尿系統(tǒng)癥狀受檢者的樣本)中獲得的適合于DNA甲基化狀態(tài)的檢測。"尿沉淀"這個術(shù)語對行內(nèi)的人士是熟知的，其包括從尿道脫落的上皮細(xì)胞等。尿沉淀的細(xì)胞學(xué)分析已用于對膀胱癌的臨床診斷，因為膀胱腫瘤細(xì)胞會脫落而存在于尿液中。在此發(fā)明中用到的樣本也可是膀胱癌細(xì)胞系，比如T24(ATCC序號HTB-4),SCaBER(HTB-3)以及5637(HTB-9)。此方法可適用于對泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤檢測。所指的泌尿生殖系統(tǒng)的癌癥包括比如膀胱癌，前列腺癌和腎癌。同樣，本發(fā)明的方法還可以檢測出凡其腫瘤細(xì)胞可進(jìn)入尿液的那些癌癥。因此，所謂的"泌尿生殖系統(tǒng)癌癥"也被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語"受檢對象"包括的范圍不僅僅局限在哺乳動物(例如人類)。"甲基化"和"高(度)甲基化"在此多為同意使用，定義為在一個基因序列中(通常在啟動子中)CpG存在和高度甲基化。以MSP分析手段而言，以甲基化特異性引物所進(jìn)行的PCR反應(yīng)可獲得陽性的PCR結(jié)果即可認(rèn)為該受試的DNA(基因)區(qū)處于高甲基化狀態(tài)。以實時定量甲基化特異性PCR而言，高甲基化狀態(tài)的判定可隨其對照樣品的甲基化狀態(tài)的相對值的統(tǒng)計學(xué)差異。本發(fā)明的依據(jù)是CpG序列(例如在腫瘤相關(guān)基因啟動子CpG島區(qū)域中，下稱基因)的甲基化狀態(tài)在患膀胱癌者與正?；蚍前螂装┱叩牟煌Ｒ虼?，下列基因中一或多個處于甲基化狀態(tài)可提示受檢對象可患膀胱癌癥。所涉及的基因可為ABCC13,ABCC6,ABCC8,ALX4,APC，BCAR3,BCL2，BMP3B,BNIP3，BRCA1,BRCA2,CBR1，CBR3,CCNA1,CDH1，CDH13,CDKN1C,CFTR，COX2，DAPK1,DRG1,DRM,EDNRB,FADD,GALC，GSTP1，HNF3B,HPP1,HTERT,ICAM1,ITGA4,PTCHD2,LAMA3,LITAF,MAGEA1,MDR1，MGMT,MINT1,MINT2,MT1A,MTSS1,MYOD1,OCLN,pl4ARF,pl6駆4aPTCHD2，RASSF1A,RP腹，RUNX3,SALL3,SERPINB5,SLC29A1,STAT1，TIMP3，TMS1，TNFRSF10A，TNFRSF10C，TNFRSF10D,TNFRSF21禾卩WWOX。更明確而言，SALL3,CFTR,ABCC6,HPR1,RASSF1A,MT1A,RUNX3,ITGA4,BCL2,ALX4,MYOD1,DRM,CDH13,BMP3B，CCNA1，RPRM,MINT1,和BRCA1中任一基因在尿沉淀中表現(xiàn)出高度甲基化狀態(tài)則說明受檢對象患有膀胱癌。測定尿沉淀細(xì)胞DNA的甲基化譜式可通過已有的技術(shù)(如甲基化特異性PCR(MSP)和實時定量甲基化特異性PCR，Methylite)，或其它仍在發(fā)展中和將被開發(fā)出來的技術(shù)來進(jìn)行。在用亞硫酸氫鹽處理之后，沒有甲基化的胞嘧啶核苷酸將會被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ず塑账?，而甲基化的胞嘧啶核苷酸則保持不變。繼而用能K分甲基化和未甲基化的DNA的引物對亞硫酸氫鹽處理過的DNA來擴(kuò)增，從而可決定受試DNA的DNA甲基化狀態(tài)(30)。這種所謂MSP的PCR方法可以從臨床含由大量源于正常細(xì)胞的DNA和少量腫瘤細(xì)胞的樣品中檢出腫瘤細(xì)胞，其前提示正常和腫瘤細(xì)胞的所示DNA區(qū)域(基因)的甲基化狀態(tài)完全相反。使用MSP有可能從10000個正常細(xì)胞中檢出1個腫瘤細(xì)胞。檢測甲基化水平時更傾向于使用定量甲基化特異性PCR(QMSP)的方法。這種方法是基于一種熒光PCR的持續(xù)性的光學(xué)監(jiān)控，其較MSP方法更為敏感(31)。其通量高并避免了用電泳方法對其結(jié)果進(jìn)行分析。如何設(shè)計引物和探針對行內(nèi)人士是顯而易見的。其他可用的技術(shù)還有通過甲基化特異性限制性內(nèi)切酶消化，亞硫酸氫鹽(bisulphite)DNA測序，甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)[26]，限制酶界標(biāo)基因組掃描(RLGS)[27]，差異性甲基化雜交(DMH)[28]，BeadArray平臺技術(shù)(Illumina,USA)[29]，和堿基特異性切割/質(zhì)譜分析(S叫uenom，USA)[30]等方法。對大樣品分析(包括與正常和/或非腫瘤對象的比較)將會獲得腫瘤相關(guān)性多基因的甲基化模式，即可通過檢測該套基因的甲基化狀態(tài)來判斷受檢對象是否患有膀胱癌或它種泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤(前列腺癌和腎癌等)。本發(fā)明還提供了檢測膀胱癌試劑盒，包括(a)測量一或多個在尿沉淀的基因甲基化譜式的方法，所述目標(biāo)基因選自下組ABCC13,ABCC6,ABCC8，ALX4,APC,BCAR3,BCL2,B旨3B,BNIP3,BRCA1,BRCA2，CBR1,CBR3,CCNA1,CDH1，CDH13,CDKN1C,CFTR,COX2，DAPK1,DRG1，DRM,EDNRB，F(xiàn)ADD,GALC,GSTP1，HNF3B，HPP1，HTERT,ICAM1,ITGA4,LAMA3,LITAF,MAGEA1,MDR1,MGMT,MINT1,MINT2，MT1GMT,MINT1,MINT2,MT1A，MTSS1,MYOD1,OCLN,pl4ARF,pl6INK4a，PTCHD2，RASSF1A,RP脂，RUNX3,SALL3，SERPINB5,SLC29A1,STAT1,TIMP3，TMS1,TNFRSF10A,TNFRSF10C,TNFRSF10D,TNFRSF21禾卩WWOX;(b)提供判定一或多個受試基因的甲基化狀態(tài)用于判定受檢者是否患有泌尿生殖癌(如膀胱癌)的標(biāo)準(zhǔn)(特異性和敏感性)。術(shù)語"測量一或多個在尿沉淀的基因甲基化樣式的方法"包括任何可能對測量一或多個在尿沉淀的基因甲基化樣式有用的實質(zhì)技術(shù)測量，器材，設(shè)備和反應(yīng)物。具體的方法要取決于采取的方案。目前首選的檢測基因甲基化狀態(tài)方法是MSP和/或QMSP。本發(fā)明的MSP和/或QMSP試劑盒中，包括的試劑對行內(nèi)人士顯而易見分離DNA的試劑和材料，PCR反應(yīng)的聚合酶(比如Taq聚合酶)，亞硫酸氫酸鈉鹽，MSP/QMSP特異性緩沖液和相應(yīng)的引物等。所有有關(guān)的試劑(引物等)都包括在現(xiàn)在發(fā)明的范圍內(nèi)。引物應(yīng)該包含DNA或RNA和合成等價物取決于應(yīng)用何種擴(kuò)增技術(shù)。例如，對于標(biāo)準(zhǔn)PCR—個短的單鏈DNA引物對會被使用，兩個引物在將被擴(kuò)增的目標(biāo)基因的兩側(cè)(包含CpG序列在內(nèi)，與其中CpG互補(bǔ)為針對原為甲基化，而與其中TpG互補(bǔ)為針對原為取甲基化的基因區(qū))。在核酸擴(kuò)增技術(shù)中對業(yè)內(nèi)人士示顯而易見的。本發(fā)明提供了已驗證過的基因引物表(表2)作為例子。然而，本發(fā)明的范圍并不局限于這些例子。本發(fā)明也包括從基因在正常和/或非腫瘤對象尿沉淀(乃至組織)中的甲基化狀態(tài)的信息。下面提到的例子有助于對發(fā)明的理解。應(yīng)該明確這些描述僅僅是作為例子。本發(fā)明的范圍并不局限于這些例子。除非另有規(guī)定，這些技術(shù)對于有基本分子生化和相關(guān)領(lǐng)域的人而言是顯而易見的。例子方法組織，尿沉淀的采集和DNA的分離在倫理委員會的同意和批準(zhǔn)的前提下，在中國廣西采集了15個膀胱癌組織(TNM分期I:7和II:8例)。從健康捐獻(xiàn)器官者中獲得3個正常的膀胱組織。從組織和尿沉淀制作DNA樣品如下所述，從廣西醫(yī)院(40例)和中國上海中山醫(yī)院(92例)的通過它法確診的膀胱癌患者中采集50ml晨尿。在上海中山醫(yī)院同時采集了79例手術(shù)后尿樣。對照組包括23例非癌癥泌尿疾病的患者作為對照(膀胱炎8，前列腺增生4，膀胱結(jié)石3，腎結(jié)石5，腎上腺結(jié)塊3)，6例神經(jīng)病患者和7個健康志愿者。尿樣細(xì)胞學(xué)分析和腫瘤結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)演示和分類是依照WHO分類法和AmericanJointCommitteeonCancer的指標(biāo)。重亞硫酸鹽(bisulphite)處理和甲基化特異性PCR分析對于甲基化或非甲基化的59個等位基因PCR檢測引物對的來源1，從已經(jīng)發(fā)表的信息里面直接獲得，和2，用軟件設(shè)計以識別CpG島。(http:〃www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html)禾卩弓l物設(shè)i十軟{牛(http:〃micro-gen.ouhsc.edu/cgi-bin/primer3—www.cgi)(表.2)。重亞硫酸鹽處理后的DNA樣品的脫鹽是通過自制的瓊脂糖在凝膠過濾系統(tǒng)進(jìn)行的[31,32]。PCR產(chǎn)物通過測序被克隆或檢驗(圖2示出20個基因為例子)。通過M.SssI對正常肝臟組織DNA的體外甲基化作為陽性對照。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析基因的甲基化狀態(tài)和每個臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)聯(lián)性的顯著性分析通過相關(guān)軟件(http:〃www.Rproject.org)進(jìn)行分析。每個基因的甲基化狀態(tài)的膀胱癌特異性標(biāo)記的顯著性以95%的置信區(qū)間的方式表示(RpackageHmischttp:〃cran.r-project.org/src/contrib/Descriptions/Hmisc.html)。通過2X2fisherexact計算來判定膀胱癌(132例)尿沉淀的每個基因為甲基化頻率與非癌癥泌尿系統(tǒng)疾患(23例)的對比顯著性。有價值的膀胱癌檢測的基因群(1到11個基因)敏感性和特異性的綜合值(RECEIVEROPERATINGCHARACTERISTICS(RO得以計算并作圖。結(jié)果尋找呈膀胱癌特異性甲基化狀態(tài)的基因59個基因(表.2)受檢基因包括1，象CDKN2A,ARF,MGMT，GSTP1,BCL2，DAPK和HTERT等已有前人在膀胱癌或它種泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤研究過，2，由我們自身的工作表明其在它類腫瘤中呈高甲基化狀態(tài)的基因[31-43])，和3，生物信息學(xué)分析提示其功能上與腫瘤發(fā)生有關(guān)。圖2A，顯示ll個有診斷價值的基因在3株膀胱癌中的甲基化狀態(tài)，及其的甲基化和非甲基化靶點序列的序列分析的驗證。圖2B，顯示20個有診斷價值基因的MSP數(shù)據(jù)和測序驗證的典型的結(jié)果。鑒于膀胱癌細(xì)胞系很可能含有臨床膀胱癌的遺傳和表觀遺傳水平上的缺陷，我們先在3株膀胱癌細(xì)胞系T24(ATCC序號HTB-4)SCaBER(HTB—3)和5637(HTB-9)中對59個基因開展了MSP分析。我們發(fā)現(xiàn)41個基因至少在一個細(xì)胞家系有一個等位基因為高甲基化(表.3)雖然，F(xiàn)ADD，LITAF,MGMT和TNFRSF21基因為純和去甲基化狀態(tài)，有報道提出它們的高甲基化與膀胱癌相關(guān)[44,45]，我們從而將其和其它41個基因同時在11個膀胱癌和3個膀胱炎患者的尿沉淀樣品中進(jìn)行分析。在這初篩階段剔除的14個基因為APC，BCAR3,BNIP3,CBR1，CBR3,COX2,DRG1,麗F3B,MDR1,MTSS1,SLC29A1,TIMP3,TNFRSF10A和WWOX.在ll例尿沉淀分析中，21個基因在分別在1到10例(9%一90%)中呈高甲基化，而在3例膀胱炎患者中則否。這提示這些基因的高甲基化狀態(tài)有不同程度的膀胱癌特異性。特征性地MAGEA1基因啟動子去基化和伴有的轉(zhuǎn)錄的活化廣泛地見于腫瘤。但本項膀胱癌研究中，該現(xiàn)象出現(xiàn)的頻率很低(表.3)從而對其的進(jìn)一步研究得以終止。以同樣的理由，LAMA3，ICAM1和GALC基因被剔出。我們進(jìn)而在15例癌組織DNA和3例正常膀胱組織中開展了32個基因DNA甲基化狀態(tài)的分析。雖然在3例正常膀胱組織中的所分析的28個基因處于去甲基化的狀態(tài)，其中19基因的高甲基化狀態(tài)在15個受試者中有1一12個(6.7%-73.3%)膀胱癌組織被檢測，提示其有不同程度的膀胱癌特異性。余下基因在腫瘤組織中亦為去甲基化狀態(tài)PTCHD2,BRCA1,CDH13,TMS1，CDH1,pl4ARF，pl6INK4a,FADD,LITAF,MGMT禾卩TNFRSF2.為了確定腫瘤組織和尿沉淀細(xì)胞DNA甲基化譜式的相關(guān)性，我們同時對9個成對的樣品進(jìn)行了分析樣品進(jìn)行了MSP分析(圖3)。在總共99個甲基化事件中，86個(87%)是腫瘤組織和尿沉淀共存的。ll個甲基化事件(11%)僅見之于腫瘤組織，而僅見之于尿沉淀的甲基化事件為2個(2%)。兩類樣品間的不吻合率雖低仍有為13%，由此，為了避免丟失有價值的位點，我們將所有僅在一種樣品中為甲基化狀態(tài)的基因包括在下一步的研究之中BRCA1和CDH13(僅在腫瘤組織中高甲基化)和PTCHD2(僅在尿沉淀中高甲基化).鑒于TMS1被認(rèn)為是有價值的前列腺癌的標(biāo)志物[44]，雖至此未發(fā)現(xiàn)其呈膀胱癌相關(guān)的甲基化狀態(tài)，對它的分析仍繼續(xù)進(jìn)行下去。膀胱癌和非膀胱癌對照組的尿沉淀DNA中21個基因甲基化狀態(tài)受試樣品為膀胱癌(132例)和3個對照組『1)，神經(jīng)疾病患者(6例)；2)，健康志愿者(7例)；3)，非癌的泌尿系統(tǒng)疾患患者(23例)，其中8例膀胱腺炎，4例前列腺肥大，3例膀胱結(jié)石，5例腎結(jié)石，3例腎上腺占位)膀胱癌患者的平均年齡為63.4(34-88)，與泌尿科非腫癌患者的平均年齡55.7(16-83)和神經(jīng)疾病患者64.1(46-78)很接近。在健康志愿者和神經(jīng)疾病患者尿沉淀DNA中21個受試基因為去甲基化狀態(tài),但在非癌的泌尿系統(tǒng)疾患組中有3例(2例前列腺肥大病例(84，64歲)，1例膀胱結(jié)石病例(54歲))發(fā)生了涉及到4個基因6次高甲基化事件RASSF1A(2/23)，MT1A(2/23)，RUNX3(1/23)和ITGA4(1/23)(圖4A)。這些假陽性的結(jié)果對判定膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)的影響已通過相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)分析予以考慮(圖4A和圖.4B)。在膀胱癌者尿沉淀DNA高甲基化率出現(xiàn)頻率最高的，并在對照組均為去甲基化狀態(tài)的4個相關(guān)基因為SALL3(58.3%，CI(置信區(qū)間)95%:49.8%-66.4%)，CFTR(55.3%CI:95%:46.8%-63.5%)，ABCC6(36.4%CI95%:28.7%-44.8%)，和HPP1(34.8%CI95%:27.3%-43.3%)。另外的6個其p為<0.01基因為BCL2(27.3%CI95%:20.4o/o-35.4o/o)，ALX4(25.0%CI95%:18.4%-33.0%)，RUNX3(32.6%CI95%:25.2%陽41.0%)，ITGA4((31.1%，CI95%:23.8%-39.4%)，RASSF1A(35.6%CI95%:28.0%-44.1%)禾卩MYOD1(22.0%CI95%:15.8%-29.8%)。其p值<0.05的基因包括MT1A(34.8%CI95%:27.3%-43.3%)，D腿(18.9%CI95%:13.2%-26.5%)，BMP3B(15.9%CI95%:10.6%-23.1%)CCNA1(15.9%CI95%:10.6%-23.1%)和CDH13(16.7%，CI95%:11.3-23.9%)。雖其p值大于0.05(p<0.131)，在膀胱癌病例甲基化率大于12.1%的基因還有RPRM，MINT1禾卩BRCA1。這些基因可能還有一定的對膀胱癌的診斷價值。與過去的報道不同[44]，TMS1(P=l)和GSTP1(P4)的高甲基化狀態(tài)僅見之于2例膀胱癌患者中(5.3%,2/132)出現(xiàn)了高甲基化狀態(tài)。通過以18個基因中任一個處于高甲基化狀態(tài)為指標(biāo)來判定膀胱癌，132例受試的膀胱癌患者中121例為陽性(92%)。其中6/8(靈敏度75%)在0a期；60/68(88.2%)在I期；49/50(98.2%)為II期；4/4(100%)為III期；2/2例(100%)為IV期(表5)。與尿細(xì)胞學(xué)分析的結(jié)果(檢測出1個I期，2個II期，遺漏了17例，包括4例0a期)相比，本項分析檢出20例中的19例，僅遺漏了1例(4例中)0a期，提示這一方法可遠(yuǎn)較尿細(xì)胞學(xué)分析為高的敏感性通過嚴(yán)格的統(tǒng)計學(xué)分析，我們未發(fā)現(xiàn)基因的DNA甲基化狀態(tài)與癌分期間有明顯的相關(guān)性(表5)。與79例手術(shù)后尿沉淀DNA基因甲基化譜式比較:MY0D1和MINT1的高甲基化狀態(tài)分別從術(shù)前的22.2%和12.9%降到術(shù)后的0%，其他基因甲基化的出現(xiàn)頻率也顯著減少(p<0.005)(表6)。尿沉淀中仍有甲基化基因的狀態(tài)很可能源于手術(shù)的不徹底。序貫地對術(shù)前和后尿沉淀DNA進(jìn)行基因甲基化狀態(tài)分析可作為手術(shù)質(zhì)量有效的評估手段。另外，DNA甲基化的模式與膀胱癌是否初發(fā)和復(fù)發(fā)無明顯相關(guān)(p〉0.05)(表7)。僅檢測單基因甲基化狀態(tài)最多能檢出58.3%的膀胱癌(SALL3)，對多個基因檢驗將能夠提高對膀胱癌的檢出率和特異性。IO個基因的高甲基化狀態(tài)有極高的腫瘤特異性(p<0.01)和另有5個基因的高甲基化狀態(tài)也有明顯的腫瘤特異性(p<0.05(圖4A和圖4B)。有3個基因甲基化狀態(tài)在非癌性泌尿系統(tǒng)疾患對照組中也低頻率的出現(xiàn)，會對這類基因作為指標(biāo)來檢出膀胱癌的特異性產(chǎn)生影響。"真陽性"(TP)的定義是膀胱癌的樣本至少一個基因甲基化了；而"假陰性"(FN)的定義是膀胱癌的樣本所有受試基因均為去甲基化狀態(tài)。"假陽性"(FP)的定義是非癌性泌尿系統(tǒng)疾患者的樣本中至少有一個基因甲基化；"真陰性"(TN)的定義是非癌性泌尿系統(tǒng)疾患者的樣本中所有受試基因均為去甲基化狀態(tài)。"敏感度'^TP/(TP+FN)(y。，圖5A，第4列)；"特異性"=TN/(TN+FP)(%^5A，第5列)，對每一個基因的檢測都可以用這兩個公式計算。2至11個基因組合的特異性和敏感度的ROC值(receiveroperatingcharacteristic)在圖5中示出。SALL4，CFTR,ABCC6禾nHPP1在對照組中均無假陽性，從而以單一和組合的方式用于對膀胱癌的檢測，其特異性均為100%(圖4):其敏感性分別為僅SALL3:58.3%(77/132)，SALL3和CFTR—起74.2%(98/132),SALL3,CFTR加ABCC6:80.3%(106/132)，SALL3,CFTR,ABCC6和HPR1—起達(dá)82.6%(109/132)(圖5A第4，5列).膀胱癌(123)非腫瘤對照(23)甲基化77Y/2/jF/Y"未甲基化FAY"第一列是基因組合的列表。方括號中的基因認(rèn)為是冗余的，因為它的加入沒有改變基因組合的敏感性。第二列分別是真陽性(TP，膀胱癌病例有至少一個基因甲基化)和假陰性(FN，膀胱癌病例沒有基因甲基化)的事件數(shù)。第三列是假陽性(FP，非腫瘤泌尿系統(tǒng)損傷有至少一個基因甲基化)以及真陰性(TN，非腫瘤泌尿系統(tǒng)損傷沒有基因甲基化)的事件數(shù)。每套基因組合的敏感度二TP/(TP+FN)(%，第四列)，特異性=TN/(TN+FP)(%,第五列)，計算結(jié)果見圖5A.在23例非癌性泌尿系統(tǒng)疾患者的樣本中有2例為RASSF1A陽性(2個假陽性，21個真陰性，圖4A，第3列)。從而加入該基因的5基因組合的敏感性雖可提高到85.6%,特異性降低到91.3%(圖5A，第4，5歹ij).由于在另一例個非癌性泌尿系統(tǒng)疾患者樣品中MT1A為甲基化(累計假陽性達(dá)3個，真陰性20個，圖5A，第3列)，加其的6基因組合的敏感性升至86.4%，并伴隨者特異性降到87%。。進(jìn)一步加入并不能提高檢測的敏感性，從而RUNX,ITGA4或BCL2基因不作為有價值的標(biāo)記無。加入ALX4的7基因組合的敏感度為87.1%，再加入CDH13的8基因組合88.6%，再加入RPRM的9基因組合90.2%,再加入MINT的IO個基因組合90.9%,和加入BRCA1的11基因組合91.7%)。特異性仍為87%。盡管上述描述屬于特例，但對業(yè)內(nèi)人員而言這項發(fā)明的思想和范圍易掌握的并能在這些已確立的原則上對這些信息及其在實際中的應(yīng)用形式作出改進(jìn)。所以，這些改進(jìn)的可能性必將包括在有關(guān)的權(quán)益要求之中。表1癌癥檢測的分子生物標(biāo)記<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注/:無相關(guān)性；靶點/基因多/單靶點需要分析一個(單)靶點以上(多)/每個基因。波動性生物標(biāo)志物對非腫瘤因素(生物鐘、生理、病理因素)變化是否發(fā)生量的變化。SNP:單核苷酸多態(tài)性，LOH:雜合性缺失.表2基因啟動子CpG島MSP分析所需引物序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>CBR1MCBR1UCBR3MCBR3UCCNA1MCCNA1UCDH1MCDH1UCDHI3MCDH13UCDKN1CMCDKN1CUCFTRMCFTRUCOX2MCOX2UDAPKIMDAPKIUDRG1MDRG1UDRMMDRMUEDNRBMEDNRBUFADDMFADDUGAIXMGALCUGSTP1MGSTPIUHNF3BMHNF3BUHPP1MHPP1UHTERTMHTERTl)ICAM1MICAM1UITGA4MFTGA4ULFTAFMMAGEA1MMAGEA1UMDR1MMDR1UMGMTMMGMTUMINT2MMINT2UMINT1MIVUNTlliMT1AMMT1AUTCGTATTTCGGCGAGGTTTGGTGGGGAGGGGTACGTAGATTATTTCGCGGTTTAGGGGTGTAGTGTGGGTAGGGTCGTCGCGTTTTAGTCGTGGGTAGTTTTGTTGTGTTTTAG丁TGGTGGGCGGGTCGTTAGTTTCGGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGTTCGCGGGGTTCGTTTTTCGCTTGTGGGGTTTGTTTTTTGTGGTTCGGTTTTCGCGTATTTTGTTGTGGTTTGGTTTTTGAGAGGTCGCGATTGTCGTTTTAAAGAGAGGTTGTGATTGTTGTTGTTCGTCGTTGCGATGTTTTGTTTGTTGTTGTGATGTTTGTCGGTAATTCGTAGCGGTAGGGGATTTGGTAATTTGTAGTGGGGTGCGGAGTATGAGTCGGTGAGGAATAGGGGTGTGGTCGGTTTCGTTGATTTCGTTGAGTTTTGGTGGTTTTGGTAGGGCGCGTTCGTATAGTGTGTTTGTATAGATTTGGAGGTGCGTGACGTTCGGGTTGTGGATTTGGTAGAGGTGTGATTGGTGACGTCGGAAGAGAAGTTATTAGGTGATGTTGGAAGAGAAGGCGATTTCGGGGATTTTAGTTGGGGATTTGGGAAAGCGTTCGTTGTTGTTTTTGCGGGAGAAGTGTGGGGTGTAAGAGGGGCGTTAGTTCGATGTGTGGAAGAGGGGTGTGCGTCGCGAGGAGAGGGGGTTGTGGAAAGGAAGTAGCGCGGTGTAGATCGTTTGGGAAATGGGAGGTGGACGCGAGmTGCGTAGGGGAGGTTTGGGTTAGGATTTCGTTCGCGAAGTTTGTTGTGTTTTGTGTGGGAGAGACGGTCGGGTTTTTACGTTGGGAGGTTGGATTTTGTTTTGTTCGGTCGAAGGAATTTGAGTTTGGTTGAAGGAATTTGATTGGGGGTTTGGTAGCGCGTTGGGGGTTTGGTAGTGTAGCGTCGTTGTTTTGTGCTTGGTAGTGTTGTTGTTTTGTGTTGTTGGTGGATTTTGGATTTAGTTCGTTGGCGGATTTTTTCGAAGCGTTTGTTTGGTATTTTTGAAGTGTTTGTTTGGTGTTAAGGTTGGGTTTTCGGAACTAAGGTTGGGTTTTTGGAATAAACCCCGCAACGTATTCAAACCCCACAACATATTCGAACCGAACTTCGAACCACAAACCAAACTTCAAACCACCTACCCGTTCTCCCAACAACAACCACTAACAACCCCCTCTCTCACAAATACTTTACAATTCCGACGAACTCACAAATCTTTACAATTCCAACGACGTTTTCATTCATACACGCGAACTTTTCATTCATACACACAAAAACGAACGTCGCGATAAACAAACATCACAATATCACATTACCCGACTTTCTCCACCCACTACGTCCTTCACTCCCTCACCACCAAACTCTTTCCCAAATCATCCAAACTCTTTCCCAAATCTACTCACCCGAACGCCTACCTAACTACTCACCCAAACACCTCCGCGAACCAATACGATACCCACAAACCAATACAATATCATAAACTACCGCGCGTAAAACAAACTACCACACATAAAACCCACTAACGCGCAAACTTTTCCCACTAACACACAAACT丁AAACCTACGCCCGACGTATCTACACCTACACCCAACATATCATCCCGCCACGATAAATACGAAAAAACAAATCCCATCACCAACGACGACGAAACTCCAATATAAAAATAATCCCACCCCACTAACCGTCGACCGCTACTAACCCAACCATCAACCACTACTAACGCTCGCAAACGCTAACACTCACAAACACTAACCCAAAAATTCGCGAACACAAACGAACCACACTTCCCACATAACACGAACTAACAAAATACCCGAACTCCAAACTAACAAAATACCCAAACTAAAATACCGCGCACTCGCAACCTAAAATACCACACACTCACTAAACGACGCCGAAACCAAACAACACCAAAACCACTCCACCTCCCGACTCGACAACAAACCTCCCAACTCAACAACCACAACCCTCCCTCTTAAAACCCACAACCCTCCCTCTTACTCTCTAAACCCGCGAACGATACTCTCTAAACCCACAAACAATCGCTTTCAAAACCACTCGCATCCTACAACCCCCACAAACAACAATTCCATACACCTTTCTCCCGAAATAATAACGACGATTCGCCTAACCTAACGCACATCCCTCTCCCCTCTA八八CTTCAAATACGAACCACGAAACCACTCCCCTAAATACAAACCACA+779+978+112864—+112749+112864—+112748+442~+562MTSSIMMTSS1UMY0D1MMY0D1UOCLNMOCLNUpl4ARFMp'4AKFUp"國'Mpl6'懸UPTCHD2MPTCHD2LIRASSF1AMRASSF1AURPRMMRPRMURUIVX3MRUNX3USAIX3MSA1X3USERP訓(xùn)5MSERP訓(xùn)5USLC29A1MSLC29AIUSTATIMSTATIUT1MP3MTIMP3UTMS1MTMS1UTNFRSF10AMTNFRSF10AUTNFRSF10CMTNFRSFIOCUTNFRSF10DMTNFRSF10DUTNFRSF21MTNFRSF21UWWOXMWWOXUTGATATTTCGGTCGGGAGTGGTGATATTTTGGTTGGGAGTGACGGTTTTCGACGGTTTATTTGATGGTTTTTGATGGTTTTGCGTTCGTTAGGTGAGCGTTAGGTGTGTTTGTTAGGTGAGGTCGAGTTCGGTTTTGGAGGTGAGTTTGGTTTTGGAGGTGGTTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGTTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGTTTCGCGGTCGTTTTAGATGGATAGTGTTTTGTGGTTGTTTGTGTTAACGCGTTGCGTATCTTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTGTGAGCGTTTATTCGTAGATTAGCGTGGTGGTGTTGGAGGAAGAGGGGCGGTCGTACGCGGGGAGGGGTGGTTGTATGTGGGGTTCGCGTAGTCGTCGTCGTGGTTTGTGTAGTTGTTGTTG丁TTTTGCGTGGGTCGAGATTTTGTGTGGGTTGAGAGGAAGGCGTCGGTCGTTAGTTGGGTGTTTAAAGGTGTTGGGTCGTTCGGTGATTGGTGTGTTTAATTGGTTGAGTGTGGAGCGTTTTATTTCGTTTCGTCGTTGGGTATTTGGAGGGTAGTTTGTAGCGGGGTGAGCGGCGGTTGTAGTGGGGTGAGTGGTGTTTTTCGGTCGGGAGTTTGTTTGGTGGATGGATGGAGCGTTTCGGTCGTTTGTGGTTGAGGTAGGG丁GTGATGAATCGCGACGATGAAGAAGAATTGTGATGATGAAGATGATGTTGTTTAGCGTCGTATTTA丁CGTTTTTTGGGTTGGGAGTTTATTGCGATATTGCGGAGATTGTTGTGGAGATTGGATTTTAGTTTTAAATACAACGCGCTCGAAAAATACAACACACTCAAAAACCTCTGCCCGAAACCGAATACACCACACACATACTCATCCTCACACGAATCCCAACTCGAAAACGCACACCTCTCTAATTCCCACAAAAACCACAACGACGAACGAACCACAACAACAAACACCCCTACCCCGAACCGCGACCGTAACAACCCCAAACCACAACCATAACCGCCCACGTACGTATAACCACCCACATACATATAAACCATAACCCCGCGAACTAAAAACGACAAACCCCACAAACTAAAAACAAGAACGAACGCCGAAAACTCAAACAAACACCAAAAACAAACAAAACGACCGACGCGAACGCCTCAAAACAACCAACACAAACACCTCCTACTCGAAAACCCCGTCACCCAACCCTCACCATACTCGCCTCGACGACACTCCCACCCCACCCCACCTTATAAACCGCCGAACGAAACCAATATAAACCACCAAACAAAAACGAAAACGCGACGATAAAACTAAACAAAAACACAACAATACAACACGATAAACCCGAACCACACAATAAACCCAAACCAAAAAACGTCCATAAACAACAACGCGCAAAACATCCATAAACAACAACACAACTCGCCCGATAATAACGAACTAAATCACTCACCCAATAATAACAATACCGTATCCCCGTCTCCTACCATATCCCCATCTCCCTACACGCGCACAAACTACGAACCTTTACACACACACAAACTACATCCTCAACCGCTA丁CGAATAATTCTCCTCAACCACTATCAAACCCTATCGCCCGCTACCCCTATCACCCACTACCAAAT95TO25597TO262+1037—+1237+1028—+1237+10I7-+1213+1034~+1213+197+387表3受試基因的甲基化狀態(tài)力-基因名5637膀胱癌細(xì)胞系基因數(shù)=59SCaBERT24CFTRSALL3尿沉淀物基因數(shù)=45腫瘤病人(11)對照(3)腫瘤(15)膀胱組織基因數(shù)=32正常對照(3)卯.981.853.3600018<image>imageseeoriginaldocumentpage19</image><image>imageseeoriginaldocumentpage20</image>注1純合了-非甲基化2灰色背景雜合子甲基化3黑色背景純合子甲基化受試基閃數(shù)示出，臨床樣品數(shù)見括號中的數(shù)字。用源于膀胱炎患者的尿沉淀作為非膀胱癌對照。下列基因表現(xiàn)為在腫瘤細(xì)胞中的純和甲基化，從而未示出表4膀胱癌患者與對照的臨床特征膀胱癌病人非腫瘤尿路疾病病人神經(jīng)系統(tǒng)疾病病人對照健康人對照(n=132)(n=23)(n=6)(n=7)表5膀胱癌尿沉淀中DNA甲基化狀態(tài)與TMN分期<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表6膀胱癌患者手術(shù)前后的尿液中的受試基因的甲基化狀態(tài)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表7初發(fā)病和復(fù)發(fā)病例的受試基因甲基化狀態(tài)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>參考文獻(xiàn)1.Jaenisch,R.andA.Bird,Epigeneticregulationofgeneexpression:howthegenomeintegratesintrinsicandenvironmentalsignals.NatGenet,2003.33Suppl:p.245-54.2.Ting，A.H"K.M.McGarvey,andS.B.Baylin,777ec"wcer一gew,e—awe/GenesDev，2006,20(23):p.32]5-31.3.Hanahan，D.andR,A.Weinberg,777e/^〃m"nbq/"ca"c^Cell,2000.100(1):p.57-70.4.Bird,A,，T7zeo/ZW」附—Cell,1992.70:p.5-8.5.Gaudet，F(xiàn).，etal"/"t/w"/02/wwons/"w/ce6少ge"ow/cScience,2003.300(5618):p.489-92.6.Eden,A.，etal"C/zrawasoma//w加M/(yaw<ifw歸rs/7ram*<i￡W/1/zypome^y/af/o".Science,2003.300(5618):p.455.7.Huang,丄,etal,，尺ecw/rewceq/"D丄A7asa"/m/n附/edgewecow/c/co"iWZw/e/oAwma"/e/a/coce//w/arcaraw畫a.Carcinogenesis,2006.Inpress.8.Belinsky,S.A.,etal"爿6e/raw/o/jt/6(77VA^a)"/ear(yevew/wwgcawcerawt/"/她/7"a/6/畫arfer/orear/y^ag"os7'51.ProcNatlAcadSciUSA,1998.95(20》p.11891-6.9.Belinsky,S.A.，Gewe，函o,er/zy/7e/7weto/0"aaWo附"rfe/"/wngcawcerNatRevCancer,2004.4(9):p.707-17.10.Ushijima,T"T.Nakajima,andT.Maekita,Z)7V^as"w2arAer》r/w/wre.JGastroenterol,2006.41(5):p.401-7.11.Jemal,A,,etal"C艦w2纖CACancerJClin，2006.56(2):p.106-30.12.Liu，丄，etal"C匿er5W她.csz>z5Tia—a〖，On"a(7972-7，.Tu麗，2004.24(1):p,11-13.13.Amiel，GE.andS.P.Lerner，CVwZ/w/"gswrger少""dc/^wo/7zen3/;v/b廠/wvas/veZ>/aiiiercwrew/朋d/幽"(i/m:"om1.ExpertRevAnticancerTher,2006.6(2》p.281-91.14.Eble，J.，etal.,PafWogy^"e"'csZ圃o腦0/，&附/w"/egewto/WorldHealthOrganizationclassificationoftumours,IARCPress,Lyon(France),2004:p.93-109.15.Kitamura,H.andT.Tsukamoto,￡"吟Wac/rfercawcer.'co"ce/f,<&zg"o^，/wawagmew/.IntJClinOncol，2006.11(1):p,28-37.16.Kriegmair,M.,etal,,0/ea吟cawcer5-,//70/^1///"/<:a"V//"A/ced/0A7一/w，,薦證.JUrol，1996.155:p.105-9,17.Schneeweiss,S.,M.Kriegmair,andH.Stepp,Aem7A/"ga〃r/沐z/wo/7z/"g咖臘wcwg爿廚/toc///zec//ag7a^/cv"/we0//racedwraw/7e/7agoW加wc/ani&JUrol，1999.161(4):p,1116-9.18.Zaak,D.，etal"EWdocop/ccfe&c,/owo/ce〃carc/"(3wavv//^5-aw/"o/evw//"/cac/d:q/"術(shù)2yZworMcewcee/7c/aycop/^y.Urology,2001.57(4》p.690-4.19.Wawroschek，F(xiàn).andP,Rathert,/T>/"eqy油gx/.UrologeA，1995.34(1):p.69-75.20.Lin，J,，etal"cati/zer/w/7rcw20/er/o/少附o/7/2/s附fC-766l4Jrz、A:recwr/"ewce//pa/Zew/svW,/sw/e/^c/a/W"t/cfercawcwClinGenet，2006.70(3):p,240-5.21.Schulz,W.A.,t/"iieAs:,aw^>gwro//^//"/ca/r,/70maArowg/z/7a/7zwqy5,IntJCancer,2006.119(7):p.1513-8.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quán)日2007年7月23日發(fā)明者朱景德申請人:上海市腫瘤研究所