專利名稱：：超氧化物歧化酶(sod)基因及其鑒定和克隆方法超氧化物歧化酶(SOD)基因及其鑒定和克隆方法發(fā)明領域本發(fā)明涉及超氧化物歧化酶(SOD)。超氧化物歧化酶(SOD)cDNA(SEQIDNo.2)從喜瑪萎陵菜(戶ote油7/aaras^gwz'wea)獲取，其包含編碼基因序列(SEQIDNo.3)，所述編碼基因序列編碼具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽(SEQIDNo.1)。另外，本發(fā)明還涉及一對用于擴增超氧化物歧化酶(SOD)基因的編碼cDNA(SEQIDNo.3)的引物，其中正向引物為5，-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3，禾Q反向引物為5，-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3，。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQIDNO.3的方法，該SEQIDNO.3表達產生具有美國專利號6485950所公開的特征的超氧化物歧化酶酶蛋白(EC1.15.1.1)。
背景技術：
：和現有技術參考SOD是普遍存在于植物、動物和微生物中的一種酶，該酶保護這些生物免受由超氧化物自由基(以下指O20弓l起的氧化損傷。所述酶按照以下氧化還原反應將超氧化物自由基歧化成過氧化氫和氧202.+2lT=H202+02這樣，SOD在所有那些其中CV生成量導致細胞損傷的反應中都具有作用。根據美國專利號6485950,我們已經從萎陵菜(尸"朋"Wa)中提取了耐高壓加熱的超氧化物歧化酶，該酶可以進行高壓加熱并在零度以下顯示活性。由于萎陵菜分布在難以接近的高海拔地方，以及我們的美國專利號6485950中提及的SOD的工業(yè)意義，因此需要開發(fā)一種在大腸桿菌中產生萎陵菜的SOD的系統(tǒng)以便在需要時獲取SOD。以下是涉及各種來源的SOD基因的分離和它們在大腸桿菌中表達以產生可回收數量的SOD的本領域的知識狀況。可以參考文獻(1)Wang,Z.,He,Z.,Shen，Q.，Gu,Y.,Li,S.andYuan,Q.(J.ofChromatographyB，2005.826:114-121)，其在大腸桿菌中過量表達蛹蟲草(Cora^ce/wmz'/toni)的Cu/ZnSOD基因。還可以參考文獻(2)Liu，W"Zhu，R.H.,Li，G.P.,andWang，D.C.(ProteinExpr.Purif.2002.25:379-388)，其在大腸桿菌中實現高產量的重組鴨Cu/ZnSOD的產生。還可以參考文獻(3)Pan,S.M.，Hwang,G.B.,andLiu，H.C.(Bot.Bull.Acad.Sin.1999.40:275-281)，其在大腸桿菌中實現了稻的胞質Cu/ZnSOD的過量表達和表征?？梢詤⒖嘉墨I(4)Hartman,J.R.，Geller,T"Yavin,Z.,Bartfeld,D"Kanner，D.,Aviv,H.，andGorecki,M.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1986.83:7142-7146)，其報道了在大腸桿菌中高水平表達具有酶活性的人Cu/ZnSOD?？梢詤⒖嘉墨I(5)Ken,CF.，Lin,C.T.，Shaw,J.F"andWu,J丄.(MarineBiotech.2003.5:167-173)，其在大腸桿菌中過量表達了斑馬魚的Cu/ZnSOD并純化出具有活性的酶?？梢詤⒖嘉墨I(6)Kim,T.S.，Jung,Y.，Na,B.K"Kim，K.S"andChung，P.R.(Infect.Immun.2000.68:3941-3948)，其克隆并在大腸桿菌中表達了肝片吸蟲(Fflcfo/aAepart'ca)的Cu/ZnSOD基因。缺點是1.沒有從萎陵菜分離的SOD基因，萎陵菜是耐高壓加熱且在零度以下具有功能的Cu/ZnSOD的來源。2.沒有從萎陵菜分離的并在大腸桿菌中表達的SOD基因。3.沒有在大腸桿菌中表達以產生可高壓加熱的SOD蛋白的SOD基因。4.沒有在大腸桿菌中表達以產生在零度以下具有功能的SOD蛋白的SOD基因。本SOD和其它已知SOD的比較數據<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>97:209-216)。然而，針對同一種酶沒有報道同時具有催化02'的歧化作用的較低的溫度和熱穩(wěn)定性。本酶可耐高壓加熱。當要將SOD注射到體內時，則需要無菌的組合物，因此可耐高壓加熱的SOD是理想選擇。另外，在重輸注應用和器官的低溫儲存中，需要可耐高壓加熱并在低溫下可以高效發(fā)揮作用的SOD。除了耐高壓加熱的SOD在藥學和醫(yī)學領域中的應用，無菌SOD也將是化妝品和食品工業(yè)的一個選擇。沒有可耐高壓加熱的SOD的報道。娜詣本發(fā)明的主要目的是提供超氧化物歧化酶(SOD)cDNA(SEQIDNo.2)，其從喜瑪萎陵菜獲取，并包含SEQIDNo.3的編碼基因序列，所述編碼基因序列編碼具有超氧化物歧化酶酶活性的SEQIDNo.1的多肽。本發(fā)明的另一個目的是提供一對用于擴增超氧化物歧化酶(SOD)基因的編碼cDNA(SEQIDNo.3)的引物，其中正向引物為5，-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3，，反向引物為5，-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3，。另外，本發(fā)明的另一個目的是提供鑒定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQIDNO.3的方法，該SEQIDNO.3表達產生具有美國號6485950專利所公開的特征的超氧化物歧化酶酶蛋白(EC1.15丄1)。本發(fā)明的另一個目的是提供萎陵菜的可耐高壓加熱的超氧化物歧化酶的基因。本發(fā)明的另一個目的是提供萎陵菜的可耐高壓加熱的超氧化物歧化酶的基因，該酶在零度以下的溫度也具有功能。本發(fā)明的另一個目的是提供SOD的重組基因，所述SOD高壓加熱后仍具有活性并且還在低溫下具有活性，所述重組基因在質粒載體內從而形成承載合成所述SOD的核苷酸序列的新載體。本發(fā)明的另一個目的是用以上所述的重組質粒載體轉化細菌宿主大腸桿菌用于在所述細菌宿主中表達SOD基因。附圖簡述圖l顯示溫度對SOD活性影響。純化在大腸桿菌中表達的萎陵菜SOD并在不同溫度的高壓加熱的前后進行分析。圖2顯示萎陵菜Cu/ZnSOD的核苷酸序列和其它植物物種的序列的比較。用星號表示完全同源的區(qū)域。圖3顯示推論出的萎陵菜Cu/ZnSOD的氨基酸序列和其它植物物種的序列的比較。用星號表示完全同源的區(qū)域。圖4(A)顯示萎陵菜SOD在大腸桿菌中的表達和純化。C，對照；I，通過IPTG誘導的蛋白；P，純化的SOD。凝膠是通過銀染染色的。(B)體現純化的SOD活性的凝膠活性染色。P，所純化的SOD。圖5顯示本發(fā)明sod基因和其它植物物種的sod基因的比對結果。圖6顯示SEQIDNo.1的SOD基因多肽序列的詳細信息。圖7顯示SEQIDNo.2的SOD基因的全長cDNA的詳細信息。圖8顯示SEQIDNO.3的萎陵菜SOD基因的編碼序列的詳細信息。表9顯示SEQIDNo.4的陽性cDNA克隆的詳細信息。圖10顯示SEQIDNo.5(a)的引物序列(正向引物)和SEQIDNo.5(b)的引物序列(反向引物)。圖IO顯示RACE引物的詳細信息(a)SEQIDNo.6(a)的引物序列GSP1:正向引物(b)SEQIDNo.6(b)的引物序列NES1:反向引物(c)SEQIDNo.6(c)的引物序列GSP2:正向引物(d)SEQIDNo.6(d)的引物序列NES2:反向引物發(fā)明概述本發(fā)明提供了喜瑪萎陵菜的超氧化物歧化酶基因及其在異源系統(tǒng)中的表達，并且包括攜帶負責所述SOD合成的編碼核苷酸序列(SEQID.3)的構建體和產生所述SOD蛋白的轉化大腸桿菌。這種SOD蛋白是可耐高壓加熱的并在零度以下的溫度仍具有功能。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了從喜瑪萎陵菜獲取的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA(SEQIDNo.2)，其中所述cDNA含856個核苷酸堿基。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述cDNA具有連同編碼前序列和編碼后序列的完整編碼序列。本發(fā)明還提供超氧化物歧化酶(SOD)基因的編碼cDNA(SEQIDNo.3)，其中所述編碼cDNA含459個核苷酸堿基。另夕卜，本發(fā)明還提供了超氧化物歧化酶(SOD)多肽(SEQIDNo.1)，其中所述多肽含152個氨基酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述多肽可耐高壓加熱。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述多肽在《1(TC至+8(TC的溫度范圍內具有功能。本發(fā)明還提供了一對用于擴增超氧化物歧化酶(SOD)基因的編碼cDNA(SEQIDNo.3)的引物，其中正向引物為5'-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3，，反向引物為5'-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3，。另外，本發(fā)明提供了一種鑒定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQIDNO.3的方法，所述SEQIDNO.3編碼具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽(SEQIDNo.1)，其中所述方法包含以下步驟a)從萎陵菜的葉子中分離mRNA;b)根據從步驟a)獲取的mRNA合成cDNA;c)構建萎陵菜的DNA的cDNA文庫，然后在合適的載體優(yōu)選細菌噬菌體中克隆從步驟b)獲取的cDNA;d)篩選來自步驟c)的所述文庫，然后進行用于鑒定陽性cDNA克隆的初次、第二次和第三次篩選；e)從步驟d)獲取的陽性cDNA克隆中分離DNA;f)利用引物擴增所述DNA，該引物包括正向引物5，-GTTGTAAAACGACGTGCCAGT-3，，反向引物5，-CACAGGAAACAGCTATGACC-3，；g)利用不同引物對通過cDNA末端快速擴增技術(RACE)擴增從步驟e)獲取的cDNA的末端以得到期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全長DNASEQIDN0.2，其中所述引物包含正向引物5，-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3，，反向引物5，-GTCATCAGGGTCTGCATGGACAACAAC-3，，正向引物5，-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3，，反向弓I物5，-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3'g)利用不同引物對通過cDNA末端快速擴增技術(RACE)擴增從步驟e)獲取的cDNA的末端以得到期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全長DNASEQIDNO.2,其中所述引物包含正向引物(GSP1):5，-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3，反向引物(NES1):5，-GTCATCAGGGTCTGCATGGACAACAAC-3，正向引物(GSP2):5，-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3，反向引物(NES2):5，-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3，SMARTIIA寡核苷酸5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG曙3，3'-RACECDS引物A(3'-CDS):5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)3。N隱！N-3，5'-RACECDS引物(5'畫CDS):5，-(T)25N.!N誦3'通用引物混合物A(UPM):長鏈5，-TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，通用引物混合物A(UPM):短鏈5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，巢式通用引物A(NUP):5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，h)利用從期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全長DNASEQIDN0.2的起始密碼子到中止密碼子設計的一對引物擴增超氧化物歧化酶(SOD)的編碼序列SEQIDNo.3，其中所述引物具有以下序列正向引物5，-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3，反向引物5，-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3，i)將從步驟g)獲取的擴增產物克隆到pQE30表達載體中，然后將它轉化到感受態(tài)大腸桿菌細胞中以得到表達構建體；j)通過常規(guī)方法分離質粒DNA，然后通過測序以確認所述SOD基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，生產針對純化的SOD的多克隆抗體并用于根據嫩葉mRNA合成的cDNA文庫的篩選。在本發(fā)明的另一個實施方案中，篩選文庫，通過聚合酶鏈式反應(以下稱為PCR)擴增陽性cDNA克隆并獲得兩個PCR產物。對這些產物進行測序并獲得大約85%的編碼SOD的基因。另外，在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述cDNA克隆的序列沒有起始密碼和中止密碼，其長度小了21%。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據陽性cDNA克隆的序列設計引物，并用cDNA末端快速擴增技術(下文稱為RACE)擴增SOD全長基因。在本發(fā)明的另一個實施方案中，對含SEQIDNo.2所示的序列的所述SOD基因進行測序和分析。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述全長SOD基因含856個核苷酸堿基。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述全長的SOD基因具有連同編碼前序列和編碼后序列的完整編碼序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據全長的SOD基因設計一對引物以擴增SEQIDNo.3的超氧化物歧化酶(SOD)基因編碼cDNA。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述編碼cDNA含459個核苷酸堿基。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述SOD基因連接到載體上以產生重組質粒，該質粒一旦轉化到適合的大腸桿菌宿主中就產生克隆。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的SEQIDNo.3的SOD基因的編碼序列對應于編碼超氧化物歧化酶(SOD)的酶蛋白的聚核苷酸。另外，本發(fā)明還提供了含編碼可選擇標記的序列和中止序列的表達構建體。在本發(fā)明中，收集印度西喜馬拉雅(WesternHimalaya)的HimachalPradesh的Lahaul和Spiti地區(qū)內生長在KunzumPass(海拔4517m;32°24'N;077°38'E)的萎陵菜植物的葉子。我們之前在我們的美國專利號6485950中報道了這種植物的葉子具有耐高壓加熱并在零度以下的溫度具有功能的SOD。因此通過本領域熟知的并常規(guī)實施的技術，鑒定、分離編碼這種SOD的基因并將其克隆到大腸桿菌中。對含SEQIDNo.2所示序列的本發(fā)明SOD基因在正義方向進行測序和分析。本文所使用的術語"正義"指RNA堿基的大體延伸(asubstantialrunofRNAbases)，所述RNA具有與特定RNA序列(如mRNA)基本相同的堿基。本發(fā)明還包含編碼SEQIDNo.1所示氨基酸序列的聚核苷酸。本發(fā)明還提供宿主細胞，其以允許所編碼的SOD多肽表達的方式包含本發(fā)明的聚核苷酸。用于轉化本發(fā)明的SOD基因的合適的宿主細胞包括細菌細胞如大腸桿菌。利用通過本領域熟知的并常規(guī)實施的將DNA引入到宿主細胞的方法，將本發(fā)明的聚核苷酸作為環(huán)狀質粒的一部分引入到所述宿主細胞中。本發(fā)明的宿主細胞是工業(yè)規(guī)模生產重組SOD的有價值資源。多克隆抗體，在本發(fā)明中指正常免疫系統(tǒng)在響應由一些很接近但由不相同的蛋白構成的抗原時產生的抗體。載體，在本發(fā)明中指能夠接受外來DNA的DNA序列，并且采用具有某種抗生素抗性的環(huán)狀質粒DNA的形式。將本發(fā)明的基因序列與所報道的其它植物的SOD比較以考察所述基因的獨特性(圖2)。本發(fā)明的多肽的獨特序列通過與其它已知多肽的序列比較是可以識別的，并且可以通過使用在本領域中常規(guī)使用的比對程序例如可在公共序列數據庫中得到的那些程序進行鑒定(圖3)。這暗示所獲取的序列是不完全的。然而，SEQIDNo.3與所報道的其它植物的SOD基因具有至少80%、至少82%、至少83%、至少85%的序列同源性。關于本發(fā)明的聚核苷酸的百分比序列"同源性"在本文中定義為在序列比對后，候選序列中與所述SOD編碼序列中核苷酸相同的核苷酸堿基的百分數，如果需要以獲得最大百分比序列同一性。對于完全100%氨基酸組合物來說是氨基酸的累積效應/組合，并且在所述組合物中觀察到了所述特征。所述組合物給這種蛋白提供了這種蛋白所具有的效果。以下實施例以示例顯示本發(fā)明的方式給予，并不被認作是對本發(fā)明的范圍的限定。實施例-1賴性產貧,游微在一年齡雄兔(NewZealand型)中生產針對所純化的蛋白的多克隆抗體。將所純化的SOD蛋白(含100嗎SOD蛋白的500^1磷酸鉀緩沖液，pH7.0)乳化到lml弗氏完全佐劑中并利用一次性注射器通過肌肉施予。完全弗氏佐劑從印度的BangaloreGenei獲得，其包含石蠟油、作為乳化劑的二縮甘露醇單油酸酯和熱滅活結核分枝桿菌(綺coZ)Gtcten'wwmZ7ercw/a^)。在初次注射的第7天后，施予加強劑量(1ml，含乳化在lml不完全佐劑中的60嗎純化蛋白)。使用固定在無菌注射器上的22號針通過快速抽入和排出抗原-佐劑混合物，使佐劑(500pl)和所純化的酶(50(^1，IOO嗎)徹底乳化以得到穩(wěn)定的抗原-佐劑乳液。通過將一滴所述混合物置于蒸餾水的靜止表面來檢測完全乳化。所述小滴完整說明完全混合。使用22號針將抗原-佐劑混合物(800pl)注射到兔的大腿肌肉中。收集來自所述兔的心臟的血液并使之在室溫下凝結2小時。4'C過夜儲存后，用Pasture吸管對凝結塊的邊緣進行邊緣化并以150xg離心5分鐘。收集上清并以350xg離心15分鐘除去細胞碎片。加入疊氮化鈉至濃度為0.025%并把血清儲存于4。C。如Kanematsu,S.andAsada,K.(1990)PlantCellPhysiol.31:99-112.中的闡述，在第二次加強劑量之后收集少量的血液以利用Ouchterlony雙擴散(下文稱為ODD)檢測抗體的存在。這樣，在85nm皮氏平板中倒入3mm厚度的在0.15MNaCl、20mMpH7.0的磷酸鉀和0.02%疊氮化鈉中制備的1.5%的瓊脂。將抗原(20pl，含4嗎蛋白)和抗體裝載到用打孔器(cork-borer)切割的直徑3mm的孔中。皮氏平板加蓋并放于濕潤的環(huán)境中37。C持續(xù)16-24小時并檢測免疫沉淀線。實施例-2臘j分庸，m4游定蘆，來^m4游"(M+柳i^游縱浙凝,冶妖利用改良的鹽酸胍方法(LaI.L.,Sahoo.R.,Gupta.R.K.，Sharma.P.andkumar.S.PlantMolecularBiologyReporter19:181a-181f.)從萎陵菜的嫩葉組織中分離核糖核酸(下文稱為RNA)。在液氮中把葉組織(500mg)研磨成微細粉末。將粉末轉移到含5mlGH緩沖液(8M鹽酸胍、20mMEDTA、20mMMES、lOOmMpME)的新的研缽中并進一步研磨。將所產生的勻漿轉移到含等體積苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:10)的旋蓋試管(oak-ridgetube)中。各相通過渦旋乳化并通過以10，000rpm離心20min(7°C)進行分離。將上層水相轉移到新的旋蓋試管中并用等體積的氯仿異戊醇(24:1)抽提。將所產生的上層水相轉移到corex試管中，通過加入0.2體積1M醋酸和0.7體積冰乙醇使RNA沉淀。將所述試管置于-72。C持續(xù)3h。通過在4。C、10,000rpm離心10分鐘使沉淀形成團塊。用5ml3M醋酸鈉(pH5.2)洗滌團塊三次接著用70%的冰乙醇進行最后洗滌。干燥團塊并溶解到最小體積的DEPC處理過的滅菌水中。通過測量在260nm處的吸光度對RNA定量，通過計算在260nm和280nm處所測定的吸光度的比值監(jiān)測純度。260/280nm的值>1.8被認為是在本研究中所使用的RNA的理想純度。計算RNA濃度和產量的公式如下RNA濃度(昭/ml)=A26()(在260nm處的吸光度)x40x稀釋倍數總產量(嗎)-濃度x儲存RNA樣本的體積為了檢査RNA的完整性，用15.5|ilMl溶液(2pl5XMOPS緩沖液、3.5pl甲醛和10pi甲酰胺[5XMOPS緩沖液300mM醋酸鈉、10mMMOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、0.5mM乙二胺四醋酸(EDTA)])稀釋含5-6嗎RNA的4.5^1DEPC處理過的滅菌水并在65。C孵育15分鐘。在加入2pl甲醛凝膠上樣緩沖液[50%甘油、lmMEDTA(pH,8.0)、0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯藍FF]后，將RNA上樣至1.0%甲醛瓊脂糖凝膠，并在72伏、lxMOPS緩沖液(60mM醋酸鈉、2mMMOPS、O.lmMEDTA)中電泳(Sambrook，J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY)。利用共價結合至聚苯乙烯-乳膠顆粒(Oligotex，QiagenInc)上的dC10T30寡核苷酸純化Poly-AmRNA。Oligotex選擇性結合具有poly-A尾的mRNA使其純化，留下所有沒有poly-A尾的RNA。使用lmg總RNA作為mRNA分離的起始材料，并在過程中按照生產商的說明進行。實施例-3定被糸翻文岸m浙為c扁文岸J游贈使用TimeSavercDNA合成試齊U盒(AmershamPharmaciaBiotech.USA)利用Poly-A+mRNA合成cDNA。利用MMLV反轉錄酶在有雙功能引物[5，d(AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT1S)p3，]存在的情況下合成第一鏈，所述雙功能引物在AWI的限制性位點的3'末端具有一段oligo(dT18)。在RNaseH切刻RNA:cDNA雜合體中的RNA鏈后，由DNA聚合酶起始第二條鏈的合成。所產生的cDNA用苯酚/氯仿抽提并在SepharoseCL-4B旋轉柱上純化。在cDNA的另一端連接上￡coRI接頭(5'd[AATTCGGCACGAGG]國3，，[GCCGTGCTCC]p-5，)。用I消化cDNA以釋放在寡聚(dT18-A^I)引物上的位點。對具有五coRI和A^I懸端的cDNA進行磷酸化以阻止自連接但可以連接到去磷酸的載體上。選擇噬菌體X載體aExCeIlA^I/￡CoRI/CIP)用于克隆以上所產生的具有五coRI和A^I懸端的cDNA。XExCell衍生自人Charon載體，其經過工程改造包含內在的線性化pExCdl拷貝。在構建和使用lawn細胞(大腸桿菌菌株NM522)的篩選后，使用含目的克隆的噬菌體感染特定的大腸桿菌菌株(NP66)，該菌株能夠在體內釋放基于pUC的環(huán)狀的自主復制的噬菌粒pExCell。由在人ExCellDNA內的噬菌粒兩側的attL和attR位點之間的位點特異性重組實現pExCell的體內切除。NP66帶有切除所需要的、由熱誘導啟動子控制的輔助蛋白。通過用人ExCell感染NP66然后在能使這些輔助蛋白表達的39i:生長，實現體內切除。將連接的載體和cDNA片段包裝在體外包裝系統(tǒng)(ReadytoGoLambda包裝試劑盒，AmershamPharmaciaBiotech.USA)中。用于XDNA的體夕卜包裝系統(tǒng)使用單個溶原體，所述溶原體編碼所有的必須包裝蛋白。用大腸桿菌溶原體制備提取物，其中所述原噬菌體攜帶一個co突變。所述突變是在抑制內源原噬菌體包裝的ccw位點的一個缺失；然而外源重組DNA被有效的包裝。包裝提取物也缺失&oX和其它識別甲基化DNA的DNA限制系統(tǒng)，這樣產生甲基化和未甲基化cDNA的有效包裝。實施例-4Jf岸縱遂鄉(xiāng)絲微敘岸游鑒定、^"潛微眾將針對所純化的SOD產生的抗體用作探針篩選文庫。用基于化學發(fā)光的檢測方法(ECLtm蛋白印記分析系統(tǒng)，Amershamlnc.)檢測固定的抗體。通過在SM緩沖液(100mMNaCl，8mMMgS04，50mMTris-HCl和0.01%明膠)中制備包裝反應物的系列稀釋液將文庫鋪在平板上。使用適合于皮氏平板(82mm)的、耐高壓加熱并干燥的硝酸纖維素濾膜。將膜浸泡在10mM異丙基-(3-D硫代半乳糖苷(下文稱為IPTG)中5分鐘，空氣干燥并用于篩選。在孵育鋪在平板中的文庫6h后或當噬菌斑開始出現時，用IPTG浸泡過的硝酸纖維素濾膜覆蓋平板。輕輕地通過平口鑷子夾持對側邊緣覆蓋濾膜并將濾膜置于平板的中心，不帶入任何氣泡。一旦濾膜與平板的接觸形成就不再移動濾膜。再次將平板-濾膜(顛倒)在37。C孵育4h。孵育后，用18號針通過不對稱的剌孔對平板進行標記用于以后的比對。將濾膜從平板移走并使蛋白側朝上。利用顯色X光、濾膜和平板的正確方向選擇陽性嗜菌斑。嗜菌斑在標記之后挖出并放在300^1SM緩沖液中室溫孵育。2h后，以13,000xg對其離心10min。將上清收集在新的無菌試管中然后加入3(Hil氯仿。將擴增的噬菌體重新鋪板用于第二次和第三次篩選。在第三次篩選后，挖取陽性嗜菌斑的中心用于體內嗜菌粒釋放。對于最初的篩選，采用105噬菌體形成單位(pfU)并轉移到膜上。膜與多克隆抗體雜交并按照EC1說明書顯色。獲取三個強陽性克隆并將其用于第二次篩選，產生70%陽性信號。將一些克隆用于第三次篩選并且在第三次篩選后，這次所有的克隆都產生了100%的陽性信號。使用所有陽性嗜菌斑用于釋放含所述克隆片段的載體pExCdl。實施例-5礞雜p細//冊遂鄉(xiāng)魏糊斜釋及根據大腸桿菌NP66釋放菌株在含50pig/ml壯觀霉素、30^g/ml氯霉素和0.2%麥芽糖的2XYT培養(yǎng)基(2XYT培養(yǎng)基終體積為1升的含12g胰蛋白胨、24g酵母提取物和5g甘油的蒸餾/去離子水)制備宿主細胞。培養(yǎng)物在32。C過夜培養(yǎng)。孵育5ml含50pg/ml壯觀霉素、30pg/ml氯霉素和0.2%麥芽糖的2XYT與50^1所述過夜培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物在32匸搖動培養(yǎng)至A^o為0.5-0.8，并且通過3000Xg離心收集細胞。將團塊重懸在含50pg/ml壯觀霉素的NZCYM肉湯(NZCYMb肉湯終體積為1升的含10g酪蛋白水解物、5g酵母提取物、5gNaCl、lg酪蛋白氨基酸和2gMgS04.7H20的蒸餾/去離子水)中，至最終A6oo為2.0。細胞在lh內使用。為了釋放pExCdl，將100pl制備的NP66細胞置于15ml無菌玻璃試管中并在39'C孵育20min以允許attL和attR位點之間位點特異性重組所需要的His蛋白的表達。將100mJ噬菌體SM溶液加入到所述細胞中并在39。C再次孵育20min。向這種NP66/噬菌體混合物中加入200pl1M擰檬酸鈉以終止XExCell對NP66的感染，并加入5ml預熱(32°C)的含50!ig/ml壯觀霉素的2XYT肉湯。培養(yǎng)物在32'C適度搖動孵育1.5h以產生"釋放的培養(yǎng)物"。為了制備用于隨后的pExCellDNA分離的過夜培養(yǎng)物，將50pl釋放培養(yǎng)物在37°C、含100jxg/ml氨芐青霉素的5mlLB(LB培養(yǎng)液終體積為1升的含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化鈉的蒸餾/去離子水)培養(yǎng)液中孵育。實施例-6棘廢游c層游分微齢將培養(yǎng)物劃線培養(yǎng)并用吸液管頭隨機挑取菌落。將菌落懸在50^1裂解緩沖液中(菌落裂解緩沖液TE(Tris-CnOmM、lmMEDTA，pH8.0)和(U%吐溫20)，在水浴中煮沸10min接著在冰上瞬間冷卻。利用每種0.2一的"正向，，(55-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3，)和"反向，，(5，陽CACAGGAAACAGCTATGACC-3')兩側引物、20dNTP和1單位水生棲熱菌(77^mmsi^M^'cwA')(下文稱為Taq)DNA聚合酶(購自M/S.Qiagen，Germany)，在1XPCR緩沖液(20mMTris-Cl(pH,8.4)、50mMKCl、1.5mMMgCl)中擴增釋放在菌落裂解物中的質粒。在本發(fā)明中，dNTP指脫氧核苷三磷酸，其包含腺嘌呤脫氧核苷三磷酸(下文稱為dATP)、鳥嘌呤脫氧核苷三磷酸(下文稱為dGTP)、胞嘧啶脫氧核苷三磷酸(下文稱為dCTP)和胸腺嘧啶脫氧核苷三磷酸(下文稱為dTTP)。熱循環(huán)儀程序由94。C持續(xù)40sec，52。C持續(xù)1min和72。C持續(xù)2min的30個循環(huán)組成。然后72。C延伸5min。擴增產物在含溴化乙錠(0.5pg/ml的終濃度)的IXTAE緩沖液(TAE緩沖液0.04MTris-.醋酸鹽、0,002MEDTA，pH8.5)中的1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，并通過與標準DNA分子量標記的比較分析插入物的正確大小。用QIAGENplasmidmini試劑盒(Cat#12125)分離質粒。將它們定量并在1%瓊脂糖凝膠上檢測，使用BigDyeterminator(version3.1)cyclesequencingmix(AppliedBiosystems,USA)在自動DNA領!]序儀(ABIPrism310，GeneticAnalyzer,AppliedBiosystems,USA)上進行測序?；旧习凑障鄳a商的闡述的操作規(guī)程進行。所用測序引物為"正向"5，-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3，和"反向"5，-CACAGGAAACAGCTATGACC-3，。SEQIDNO:4的信息(i)序列特征-(A)長度365個堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓撲環(huán)狀(ii)分子類型cDNA(iii)序列說明:SEQIDNO:45'CAAGAGGGAGATGGCCCAACTACTGTGACCGGAAACATTTCTGAGCAAATCCACTGGAAATGCTGGTGGCAGGAT3,實施例-7在URLwww.ncbi.nlm.nih.gov.上可獲取的基因數據庫中利用BasicLocalAlignmentSearchTool(下文稱為BLAST)查找實施例6中提及的序列的同源性。從結果中可以清楚的看出所述序列與數據庫中所提交的SOD序列具有80-90%之間的同源性。實施例-8鄉(xiāng)c腦束微免,潛r7^豫為wc^凝全長微利用cDNA末端的快速擴增(RACE)從喜瑪萎陵菜分離全長的SOD基因。RACE從信使RNA模板的一個確定的內部位點和3，或5'末端的未知序列之間擴增DNA序列(Frohman,M.A.，Dush.M.K.andMartin,G.R.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8998-9002;5962271和美國專利號5962272)。利用一對基因特異性引物分別產生所述基因的5'和3'末端。利用部分cDNA序列(SEQIDNo.1)設計兩對引物。這樣設計引物以使所擴增的5'和3'末端彼此重疊一小段核苷酸。針對5'RACE,基因特異性引物(下文稱為GSP1)5，-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3，用于初次PCR，巢式基因特異性引物(下文稱為NES1)5'-GTCATCAGGGTCTGCATGGACAACAAC-3，用于第二次PCR(RACE)。使用1^10巢式引物儲存液用于第二次PCR。針對3'RACE,設計用于初次PCR的基因特異性引物(以下稱為GSP2)5'-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3，和巢式引物(下文稱為NES2)5，-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3，。這樣設計引物以使所擴增的5'和3'末端彼此重疊一小段核苷酸。使用修飾的鎖定oligo(dT)引物和SMARTIIAoligo(dT)引物合成用于5，-RACE的cDNA。所述修飾的oligo(dT)引物，稱為5，-RACECDS引物(5'-CDS)，在3'末端具有兩個簡并核苷酸位點。在單個反應中利用稱為反轉錄酶的酶反轉錄lug的總RNA以產生為5'和3'RACE準備的cDNA。對于5'eDNA的合成，使用含RNA的反應混合物中的1)jM5，-CDS引物和1—ISMARTIIoligo(dT)引物進行反應。利用常規(guī)的反轉錄方法合成3'-RACEcDNA，但使用特定的oligo(dT)引物。該3'-RACECDS引物AG，-CDS)弓l物與5，-CDS—樣包含鎖定核苷酸位點并且在其5'末端還有一個智能序列(smartsequence)部分。加入無菌H20至每個反應的終體積為5^1，混合并離心e反應混合物在70。C孵育2h并在冰上冷卻2min。向每個反應中加入第一鏈緩沖液(50mMTris-Cl(pH，8.3)、75mMKCl和6mMMgCl2)、1mMdNTP、2mMDTT和反轉錄酶并在通氣孵育箱中于42。C孵育1.5hr。將第一鏈反應產物用lOOp.l麥黃酮-EDTA緩沖液(10mM麥黃酮-KOH(pH8.5)，1.0mMEDTA)稀釋并在72。C加熱反應管7min。(反轉錄系統(tǒng)是SMARTRACEcDNA擴增試劑盒的一個組分，其來自BDBiosciences,USA)。^f/MCE游歹/欽^^^^77Y廣應5D5iVwc/柳"s，^iL4CE試縱游一教W引物引物序列SMARTIIA寡核苷酸5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'3，-RACECDS引物A(3，-CDS)5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)3。N-!N國3，5，-RACECDS引物(5,-CDS)5，-(T)25N,3'IOX通用引物混合物A(UPM)長引物5'-TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'短引物5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，巢式通用引物A(NUP)5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，利用0.2GSP1、GSP2引物和IX通用引物(UPM)、0.2mMdNTP以及1XBD聚合酶混合物擴增5'和3'RACEcDNA。熱循環(huán)儀程序由94°C持續(xù)30sec、68。C持續(xù)30sec和72°C3min的30個循環(huán)組成。將反應擴大到50pl的規(guī)模，并在PCR完成之后，將45plPCR樣本在含溴化乙錠(0.5pg/ml的終濃度)的TAE緩沖液中的1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。如果需要，將剩余的擴增產物儲存在-2(TC用于第二次PCR。將擴增子從凝膠上切除并使用德國M/SQiagen的QIAEXII凝膠提取試劑盒按照生產商的說明從凝膠中洗脫DNA。將純化的DNA克隆到pGEM-Teasy載體(Promega，USA)中，用Qiagenplasmidmini-isolation試劑盒分離質粒并在自動DNA測序儀(ABIPrism310，GeneticAnalyzer,AppliedBiosystems)上禾U用BigDyeterminator(version3.1)cycle測序混合物(AppliedBiosystems,USA)測序?；旧习凑障鄳a商所述的方法進行操作規(guī)程。通過BLAST分析RACE產物。(3)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征(A)長度856個堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓撲環(huán)狀'(ii)分子類型CDNA(iii)序列說明SEQIDNO:25，ACGGGGGGGGGACTGAAATAAATAGAGAGGGTCATAGTCACATTGAAACATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTTAGCTCCAGTGAGGGTGTTGCTGGAACTATCCTCTTTACCCAAGAGGGAGATGGCCCAACTACTGTGCATTGGTAGGGCTGTTGTTGTCCATGCAGATCCTGATGACCTTGGCAATTTCTTGCTTTGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3，實施例-9f潛膽游薪礙胸/f—，>>并克虔至教翥沐通過PCR利用從起始密碼子到終止密碼子設計的正向引物5，-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3，和反向弓|物5'-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3，擴增SOD的CDS。將擴增產物克隆至pQE30表達載體中并轉化至感受態(tài)大腸桿菌細胞中。利用標準的質粒分離操作規(guī)程(Sambrook，丄，Fritsch，E.F.andManiatis,T.1989.MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NY)分離該質粒并在自動DNA測序儀(ABIPrism310,GeneticAnalyzer,AppliedBiosystems)上禾U用BigDyeterminator(version3.1)cycle領!j序、昆合物(AppliedBiosystems,USA)進行測序以確認插入物的克隆?；旧习凑丈a商所述的方法進行操作規(guī)程。(4)SEQIDNO.3的信息(O序列特征(A)長度459個堿基對(B)類型核酸(C)鏈雙鏈(D)拓撲環(huán)狀(ii)分子類型cDNA(iii)序列說明SEQIDNO.3GCTTGTGGTATTATTGGCCTTCAAGGATGA3'(5)SEQIDNO.l的信息(O序列特征(A)長度152個氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型多肽(iii)序列說明<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>G實施例10資表這游歪力游薪賴箱眾將含萎陵菜的SOD基因的大腸桿菌培養(yǎng)在37°C、含100jxgml'1和25嗎ml"卡那霉素的100mlLB培養(yǎng)液中。當培養(yǎng)物生長至在600nm處的吸光度為0.6時，加入IPTG至終濃度為lmM。分別加入CuS04和ZnS04至終濃度為lOOppm和2ppm。在37匸誘導SOD蛋白表達5h后，收集細胞、洗滌并重懸到4ml裂解緩沖液(含300mMNaCl和10mM咪唑50mMNaH2P04緩沖液，pH8.0)中。超聲處理所述細胞重懸液并通過以12000g、4。C離心20min使裂解物變澄清。然后將上清倒入裝載有鎳-氮川三乙酸(Ni-NTA)瓊脂糖的柱子上，用洗滌緩沖液(含300mMNaCl和20mM咪唑的50mMNaH2P04緩沖液，pH8.0)洗滌，用洗脫緩沖液(含300mMNaCl和250mM咪唑的50mMNaH2P04緩沖液，pH8.0)洗脫SOD蛋白。通過10%SDS-PAGE，利用銀染可視化所述蛋白對所純化的SOD進行評估(圖4A)。在高壓加熱所純化SOD之前和之后對所述蛋白進行估計，顯示有±25%的蛋白損失。由于使用50pl蛋白樣本用于檢測SOD活性，因此在計算酶活性時計算蛋白的損失。反應基質含0.05mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、5.7X10-5M氮藍四唑(下文稱為NBT)、9.9X10-3M蛋氨酸、1.17X1(T6M核黃素和0.025%TritonX-100，終體積為3.0ml。通過使用光纖光源(Nikon)用1000piEinstein/m/秒的光強度照射而起始反應(在30ml玻璃小瓶中進行)。2min后終止所述反應并在560nm處讀取吸光度。始終進行對照反應，其中所有步驟和成分都與上述完全相同，除了將所純化的酶替換為等體積的均質緩沖液。用與對照反應相比顯色的百分抑制來表示SOD的活性(抑制越高，SOD活性越高)?；钚詳祿鐖Dl所示。實施例-ll麟雄，薛鄺度好游，薪絲在-10至80'C的溫度范圍內以及實施例IO所述的緩沖組合物(另外在反應混合物中加入50%甘油以防止在低溫下凍結)中檢測所純化的SOD酶。100ml容量的玻璃燒杯中裝滿酒精(在-lO、-5、(TC的溫度下工作)或蒸餾水(在其它溫度下工作)以在檢測SOD時保持反應媒介的溫度。在期望溫度下預平衡反應媒介和酶以避免在達到期望溫度的過程中的時間滯后。如從圖1中可以看出所述酶在(TC顯示最高的活性(87.5%的抑制)。甚至在低至-l(TC時，所述酶仍具有功能。預計所述酶低于-10'C的溫度時，還有功能。如實施例10中所提及，在所有溫度下都一直進行對照反應。實施例-12邀過求變絲凝皮游薪絲染經;j^oz)定泣如Beauchamp和Fridovich的闡述(Anal.Biochem.1971;44:246-287)，通過活性染色在10%聚丙烯酰胺凝膠上定位所純化的SOD。電泳后，用蒸餾水漂洗所述凝膠之后在含2.5mMNBT的50ml磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)中，室溫避光孵育30min。然后將凝膠浸入1.17X10-6M核黃素中持續(xù)20min，然后在光源(Nikon)下曝光。曝光導致02—的成像，其將NBT轉化成可溶的紫色的甲臢(formazan)。如圖4B所示紫色在SOD停留的位置以外的整個凝膠上形成。優(yōu)點本發(fā)明的主要優(yōu)點是1.己經克隆了萎陵菜的可耐高壓加熱的、在零度以下溫度具有功能的SOD基因。2.將從萎陵菜分離的SOD基因在大腸桿菌中表達。3.將來自萎陵菜的基因在大腸桿菌中表達以合成耐高壓加熱的SOD蛋白。4.將來自萎陵菜的基因在大腸桿菌中表達可合成耐高壓加熱且在零度以下溫度具有功能的SOD蛋白。權利要求1.從喜瑪萎陵菜獲取的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA，其為SEQIDNo.2，其中所述cDNA含856個核苷酸堿基。2.如權利要求1的超氧化物歧化酶(SOD)cDNA，其中所述cDNA具有連同編碼前序列和編碼后序列的完整編碼序列。3.超氧化物歧化酶(SOD)基因的編碼cDNA，其為SEQIDNo.3，其中所述編碼cDNA含459個核苷酸堿基。4.超氧化物歧化酶(SOD)多肽，其為SEQIDNo.1，其中所述多肽含152個氨基酸。5.如權利要求4所述的超氧化物歧化酶(SOD)多肽，其中所述多肽能夠耐高壓加熱。6.如權利要求4所述的超氧化物歧化酶(SOD)多肽，其中所述多肽在《1(TC至+8(TC的溫度范圍內具有功能。7.—對用于擴增超氧化物歧化酶(SOD)基因的編碼cDNASEQIDNo.3的引物，其中正向引物為5，-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3，；反向引物為5，-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3，。8.—種鑒定和克隆超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQIDNO.3的方法，所述SEQIDNO.3編碼具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽SEQIDNo.1，其中所述方法包含以下步驟a)從萎陵菜的葉子中分離mRNA;b)根據從歩驟a)獲取的mRNA合成cDNA;c)構建萎陵菜的DNA的cDNA文庫，然后在合適的載體優(yōu)選細菌噬菌體中克隆從步驟b)獲取的cDNA;d)篩選來自步驟c)的所述文庫，然后進行用于鑒定陽性cDNA克隆的初次、第二次和第三次篩選；e)從步驟d)獲取的陽性cDNA克隆中分離DNA;f)利用引物擴增所述DNA，該引物包括正向引物5，-GTTGTAAAACGACGTGCCAGT-3，反向引物5，-CACAGGAAACAGCTATGACC隱3，；h)利用不同引物對通過cDNA末端快速擴增技術(RACE)擴增從步驟e)獲取的cDNA的末端以得到期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全長DNASEQIDN0.2，其中所述引物包含正向引物(GSP1):5，-CCAGTGGATTTGCTAAGCTCATGTCCA-3，反向引物(NES1):5，-GTCATCAGGGTCTGCATGGACAACAAC國3，正向引物(GSP2):5，-ATGGTTGCATGTCAACTGGACCACATT-3，反向引物(NES2):5，-TTGCATGTCAACTGGACCACATTTCAA-3，SMARTIIA寡核苷酸5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3，3，-RACECDS引物A(3，-CDS):5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)3oN-W5，-RACECDS引物(5，-CDS)5，-(T)25NjN-3，通用引物混合物A(UPM):長鏈5，-TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'通用引物混合物A(UPM):短鏈5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，巢式通用引物A(NUP):5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，O利用期望的超氧化物歧化酶(SOD)的全長DNASEQIDNO.2從起始密碼子到中止密碼子設計的一對引物擴增超氧化物歧化酶(SOD)的編碼序列SEQIDNo.3，其中所述引物具有以下序列正向引物5，-ATGGCAAAGGGCGTTGCTGTACTT-3，反向引物5，-TCATCCTTGAAGGCCAATAATACCA-3，j)將從步驟g)獲取的擴增產物克隆到pQE30表達載體中，然后將其轉化到感受態(tài)大腸桿菌細胞中以得到表達構建體；k)通過常規(guī)方法分離質粒DNA，然后通過測序以確認所述SOD基因。9.如權利要求9所述的方法，其中針對所純化的SOD產生所述多克隆抗體并用于根據嫩葉toRNA合成的cDNA文庫的篩選。10.如權利要求9所述的方法，其中采用105噬菌斑形成單位(pfii)用于初次篩選。11.如權利要求11所述的方法，其中從所述初次克隆中獲取了三個強陽性克隆。12.如權利要求12所述的方法，其中采用所述陽性克隆用于第二次篩選，產生大約70%的陽性克隆。13.如權利要求13所述的方法，其中隨機采用所述陽性克隆用于第三次篩選，在第三次篩選后所述克隆產生100%陽性信號。14.如權利要求9所述的方法，其中設計所述RACE引物使得所擴增的5'和3'末端彼此重疊一小段核苷酸。15.如權利要求9所述的方法，其中所述全長SOD基因SEQIDNo.2含856個核苷酸堿基。16.如權利要求16所述的方法，其中所述全長SOD基因SEQIDNo.2具有連同編碼前序列和編碼后序列的完整編碼序列。17.如權利要求9所述的方法，其中所述編碼cDNASEQIDNo.3含459個核苷酸堿基。18.如權利要求18所述的方法，其中所述SOD基因的編碼序列SEQIDNo.3與編碼超氧化物歧化酶(SOD)的聚核苷酸對應。19.一種表達構建體，其包含超氧化物歧化酶(SOD)基因的SEQIDNo.3的核苷酸序列、選擇標記和終止子序列，所述核苷酸序列編碼具有超氧化物歧化酶酶活性的多肽SEQIDNo.1。全文摘要本發(fā)明提供了喜瑪萎陵菜(Potentillaatrosanguinea)的超氧化物歧化酶基因、含編碼超氧化物歧化酶的基因的構建體和產生SOD蛋白的轉化大腸桿菌。文檔編號C12N9/02GK101437940SQ200680054556公開日2009年5月20日申請日期2006年8月1日優(yōu)先權日2006年3月31日發(fā)明者帕拉姆維爾·辛格·阿胡賈,拉什米塔·薩胡,普拉迪普·庫馬爾·巴拉德瓦賈,桑賈伊·庫馬爾申請人:科學與工業(yè)研究委員會