專利名稱::一種通用熒光標(biāo)記探針在pcr-ldr基因單核苷酸多態(tài)性芯片上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及生物技術(shù),具體涉及到一種通用熒光標(biāo)記探針在PCR-LDR基因單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphisms,縮寫SNP)芯片上的應(yīng)用。
背景技術(shù):
:隨著人類藥物基因組學(xué)的發(fā)展,越來(lái)越多的研究成果將運(yùn)用于臨床診斷中,這就需求有大規(guī)模的基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)方法。近年來(lái),將連接反應(yīng)用于檢測(cè)基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)越來(lái)越引起人們的重視,學(xué)者們已經(jīng)做了大量的研究(FranceBaranyetal.,Proc.Nat,lAcad.Sci.USA,88:189-93(1991),TheLigaseChainReaction(LCR)inaPCRWorld,PCRMethodsandApplications,1:5-16(1991))。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligasechainreaction,LCR)是指在反應(yīng)中設(shè)計(jì)兩對(duì)探針,使連接反應(yīng)可以指數(shù)擴(kuò)增模板。連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligasedetectionreaction,LDR)是在反應(yīng)中僅加入一對(duì)探針,模板被線性擴(kuò)增。目前,出現(xiàn)了將LDR技術(shù)和PCR技7(t關(guān)聯(lián)使用,以及LDR技術(shù)、PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)關(guān)聯(lián)用于基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)(NormanP.Gerryletal.,J.Mol.Biol.(1999)292,251-262,U.S.Pat.Pub,No.2003/0032016A1),這些技術(shù)的出現(xiàn)大大方便了基因位點(diǎn)的檢測(cè),但在這些技術(shù)中,需要大量的熒光標(biāo)記的探針,而這些標(biāo)記的探針成本昂貴,為開發(fā)和應(yīng)用造成不便,因而,限制了它們的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處,研究設(shè)計(jì)應(yīng)用方便和價(jià)格合理的熒光標(biāo)記探針。本發(fā)明提供了一種通用熒光標(biāo)記探針在PCR-LDR基因SNP(單核苷酸多態(tài)性)多態(tài)性芯片上的應(yīng)用?;騿魏塑账岫鄳B(tài)性包括單位點(diǎn)基因突變、基因缺失、插入、以及微衛(wèi)星等多種情況,本發(fā)明所述的基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)主要是針對(duì)基因單位點(diǎn)突變,即單堿基突變,插入和缺失,并且在突變位點(diǎn)周圍大約20個(gè)堿基內(nèi)沒有其他單位點(diǎn)突變。當(dāng)LDR和PCR關(guān)聯(lián)用于基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)時(shí),針對(duì)每一個(gè)突變位點(diǎn),涉及到兩種探針,一種標(biāo)記探針,序列是和模板配對(duì);第二種檢測(cè)探針包含兩個(gè)部分,一部分為和模板配對(duì)部分,另一部分為和芯片探針互補(bǔ)配對(duì)部分。其中第二種探針,即包含通用探針互補(bǔ)配對(duì)探針是根據(jù)突變位點(diǎn)需要設(shè)計(jì),它可以是兩根也可以是三根或者四根,探針中3'端為檢測(cè)位點(diǎn)。本發(fā)明主要是針對(duì)第一種標(biāo)記探針進(jìn)行改造,即在標(biāo)記探針的5'端不直接進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記,而引入一段特異性序列。同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)通用的熒光標(biāo)記探針,其序列和該特異性序列互補(bǔ),通過這種方式,在雜交過程中實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記。在LDR反應(yīng)結(jié)束后,將LDR產(chǎn)物和通用熒光探針點(diǎn)在基因芯片表面,此基因芯片表面點(diǎn)有與檢測(cè)探針特異性序列部分相配對(duì)的探針,根據(jù)雜交掃描結(jié)果判讀位點(diǎn)的多態(tài)性。具體的說(shuō),本發(fā)明的探針的設(shè)計(jì)及其運(yùn)用包括以下步驟(1)探針設(shè)計(jì)①設(shè)計(jì)一種由10-25個(gè)堿基組成的通用熒光探針,該通用探針具有極高的特異性,在任何生物中找不到其同源相似的序列。②在要檢測(cè)的突變位點(diǎn)的前后各設(shè)計(jì)10-25堿基長(zhǎng)度的序列,其中5'端上游序列是檢測(cè)探針,在3'端有檢測(cè)位點(diǎn);3'端下游序列是標(biāo)記探針。③據(jù)檢測(cè)探針的數(shù)量,針對(duì)每一根檢測(cè)探針設(shè)計(jì)不同的長(zhǎng)度為15-25堿基的特異性序列和芯片上探針互補(bǔ)。在每個(gè)標(biāo)記探針的3'端引入和通用熒光探針互補(bǔ)的序列。(2)PCR產(chǎn)物制備取待檢測(cè)DNAlial,PCR引物各10-30pmol,高溫聚合酶,高溫聚合酶混合液,相互混合,PCR反應(yīng)條件為依次按94。C30秒,40。C-68。C30秒-2分鐘,60-72°C45秒-2分鐘為一次循環(huán),共循環(huán)25-40次;(3)LDR產(chǎn)物制備取PCR產(chǎn)物取待檢測(cè)DNA探針各40fmol-10pmo1,連接酶,連接酶緩沖液,相互混合。LDR反應(yīng)條件為依次按94。C30秒,40-70°C1-10分鐘,以45-60。C為最好作為一次循環(huán),共循環(huán)l-40次;(4)結(jié)果檢測(cè).取LDR產(chǎn)物l-5)al與l-10(al雜交液混合,點(diǎn)于基因芯片表面,用蓋玻片覆蓋,30-70°C恒溫10-60分鐘,用洗脫液洗脫l-30分鐘,掃描讀取結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果與直接標(biāo)記技術(shù)相比,本發(fā)明在檢測(cè)效果上具有相同的準(zhǔn)確性和精確度。但是,運(yùn)用本發(fā)明可以降低PCR-LDR聯(lián)合芯片技術(shù)的成本和節(jié)省探針合成的時(shí)間。'圖1為芯片點(diǎn)樣示意圖。圖2表示HBV1896野生型。圖3表示HBV1896突變型。圖4為芯片示意圖。圖5表示HBV病毒是1896野生型和YMDD野生型。圖6表示HBV病毒1896混合感染和YMDD/YIDD混合感染。圖7為芯片點(diǎn)樣示意圖。圖8為某樣本A的心血管相關(guān)基因的分型結(jié)果。圖9為某樣本B的心血管相關(guān)基因的分型結(jié)果。圖IO為芯片點(diǎn)樣示意圖。圖11為某樣本A的腫瘤化療藥物毒副作用相關(guān)基因的分型結(jié)果。圖12為某樣本B的腫瘤化療藥物毒副作用相關(guān)基因的分型結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及其附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一探針的設(shè)計(jì)以乙型肝炎病毒(HBV)DNA1896位點(diǎn)為例進(jìn)行說(shuō)明,1896位點(diǎn)附近序列為:5'GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3'1.引物和探針設(shè)計(jì)(1)引物設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1、-游引物ACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATG30(2)通用標(biāo)記探針Cy5-GATGTAATCCTCCGTAGTGTCGCA(3)標(biāo)記探針<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注*表示探針需5'端磷酸化。(4)檢測(cè)探針一<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)通用標(biāo)記探針Cy5-GATGTAATCCTCCGTAGTGTCGCA(3)標(biāo)記探針<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注*表示探針需5'端磷酸化。(4)檢測(cè)探針一<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)檢測(cè)探針二<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.PCR反應(yīng)反應(yīng)混合液為200nMdATP,200nMdTTP,200pMdCTP,200(aMdGTP,2mMMgCl2,2UTaqDNA聚合酶,各lpM的上下游引物,1^1基因組模板(濃度大于5ng4U)。反應(yīng)條件為94°C30秒,60°C30秒,72°C45秒,循環(huán)30次。3.LDR反應(yīng)反應(yīng)混合液為20mMTris-HCl,pH8.3(at25。C),50mMKCl,10mMMgCl2,lmMEDTA,lmMNAD+,10mMDTT,0.1%(v/v)TritonX-IOO,探針各0.01|liM,連接酶15U,lplPCR模板DNA。反應(yīng)條件為94。C30秒,60°C2分鐘,循環(huán)30次。4.雜交取PCR產(chǎn)物4pl,加雜交液1(V1,98'C變性5分鐘,冰浴淬火,將混合液點(diǎn)在DNA芯片上,加蓋玻片,50'C恒溫30分鐘,洗脫液洗脫10分鐘,吹干后掃描,結(jié)果見圖4-圖6。■實(shí)施例三心血管疾病相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)對(duì)心血管相關(guān)相關(guān)基因(ACE、AGT、ANP664、ALDH、AP0E112和APOE158)的SNP進(jìn)行分型。1.引物和探針設(shè)計(jì)(1)普通PCR引物設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.PCR反應(yīng)反應(yīng)混合液為200pMdATP,20(VMdTTP,200(aMdCTP,200(iMdGTP,2mMMgCl2,2UTaqDNA聚合酶,各lpM的上下游引物,1^1基因組模板(濃度大于5ng小l)。反應(yīng)條件為94°C30秒,60°C90秒,72°C60秒,循環(huán)35次。3.LDR反應(yīng)反應(yīng)混合液為20mMTris-HCl,pH8.3(at25。C),50mMKCl,10mMMgCl2,lmMEDTA,lmMNAD+,10mMDTT,0.1%(v/v)TritonX-IOO,探針各0.01jiM,連接酶15U,l(ilPCR模板DNA。反應(yīng)條件為94。C30秒,60°C2分鐘,循環(huán)30次。4.雜交取PCR產(chǎn)物4iul,加雜交液10pl,98。C變性5分鐘,冰浴淬火,將混合液點(diǎn)在DNA芯片上,加蓋玻片,50。C恒溫30分鐘,洗脫液洗脫10分鐘,吹千后掃描,結(jié)果見圖7-圖9及表1。表l心血管相關(guān)基因的分型結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例四腫瘤化療藥物毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性檢測(cè)對(duì)腫瘤化療藥物毒副作用相關(guān)基因(GSTM1、DPD、UGT1A1、XRCC1、MTHFR、TPMT和GSTP1)的SNP進(jìn)行分型。(1)普通PCR引物設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(5)檢測(cè)探針二<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>反應(yīng)混合液為200pMdATP,200pMdTTP,200pMdCTP,200pMdGTP,2mMMgCl2,2UTaqDNA聚合酶,各lpM的上下游引物,基因組模板(濃度大于5ng/|al)。反應(yīng)條件為94°C30秒,58°C卯秒,64°C90秒,循環(huán)30次。3.LDR反應(yīng)反應(yīng)混合液為20mMTris-HCl,pH8.3(at25。C),50mMKCl,10mMMgCl2,ImMEDTA,lmMNAD+,lOmMDTT,0.1%(v/v)TritonX-100,探針各0.01iaM,連接酶15U,1(^1PCR模板DNA。反應(yīng)條件為94。C30秒,60°C2分鐘,循環(huán)30次。4.雜交取PCR產(chǎn)物4pl,加雜交液10pl,98'C變性5分鐘,冰浴淬火,將混合液點(diǎn)在DNA芯片上,加蓋玻片,5(TC恒溫30分鐘,洗脫液洗脫10分鐘,吹干后掃描,結(jié)果見圖IO-圖12及表2。表2腫瘤化療藥物毒副作用相關(guān)基因分型結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>權(quán)利要求1、一種通用熒光標(biāo)記探針在PCR-LDR基因單核苷酸多態(tài)性芯片上的應(yīng)用,其特征在于所述應(yīng)用包括下列步驟(1)探針設(shè)計(jì)①設(shè)計(jì)一種由10-25個(gè)堿基組成的通用熒光探針,該通用探針具有極高的特異性,在任何生物中找不到其同源相似的序列;②在要檢測(cè)的突變位點(diǎn)的前后各設(shè)計(jì)10-25堿基長(zhǎng)度的序列,其中5’端上游序列是檢測(cè)探針,在3’端有檢測(cè)位點(diǎn);3’端下游序列是標(biāo)記探針;③據(jù)檢測(cè)探針的數(shù)量,針對(duì)每一根檢測(cè)探針設(shè)計(jì)不同的長(zhǎng)度為15-25堿基的特異性序列和芯片上探針互補(bǔ);④在每個(gè)標(biāo)記探針的3’端引入和通用熒光探針互補(bǔ)的序列;(2)PCR產(chǎn)物制備取待檢測(cè)DNA1μl,PCR引物各10-30pmol,高溫聚合酶,高溫聚合酶混合液,相互混合,PCR反應(yīng)條件為依次按94℃30秒,40℃-68℃30秒-2分鐘,60-72℃45秒-2分鐘為一次循環(huán),共循環(huán)25-40次;(3)LDR產(chǎn)物制備取PCR產(chǎn)物1μl取待檢測(cè)DNA1μl,探針各40fmol-10pmol,連接酶,連接酶緩沖液,相互混合。LDR反應(yīng)條件為依次按94℃30秒,40-70℃1-10分鐘,以45-60℃為最好作為一次循環(huán),共循環(huán)1-40次;(4)結(jié)果檢測(cè)取LDR產(chǎn)物1-5μl與1-10μl雜交液混合,點(diǎn)于基因芯片表面,用蓋玻片覆蓋,30-70℃恒溫10-60分鐘,用洗脫液洗脫1-30分鐘,掃描讀取結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了一種通用熒光標(biāo)記探針在PCR-LDR基因SNP單核苷酸多態(tài)性芯片上的應(yīng)用。本發(fā)明的應(yīng)用包括探針設(shè)計(jì)、PCR產(chǎn)物制備、LDR產(chǎn)物制備及結(jié)果檢測(cè)等步驟。本發(fā)明的探針包括標(biāo)記探針和檢測(cè)探針,由于對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行改造,可以不直接進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記,因而,能降低PCR-LDR聯(lián)合芯片技術(shù)的成本和節(jié)省探針合成時(shí)間,檢測(cè)結(jié)果達(dá)到用直接標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精確度。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101358231SQ200710044388公開日2009年2月4日申請(qǐng)日期2007年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者肖君華,炯陸,陳軼群申請(qǐng)人:上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司