專利名稱：非熒光能量轉(zhuǎn)移的制作方法
非熒光能量轉(zhuǎn)移 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物分子化學(xué)的領(lǐng)域。在某些實(shí)施方案 中，提供了涉及非熒光能量轉(zhuǎn)移的試劑和測定。發(fā)明背景用以獲得關(guān)于生物分子如核酸和蛋白質(zhì)的信息的技術(shù)，在許多不 同的學(xué)科中得到應(yīng)用，包括醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)分支。許多這些技術(shù)包括使用熒光標(biāo)記(label)來產(chǎn)生可檢測信號。例如，已開發(fā)的一類熒光染 料包括能量轉(zhuǎn)移熒光染料。一^:來說，涉及這些染料的能量轉(zhuǎn)移過程 包括相同或不同生物分子中的供體部分(donor moiety)和接納體部分 (acceptormoiety)之間的偶極-偶極共糾目互作用。在這些過程中，當(dāng)將 供體部分和接納體部分定位成足夠接近且相互間取向適當(dāng)時(shí)，從供體 部分發(fā)射的能量就被接納體部分吸收。當(dāng)這一被吸收能量造成接納體 部分發(fā)出熒光時(shí)，就產(chǎn)生可檢測信號。通常采用能量轉(zhuǎn)移熒光染并牛的示例性核酸分析方法包括基于雜 交的測定，如核酸擴(kuò)增程序(例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈置換擴(kuò)增 (SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)展(NASBA)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR))、基于 高密度核酸陣列的方法、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析和核酸測序技術(shù)。 進(jìn)一步說，還已知有多種可采用能量轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)檢測的用以測定其它 類型的生物分子的方法。例如，蛋白質(zhì)可用不同的技術(shù)來檢測和定量， 包括SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、酶測定、基于細(xì)胞的測 定以及多種免疫學(xué)技術(shù)如蛋白質(zhì)印跡法和ELISA。另外，還開發(fā)出了幾種涉及用熒光染料檢測樣品中的多個(gè)成分的 診斷和分析測定法，包括例如流式細(xì)胞術(shù)(Lanier等，(1984) "Human lymphocyte subpopulations identifiedbyusing three-colorimmunofluorescence and flow cytometry analysis: correlation of Leu-2, Leu-3, Leu-7, Leu-8， and Leu-11 cell surface antigen expression (用三色 免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定的人淋巴細(xì)胞亞群Leu-2、 Leu-3、 Leu-7、 Leu-8和Leu-11細(xì)胞表面抗原表達(dá)的相關(guān)性)"，J. Immunol. 132:151-156)和染色體分析(Gray等，(1979) "High resolution chromosome analysis: one and two parameter flow cytometry (高分辨率 染色體分析 一或兩參數(shù)流式細(xì)胞術(shù))"，Chromosoma 73:9-27)以及許多 上述測定法。對于這些測定法，需要同時(shí)采用一套的兩種或多種可光 譜拆分(spectrally resolvable)熒光染料，以便能同時(shí)檢測樣品中的一種 以上的耙標(biāo)物質(zhì)。使用多種染料同時(shí)檢測樣品中的多個(gè)成分，能減少 對樣品中的各個(gè)成分依次進(jìn)行4企測所需的時(shí)間。在多基因座DNA探 針測定的情況下，多種可光譜拆分熒光染料的使用能減少所需的反應(yīng) 管的數(shù)量，從而簡化實(shí)驗(yàn)方案，有利于針對具體應(yīng)用的試劑盒的制造。 例如在自動DNA測序的情況下，多種可光譜拆分熒光染料的使用使 得可以分析單一泳道中的所有四種堿基，從而比單一顏色方法增加了 通量(throughput),消除了泳道間電泳遷移率差異所致的不確定性。在各種多重檢測方法(multiplex detection method)當(dāng)中，使用5，核 酸酶探針、分子信標(biāo)、FRET探針或雜交探針的多重PCR檢測通常包 括將猝滅或未猝滅的熒光探針進(jìn)行集中(pooling),例如以改進(jìn)相對于 在給定反應(yīng)中采用單一探針的方案的測定通量。舉例而言，多重測定 法通常作為診斷程序的 一部分用來檢測荻自患者的樣品中的多種基 因型標(biāo)志(marker)或病原體。在這些測定形式中，隨著反應(yīng)混合物中 探針數(shù)量的增加，來自集中的探針的總體基線或背景熒光也累積增 加。當(dāng)任何單一探針的量增加時(shí)，在幾乎所有測定系統(tǒng)中這一基線焚 光也會增加?；€熒光通常會例如通過降低給定測定的檢測靈敏度和 動態(tài)范圍而對該測定的性能產(chǎn)生不利影響。因此，基線熒光實(shí)際上限 制了特定測定中一次可采用的熒光探針的總數(shù)和/或給定探針的量。發(fā)明概述本發(fā)明提供涉及非熒光能量轉(zhuǎn)移的生物分子和其它試劑。例如，靶標(biāo)生物分子的檢測。使用這些供體部分進(jìn)行這種4t測有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)， 其中一個(gè)是相對于采用熒光供體部分的方法而言背景熒光減少。本發(fā) 明除提供反應(yīng)混合物和多個(gè)方法外，還提供相關(guān)的試劑盒和系統(tǒng)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)基本上非熒光供體部分的 生物分子，該基本上非熒光供體部分在至少一個(gè)接納體部分或報(bào)道部 分(例如熒光染料)與其足夠接近時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰哭D(zhuǎn)移到該接納體 部分，使得該接納體部分響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā)射光線。生物 分子通常包含至少一個(gè)核苷、至少一個(gè)氨基酸、至少一個(gè)糖和/或至少 一個(gè)脂質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，生物分子包含接納體部分和/或至少一個(gè)猝滅劑部分(quenchermoiety)。在一些實(shí)施方案中，基本上非熒光供 體部分和/或接納體部分通過至少一個(gè)接頭部分(linker moiety)連接到生物分子。本文所述的生物分子包括許多不同的實(shí)施方案。舉例而言，在某 些實(shí)施方案中，生物分子包含生物聚合物合成試劑(例如亞磷酰胺)。 在一些實(shí)施方案中，生物分子包含生物聚合物。在這些實(shí)施方案中，體部分。在某些這些實(shí)施方案中，生物聚合物的不同單體單元同時(shí)包 含基本上非熒光供體部分和接納體部分。任選地，基本上非熒光供體 部分和接納體部分不通過至少一個(gè)接頭部分相互連接。進(jìn)一步舉例而言，在某些實(shí)施方案中，生物分子包含至少一個(gè)寡核苷酸或至少一個(gè) 多核苷酸。寡核苷酸通常包含引物核酸或探針核酸(例如雜交探針、5，-核酸酶探針和發(fā)夾探針)。在一些實(shí)施方案中，生物分子包含至少一個(gè) 肽、至少一個(gè)多肽、至少一個(gè)蛋白質(zhì)、至少一個(gè)酶、至少一個(gè)激素或 至少一個(gè)免疫球蛋白。在另 一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括至少一個(gè)核苷酸(例如可延伸核苷 酸和/或終止核苷酸)、至少一個(gè)引物核苷酸和/或至少第一探針核酸(例如雜交探針、5，-核酸酶探針和發(fā)夾探針)的反應(yīng)混合物，其中該核苷 酸、引物核酸或第 一探針核酸中的一個(gè)或多個(gè)包含至少 一個(gè)基本上非 熒光供體部分，該基本上非熒光供體部分在至少一個(gè)接納體部分與其 足夠接近時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰哭D(zhuǎn)移到該接納體部分，使得該接納體部 分響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā)射光線。在一些實(shí)施方案中，該核苷 酸、引物核酸或第一探針核酸包含接納體部分(例如熒光染料)。任選 地，該核苷酸、引物核酸或第一探針核酸包含至少一個(gè)猝滅劑部分。 在某些實(shí)施方案中，基本上非熒光供體部分和/或接納體部分通過至少 一個(gè)接頭部分連接到該核苷酸、引物核酸或第一探針核酸。在一些實(shí) 施方案中，反應(yīng)混合物還包括至少一個(gè)催化核苷酸摻入的生物催化 劑。任選地，基本上非熒光供體部分通過至少一個(gè)接頭部分連接到該 核苷酸、引物核酸或第一探針核酸。在某些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物 包括至少第二探針核酸(例如在一些實(shí)施方案中任選用作雜交探針)， 該第二探針核酸包含接納體部分。在一些這些實(shí)施方案中，第二探針 核酸還包含至少一個(gè)猝滅劑部分。舉例而言，這一反應(yīng)混合物可用于 執(zhí)行各種實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測方案或核酸測序程序，以及用于許多其它可能 的應(yīng)用。在另 一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少第 一生物聚合物合成試劑的 反應(yīng)混合物，該第一生物聚合物合成試劑包含至少一個(gè)基本上非熒光供體部分的生物分子，該基本上非熒光供體部分在至少一個(gè)接納體部 分與其足夠接近時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰哭D(zhuǎn)移到該接納體部分，使得該接納體部分響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā)射光線。在一些實(shí)施方案中， 基本上非焚光供體部分通過至少一個(gè)接頭部分連接到第一生物聚合 物合成試劑。在某些實(shí)施方案中，第一生物聚合物合成試劑包含接納 體部分，該基本上非熒光供體部分和接納體部分不通過至少一個(gè)接頭 部分相互連接。在其它實(shí)施方案中，第一生物聚合物合成試劑包含接 納體部分，該基本上非焚光供體部分和接納體部分通過至少一個(gè)接頭部分相互連接。任選地，固相載體(solid support)包含第一生物聚合物合成試劑。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包括至少第二生物聚合物 合成試劑，該第二生物聚合物合成試劑包含接納體部分和/或至少一個(gè) 猝滅劑部分。進(jìn)一步舉例而言，在某些實(shí)施方案中，第一生物聚合物 合成試劑包含多肽合成試劑，而在其它實(shí)施方案中，第一生物聚合物 合成試劑包含核酸合成試劑(例如亞磷酰胺)。這一反應(yīng)混合物任選用 于例如生物聚合物的合成和/或標(biāo)記。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種檢測靶標(biāo)生物分子的方法。該方法包括(a)將至少一個(gè)探針生物分子(例如免疫球蛋白)結(jié)合到靶標(biāo)生物 分子，其中該探針生物分子包含至少一個(gè)基本上非熒光供體部分和至 少一個(gè)接納體部分(例如熒光染津牛)，該接納體部分接受從該基本上非 焚光供體部分轉(zhuǎn)移來的非熒光能量，并響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā) 射光線。另外，該方法還包括(b)檢測從該接納體部分發(fā)射出的光線， 從而檢測出耙標(biāo)生物分子。在一些實(shí)施方案中，靶標(biāo)生物分子包含靶 標(biāo)核酸，因此該方法包括在進(jìn)行(b)之前和/或在進(jìn)行(b)的過程中擴(kuò)增 至少靶標(biāo)核酸的亞序列。通常，探針生物分子包含生物聚合物。在某 些實(shí)施方案中，生物聚合物的不同單體單元包含基本上非熒光供體部 分和接納體部分。生物聚合物的不同單體單元任選同時(shí)包含基本上非熒光供體部分和接納體部分，該基本上非熒光供體部分和接納體部分 通常通過至少一個(gè)接頭部分相互連接或者不通過至少一個(gè)接頭部分 相互連接。進(jìn)一步舉例而言，在某些實(shí)施方案中，探針(例如雜交探針、 5，-核酸酶探針和發(fā)夾探針)和/或靶標(biāo)生物分子包含核酸。在這些實(shí)施 方案中，(a)通常包括將探針和靶標(biāo)生物分子進(jìn)行雜交。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供另一種檢測靶標(biāo)生物分子的方法。該 方法包括(a)提供至少第 一和第二探針生物分子，其中第 一探針生物分 子包含至少一個(gè)基本上非熒光供體部分，且其中第二探針生物分子包 含至少一個(gè)接納體部分(例如熒光染料)。該方法還包括(b)將第一和第 二探針生物分子結(jié)合到靶標(biāo)生物分子，使得該接納體部分接受從該基 本上非焚光供體部分轉(zhuǎn)移來的非熒光能量，并響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā)射光線。另外，該方法還包括(C)檢測從該接納體部分發(fā)射出的 光線，從而檢測出靶標(biāo)生物分子。在一些實(shí)施方案中，第一探針生物分子上的基本上非熒光供體部分是4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4，-異 硫氰酸酯(DABITC)之外的異硫氰酸酯。在一些實(shí)施方案中，把標(biāo)生物 分子包含靶標(biāo)核酸，該方法包括在進(jìn)行(c)之前和/或在進(jìn)行(c)的過程 中擴(kuò)增至少靶標(biāo)核酸的亞序列。在某些實(shí)施方案中，第一和/或第二探 針生物分子包含免疫球蛋白。在一些實(shí)施方案中，第一探針生物分子、 第二探針生物分子和/或靶標(biāo)生物分子包含核酸。在這些實(shí)施方案中， 第一和/或第二探針生物分子通常包含雜交探針、5，-核酸酶探針和發(fā)夾 探針。在一些這些實(shí)施方案中，(b)包括將第一探針生物分子、第二探 針生物分子和靶標(biāo)生物分子進(jìn)^于雜交。在另 一個(gè)方面，本發(fā)明提供進(jìn)行親近測定(例如脂質(zhì)混合測定)的 方法。該方法包括(a)提供至少第一和第二探針生物分子，其中第一探 針生物分子包含至少一個(gè)基本上非熒光供體部分，且其中第二探針生 物分子包含至少 一個(gè)接納體部分。該方法還包括(b)將第 一和第二探針 生物分子置于相對而言的(relative to one another)第一位置，在該第一 位置處第一和第二探針生物分子相互間足夠接近，使得該接納體部分 接受從該基本上非熒光供體部分轉(zhuǎn)移來的非熒光能量，并響應(yīng)所接受 的非熒光能量而發(fā)射光線。另外，該方法還包括(c)將第一和第二探針 生物分子移動到相對而言的至少第二位置，和(d)在第 一和第二探針生 物分子被移動到第二位置之前、之后和/或之同時(shí)監(jiān)測從該接納體部分 發(fā)射出的光線，從而進(jìn)行該親近測定。通常，第一和/或第二探針生物 分子包含寡核苷酸、免疫球蛋白或脂質(zhì)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供延伸引物核酸的方法。該方法包括將 耙標(biāo)核酸與(a)至少一個(gè)可延伸核苷酸和/或至少一個(gè)終止核苷酸、(b) 至少 一 個(gè)催化核苷酸摻入的生物催化劑和(c)至少 一 個(gè)與靶標(biāo)核酸的 至少亞序列至少部分互補(bǔ)的引物核酸，在催化核苷酸摻入的生物催化 劑能通過將可延伸核苷酸和/或終止核苷酸摻入在被延伸引物核酸的末端來延伸引物核酸以產(chǎn)生至少一個(gè)被延伸引物核酸的條件下進(jìn)行 溫育，其中該引物核酸、可延伸核苦酸和/或終止核苦酸包含至少一個(gè) 基本上非焚光供體部分，該基本上非熒光供體部分在至少一個(gè)接納體 部分與其足夠接近時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰哭D(zhuǎn)移到該接納體部分，使得該 接納體部分響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā)射光線，從而延伸引物核酸。在某些實(shí)施方案中，有多個(gè)被延伸引物核酸得以產(chǎn)生，該方法包 括鑒定被延伸引物核酸中的終止核苷酸，由此從被鑒定的終止核苷酸 可確定靶標(biāo)核酸的堿基序列的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，引物 核酸、可延伸核苷酸和/或終止核苷酸包含接納體部分。在某些實(shí)施方 案中，基本上非熒光供體部分和接納體部分不通過至少一個(gè)接頭部分 相互連接，而在其它實(shí)施方案中，基本上非熒光供體部分和接納體部 分通過至少一個(gè)4妾頭部分相互連接。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生亞磷酰胺的方法。該方法包括(a) 將至少一個(gè)基本上非熒光供體部分連接到包含至少一個(gè)保護(hù)基的化 合物。該基本上非熒光供體部分在至少一個(gè)接納體部分與其足夠接近 時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰哭D(zhuǎn)移到該^^納體部分，使得該接納體部分響應(yīng)所 接受的非熒光能量而發(fā)射光線。該方法還包括(b)連接包含以下化學(xué)式 的基團(tuán) R3 ——〇——p其中R,和R2為獨(dú)立選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊 基、己基、庚基、辛基、壬基和庚基的烷基基團(tuán)；R3為(CH2》CN或 CH3，從而產(chǎn)生亞磷酰胺。示例性的保護(hù)基選自例如三苯曱基(trityl)、 一曱氧基三笨曱基、二甲氧基三苯曱基、菊芋糖基(levulinyl)、芴基曱氧基羰基和二苯甲氧基羰基(benzhydryloxyearbonyl)。在一些實(shí)施方案 中，亞磷酰胺包含以下化學(xué)式在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種商業(yè)方法，該法包括(a)接收來自 客戶的定購至少第一生物分子的定購單，該第一生物分子包含至少一 個(gè)基本上非熒光供體部分，該基本上非熒光供體部分在至少一個(gè)接納 體部分與其足夠接近時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰哭D(zhuǎn)移到該接納體部分，使得該接納體部分響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā)射光線。另外，該商業(yè)方 法還包括(b)按照該定購單將第一生物分子供應(yīng)給客戶。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括至少第一生物分子的試劑盒，該 第一生物分子包含至少一個(gè)基本上非熒光供體部分，該基本上非熒光 供體部分在至少一個(gè)接納體部分與其足夠接近時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰?轉(zhuǎn)移到該接納體部分，使得該接納體部分響應(yīng)所接受的非熒光能量而 發(fā)射光線。在一些實(shí)施方案中，固相載體包含第一生物分子。在某些 實(shí)施方案中，第一生物分子包含接納體部分。在一些這些實(shí)施方案中， 基本上非熒光供體部分和接納體部分不通過至少一個(gè)接頭部分相互 連接，而在其它實(shí)施方案中，基本上非熒光供體部分和接納體部分通 過至少一個(gè)接頭部分相互連接。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括第二 生物分子，該第二生物分子包含接納體部分。任選地，試劑盒包括例 如緩沖液、鹽、金屬離子、催化核苷酸摻入的生物催化劑、焦磷酸酶、甘油、二甲亞砜和/或poly rA中的一個(gè)或多個(gè)。通常，試劑盒包括至 少一個(gè)供包裝至少第一生物分子的容器。
試劑盒包括多個(gè)實(shí)施方案，可用來執(zhí)行許多不同的應(yīng)用。例如在 一些實(shí)施方案中，第一生物分子包含免疫球蛋白，試劑盒包括有關(guān)將 免疫球蛋白結(jié)合到靶標(biāo)表位并4全測免疫球蛋白與耙標(biāo)表位的結(jié)合的 說明。任選地，第一生物分子包含脂質(zhì)，試劑盒包括有關(guān)用脂質(zhì)進(jìn)行 親近測定的說明。在某些實(shí)施方案中，第一生物分子包含引物核酸， 試劑盒包括有關(guān)延伸引物核酸的說明。在一些實(shí)施方案中，第一生物 分子包含可延伸核苷酸和/或終止核苷酸。在某些實(shí)施方案中，第一生 物分子包含第一生物聚合物合成試劑，試劑盒包括有關(guān)用第一生物聚 合物合成試劑合成生物聚合物的說明。在一些這些實(shí)施方案中，第一 生物聚合物合成試劑包含多肽合成試劑。任選地，試劑盒包括至少第 二生物聚合物合成試劑。在一些實(shí)施方案中，第二生物聚合物合成試 劑包含接納體部分。在某些實(shí)施方案中，第一生物聚合物合成試劑包 含核酸合成試劑(例如亞磷酰胺)。在一些實(shí)施方案中，第一生物分子 包含至少第一探針核酸。舉例而言，第一探針核酸任選包含雜交探針、 5，-核酸酶探針或發(fā)夾探針。在一些這些實(shí)施方案中，試劑盒包括包含 至少第二探針核酸，該第二探針核酸包含接納體部分。在某些實(shí)施方 案中，這一第二探針核酸作為雜交探針與第一探針核酸一起用于執(zhí)行 各種雜交探針測定。
在另 一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括(a)至少一個(gè)容器和/或固相載體的 系統(tǒng)，該容器和/或固相載體包含至少一個(gè)生物分子，該生物分子包含 至少一個(gè)基本上非熒光供體部分，該基本上非熒光供體部分在至少一 個(gè)接納體部分與其足夠接近時(shí)能夠?qū)⒎菬晒饽芰哭D(zhuǎn)移到該接納體部 分，使得該接納體部分響應(yīng)所接受的非熒光能量而發(fā)射光線。該系統(tǒng) 還包括(b)至少一個(gè)輻射源，該輻射源設(shè)置成能將電/^茲輻射對準(zhǔn)供體部 分。另外，該系統(tǒng)還包括(c)至少一個(gè)檢測器件，該檢測器件設(shè)置成能 檢測在接納體部分與基本上非熒光供體部分足夠接近時(shí)從接納體部分發(fā)射出的光線。通常，該系統(tǒng)包括至少一個(gè)可操作性地(opembly) 連接到檢測器件的邏輯器件，該邏輯器件包含一個(gè)或多個(gè)用以對所檢 測到的來自接納體部分的光發(fā)射進(jìn)行比例調(diào)整(scale)的指令集。在一 些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包括(d)至少一個(gè)熱調(diào)節(jié)器，該熱調(diào)節(jié)器能與容 器和/或固相載體形成熱傳送(thermally communicate),以調(diào)節(jié)4妻近容器 和/或固相載體處的溫度，和/或(e)至少一個(gè)流體轉(zhuǎn)移器件，該流體轉(zhuǎn) 移器件能將流體轉(zhuǎn)移到和/或轉(zhuǎn)移出容器和/或固相載體。
本文描述的各生物分子、反應(yīng)混合物、方法、試劑盒和系統(tǒng)中的 基本上非熒光供體部分包括多個(gè)實(shí)施方案。例如在一些實(shí)施方案中， 基本上(substantially)非熒光供體部分包括4'，5'-二甲氧基-6-羧基熒光 素、4',5'-二曱氧基-5-羧基熒光素、6-羧基-氨基五氯熒光素或5-羧基-氨基五氯熒光素中的一種或多種。在某些實(shí)施方案中，基本上非熒光 供體部分和接納體部分的峰值可見光吸收相差約100 nm或更大。通
下，來自前者的可檢測絕對熒光發(fā)射與來自后者的可檢測絕對熒光發(fā) 射之比為約1000:1或更大。在某些實(shí)施方案中，基本上非熒光供體部 分是羧基熒光素、1，2-二苯乙烯-2,2，-二磺酸或異硫氰酸酯。在其它實(shí) 施方案中，基本上非熒光供體部分是4-二曱基氨基苯基偶氮苯基-4，-異硫氰酸酯(DABITC)之外的異石克氰酸酯。
在一些實(shí)施方案中，本文所迷的基本上非熒光供體部分和接納體 部分不通過接頭部分相互連接。在其它實(shí)施方案中，本文所述的基本
在一些這些
實(shí)施方案中，接頭部分缺乏以下結(jié)構(gòu):
<formula>formula see original document page 18</formula>其中R4為連接到基本上非熒光供體部分的d.5烷基;R5選自NH、 S和O; &選自烯烴、二烯、炔烴和具有至少一個(gè)不飽和鍵的五元或 六元環(huán)或者與羰基碳連接的稠環(huán)結(jié)構(gòu)；R7包含將接頭部分連接到接納 體部分的官能團(tuán)。
附圖簡述
圖IA-F示出了本發(fā)明一些試劑的某些代表性實(shí)施方案。 圖2示出了在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的5，-核酸酶反應(yīng)中所進(jìn) 行的某些步驟。
圖3示出了在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的涉及發(fā)夾探針的測定中 所進(jìn)行的一些步驟。
圖4示出了在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的涉及雜交探針的測定中 所進(jìn)行的某些步驟。
圖5示出了在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的涉及標(biāo)記引物的測定中 所進(jìn)行的某些步驟。
圖6示出了在根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案的涉及標(biāo)記蛋白質(zhì)的測定 中所進(jìn)行的一些步驟。
圖7示出了在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的脂質(zhì)混合測定中所進(jìn)行 的一些步驟。
圖8這一框圖顯示了在根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的商業(yè)方法中所 進(jìn)行的某些步驟。
圖9這一框圖顯示了用以進(jìn)行親近測定的代表性系統(tǒng)。


圖10是從標(biāo)記上6-羧基熒光素(或6-FAM)、 4'，5'-二曱氧基-5-羧 基熒光素(或5-DmF)或4',5'-二曱氧基-6-羧基熒光素(或6-DmF)的寡核 普酸獲得的重疊光譜的曲線圖。
圖11是圖IO所示坐標(biāo)圖的細(xì)節(jié)摘選圖，顯示了從標(biāo)記上5-DmF 或6-DmF的寡核苷酸的激發(fā)和發(fā)射掃描獲得的重疊光語。
圖12示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的5-和6-DmF-DMT-CX-接頭-亞磷酰胺合成方案中的某些步驟。圖13是顯示5-DmF和6-DmF的檢測的高效液相層析(HPLC)跡線。
圖14是顯示新戊酰5-DmF和新戊酰6-DmF的檢測的HPLC跡線。 圖15是顯示新戊?；?pivalated) DmF+CX-接頭的檢測的HPLC跡線。
圖16是顯示DmF-CX-接頭的檢測的HPLC跡線。 圖17是顯示DmF-CX-接頭-亞磷酰胺的檢測的HPLC跡線。 圖18是顯示DmF-CX-接頭-亞磷酰胺的檢測的HPLC跡線。 圖19是顯示DmF-CX-接頭-亞磷酰胺的檢測的31P NMR i普。 圖20示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的將5-DmF異構(gòu)體和 6-DmF異構(gòu)體相互分離的純化方案中的某些步驟。 圖21是顯示5-DmF的檢測的層析圖。 圖22是顯示6-DmF的檢測的層析圖。
圖23示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的6-DmF-DMT-CX-接頭誦
亞磷酰胺合成方案中的某些步驟。
圖24是顯示新戊酰化6-DmF的檢測的HPLC跡線。
圖25是顯示6-DmF-CX-接頭的檢測的HPLC跡線。
圖26是顯示6-DmF-CX-接頭-亞磷酰胺的檢測的HPLC跡線。
圖27示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的5-DmF-DMT-CX-接頭-
亞磷酰胺合成方案中的某些步^^。
圖28是顯示新戊?；?-DmF的才企測的HPLC跡線。 圖29是顯示5-DmF-CX-接頭的檢測的HPLC跡線。 圖30是從包括標(biāo)記上6-FAM、 5-DmF或6-DmF的供體探針的多
個(gè)雜交探針測定的激發(fā)掃描獲得的重疊光譜的曲線圖。
圖31是已對被檢測熒光激發(fā)掃描進(jìn)行了歸一化的圖30所示重疊
光譜的曲線圖。圖32是從包括標(biāo)記上6-FAM、 5-DmF或6-DmF的供體探針或者 缺乏供體探針的多個(gè)雜交探針測定的發(fā)射掃描獲得的重疊光語的曲線圖。
圖33是從包括標(biāo)記上6-FAM的供體探針的解鏈曲線分析獲得的 重疊光譜的曲線圖。
圖34是從包括標(biāo)記上5-DmF的供體探針的解鏈曲線分析獲得的 重疊光鐠的曲線圖。
PCR analysis)獲得的重疊光譜的曲線圖
重疊光譜的曲線圖。
圖37A示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的5，-核酸酶探針。
圖37B示出了缺乏基本上非熒光供體部分的5，-核酸酶探針。
圖38是從其中使用5，-核酸酶探針來監(jiān)測反應(yīng)的PCR分析獲得的
重疊光譜的曲線圖。
圖39是已對被檢測熒光進(jìn)行了歸一化的圖38所示重疊光譜的曲線圖。
圖41A是從標(biāo)記上LC-Red 610的雜交探針的發(fā)射掃描獲得的光 語的曲線圖。
圖4B是從標(biāo)記上JA-270的雜交探針的發(fā)射掃描獲得的光譜的 曲線圖。
圖41C是從標(biāo)記上CY5的雜交探針的發(fā)射掃描獲得的光譜的曲 線圖。
圖41D是從標(biāo)記上CY5.5的雜交探針的發(fā)射掃描獲得的光譜的曲 線圖。
圖42A是從標(biāo)記上FAM或DmF的雜交探針的發(fā)射掃描(絕對熒 光)獲得的重疊光^"的曲線圖。圖42B是從42A所示發(fā)射掃描獲得的某些重疊光譜的曲線圖，
其中已對熒光發(fā)射進(jìn)行了比例調(diào)整。
圖43A是從涉及標(biāo)記上LC-Red 610的接納體探針和標(biāo)記上FAM 或DmF的供體探針的雜交探針測定的激發(fā)掃描獲得的重疊光譜的曲線圖。
圖43B是從涉及標(biāo)記上LC-Red 610的接納體探針和標(biāo)記上FAM 或DmF的供體探針的雜交探針測定的發(fā)射掃描(絕對熒光)獲得的重 疊光譜的曲線圖。
圖43C是從43B所示發(fā)射掃描獲得的重疊光譜的曲線圖，其中 已對熒光發(fā)射進(jìn)行了比例調(diào)整。
圖44A是從涉及標(biāo)記上JA-270的接納體探針和標(biāo)記上FAM或 DmF的供體探針的雜交探針測定的激發(fā)掃描獲得的重疊光譜的曲線 圖。
圖44B是從涉及標(biāo)記上JA-270的接納體探針和標(biāo)記上FAM或 DmF的供體探針的雜交探針測定的發(fā)射掃描(絕對熒光)獲得的重疊光 譜的曲線圖。
圖44C是從44B所示發(fā)射掃描獲得的重疊光譜的曲線圖，其中
已對熒光發(fā)射進(jìn)行了比例調(diào)整。
圖45A是從涉及標(biāo)記上CY5的接納體探針和標(biāo)記上FAM或DmF
的供體探針的雜交探針測定的激發(fā)掃描獲得的重疊光譜的曲線圖。
圖45B是從涉及標(biāo)記上CY5的接納體探針和標(biāo)記上FAM或DmF 的供體探針的雜交探針測定的發(fā)射掃描(絕對熒光)獲得的重疊光譜的 曲線圖。
圖45C是從45B所示發(fā)射掃描獲得的重疊光譜的曲線圖，其中 已對熒光發(fā)射進(jìn)行了比例調(diào)整。
圖46A是從涉及標(biāo)記上CY5.5的4妄納體4笨針和標(biāo)記上FAM或 DmF的供體探針的雜交探針測定的激發(fā)掃描獲得的重疊光譜的曲線圖。圖46B是從涉及標(biāo)記上CY5.5的接納體探針和標(biāo)記上FAM或 DmF的供體探針的雜交探針測定的發(fā)射掃描(絕對熒光)獲得的重疊光 譜的曲線圖。
圖46C是從46B所示發(fā)射掃描獲得的重疊光語的曲線圖，其中 已對熒光發(fā)射進(jìn)行了比例調(diào)整。
圖47A是從涉及標(biāo)記上LC-Red 610的接納體探針和標(biāo)記上 FAM、 DmF或Dam HEX的供體探針的雜交探針測定的激發(fā)掃描獲得 的重疊光譜的曲線圖。
圖47B是從涉及標(biāo)記上LC-Red 610的接納體探針和標(biāo)記上FAM、 DmF或Dam HEX的供體探針的雜交探針測定的發(fā)射掃描(絕對熒光) 獲得的重疊光譜的曲線圖。
圖48A是從涉及標(biāo)記上CY3.5的接納體探針和標(biāo)記上FAM、DmF 或Dam HEX的供體探針的雜交探針測定的激發(fā)掃描獲得的重疊光譜 的曲線圖。
圖48B是從涉及標(biāo)記上CY3.5的接納體探針和標(biāo)記上FAM、DmF 或Dam HEX的供體探針的雜交探針測定的發(fā)射掃描(絕對熒光)獲得 的重疊光譜的曲線圖。
發(fā)明詳述
I.定義
在詳細(xì)描述本發(fā)明前，要認(rèn)識到的是本發(fā)明并不限于具體的生物 分子、方法、反應(yīng)混合物、組合物、試劑盒或系統(tǒng)，他們是可以改變 的。本說明和所附權(quán)利要求書中用到的單數(shù)形式的名詞也包括復(fù)數(shù)含 義，除非上下文另有清楚規(guī)定。因此，例如"生物分子"一詞包括兩個(gè) 或多個(gè)生物分子的組合。還應(yīng)i人識到，本文所用的術(shù)語目的只在于描 述具體的實(shí)施方案，并不意在限制本發(fā)明。此外，除非另有定義，否
通技術(shù)人員通常理解的含義相同。在對本發(fā)明進(jìn)行描迷和提出權(quán)利要 求時(shí)，以下術(shù)語及其語法變化形式將按下述定義進(jìn)行使用。"5，-核酸酶探針"指在被切割時(shí)能夠產(chǎn)生可檢測信號變化的標(biāo)記 寡核苷酸。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，5，-核酸酶探針包含三個(gè)標(biāo) 記部分，在其中 一個(gè)標(biāo)記從寡核苷酸切割或以其它方式分離后會發(fā)射
強(qiáng)度增加的輻射。例如在一些這些實(shí)施方案中，5，-核酸酶探針在其5， 末端標(biāo)記上猝滅劑部分，在靠近其3'末端處標(biāo)記上成一對的接納體部 分和基本上非熒光供體部分。在某些實(shí)施方案中，5，-核酸酶探針在這 些末端位置之外的一個(gè)或多個(gè)位置有標(biāo)記，或者除了這些末端位置之 外還在一個(gè)或多個(gè)位置有標(biāo)記。當(dāng)探針是完整的時(shí)候，能量轉(zhuǎn)移通常 出現(xiàn)在標(biāo)記部分之間，使得猝滅劑部分至少部分上摔滅來自接納體部 分的熒光發(fā)射。在例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的延伸步驟中，結(jié)合到模板核 酸的5，-核酸酶探針被例如Taq聚合酶的5，-3，核酸酶活性切割，或者 被別的具有這一活性的聚合酶切割，使得來自接納體部分的熒光發(fā)射 不再被猝滅。在其它示例性的實(shí)施方案中，5，-核酸酶探針只包括接納 體部分和基本上非熒光供體部分。當(dāng)這些探針中的所述部分被切割而 相互分離時(shí)，通常出現(xiàn)來自接納體部分的熒光發(fā)射降低。進(jìn)一步舉例 而言，在某些實(shí)施方案中，5，-核酸酶探針包括自身互補(bǔ)性區(qū)域，使得 探針在選定的條件下能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在這些實(shí)施方案中，5，-核酸 酶探針在本文中也被稱為"發(fā)夾探針"?？蛇m應(yīng)于與本文所述基本上3陣 熒光供體部分一起使用的示例性5，-核酸酶探針，在例如以下文獻(xiàn)中也 有描述Gelfand等的美國專利5,210,015,標(biāo)題"HOMOGENEOUS ASSAY SYSTEM USING THE NUCLEASE ACTIVITY OF A NUCLEIC ACID POLYMERASE (使用核酸聚合酶的核酸酶活性的同 源測定系統(tǒng))"，1993年5月11日4受權(quán)；Higuchi的美國專利5,994,056, 標(biāo)題"HOMOGENEOUS METHODS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DETECTION (核酸擴(kuò)增和檢測的同源方法)"， 1999年11月30日授權(quán)；和Higuchi的美國專利6,171,785,標(biāo)題 "METHODS AND DEVICES FOR HEMOGENEOUS NUCLEIC ACIDAMPLIFICATION AND DETECTOR (同源核酸擴(kuò)增和^r測的方法和 裝置)"，2001年1月9日授權(quán)。
"接納體部分，，或"接納體"指能夠接受或吸收從能量源轉(zhuǎn)移來的能 量的部分。在一些實(shí)施方案中，接納體部分在接受了足量的轉(zhuǎn)移能量 時(shí)還能夠發(fā)射能量(例如光和/或熱)。在這些實(shí)施方案中，接納體也稱 為"才艮道部分"或者稱為"報(bào)道分子"。舉例而言，某些接納體部分在接 受了足量的從本文所述基本上非熒光供體部分轉(zhuǎn)移來的非熒光能量 時(shí)會作出響應(yīng)而發(fā)出焚光。示例性的接納體部分包括但不限于各種熒 光團(tuán)如LightCycler -Red 610 (LC-Red 610)、 LC-Red 640、 LC-Red 670、 LC-Red 705、 JA-270、 CY5、 CY5.5等等。
"烷基基團(tuán)"指直鏈、支鏈或環(huán)狀的飽和烴部分，包括所有位置異 構(gòu)體，如曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己基、辛基、壬 基、庚基、l-曱基乙基、l-曱基丙基、2-曱基丙基、l-曱基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、l-乙基丙基、1,2-二曱基丙 基、l-曱基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、],l-二甲基 丁基、1,2-二曱基丁基、1,3-二曱基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二曱基 丁基、3，3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、U,2-三曱基丙基、 1，2,2-三甲基丙基、1-乙基小曱基丙基、l-乙基-2-曱基丙基、正己基、 環(huán)己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基和正癸基。烷基基團(tuán) 通常包含約1-20個(gè)碳原子，更通常包含約2-15個(gè)碳原子。坑基基團(tuán) 可以被取代或未被取代。
"氨基酸，，指能被摻入到肽、多肽或蛋白質(zhì)在的任何單體單元。本 文所用的術(shù)語"氨基酸"包括以下20種天然或遺傳編碼的a-氨基酸 丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨 酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、曱硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。這20 種天然氨基酸的結(jié)構(gòu)在例如Stryer等，Biochemistry,第5版，F(xiàn)reeman and Company (2002)中有顯示。另外的氨基酸如硒半胱氨酸和吡咯賴氨酸也可進(jìn)行遺傳編碼(Stad加an (1996) "Selenocysteine (竭半胱氨 酸)，，，Annu Rev Biochem.65:83-100和Ibba等.(2002) "Genetic code: introducing pyrrolysine (遺傳密碼介紹吡咯賴氨酸)"，Curr Biol. 12(13):R464-R466)。術(shù)語"氨基酸"還包括非天然氨基酸、修飾氨基酸 (例如具有修飾的側(cè)鏈和/或骨架)和氨基酸類似物。參見例如Zhang等， (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells (5-羥色氨酸向哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)中的選擇性摻 入)"，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887， Anderson等， (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon (具 有功能性四倍密碼子的擴(kuò)展遺傳秘密)"，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571， Ikeda等，(2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo (新型組氨酸 類似物的合成及其向體內(nèi)蛋白質(zhì)的有效摻入)"，Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699畫706， Chin等，(2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code (擴(kuò)展的真核生物遺傳密碼)"，Science 301(5635):964-967, James等， (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues (含有光可異才勾孑匕笨 基偶氮苯丙氨酸殘基的核糖核酸酶S突變體的動力學(xué)表征)"，Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991 ， Kohrer等，(2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammaian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins (琥詢和赭石 抑制tRNA向哺乳動物細(xì)胞中的輸入氨基酸類似物向蛋白質(zhì)的位點(diǎn) 特異性插入的一 方法)"，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315 ，Bacher等，(2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue (能夠在對大腸桿菌有毒性的色氨酸類似物上生 長的大腸桿菌突變體的選擇和表征)"，丄Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku等，(2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNASynthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine (突變大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶利用非天 然氨基酸重氮酪氨酸比利用酪氨酸更有效)"，J. Biol. Chem. 275(51 ):40324-40328 和 Budisa 等，(2001) "Proteins w他 {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids (具有作為替^(戈發(fā)色團(tuán)和藥物活性 氨基酸的卩-(p塞吩并吡咯基丙)氨酸的蛋白質(zhì))"，Protein Sci. 10(7):1281-1292。進(jìn)一步舉例而言，氨基酸通常是包括取代或未被取代的氨基基 團(tuán)、取代或未被取代的羧基基團(tuán)和一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈或側(cè)基或者任何這 些基團(tuán)的類似物的有機(jī)酸。示例性的側(cè)鏈包括例如巰基、硒基、磺酰 基、烷基、芳基、酰基、酮基、疊氮基、羥基、肼、氰基、卣代基、 酰肼、烯基、炔基、醚、硼酸(基)(borate)、硼酸(基)(boronate)、磷酸 (基)(phospho)、膦酸(基)(phosphono)、膦、雜環(huán)基、烯酮、亞胺、醛、 酯、硫代酸、羥胺或者任何這些基團(tuán)的組合。其它代表性氨基酸包括 但不限于包含光可活化的交聯(lián)劑的氨基酸、金屬結(jié)合性氨基酸、自旋 標(biāo)記氨基酸、熒光氨基酸、含金屬氨基酸、具有新型官能團(tuán)的氨基酸、 能與其它分子發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)相互作用的氨基酸、光籠化 (photocaged)和/或光可異構(gòu)化的(photoisomerizable)氨基酸、放射性氨 基酸、包含生物素或生物素類似物的氨基酸、糖基化氨基酸、其它碳 水化合物修飾氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的 氨基酸、化學(xué)可切割和/或光可切割的氨基酸、含有碳連接糖 (carbon-linked sugar)的氨基酸、氧化還原活性氨基酸、含有氨基硫代 酸的氨基酸和包含一個(gè)或多個(gè)毒性部分的氨基酸。術(shù)語"擴(kuò)增"在生物分子的情形中指任何能導(dǎo)致某生物分子或一批 生物分子或它們的亞序列的拷貝數(shù)增加的過程。如應(yīng)用于核酸，擴(kuò)增 指產(chǎn)生多個(gè)拷貝的多核苷酸或多核苷酸的一部分，通常是從少量的多 核苷酸(例如單個(gè)多核苷酸分子)產(chǎn)生，其中擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增子通常是可檢測的。多核苷酸的擴(kuò)增涵蓋多個(gè)化學(xué)和酶促過程。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)過程中從一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)拷貝的 靶標(biāo)或模板DNA分子產(chǎn)生多個(gè)DNA拷貝，這是擴(kuò)增的形式。擴(kuò)增并 不限于起始分子的嚴(yán)格復(fù)制。例如，用RT-PCR從樣品中有限數(shù)量的 RNA產(chǎn)生多個(gè)cDNA分子，這是擴(kuò)增的形式。此外，在轉(zhuǎn)錄的過程 中從單個(gè)DNA分子產(chǎn)生多個(gè)RNA分子，這也是擴(kuò)增的形式。術(shù)語"連接"或"結(jié)合"指兩個(gè)或多個(gè)物質(zhì)相互間發(fā)生共價(jià)和/或非 共價(jià)締合的過程，即使該過程只是短暫的。例如在某些實(shí)施方案中， 作為產(chǎn)生亞磷酰胺的方法的 一部分，將基本上非熒光供體部分連接到 化合物。進(jìn)一步舉例而言，在一些本文所述的過程中，探針生物分子 結(jié)合靶標(biāo)生物分子而實(shí)現(xiàn)這些^4示的檢測。"生物分子"指為生物體所產(chǎn)生和/或使用的有機(jī)分子，和/或被用來 分析生物或其成分的有機(jī)分子。示例性的生物分子包括核酸、核苷酸、 氨基酸、多肽、肽、肽片段、糖、脂肪酸、類固醇、脂質(zhì)和這些生物 分子的組合(例如糖蛋白、核糖核蛋白或脂蛋白)。"生物聚合物，，指包括至少兩個(gè)相互連接的單體單元的生物分子。"生物聚合物合成試劑"指可用來合成生物聚合物或其成分的化合 物。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，生物聚合物合成試劑是可用來合 成寡核苷酸或其它核酸的"核酸合成試劑"，如亞磷酰胺或其它試劑。 任選采用的示例性寡核苷酸合成技術(shù)包括磷?；然?phosphoryl chloridate)方法(Michelson等，(1955) J. Chem. Soc. 2632)、磷酸二酯偶 聯(lián)方法(Khorana等，(1956) Chem. & Ind. London 1523)、磷酸三酯方法 (Letsinger等，(1969) J. Am. Chem. Soc. 91(12):3360-3365)、亞磷酸三酯 方法(Letsinger等，(1975) J. Am. Ghem. Soc. 97:3278-3279和Letsinger 等，(1976) J. Am. Chem, Soc. 98:3655-3661)和亞磷酰胺方法(Beaucage 等，(1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862和McBride等，(]983) Tetrahedron Lett. 24:245-248)。進(jìn)一步舉例而言，生物聚合物合成試劑 還包括可用來合成肽或其它蛋白質(zhì)的"多肽合成試劑"(例如t-Boc/Fmoc試劑)。參見例如Chan等(編輯)，F(xiàn)腦c Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach Oxford University Press (2000)和Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press (2002)。生物 聚合物還可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多其它方法合成，如通過化學(xué) 連接法合成(參見例如Hackeng等，(1999) "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology (通過天然化學(xué)連接的蛋白質(zhì)合成通過使用直接了當(dāng)?shù)姆椒〝U(kuò)展范 圍)，，，PNAS %(18):10068-10073)。"補(bǔ)體，，在核酸的情形中指能以反向平行結(jié)合(antiparallel association)方式與某核酸的至少亞序列進(jìn)行組合或者能與該亞序列進(jìn) 行雜交的核酸或其區(qū)段。反向平行結(jié)合可以是在分子內(nèi)，例如以核酸 當(dāng)中的發(fā)夾環(huán)的形式，或者是在分子間，如當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)單鏈核酸相 互雜交時(shí)。某些在天然核酸中不常見的堿基可包括在本文所指的核酸 中，它們包括例如次黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤等等。互補(bǔ)性不需要是完 美的；例如穩(wěn)定的雙鏈體或三鏈體可含有錯配堿基對或未配對堿基。 也就是說，當(dāng)核酸只是"部分互補(bǔ)"時(shí)，反向平行結(jié)合無論是在分子內(nèi) 還是在分子間，在某些條件下都可出現(xiàn)。核酸化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員能 通過對多個(gè)變量的經(jīng)驗(yàn)判斷確定例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性，所述變 量如互補(bǔ)性區(qū)域的長度、互補(bǔ)性區(qū)域中的堿基組成和序列、離子強(qiáng)度，解鏈溫度(Tm)和錯配堿基對的發(fā)生率。"表位"指抗原上能被免疫球蛋白或T細(xì)胞受體識別和結(jié)合的位點(diǎn)。"可延伸核苷酸"指例如在催化核苷酸摻入的生物催化劑所催化的 反應(yīng)中， 一旦其被摻入到核苷酸聚合物中時(shí)至少一個(gè)其它核苷酸可加 入或共價(jià)鍵合到其上的核苷酸?？裳由旌塑账岬膶?shí)例包括脫氧核糖核香酸術(shù)語"延伸，，在核酸的情形中指一個(gè)或多個(gè)核苷酸加入或以其它方 式摻入到給定核酸中的過程。
"被延伸引物核酸，，指已加入了或以其它方式摻入了 (例如共價(jià)結(jié) 合了 )一個(gè)或多個(gè)另外的核苷酸的引物核酸。
"熒光染料"指能夠吸收來自能量源的能量并響應(yīng)該被吸收能量而 發(fā)射光線的化合物。在一些實(shí)施方案中，某些熒光染料在本文所述的 生物分子中充當(dāng)接納體部分。
"發(fā)夾探針"指可用來實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸檢測的寡核苷酸，其包括至少 一個(gè)自身互補(bǔ)性區(qū)域，使得探針在選定的條件下能夠形成發(fā)夾或環(huán)結(jié) 構(gòu)。通常，發(fā)夾探針包括一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記部分。在一個(gè)示例性的實(shí)施 方案中，接納體部分和基本上非熒光供體部分在發(fā)夾探針中相互間定 位成使得這些部分之間的能量轉(zhuǎn)移基本上只在探針為發(fā)夾構(gòu)象時(shí)才 能出現(xiàn)。在其它實(shí)施方案中，發(fā)夾探針除包括接納體部分和基本上非 焚光供體部分外，還包括猝滅劑部分。在一些這些實(shí)施方案中，這些 部分在探針中定位成使得猝滅劑部分至少部分上猝滅當(dāng)探針為發(fā)夾 構(gòu)象時(shí)由接納體部分和基本上非熒光供體部分之間的能量轉(zhuǎn)移所產(chǎn) 生的本來可檢測的信號。相反，當(dāng)這些實(shí)施方案中的探針不為發(fā)夾構(gòu) 象時(shí)，由接納體部分和基本上非熒光供體部分之間的能量轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生 的信號通常是可檢測的。因此，在一些這些實(shí)施方案中發(fā)夾探針的作
用類似于分子信標(biāo)。發(fā)夾探針在某些實(shí)施方案中還可充當(dāng)5，-核酸酶探 針或雜交探針。
"激素"指生物所產(chǎn)生的、能在其在生物的產(chǎn)生部位之外的部位對 生物產(chǎn)生特異性作用的生物分子。激素通常由多細(xì)胞生物的內(nèi)分泌系 統(tǒng)產(chǎn)生， 一般對細(xì)胞活性施加刺激性或抑制性作用。激素也可體外合 成。
"雜交探針，，指包括至少一個(gè)可用來實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸檢測的標(biāo)記部分 的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，雜交探針成對起作用。例如在一些 這些實(shí)施方案中，該雜交探針對中的第一雜交探針在其3，-末端處或接近其3，-末端處包括至少一個(gè)基本上非熒光供體部分，而第二雜交探針 在其5，-末端處或接近其5，-末端處包括至少一個(gè)接納體部分(例如
LC畫Red610、 LC-Red 640、 LC-Red 670、 LC-Red 705、 JA-270、 CY5 或CY5.5)。探針通常設(shè)計(jì)成使得當(dāng)兩個(gè)探針都與耙標(biāo)核酸或模板核酸 雜交時(shí)(例如在PCR過程中)，第一雜交探針會結(jié)合第二雜交探針的5-末端或上游，使它們足夠接近以便在基本上非焚光供體部分和接納體 部分之間出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生可檢測的信號。通常，第二雜交探 針在其3，-末端上還包括磷酸(基)或其它基團(tuán)，以防止它在PCR過程 中發(fā)生延伸。在某些實(shí)施方案中，雜交探針對在一個(gè)探針的5'-末端處 或接近5'-末端處包括基本上非熒光供體部分,在另一個(gè)探針的3'-末 端處或接近3'-末端處包括接納體部分。在另一步示例性實(shí)施方案中， 雜交探針對中的一個(gè)雜交探針包括至少一個(gè)基本上非熒光供體部分 和至少一個(gè)接納體部分，而另一個(gè)雜交探針則包含至少一個(gè)猝滅劑部 分。在這個(gè)實(shí)施方案中，這些部分在兩個(gè)探針上定位成使得當(dāng)兩個(gè)探 針都與靶標(biāo)核酸雜交時(shí)，猝滅劑部分會猝滅從接納體部分發(fā)射出的熒 光。
在一個(gè)多核苷酸與另 一個(gè)多核苷酸(通常是反向平行多核苷酸)的 堿基配對相互作用中，核酸會發(fā)生"雜交"或"退火"，導(dǎo)致形成通常被 稱為雜交復(fù)合物的雙鏈體或其它更高級結(jié)構(gòu)。反向平行多核苷酸之間 的一級相互作用通常是遵照Watson/Crick和/或Hoogsteen型相互作用 的堿基特異性相互作用，例如A/T和G/C。并不要求兩個(gè)多核苷酸在 其整個(gè)長度上具有100%互補(bǔ)性來實(shí)現(xiàn)雜交。在一些方面，雜交復(fù)合 物可從分子內(nèi)相互作用形成，或者可從分子間相互作用形成。雜交因 多種得到充分表征的力而產(chǎn)生，包括氫鍵合、溶劑排斥和堿基堆積。 有關(guān)4亥酉吏雜交的詳盡才旨南可見于Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology~Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分第2章,"Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays (雜交原理和核酸探針測定策略概 述)"，Elsevier (1993)。
"免疫球蛋白"或"抗體"指基本上由至少 一 個(gè)免疫球蛋白基因或至 少一個(gè)免疫球蛋白基因的片段所編碼的，能參與與配體的特異性結(jié)合 的多肽。該術(shù)語包括天然形式以及片段和衍生物。在本文所用該術(shù)語 的范圍內(nèi)的片段包括通過用各種肽酶消化產(chǎn)生的片段如Fab、 Fab'和 F(ab)'2片段，通過化學(xué)離解產(chǎn)生的片段，通過化學(xué)切割產(chǎn)生的片段以 及以重組方式或別的人工方式設(shè)計(jì)出的片段，只要該片段仍然能夠特 異性結(jié)合耙標(biāo)分子。例如通過p笪菌體展示所產(chǎn)生的典型重組片段，包 括單鏈Fab片段和scFv ("單鏈可變區(qū)")片段。在該術(shù)語范圍內(nèi)的衍生 物包括在序列上已作修飾、但仍然能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的抗體(或 其片段)，這些抗體包括種間嵌合和人源化抗體。本文所用的抗體或免 疫球蛋白可通過任何已知的技術(shù)產(chǎn)生，包括得自天然B淋巴細(xì)胞、雜 交瘤、重組表達(dá)系統(tǒng)或噬菌體展示的細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲物。
"接頭部分"或"接頭"指能將某化合物、某取代基或某部分共價(jià)連 接或非共價(jià)連接(例如離子連接)到例如固相載體、另一化合物、另一
基團(tuán)或另一部分的化學(xué)部分。例如，接頭任選將標(biāo)記(例如基本上非熒 光供體部分、接納體部分)連接到生物分子。接頭通常是雙功能化學(xué)部 分，在某些實(shí)施方案中它們包含可切割連接，該可切割連接能被例如 熱、酶、化學(xué)物劑和/或電磁輻射所切割，以從例如固相載體或另一化 合物釋放出物質(zhì)或化合物。精心選擇接頭可讓切割在與化合物和測定 方法的穩(wěn)定性相配的適當(dāng)條件下進(jìn)行。 一般來說，接頭除了例如將化 學(xué)部分(例如基本上非熒光供體部分和接納體部分)連接在一起或者使 這些部分之間保持一定的最小距離或其它空間關(guān)系之外，并沒有特異 性的生物活性。但是，可將接頭的成分選定成能影響^f皮連接的化學(xué)部 分的一些性質(zhì)，如三維構(gòu)象、凈電荷和/或疏水性。有關(guān)接頭分子的另 外的描述見于例如Lyttle等，(1996) Nucleic Acids Res. 24(14):2793， Shchepino等,(2001) Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids 20:369，Doronina et al (2001) Nucleosides, Nucleotides, & Nucleic Acids 20:1007, Trawick等，(2001) Bioconiugate Chem. 12:900, Olejnik等， (1998) Methods in EnzvmologY 291:135, Pljevaljcic等，(2003) J. Am. Chem. Soc. 125(12):3486 ， Ward, et. al.,美國專利4,711,955, Stavrianopoulos,美國專利4，707，352和Stavrianopoulos，美國專利 4，707，440。
"脂質(zhì)"指包含脂肪酸、固醇和/或類異戊二烯化合物的水不溶性生 物分子。示例性的脂質(zhì)基團(tuán)包括脂肪酸(例如油酸、棕櫚酸和硬脂酸)、 中性脂肪(例如椰子油和牛油)、磷脂(例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、 磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇)、鞘脂(例如神經(jīng)鞘髓磷脂)、糖酯(例如腦 苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂)、類固醇(例如膽固醇)和薛(例如精油和類胡蘿卜 素)。在例如 Vance等,Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes,第4版，Elsevier Science (2002)中也對脂質(zhì)進(jìn)行了描述。
"脂質(zhì)混合測定"指涉及檢測當(dāng)將脂質(zhì)相互組合或集中時(shí)脂質(zhì)的一 種或多種性質(zhì)的測定。舉例而言， 一些這些測定涉及將包含各標(biāo)記部 分的各個(gè)膜融合在一起，所述標(biāo)記部分如本文所述的基本上非熒光供 體部分、接納體部分和/或猝滅劑部分。脂質(zhì)混合測定在例如以下文獻(xiàn) 中也有描述Blumenthal等,(2002) "Fluorescent lipid probes in the study of viral membrane fUsion (病毒膜融合研究中的熒光脂質(zhì)探針)"，Chem Phys Lipids 116:39-55, Hoekstra等，(1993) "Lipid mixing assays to determine fusion in liposome systems (用以測定脂質(zhì)體系統(tǒng)中的融合的 脂質(zhì)；容液測定)"，Methods Enzvmol 220:15-32, Hoekstra (1990) "Fluorescence assays to monitor membrane fUsion: potential application in biliary lipid secretion and vesicle interactions (用以監(jiān)觀'J膜融合的熒光測 定在膽汁脂質(zhì)分泌和嚢泡相互作用中的潛在應(yīng)用)"，H印atoogy 12:6] S-66S, Stegmann等，(1989) "Protein-mediated membrane fUsion (蛋 白質(zhì)介導(dǎo)的膜融合)"，Annu Rev Biophvs Biophys Chem 18:187-211， Hoekstra等,(1984) "Fluorescence method for measuring the kinetics offusion between biological membranes (觀'J量生物膜之間的融合'的動力學(xué) 的熒光方法),，，Biochemistry 23:5675-5681, Struck等，(1981) "Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion (共振能量壽爭移用 于監(jiān)測膜融合的用途)"，Biochemistry 20:4093-4099和Stegmann等， (1993) "Evaluation of viral membrane fUsion assays. Comparison of the octadecylrhodamine dequenching assay with the pyrene excimer assay (病 毒膜融合測定的評估。八癸基羅丹明去猝滅測定與芘激態(tài)分子測定的 比較)"，Biochemistry 32:11330-11337。
"單體單元"或"單體"指能進(jìn)行聚合的化學(xué)化合物。示例性的單體 單元包括能聚合形成核酸的核苷酸、能聚合形成蛋白質(zhì)的氨基酸和能 聚合形成多糖的單糖。
"混合物"指兩種或多種不同成分的組合。"反應(yīng)混合物"指包含能 參與和/或促進(jìn)給定的反應(yīng)或測定的分子的混合物。舉例而言，擴(kuò)增反 應(yīng)混合物通常包括含有進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑的溶液，且通常含有 在合適緩沖液中的引物、催化核苷酸摻入的生物催化劑、dNTP和二 價(jià)金屬陽離子。反應(yīng)混合物如含有進(jìn)行反應(yīng)所需的所有試劑則稱為完 全反應(yīng)混合物，如只含有所需試劑的子集(subset)則稱為不完全反應(yīng)混 合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到各反應(yīng)成分常規(guī)上是作為單獨(dú)溶液儲 藏的，每種溶液含有總成分的子集，其原因是為了方便、儲藏穩(wěn)定性 起見，或者是為了可以根據(jù)應(yīng)用情況對成分濃度進(jìn)行調(diào)整，他們還會 認(rèn)識到，在反應(yīng)前可將各反應(yīng)成分進(jìn)行組合產(chǎn)生出完全反應(yīng)混合物。 此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，各反應(yīng)成分是單獨(dú)包裝進(jìn)行市售的， 且有用的市售試劑盒可含有各反應(yīng)或測定成分的任何子集，該子集包 括本發(fā)明的生物分子。
"部分(moiety)"或"基團(tuán)(group)"指將某物如分子劃分成的各份子 (portion)中的一份子(例如官能團(tuán)或取代基)。例如，本發(fā)明的生物分子 包括至少一個(gè)基本上非焚光供體部分。術(shù)語"監(jiān)測"在給定的過程、反應(yīng)或測定的情形中指對該過程、反
應(yīng)或測定或者它們的組成部分(component)的 一個(gè)或多個(gè)方面或性質(zhì) 進(jìn)行定期或連續(xù)的觀察、檢測、試驗(yàn)和/或定量。舉例而言，在某些基 于PCR的測定中，在各反應(yīng)循環(huán)過程中定期或連續(xù)檢測從接納體部分 發(fā)射出的光線的強(qiáng)度。監(jiān)測過程通常至少部分上是自動的。
"非熒光供體部分"指能夠?qū)⒁环N或多種形式的激發(fā)能量轉(zhuǎn)移、發(fā) 射或供給到一個(gè)或多個(gè)接納體部分的部分，但該能量不是可檢測熒光 形式的能量。"基本上非熒光供體部分"指能夠?qū)⒁环N或多種形式的激 發(fā)能量轉(zhuǎn)移、發(fā)射或供給到一個(gè)或多個(gè)接納體部分的部分，但大體上 或幾乎沒有從供體發(fā)射出可檢測的熒光。例如，熒光部分和基本上非 熒光供體部分在大體上相同的濃度下，來自前者的可檢測絕對熒光發(fā) 射與來自后者的可檢測絕對熒光發(fā)射之比通常為約500:1或更大，更 通常為約1000:1或更大，甚至更通常為約1500:1或更大(例如約 2000:1、約2500:1、約3000:1、約3500:1、約4000:1、約4500:1或約 5000:1)。示例性的基本上非熒光供體部分包括4'，5'-二甲氧基-6-羧基 熒光素、4',5'-二曱氧基-5-羧基熒光素、6-羧基-氨基五氯熒光素和5-羧基-氨基五氯熒光素。非熒光供體部分和基本上非熒光供體部分在從 另一能量源(例如光源和/或熱源)吸收足量的能量時(shí)通常會作出響應(yīng)而 發(fā)射非熒光激發(fā)能量。另外，4秦納體部分通常能夠吸收從這些供體部 分發(fā)射出的激發(fā)能量并作出響應(yīng)而發(fā)出熒光。
術(shù)語"非熒光能量"指被發(fā)射熒光形式的能量之外的能量。 術(shù)語"核酸"或"多核苷酸"指可被對應(yīng)于核糖核酸(RNA)或脫氧核 糖核酸(DNA)聚合物或它們的類似物的聚合物。這包括核苷酸的聚合 物如RNA和DNA及它們的+務(wù)飾形式、肽核酸(PNA)和鎖核酸 (LNA )。在某些實(shí)施方案中，核酸可以是包含多種單體類型，例如 同時(shí)包含RNA亞單位和DNA亞單位的聚合物。核酸可以是或者可以 包括例如染色體或染色體區(qū)段、載體(例如表達(dá)載體)、表達(dá)盒、棵DNA 或RNA聚合物、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的產(chǎn)物、寡核苷酸、探針和引物。核酸可以是例如單鏈核酸、雙鏈核酸或三鏈核酸，且并不限于任 何具體的長度。除非另外指明，否則具體的核酸序列除了包含或編碼 任何明確指明的序列外，還任選包含或編碼互補(bǔ)序列。
核酸并不限于具有天然多核苷酸序列或結(jié)構(gòu)、天然骨架和/或天然 核瞽酸間連鍵的分子。例如，含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也被包括
在這個(gè)定義內(nèi)(Jenkins等，(1995) Chem. Soc. Rev.第169-176頁)。進(jìn)一 步舉例而言，盡管核酸通常會含有磷酸二酯鍵，但在一些情況下也包 括具有替代(altemate)骨架的核酸類似物。這些骨架包括但不限于磷酰 胺連鍵(Beaucage等，(993) Tetrahedron 49(]0):1925及其中的參考文 獻(xiàn)；Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl等，(1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger等，(1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai 等，(1984) Chem. Lett. 805; Letsinger等，(1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470和Pauwels等，(1986) Chemica ScritJta 26:1419)、硫代磷酸酉旨 連鍵(Mag等，(1991) Nucleic Acids Res. 19:1437和美國專利 5,644,048)、 二硫代磷酸酯連鍵(Briu等，(1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321) 、 O-曱基氨基磷酉臾酯(phophoroamidite)連鍵(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992))和肽核酸骨架和連鍵(Egholm (1992)丄Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier等，H992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008; Nielsen (1993) Nature 365:566和Carlsson等，(1996) Nature 380:207)。 其它類似核酸包括具有帶正電荷骨架的核酸(De叩cy等，(l995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097)、具有非離子骨架的核酸(美國專利 5，386，023、 5,637,684、 5,602,240、 5,216,141和4,469,863; Angew(簡) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger等，(1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger等，(1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; ASC Symposium Series 580， "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y. S. Sanghvi和P. Dan Cook (編輯)，第2和第3章； Mesmaeker等,(1994) Bioorganic & Medicinal Chem, Lett. 4: 395; Jeffs等，(1994) J. BiomolecularNMR34:17: Tetrahedron Lett. 37:743 Q996)) 和具有非核糖骨架的核酸，這些具有非核糖骨架的核酸包括美國專利 5,235,033和5,034,506及ASC Symposium Series 580， Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Y. S. Sanghvi ,口 P. Dan Cook (纟扁 輯)，第6和第7章中所述的那些具有非核糖骨架的核酸。在例如 Rawls, C & E News, 1997年6月2日，第35頁中也描述了幾種核酸類 似物。可進(jìn)行核糖-磷酸骨架的修飾，以促進(jìn)另外的部分如標(biāo)記部分的 加入，或者改變這種分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半壽期。
除了核酸中通常存在的天然雜環(huán)堿基(例如腺嘌呤、鳥。票呤、胸腺 嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)外，核酸類似物還包括具有非天然雜環(huán)堿基或 其它修飾堿基的核酸。舉例而言，某些用于核苷酸中充當(dāng)解鏈溫度(TJ 修飾劑的堿基任選包括在內(nèi)。例如，這些堿基中的一些包括7-脫氮嘌 呤(例如7-脫氮噪呤或7-脫氮腺噪呤)、吡唑并[3,4-d]嘧啶和丙炔基-dN (例如丙炔基-dU或丙炔基-dC)。參見例如Seela的美國專利S,"0,303, 標(biāo)題 "SYNTHESIS OF 7誦DEAZA-2，-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES (7-脫氮-2，-脫氧鳥苷核苷酸的合成)"，，1999年11月 23曰授權(quán)。其它代表性的雜環(huán)^喊基包括例如次黃嘌呤、黃嘌呤；2-氨 基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯噤呤、次黃嘌呤和黃嘌呤的8-氮雜衍生物；腺噤呤、烏嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基 -6-氯噪呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的7-脫氮-8-氮雜衍生物；6-氮雜 胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基 胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧 啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟曱基尿嘧啶；5-曱氧基曱基尿嘧 啶；5-乙炔基尿嘧啶和5-丙炔基尿嘧啶。在例如Seela等，(1991) Helv. Chim. Acta 74:1790、 Grein等，(1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971—976和Seela等，(1999) Helv. Chim. Acta 82:1640中還描述了許多 非天然堿基。修飾堿基和核苷酸的另外的實(shí)例還描述于例如以下文獻(xiàn)中
Froehler等的美國專利5,484,908，標(biāo)題"OLIGONUCLEOTIDES
CONTAINING 5-PROPYNYL PYRIMIDINES (含有5-丙炔基嘧咬的寡
核苷酸)"，1999年1月16日授權(quán)；Froehler等的美國專利5,645,985,標(biāo)
題"ENHANCED TRIPLE-HELIX AND DOUBLE-HELIX
FORMATION WITH OLIGOMERS CONTAINING MODIFIED
PYRIMIDINES (具有含修飾嘧n定的寡聚物的增強(qiáng)型三螺旋和雙螺旋
結(jié)構(gòu))"，1997年7月8日授權(quán)；FroeWer等的美國專利5,830,653,標(biāo)題
"METHODS OF USING OLIGOMERS CONTAINING MODIF正D
PYRIMIDINES (使用含有修飾嘧啶的寡聚物的方法)"，1998年11月3
日授權(quán)；Kochkine等的美國專利6,639,059,標(biāo)題"SYNTHESIS OFBICYCLO NUCLEOSIDES ([2.2.1]雙環(huán)核苷的合成)"，2003年
10月28日授權(quán)；Skouv的美國專利6,303,315，標(biāo)題"ONE STEP
SAMPLE PREPARATION AND DETECTION OF NUCLEIC ACIDS
IN COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES (復(fù)雜生物樣品中的核酸的一
步樣品制備和檢測)"，2001年10月16日授權(quán)和Kochkine等的美國專
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