專利名稱：：抑制人類免疫缺陷病毒(hiv)感染的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及HIV感染的抑制。更具體地，本發(fā)明涉及新的HIV相互作用宿主因子的鑒定，并涉及使用這些宿主因子鑒定抑制HIV感染的新化合物的方法。
背景技術(shù)：
：人類免疫缺陷病毒(HIV)是屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的慢病毒。據(jù)估計(jì)，世界上有多達(dá)90%的艾滋病例是通過性接觸和懷孕途徑傳播HIV的。當(dāng)接觸到傳染性體液(如精液、陰道分泌物或血液)時(shí)，這種傳播通過穿過性器官或胎盤粘膜屏障引發(fā)。其余的艾滋病例是由于輸入HIV污染的血液、靜脈注射吸毒者共用針頭、在侵入性的過程中意外接觸到HIV污染的體液以及傳染性病毒能夠直接接觸易感性人組織的其它情況。目前用來治療HIV感染和艾滋病的藥物不能令人滿意。當(dāng)以有效藥用濃度使用治療HIV感染的普通藥物(如AZT或HIV蛋白酶抑制劑)時(shí)，它們的毒性或不良副作用與其抗病毒活性是不相容的。由于病毒基因組的高突變能力，病毒^f艮快就會(huì)產(chǎn)生對(duì)當(dāng)前藥物的抵抗性并且在群體中擴(kuò)散。因此，在本領(lǐng)域中仍然需要更好的用于預(yù)防和治療艾滋病和HIV感染的備選化合物和新的治療靶標(biāo)。本發(fā)明解決了這種需要以及其它需要。發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供了抑制HIV感染的試劑的鑒定方法。這些方法包括篩選受試化合物以鑒定一種或多種調(diào)節(jié)化合物，所述調(diào)節(jié)化合物下調(diào)由選自表2-4中所列的多核苷酸編碼的HIV相互作用宿主因子的生物學(xué)活性或表達(dá)水平，然后檢查鑒定到的調(diào)節(jié)化合物抑制HIV感染的能力。在一些方法中，所使用的HIV相互作用宿主因子是三十四肽重復(fù)序列1(IFIT1)、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白o(hù)c(PITPNot)或者混合語系激酶3(MLK3)。一些方法使用MLK3，并篩選受試化合物抑制MLK3激酶活性或其表達(dá)的能力。在一些方法中，通過監(jiān)測(cè)報(bào)道基因在HIVLTR啟動(dòng)子控制下在HIV感染細(xì)胞中的表達(dá)來檢查調(diào)節(jié)化合物抑制HIV感染的能力。例如，HIV感染的細(xì)胞可以是表達(dá)l3-半乳糖苷酶報(bào)道基因的Hela-CD4-0gal細(xì)胞。在一些方法中通過HIV-IIIb病毒林感染細(xì)胞。在一些其它方法中，通過比較接觸調(diào)節(jié)化合物的人工改造的HIV允許細(xì)胞和沒有接觸調(diào)節(jié)化合物的對(duì)照細(xì)胞中的HIV復(fù)制來檢查調(diào)節(jié)化合物抑制HIV-1感染的能力。在一些方法中，所使用的HIV允許細(xì)胞是Hela-T4-PGalHIV細(xì)胞。在一些方法中，通過p24抗原酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或反轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定來監(jiān)測(cè)HIV復(fù)制。在一些其它方法中，通過比較使用化合物處理的宿主細(xì)胞和不使用化合物處理的對(duì)照宿主細(xì)胞中的假病毒產(chǎn)生來檢查化合物抑制HIV感染的能力。在一些方法中，所使用的宿主細(xì)胞是293THEK細(xì)胞。在一些方法中，使用能夠在細(xì)胞中產(chǎn)生HIV假病毒的假病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。一些篩選方法使用的HIV相互作用宿主因子是酶。在這些方法中，所測(cè)定的生物學(xué)活性通常是酶活性。一些方法使用的HIV相互作用宿主因子是激酶，如MLK3。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制受試者體內(nèi)HIV感染的方法。這些方法包括對(duì)受試者施用包含抑制HIV相互作用宿主因子的生物學(xué)活性或表達(dá)有效量的化合物的藥物組合物。HIV相互作用因子由選自表2-4中所列的多核苷酸編碼。一些方法中使用抑制三十四肽重復(fù)序列l(wèi)(IFITl)、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白o(hù)c(PITPNoc)或者混合i瞽系激酶3(MLK3)的生物學(xué)活性或表達(dá)的化合物。一些方法中使用的治療化合物抑制MLK3的激酶活性，如K252a或CEP1347。通過參考說明書和權(quán)利要求書的其余部分可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示無激酶活性的MLK3(K144R)對(duì)HIV感染HeLaCD40gal細(xì)月包的影響。4吏用編碼野生型MLK3、無、激酶活性的MLK3(K144R)的cDNA，或者對(duì)照質(zhì)粒以及HIV-LTR控制下的螢光素酶報(bào)道基因共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24小時(shí)后以HIV-IIIb感染。3天后通過^f吏用BriteGlo測(cè)量螢光素酶活性來評(píng)估感染。無激酶活性的突變體不能增加感染，這突出顯示出激酶功能對(duì)于從野生型MLK3中觀察到的增加是必需的。數(shù)據(jù)顯示為相對(duì)于陰性對(duì)照質(zhì)粒的增加倍數(shù)，并且是四個(gè)獨(dú)立測(cè)定的概括，每種測(cè)定重復(fù)兩次。圖2顯示MLK3過表達(dá)對(duì)HIV轉(zhuǎn)錄的影響。以作為對(duì)照，使用編碼野生型MLK3的cDNA或?qū)φ召|(zhì)粒(pcDNA3)以及HIV-LTR控制下的螢光素酶報(bào)道基因(LTRLuc)和Tat表達(dá)載體(Tat)或?qū)φ蛰d體Sport6-GFP(S6G)共轉(zhuǎn)染HeLaCD4|3gal細(xì)胞，以評(píng)估依賴或不依賴于Tat的轉(zhuǎn)錄。2天后通過使用BriteGlo測(cè)量螢光素酶活性來評(píng)估轉(zhuǎn)錄。MLK3的表達(dá)增加了荄光素i^農(nóng)賴于Tat的轉(zhuǎn)錄，但是對(duì)不依賴于Tat的轉(zhuǎn)錄影響極小。數(shù)據(jù)顯示為MLK3(如MLK3/Tat/LTRLuc)相對(duì)于陰性對(duì)照質(zhì)粒(如pcDNA3/Tat/LTRLuc)的平均增加倍數(shù)，并且是兩種獨(dú)立測(cè)定的概括，每種測(cè)定重復(fù)兩次。圖3A-3D顯示針對(duì)MLK3的siRNA抵抗HIV感染的效力。A:轉(zhuǎn)染入HeLaCD4Pgal細(xì)胞的單個(gè)MLK3siRNA對(duì)HIV感染的影響；B:靶定MLK3的siRNA引起的HeLaCD4Pgal細(xì)胞內(nèi)源性MLK3水平的顯著耗盡；C:通過電穿孔入Jurkat細(xì)胞的單個(gè)MLK3siRNA對(duì)HIV感染的影響；D:針對(duì)MLK3的siRNA引起的Jurkat細(xì)胞中內(nèi)源性MLK3水平的耗盡。數(shù)據(jù)顯示為相對(duì)于對(duì)照GL2siRNA偏差的感染抑制或細(xì)胞毒性百分比，是至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)有12個(gè)重復(fù)孔)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。詳述I.概述下文的實(shí)施例中所詳細(xì)描述，本發(fā)明人使用Hela-CD4-egal細(xì)胞和HIV-IIIb篩選了集中的siRNA文庫(Qiagen)和代表15,000個(gè)獨(dú)特基因的cDNA文庫(Origene)。選擇來自siRNA篩選命中的96個(gè)基因(其擊倒能抑制HIV感染)進(jìn)行后續(xù)研究。這些包括兩種已知的HIV相互作用宿主因子Furin和Rad23。另一個(gè)通過篩選鑒定的命中是Pak3，它在美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/650,789中被公開。幾乎所有選中的siRNA命中在最初的測(cè)定中被重新證實(shí)，但是62.5%具有嚴(yán)重毒性。在最初的96個(gè)命中中，36個(gè)被重新證實(shí)，并且顯示出比它們?cè)贖eLa-CD4-Pgal細(xì)胞中的毒性效應(yīng)更強(qiáng)的抗HIV的效力。這些命中如表2所示。在cDNA篩選中，選擇HIV感染的89個(gè)增強(qiáng)子進(jìn)行后續(xù)研究，包括檢查額外的cDNA制備物以及序列確認(rèn)。在這89個(gè)命中中，13個(gè)在重新確認(rèn)過程中都繼續(xù)顯示出HIV感染的增強(qiáng)。這些確認(rèn)的命中如表3所示。本發(fā)明人還通過酵母雙雜交篩選鑒定到了另外一些可能在HIV感染過程中起作用的宿主因子。如下文的實(shí)施例4所詳細(xì)描述，本發(fā)明人^f吏用HIV-1HXB2Vpr作為誘斜，篩選了克隆入GAL4表達(dá)載體(Clontech)的人白細(xì)胞cDNA文庫，以鑒定新的相互作用宿主細(xì)胞因子。Vpr是一種HIV輔助蛋白質(zhì)，它對(duì)于在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的病毒復(fù)制是必需的，并增加在T細(xì)胞和T細(xì)胞系中的病毒復(fù)制。使用濾器舉起測(cè)定法(filterliftassay)測(cè)定來自篩選的陽性集落的P-半乳糖苷酶活性以進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用。從篩選中鑒定到的一種Vpr相互作用配偶體為異肽酶T(IsoT)，其詳細(xì)信息公布于美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/673,623。其它的篩選7命中如本文表4所示。通過siRNA篩選、cDNA篩選和酵母雙雜交篩選所鑒定的宿主分子在本文稱為"HIV相互作用宿主因子"。這些宿主因子可以在HIV感染的各個(gè)階段起非常重要的作用。它們還可以提供能夠用于篩選抑制HIV感染的化合物的新靶標(biāo)。接下來的部分提供使用這些宿主因子鑒定新的抗-HIV試劑的進(jìn)一步指南。II.定義除非另有定義，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常的理解具有相同的含義。下面的參考文獻(xiàn)給技術(shù)人員提供了本發(fā)明所使用的4艮多術(shù)語的一般定義OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology,Smithetal.(eds.)，OxfordUniversityPress(修訂版,2000);DictionaryofMicroBiologyandMolecularBiology,Singletonetal.(Eds.)，JohnWiley&Sons(第三版，2002);和ADictionaryofBiology(OxfordPaperbackReference),MartinandHine(Eds.)，OxfordUniversityPress(第四版，2000)。此外，提供如下定義以幫助讀者實(shí)施本發(fā)明。術(shù)語"試劑"包括任何物質(zhì)、分子、元素、化合物、實(shí)體或其組合。它包括但不限于，例如蛋白質(zhì)、多肽、小有機(jī)分子、多糖、多核苷酸等等。它可以是天然產(chǎn)物、合成化合物，或者化合物，或者兩種或多種物質(zhì)的組合。除非另有說明，術(shù)語"試劑"、"物質(zhì)"和"化合物，，可以互換使用。本文所用的術(shù)語"類似物，，指在結(jié)構(gòu)上與參考分子類似，但是通過用備選取代團(tuán)取代參考分子中的特定取代基，以定向和可控制的方式修飾的分子。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員期望類似物與參考分子相比表現(xiàn)出相同、類似或改良的用途。為了鑒定具有改良特征(如對(duì)目標(biāo)分子的更高的結(jié)合親和性)的已知化合物的變體，類似物的合成與篩選是制藥化學(xué)中的一種公知的方法。如本文所使用地，"接觸"有其普通含義，指組合兩種或多種分子(例如，試劑和多肽)，或者種分子與細(xì)胞(例如試劑和細(xì)胞)。接觸可以在體外發(fā)生，例如在試管或其它容器中組合兩種或多種試劑，或者組合試劑和細(xì)胞或細(xì)胞裂解物。接觸還可以發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)或原位，例如通過在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)編碼兩種多肽的重組多核苷酸，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞裂解物中接觸這兩種多肽。本文所用的"異源序列"或"異源多核苷酸"是來自特定宿主細(xì)胞外源的序列，或者來自同源但是與初始形式相比受到改變的序列。因此，宿主細(xì)胞內(nèi)的異源多核苷酸包括宿主細(xì)胞內(nèi)源的被改變的多核苷酸。異源序列的改變可以通過諸如如下方式產(chǎn)生使用限制酶處理多核苷酸從而產(chǎn)生能夠有效連接到啟動(dòng)子上的多核苷酸片段。諸如定點(diǎn)誘變的技術(shù)也可用于改變異源多核苷酸。當(dāng)提及蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)序列時(shí)，術(shù)語"同源，，指它們天然或人工地來源于共同的祖先蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)序列。類似地，當(dāng)核酸和/或核酸序列天然或人工地來源于共同的祖先核酸或核酸序列時(shí)，它們是同源的。通常由兩個(gè)或多個(gè)核酸或蛋白質(zhì)(或其序列)之間的序列相似性來推斷同源性。用不同而不同，但是常規(guī)僅僅使用25%序列相似性來建立同源性。也可以用更高水平的序列相似性(例如，30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或更高)來建立同源性。本文所用的"宿主細(xì)胞"指異源多核苷酸(例如表達(dá)載體)導(dǎo)入的原核或真核細(xì)胞。異源多核苷酸可以通過任何方式(例如，轉(zhuǎn)染、電穿孔、磷酸釣沉淀、微注射、轉(zhuǎn)化、病毒感染等等)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。術(shù)語"HIV相互作用宿主因子"指本發(fā)明人所鑒定的在促進(jìn)HIV感染或生命周期中起作用的宿主基因或它們編碼的多肽。如表2-4所示，這些因子包括其擊倒導(dǎo)致抑制HIV復(fù)制的宿主分子和其過表達(dá)導(dǎo)致增強(qiáng)HIV感染的分子。此外，此術(shù)語還包括在物理上與HIV病毒感染必需的HIV輔助蛋白質(zhì)Vpr相互作用的宿主因子。兩個(gè)核酸序列或氨基酸序列背景下的術(shù)語"序列同一性"指當(dāng)在特定的比較窗口中比對(duì)產(chǎn)生最大一致性時(shí)這兩個(gè)序列中相同的殘基。"比較窗口"指至少大約20個(gè)、通常大約50到約200個(gè)、更通常大約100到150個(gè)連續(xù)位置的區(qū)段，在其中可以最優(yōu)比對(duì)兩個(gè)序列后將一個(gè)序列與參考序列的相同數(shù)目的連續(xù)位置相比較。序列比對(duì)方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的?？梢酝ㄟ^Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.8:443的比對(duì)算法、Pearson和Lipman(1988)Proc,Nat.Acad.SciU.S.A.85:2444的相似性搜索方法、這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(包括但不限于Intelligentics，MountainView，CA的PC/Gene程序中的CLUSTAL，以及WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceMadison博士,Wis.，U.S.A.中GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA或TFASTA)進(jìn)行序列的最優(yōu)比對(duì)。還可以通過檢視和手動(dòng)比對(duì)進(jìn)行比對(duì)。"實(shí)質(zhì)同一的"核酸或氨基酸序列指使用上文所描述的程序(例如BLAST)用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)計(jì)算得到的與參考序列具有至少90%序列同一性的核酸或氨基酸序列。序列同一性優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少98%，最優(yōu)選至少99%。優(yōu)選地，實(shí)質(zhì)同一性存在于至少大約50個(gè)殘基長(zhǎng)的序列區(qū)域，更優(yōu)選至少大約100個(gè)殘基長(zhǎng)的區(qū)域，最優(yōu)選地，序列的至少大約150個(gè)殘基是實(shí)質(zhì)同一的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列在編碼區(qū)全長(zhǎng)上是實(shí)質(zhì)同一的。關(guān)于參考蛋白質(zhì)或其片段的生物學(xué)活性的術(shù)語"調(diào)節(jié)"是指此蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或其它生物學(xué)活性的改變。例如，調(diào)節(jié)可以引起參考蛋白質(zhì)表達(dá)水平、蛋白質(zhì)的酶促修飾(例如磷酸化)、結(jié)合特性(例如，與靶標(biāo)多核苷酸的結(jié)合)或者參考蛋白質(zhì)的其它任何生物學(xué)、功能性或免疫性質(zhì)的增加或減小。例如，活性的改變可以由編碼參考蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的增加或減小引起，或者由編碼此蛋白質(zhì)的mRNA的穩(wěn)定性引起，或者由參考蛋白質(zhì)的翻譯效率或其它生物學(xué)活性的改變引起。這種改變還可以是由于調(diào)控參考蛋白質(zhì)的另一分子(例如，使參考蛋白質(zhì)磷酸化的激酶)的活性引起。對(duì)參考蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)可以是上調(diào)(即激活或刺激)或下調(diào)(即抑制或阻抑)。參考蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)子作用方式可以是直接的，例如通過與這個(gè)蛋白質(zhì)或編碼它的基因結(jié)合，也可以是間接的，例如通過結(jié)合和/或修飾(例如，酶促修飾)調(diào)節(jié)參考蛋白質(zhì)的另一個(gè)分子。術(shù)語"受試者"包括哺乳動(dòng)物，尤其是人。此外它還包括其它非人類動(dòng)物，如奶牛、馬、綿羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴子。參考分子的"變體"指在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性上與整個(gè)參考分子或其片段基本類似的分子。因此，假如兩個(gè)分子具有類似的活性，那么即使其中一個(gè)分子與另一個(gè)分子的組成或二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)不同，或者氨基酸殘基序列不同，也可以把它們認(rèn)為是如此處所用的術(shù)語變體。ffl,篩選HIV感染的新調(diào)節(jié)子-一般方案本發(fā)明人鑒定的HIV相互作用宿主因子為篩選抑制HIV感染的化合物提供了新的靶標(biāo)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中各種眾所周知的生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)或測(cè)定來實(shí)施本發(fā)明。這些技術(shù)描述于，例如，HandbookofDrugScreening,Seethala等人(編輯)，MarcelDekker(第一版，2001);HighThroughputScreening:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology,190)，Janzen(編輯)，HumanaPress(第一版，2002);CurrentProtocolsinImmunology,Coligan等人(編輯)，JohnWiley&SonsInc(2002);Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(第三版，2001);以及Brent等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons公司(ringbou編輯，2003)。一般地，首先篩選試劑對(duì)表2-4中所示的多核苷酸編碼的HIV相互作用宿主因子的生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)能力("笫一步測(cè)定步驟")。然后通常在存在HIV相互作用宿主因子的情況下，進(jìn)一步篩選鑒定到的調(diào)節(jié)劑抑制HIV感染的能力("第二步檢查步驟，，)。取決于方法中所使用的HIV相互作用宿主因子，可以在第一步中測(cè)定HIV相互作用宿主因子不同生物學(xué)活性的調(diào)控。例如，可以測(cè)定試劑與HIV相互作用宿主因子的結(jié)合?？梢詼y(cè)定試劑調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子表達(dá)，例如，轉(zhuǎn)錄或翻譯的活性。還可以測(cè)定試劑調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子的表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)水平，例如，翻譯后4務(wù)飾或蛋白酶解的活性。在第一步測(cè)定步驟中可以篩選試劑對(duì)HIV相互作用宿主因子的生物學(xué)活性的上調(diào)或下調(diào)能力。一旦鑒定到抑制HIV相互作用宿主因子的試劑，通常要進(jìn)一步檢查其抑制HIV感染的能力。經(jīng)常需要這種進(jìn)一步的檢查步驟以證實(shí)它們對(duì)HIV相互作用宿主因子的調(diào)節(jié)作用確實(shí)會(huì)引起對(duì)HIV感染的抑制。例如，需要進(jìn)一步檢查抑制表2-4所示的HIV相互作用宿主因子生物學(xué)活性的試劑，以確定這種調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致抑制或降低HIV感染。在第一步測(cè)定步驟和第二步檢查步驟中，可以使用完整的HIV相互作用宿主因子或其片段。還可以使用具有與HIV相互作用宿主因子實(shí)質(zhì)同一的序列的分子。在篩選中還可以類似地使用HIV相互作用宿主因子的類似物或功能衍生物。在這些測(cè)定中可以使用的片段或類似物通常保留HIV相互作用宿主因子的一種或多種生物學(xué)活性(例如，如果在第一步測(cè)定步驟中使用的HIV相互作用宿主因子是激酶，那么保留激酶活性)。還可以使用包含這些片段或類似物的融合蛋白來篩選試劑。HIV相互作用宿主因子的功能衍生物通常會(huì)有氨基酸缺失和/或插入和/或置換，但是保持一種或多種生物活性，因此它們也可用于實(shí)踐本發(fā)明的篩選方法?？梢酝ㄟ^對(duì)HIV相互作用宿主因子進(jìn)行蛋白酶解裂解，然后使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所周知的常規(guī)純化程序制備功能衍生物。備選地，可以通過只表達(dá)保留HIV相互作用宿主因子一種或多種生物活性的HIV相互作用宿主因子片段的重組DNA技術(shù)來制備功能衍生物。IV.受試化合物使用本發(fā)明的方法可以篩選的試劑或化合物包括多肽、P-轉(zhuǎn)角模擬物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯并二氮雜萆、寡聚N-取代的甘氨酸、寡聚氨基甲酸酯、多肽、糖、脂肪酸、類固醇、噤呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。一些試劑是成分子，其余為天然分子。試劑取自多種來源，包括合成或天然化合物文庫。可以以逐步方式合成，為多種類型^:合物產(chǎn)生組合文庫?？梢酝ㄟ^WO95/12608、WO93/06121、WO94/08051、WO95/35503和WO95/30642中所描述的編碼合成文庫(ESL)方法構(gòu)建化合物大的組合文庫。也可以通過噬菌體展示方法(參見，例如，Devlin,WO91/18980)產(chǎn)生肽文庫?？梢詮纳虡I(yè)來源獲取或者在本領(lǐng)域收集得到細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫。已知的藥學(xué)試劑可以進(jìn)行直接或隨機(jī)化學(xué)修飾，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化，從而制備結(jié)構(gòu)類似物。肽或其它化合物的組合文庫可以是完全隨機(jī)的，在任何位置都沒有序列偏好性或恒定的。或者組合文庫可以是有偏向性的，即序列內(nèi)的一些位置保持不變或者選自有限數(shù)目的可能性。例如，在一些情況下，核苷酸或氨基酸殘基在一個(gè)確定的類(如疏水性氨基酸、親水性殘基、立體偏好性(小的或大的)殘基、傾向于形成用于交聯(lián)的半胱氨酸、用于SH-3結(jié)構(gòu)域的脯氨酸、用于磷酸化位點(diǎn)的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或組氨酸，或者嘌呤)中是隨機(jī)化的。試劑可以是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或其片段?？梢詮奶烊粊碓?例如細(xì)胞或組織裂解物)獲得這種試劑。還可以通過諸如商品途徑或常規(guī)方法產(chǎn)生的cDNA文庫制備多肽試劑文庫。試劑還可以是肽，例如大約5到大約30個(gè)氨基酸的多肽，優(yōu)選5大約到大約20個(gè)氨基酸，尤其優(yōu)選大約7到大約15個(gè)氨基酸。肽可以是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的消化產(chǎn)物、隨機(jī)肽或"偏向性"隨機(jī)肽。在一些方法中，試劑是多肽或蛋白質(zhì)。試劑還可以是核酸。核酸試劑可以是天然產(chǎn)生的核酸、隨機(jī)核酸或"偏向性"隨機(jī)核酸。例如，可以像上文描述蛋白質(zhì)時(shí)那樣類似地使用原核或真核基因組的消化產(chǎn)物。在一些優(yōu)選的方法中，試劑是小分子有機(jī)化合物，如分子量不大于大約1000或不大于大約500的化合物。優(yōu)選地，改造并使用高通量測(cè)定來篩選這種小分子。在一些方法中，可以容易地使用上文所描述的小分子試劑的組合文庫來篩選抑制HIV感染的小分子化合物。許多測(cè)定可用于這種篩選，例如描述于Schultx(1998)BioorgMedChemLett8:2409-2414;Weller(1997)Mo1Divers3:61-70;Fernandes(1998)CurrOpinChemBiol2:597-603;以及Sittampalam(1997)CurrOpinChemBiol1:384-91。還可以基于上文討論的HIV相互作用宿主因子或其片段的結(jié)構(gòu)研究產(chǎn)生將要使用要求保護(hù)的方法篩選的試劑文庫。這種結(jié)構(gòu)研究容許鑒定更可能與HIV相互作用宿主因子相結(jié)合的試劑?？梢酝ㄟ^多種方式(例如，晶體結(jié)構(gòu)和分子建模)研究HIV相互作用宿主因子的三維結(jié)構(gòu)。使用X射線晶體學(xué)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法是本領(lǐng)域公知的。參見PhysicalBio-chemistry,VanHolde，K.E.(Prentice-Hall，新澤西1971)，221-239頁,以及PhysicalChemistrywithApplicationstotheLifeSciences,D.Eisenberg&D.C.Crothers(BenjaminCummings，MenloPark1979)。HIV相互作用宿主因子結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)建模提供了設(shè)計(jì)篩選HIV感染調(diào)節(jié)子的試劑的另一種方法。分子建模的方法在文獻(xiàn)中有所描述，例如，標(biāo)題為"Systemandmethodformolecularmodelingutilizingasensitivityfactor"的美國(guó)專利號(hào)5,612,894，以及標(biāo)題為"Molecularmodelingmethodandsystem"的美國(guó)專利號(hào)5,583,973。此外，還可以通過中子衍射和核磁共振(NMR)確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。參見，例如，PhysicalChemistry,第四版Moore，W.J.(Prentice-Hall，新澤西1972)，以及NMRofProteinsandNucleicAcids,K.Wuthrich(Wiley-Interscience，紐約1986)。本發(fā)明的調(diào)節(jié)子還包括與表2-4中的HIV相互作用宿主因子特異性結(jié)合的抗體。這些抗體可以是單克隆或多克隆抗體。這些抗體可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法產(chǎn)生。例如，非人單克隆抗體(如小鼠或大鼠源)可以通過使用表2-4中的HIV相互作用宿主因子或其片段免疫動(dòng)物產(chǎn)生(參見Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,第三版，2000)?？梢詮奶烊粊碓?、通過肽合成或重組表達(dá)獲得這種免疫原?？梢酝ㄟ^重組DNA技術(shù)將非人抗體的CDR區(qū)連接到人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生小鼠抗體的人源化形式。參見Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，10029-10033(1989)和WO90/07861?？梢?吏用噬菌體展示方法獲得人抗體。參見，例如，Dower等人，WO91/17271;McCafferty等人，WO92/01047。在這些方法中，制備噬菌體文庫，其中成員在其外表面展示不同的抗體?？贵w通常展示為Fv或Fab片段。通過表2-4種HIV相互作用宿主因子的親和富集選擇具有期望特異性的噬菌體展示抗體。還可以從具有編碼人免疫球蛋白基因座的至少一個(gè)區(qū)段和失活的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物制備抗HIV相互作用宿主因子的人抗體。參見，例如，Lonberg等人，W093/12227(1993);Kucherlapati，WO91/10741(1991)。可以通過竟?fàn)幮越Y(jié)合實(shí)驗(yàn)選擇人抗體，或相反，人抗體與特定小鼠抗體具有相同的表位特異性。這種抗體特別可能具有小鼠抗體的有用的功能性質(zhì)。還可以用免疫原性試劑免疫的人血清的形式提供人多克隆抗體。任選地，可以使用HIV相互作用宿主因子或其片段通過親和純化來濃縮這種多克隆抗體。V.篩選HIV相互作用宿主因子的調(diào)節(jié)子一般地，首先篩選試劑對(duì)本發(fā)明人所鑒定的HIV相互作用宿主因子的生物活性的調(diào)節(jié)能力。在這一篩選步驟中可以使用許多測(cè)定系統(tǒng)。這種篩選可以使用體外測(cè)定系統(tǒng)或基于細(xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)。在這一篩選步驟中，可以才艮據(jù)其與HIV相互作用宿主因子的結(jié)合、其改變HIV相互作用宿主因子的表達(dá)水平或其調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子的其它生物活性(如，酶活)來篩選試劑。1.調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子的結(jié)合活性在一些方法中，第一個(gè)篩選步驟中確定試劑和HIV相互作用宿主因子的結(jié)合?？梢酝ㄟ^多種方法測(cè)定試劑和HIV相互作用宿主因子的結(jié)合，這些方法包括，例如，體外標(biāo)記的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定、電泳遷移率變動(dòng)分析、蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫測(cè)定、功能測(cè)定(磷酸化測(cè)定，等)，或其他類似方法。參見，如美國(guó)專利4,366,241;4,376,110;4,517,288和4,837,168;此外還有Bevan等人，TrendsinBiotechnology13:115-122，1995;Ecker等人，Bio/Technology13:351-360,1995;以及Hodgson,Bio/Technology10:973-980，1992?？梢酝ㄟ^檢測(cè)與HIV相互作用宿主因子的直接結(jié)合來鑒定試劑，如，通過針對(duì)HIV相互作用宿主因子的抗體與HIV相互作用宿主因子免疫共沉淀。也可以通過檢測(cè)指示試劑和HIV相互作用宿主因子相結(jié)合的信號(hào)(如，熒光淬滅或FRET)來鑒定試劑。竟?fàn)帨y(cè)定提供了鑒定與HIV相互作用宿主因子特異性結(jié)合的試劑的合適形式。在這種形式中，通過和已知與HIV相互作用宿主因子相結(jié)合的化合物進(jìn)行竟?fàn)幎Y選試劑。已知的結(jié)合化合物可以是合成化合物。它也可以是特異識(shí)別HIV相互作用宿主因子的抗體，例如，針對(duì)HIV相互作用宿主因子的單克隆抗體。如果試劑抑制已知結(jié)合HIV相互作用宿主因子的結(jié)合，那么試劑也可以和HIV相互作用宿主因子結(jié)合。已知許多類型的竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定，例如固相直接或間接放射免疫測(cè)定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測(cè)定(EIA)、夾層竟?fàn)帨y(cè)定(參見Stahli等人，MethodsinEnzymology9:242-253，1983)、固相直接生物素-親和素EIA(參見Kirkland等人，J.Imminol.137:3614-3619，1986)、固相直接標(biāo)記測(cè)定、固相直才妄標(biāo)記夾層測(cè)定(參見，Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratoryMannual，冷泉港出版社，第三版，2000)、使用125I的固相直接標(biāo)記RIA(參見Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7-15,1988)、固相直接生物素-親和素EIA(Cheuang等人，Virolody176:546-552，19卯)，以及直接標(biāo)記RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77-82,19卯)。一般地，這類測(cè)定涉及使用結(jié)合于固體表面的純化多肽或具有未標(biāo)記的試劑或標(biāo)記的參考化合物之一的細(xì)胞。通過確定試劑存在情況下固體表面或細(xì)胞中結(jié)合的標(biāo)記物的量來測(cè)定竟?fàn)幮砸种?。通常試劑是過量的。通過竟?fàn)帨y(cè)定鑒定的調(diào)節(jié)試劑包括與參考化合物結(jié)合相同表位的試劑和與參考化合物結(jié)合的表位足夠接近以發(fā)生空間位阻的鄰近表位相結(jié)合的試劑。通常，當(dāng)竟?fàn)幵噭┻^量存在時(shí)，它可以將參考化合物與共同的靶標(biāo)多肽特異性結(jié)合抑制至少50%或75%。篩選測(cè)定可以是不可溶或可溶形式。一個(gè)不可溶測(cè)定的例子是將HIV相互作用宿主因子或其片段固定在固相基質(zhì)上。接著將固相基質(zhì)與試劑接觸足夠允許試劑結(jié)合的時(shí)間。從固相基質(zhì)上洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，在固相上結(jié)合的試劑的存在允許鑒定該試劑。該方法可以進(jìn)一步包括將結(jié)合的試劑從固相基質(zhì)上洗脫，從而分離出試劑的步驟?；蛘?，不固定細(xì)胞宿主因子外，將試劑結(jié)合到固相基質(zhì)然后加入HIV相互作用宿主因子?？扇軠y(cè)定包括上文所述的一些組合文庫篩選法。在可溶測(cè)定形式下，試劑和HIV相互作用宿主因子均不與固相支持體結(jié)合?？梢酝ㄟ^如HIV相互作用宿主因子或試劑或兩者的熒光變化來測(cè)定HIV相互作用宿主因子或其片段與試劑的結(jié)合。熒光可以是固有的或通過熒光團(tuán)標(biāo)記任一組分而賦予。在一些結(jié)合測(cè)定中，可以以標(biāo)記的實(shí)體提供HIV相互作用宿主因子、試劑或第三種分子(例如，抗HIV相互作用宿主因子的抗體)，即，共價(jià)結(jié)合或連接到可檢測(cè)的標(biāo)記或基團(tuán)，或可交聯(lián)的基團(tuán)，以方便在特定情況下多肽的鑒定、檢測(cè)和定量。這些可檢測(cè)基團(tuán)可以包含可檢測(cè)的多肽基團(tuán)，例如，可測(cè)定的酶或抗原表位。備選地，該可檢測(cè)基團(tuán)可以選自許多其它可檢測(cè)基團(tuán)或標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記(如，125I、32P、"S)或化學(xué)發(fā)光或熒光基團(tuán)。類似地，可檢測(cè)基團(tuán)可以是底物、輔因子、抑制劑或親和配體。2.調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子的其它活性試劑和HIV相互作用宿主因子的結(jié)合表明該試劑可以是HIV相互作用宿主因子的調(diào)節(jié)子。它還表明該試劑可以通過作用于HIV相互作用宿主因子抑制HIV感染。因此，可以檢查與HIV相互作用宿主因子結(jié)合的試劑調(diào)節(jié)HIV感染相關(guān)活性的能力(即上文概述的第二步檢查步驟)。備選地，可以進(jìn)一步檢查與HIV相互作用宿主因子相結(jié)合的試劑，以確定它是否確實(shí)調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子的生物學(xué)活性(例如，酶活)?？梢酝ㄟ^活性測(cè)定檢查測(cè)這種調(diào)節(jié)的存在、性質(zhì)和程度。更常見的是，可以獨(dú)立使用這種活性測(cè)定來鑒定調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子活性的試劑(即不用首先測(cè)定它們與HIV相互作用宿主因子結(jié)合的能力)。一般而言，該方法涉及向含有HIV相互作用宿主因子樣品中加入試劑，該樣品存在或不存在測(cè)定HIV相互作用宿主因子生物學(xué)活性(例如，如果HIV相互作用宿主因子是酶，則為酶學(xué)活性)所必需的其它分子或試劑，并確定HIV相互作用宿主因子的生物活性變化。如果HIV相互作用宿主因子具有已知的生物學(xué)或酶學(xué)功能(如，激酶活性或蛋白酶活性)，那么在第一步篩選步驟中所監(jiān)測(cè)的生物學(xué)活性也可以是該HIV相互作用宿主因子的特定生物化學(xué)或酶學(xué)活性。這些包括激酶(如，NTRK1、CCRK、PAK7、MAP3K14、MARK14、TYK2和MLK3)，蛋白酶(如CTSO)，鱗酸酶(如，LOC91443)，或表2-4中所示的其它酶(如，NMT1、ALDH3A1、PDE1B和CAT)。在笫一步篩選步驟中可以使用這些分子的任一種。這些分子的酶活測(cè)定方法在本領(lǐng)域中眾所周知，并常規(guī)地實(shí)踐。篩選中所使用的底物可以是已知可以被酶(如激酶)進(jìn)行酶促修飾的分子，或者可從給定類的酶的候選底物中容易被鑒定的分子。在一個(gè)典型的實(shí)施方案中，用于篩選的HIV相互作用宿主因子是MLK3激酶，首先篩選試劑調(diào)節(jié)MLK3激酶自身磷酸化或其對(duì)底物進(jìn)行磷酸化的能力?？梢酝ㄟ^監(jiān)測(cè)在化合物存在時(shí)MLK3的自身磷酸化來檢查受試化合物對(duì)MLK3激酶活性的影響，使用如Gallo等人，JBiolChem.269:15092-100，1994;Leung等人，JBiolChem.273:32408-15，1998;Zhang等人，JBiolChem.276:45598-603，2001和Durkin等人，Biochemistry43:16348-55，2004中所述的方法。也可以通過監(jiān)測(cè)在受試化合物存在時(shí)MLK3對(duì)底物的磷酸化來鑒定抑制MLK3激酶活性的化合物。例如，通過體外測(cè)定(如Cha等人，JCellSci.117:751-60，2004中所述)可以檢查化合物對(duì)golgin-160的MLK3磷酸化的影響。許多其他監(jiān)測(cè)蛋白激酶活性的方法在本領(lǐng)域中也有描述。這些包括如，Chedid等人，J.Immunol.147:867-73，1991;Kontny等人，EurJPharmacol.227:333-8,1992;Wang等人，Oncogene13:2639-47，1996;Murakami等人，Oncogene14:2435-44，1997;Pyrzynska等人，JNeurochem.74:42-51,2000;Berry等人，BiochemPharmacol.62:581-91，2001;Cai等人，ChinMedJ(Engl)l14:248-52,2001中所報(bào)道的方法?？梢允褂煤托薷倪@些方法中任何一種來測(cè)定試劑對(duì)為激酶的HIV相互作用宿主因子如NTRK1、CCRK、PAK7、MAP3K14、MARK14、TYK2和MLK3的調(diào)節(jié)作用。此外，本領(lǐng)域中可獲得許多激酶的底物。參見，如www.emdbiosciences.com和www.proteinkinase.de。jt匕夕卜，^T以寸吏用高i量形式篩選激酶的適當(dāng)?shù)孜?。例如，可以使用Kinase-Glo⑧發(fā)光激酶測(cè)定(Promega)或其它激酶底物篩選試劑盒(如CellSignalingTechnology,Beverly,Massachusetts所開發(fā)的)鑒定激酶底物。除了用于篩選調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子酶活或其它生物學(xué)活性的試劑的測(cè)定外，活性測(cè)定還包含在體內(nèi)和體外篩選HIV相互作用宿主因子的表達(dá)水平的變化。可以通過在培養(yǎng)細(xì)胞系中瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)載體在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中檢查HIV相互作用宿主因子表達(dá)的調(diào)節(jié)。例如，可以測(cè)定受試化合物抑制處于HIV相互作用宿主因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如，啟動(dòng)子序歹'j)控制下的報(bào)道基因(如，螢光素酶基因)表達(dá)的能力。編碼表2-4中所示的HIV相互作用宿主因子的基因在本領(lǐng)域中均已表征。許多這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動(dòng)子序列)均已^皮描述。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，以測(cè)定啟動(dòng)子活性。報(bào)道基因通常編碼具有易于測(cè)定酶活性的多肽，所述活性在宿主細(xì)胞中天然缺乏。真核生物啟動(dòng)子典型的報(bào)道多肽包括，例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢火蟲或海腎(reniUa)螢光素酶、p-半乳糖苦酶、P-葡糖醛酸糖苷酶、堿性磷酸酶和綠色熒光蛋白(GFP)?？梢灾皇褂贸Ｉ硪妼?shí)踐技術(shù)和分子生物學(xué)方法(參見，例如，Samrbook等人，同上；Brent等，同上)制備表達(dá)處于HIV相互作用宿主因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件控制下的報(bào)道基因的載體。除了報(bào)道基因外，載體還可包含宿主細(xì)胞繁殖或維持所必需的元件，以及諸如多腺苷酸化序列和轉(zhuǎn)錄終止子等元件。典型的測(cè)定載體包括含有螢光素酶基因5'多接頭序列的pGL3系列載體(Promega，Madison,WI;美國(guó)專利號(hào)5,670,356)。細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和報(bào)道基因測(cè)定的一般方法在本領(lǐng)域中已有描述，例如，Samrbool等人，同上；和TransfectionGuide,PromegaCorporation,Madision,WI(1998)。任何易于轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如，HCT116、HEK293、MCF-7和HepG2細(xì)胞)都可以用于測(cè)定載體中報(bào)道基因的表達(dá)。VI.檢測(cè)調(diào)節(jié)化合物對(duì)HIV感染的抑制活性為了鑒定新的HIV感染抑制劑，通常進(jìn)一步檢查上文所描述的調(diào)節(jié)HIV相互作用宿主因子的化合物，以確定它們對(duì)HIV感染的抑制作用。通常篩選化合物對(duì)可指示HIV感染或HIV復(fù)制的活性的調(diào)節(jié)能力。在存在調(diào)節(jié)化合物作用于的HIV相互作用宿主因子的情況下進(jìn)行篩選。可以通過細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)或由第二表達(dá)栽體表達(dá)在第一步篩選步驟中鑒定的調(diào)節(jié)試劑所針對(duì)的HIV相互作用宿主因子。優(yōu)選地，使用內(nèi)源性表達(dá)HIV相互作用宿主因子的細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行這種篩選步驟。作為對(duì)照，還可以檢查調(diào)節(jié)化合物對(duì)不表達(dá)HIV相互作用宿主因子的細(xì)胞的影響。例如，如果在第一步篩選步驟中使用的HIV相互作用宿主因子(例如，由小鼠基因編碼)在細(xì)胞系(例如，人細(xì)胞系)中無內(nèi)源性表達(dá)，那么可以將表達(dá)這種多肽的另一種載體引入細(xì)胞。通過比較在調(diào)節(jié)化物存在或缺乏時(shí)HIV感染的相關(guān)活性，可以鑒定化合物對(duì)HIV感染的活性。有許多測(cè)定和方法能檢查化合物的HIV-抑制活性。這些通常涉及測(cè)試化合物體外抑制HIV病毒復(fù)制的能力或指示HIV感染的生物化學(xué)活性。在一些方法中，可以通過使用本領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)踐方法檢查調(diào)節(jié)化合物對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞的HIV感染的影響來檢測(cè)它們對(duì)HIV感染的潛在抑制活性。例如，可以通過Seddiki等人，AIDSResHumRetroviruses.15:381-卯，1999所描述的原代巨噬細(xì)胞的HIV感染來檢查這些化合物。也可以通過Fujii等人，JVetMedSci.66:115-21，2004所報(bào)道的其他T細(xì)胞和單核細(xì)胞系的HIV感染來檢查它們。監(jiān)測(cè)HIV感染的其它體外系統(tǒng)在本領(lǐng)域已經(jīng)有所描述。參見，如，Li等人，PediatrRes.54:282-8,2003;Steinberg等人，Virol.193:524-7,1993;Hansen等人，AntiviralRes.16:233-42，1991和Piedimonte等人，AIDSResHumRetroviruses.6:251-60，1990。在這些測(cè)定中，可以通過形態(tài)學(xué)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的HIV感染，例如，通過顯微致細(xì)胞病變測(cè)定(參見，如Fujii等人，JVetMedSci.66:115-21,2004)。也可以通過酶法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，例如，通過測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。這種測(cè)定在本領(lǐng)域中已有描述，例如，Reynolds等人，ProcNatlAcadSciUSA.100:1615-20，2003和Li等人，PediatrRes.54:282-8，2003。其他測(cè)定通過對(duì)病毒核酸或病毒抗原積累的定量來檢測(cè)HIV感染。例如，Winters等人(PCRMethodsAppl.1:257-62，1992)描述了從感染HIV的細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定HIVgagRNA和DNA的方法。Vanitharani等人描述了測(cè)定病毒p24抗原的產(chǎn)生的HIV感染測(cè)定(Virology289:334-42，2001)。還可以通過p24抗原酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定在體外監(jiān)測(cè)病毒復(fù)制，如在Chargelegue等人，JVirolMethods.38(3):323畫32，1992和Klein等人，JVirolMethods,107(2):169-75，2003中所述。可以使在一些方法中，可以在允許HIV復(fù)制的人工改造的報(bào)道細(xì)胞中來檢測(cè)調(diào)節(jié)化合物對(duì)HIV感染的潛在抑制作用。在這些細(xì)胞中，通過檢查在HIV轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(例如，HIV-LTR)控制下報(bào)道基因的表達(dá)來監(jiān)測(cè)HIV感染和復(fù)制。這類細(xì)月包的一個(gè)實(shí)例是HeLa-T4-PGalHIV凈艮道細(xì)胞。如下文實(shí)施例所述，使用調(diào)節(jié)化合物處理可以后可以用HIV-IIIb感染HeLa-T4-PGal報(bào)道細(xì)胞。如通過測(cè)定P-半乳糖苷酶活性監(jiān)測(cè)的化合物處理后的細(xì)胞中的病毒感染力可以與未用所述化合物處理過的對(duì)照細(xì)胞中的病毒感染力進(jìn)行比較。調(diào)節(jié)化合物處理后的細(xì)胞中病毒滴度或感染力的減少可以證實(shí)該化合物確實(shí)能夠抑制HIV感染或病毒復(fù)制。除了此處所例舉的HeLa-T4-PGal細(xì)胞外，許多類似的報(bào)道基因測(cè)定也在本領(lǐng)域中已經(jīng)有所描述。例如，Gervaix等人(ProcNatlAcadSciUSA.94:4653-8，1997)開發(fā)了表達(dá)編碼在HIV-ILTR啟動(dòng)子控制下的人綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒的穩(wěn)定T細(xì)胞系。經(jīng)HIV-I感染后，與未感染細(xì)胞相比，可以觀察到感染細(xì)胞中的熒光增加了100-l,000倍。在本發(fā)明中可以使用這些測(cè)定系統(tǒng)的任一種來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)化合物對(duì)HIV感染的影響。這些體外系統(tǒng)還允許隨時(shí)間對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行定量，并確定它們對(duì)化合物的敏感性。在一些其它方法中，可以通過檢查經(jīng)該化合物處理后細(xì)胞中HIV-1假病毒的產(chǎn)生來檢查調(diào)節(jié)化合物對(duì)HIV復(fù)制的影響。細(xì)胞可以內(nèi)源性或外源性表達(dá)HIV相互作用宿主因子。例如，可以將編碼HIV相互作用宿主因子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入不內(nèi)源性表達(dá)該HIV相互作用宿主因子的宿主細(xì)胞中。如美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/673,623中所詳述的，可以使用報(bào)道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)細(xì)胞(如293THEK細(xì)胞)而產(chǎn)生HIV-1假病毒，這種質(zhì)粒表達(dá)編碼報(bào)道基因(例如，螢光素酶基因)的psi-陽性RNA、編碼各種結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控或輔助蛋白的deltapsi包裝構(gòu)建體，如Tat、Rev、Vpr和Vif以及VSV-g被膜表達(dá)質(zhì)粒。生產(chǎn)細(xì)胞中產(chǎn)生的假病毒只編碼報(bào)道基因。在使用生產(chǎn)細(xì)胞上清液中的假病毒感染靶細(xì)胞后，報(bào)道基因在逆轉(zhuǎn)錄并整合入靶細(xì)胞基因組后表達(dá)。為了篩選HIV復(fù)制抑制物，可以在假病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之前、同時(shí)或之后使用調(diào)節(jié)化合物處理生產(chǎn)宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，該化合物在假病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之前施用于宿主細(xì)胞，并且存在于整個(gè)測(cè)定過程中?？梢允褂蒙a(chǎn)細(xì)胞上清液中的假病毒感染靶細(xì)胞并測(cè)定靶細(xì)胞中報(bào)道基因(如，螢光素酶活性)活性來監(jiān)測(cè)產(chǎn)生的假病毒滴度。作為對(duì)照，也對(duì)未經(jīng)該化合物處理的生產(chǎn)細(xì)胞上清液感染的靶細(xì)胞中報(bào)道基因的活性進(jìn)行測(cè)定。如果調(diào)節(jié)化合物具有抑制病毒出芽的作用，那么相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞來說，與使用該化合物處理的生產(chǎn)細(xì)胞的上清液相接觸的靶細(xì)胞將具有降低的報(bào)道基因活性。VII.治療應(yīng)用通過抑制HIV感染，上文所描述的HIV抑制化合物提供了本發(fā)明的有用的治療應(yīng)用。它們?nèi)菀子糜陬A(yù)防或治療多種受試者中HIV感染以及與HIV感染相關(guān)的疾病或狀況(如，艾滋病)。此外，本領(lǐng)域中已知的抑制本發(fā)明人所鑒定的任何HIV相互作用宿主因子的化合物也可用于治療應(yīng)用。實(shí)例包括抑制MLK3激酶活性的K252a和CEP1347(Roux等人，J.Biol.Chem.277:49473-80，2002)。適合用此處所公開的HIV抑制化合物進(jìn)行治療的HIV感染包括被任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的HIV家族(例如，HIV-I、HIV-II、HIV-III)感染的受試者，尤其是人類受試者。HIV-抑制化合物可用于治療攜帶任何逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV家族成員的受試者。它們可以用于治療被診斷為活性艾滋病的受試者。這些化合物還可用于治療或預(yù)防這些受試者中艾滋病相關(guān)狀況。未被診斷出被HIV感染但是被認(rèn)為具有HIV感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者也適合用本發(fā)明的HIV抑制化合物進(jìn)行治療。患有任何艾滋病相關(guān)疾病的受試者都適合用這些HIV抑制化合物進(jìn)行治療。這些疾病包括艾滋病相關(guān)性綜合征(ARC)、進(jìn)行性全身淋巴結(jié)病(PGL)、抗-HIV抗體陽性狀況、HIV陽性狀況、艾滋病相關(guān)神經(jīng)狀況(例如癡呆和熱帶下身截癱)、卡波西肉瘤、血小板減少性紫癜和相關(guān)的機(jī)會(huì)性感染，如卡氏肺嚢蟲肺炎、結(jié)核分枝桿菌感染、食道念珠菌感染、腦弓形體病、CMV視網(wǎng)膜炎、HIV-相關(guān)腦病、HIV-相關(guān)消耗綜合征，等等。測(cè)定體內(nèi)HIV感染和進(jìn)展為艾滋病的標(biāo)準(zhǔn)方法可用于確定受試者是否對(duì)本發(fā)明中的HIV抑制化合物治療為陽性反應(yīng)。例如，在^f吏用本發(fā)明的HIV抑制化合物治療后，可以監(jiān)測(cè)受試者的CD4+T細(xì)胞數(shù)量。CD4+T細(xì)胞數(shù)量的增加表明受試者從抗病毒治療給藥中受益。該方法和本領(lǐng)域中已知的其它方法可用于確定本發(fā)明中的化合物對(duì)于治療受試者中HIV感染和艾滋病的有效程度。本發(fā)明中的HIV抑制化合物可以在無菌條件下直接施用于待治療的受試者?？梢詥为?dú)或作為藥物組合物的活性成分施用調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明中的治療組合物也可以與其他治療劑組合或聯(lián)合^f吏用。在一些應(yīng)用中，將第一種HIV抑制化合物和另一種HIV抑制化合物組合使用，以達(dá)到單獨(dú)使用一種HIV抑制化合物所不能實(shí)現(xiàn)的對(duì)HIV感染的更廣泛抑制。在一些其他應(yīng)用中，本發(fā)明中的HIV-抑制化合物可以與已知的抗HIV藥物(例如AZT)聯(lián)合使用。本發(fā)明中的藥物組合物一般包含至少一種活性成分及其一種或多種可接受的載體?？伤幱玫妮d體可以增強(qiáng)或穩(wěn)定該組合物，或方便組合物的制備?？伤幱幂d體部分由施用的特定組合物決定(例如，核酸、蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)化合物)，以及由施用組合物的特定方法決定。它們還應(yīng)當(dāng)在藥學(xué)和生理學(xué)上都是可接受的，意思是說它們能夠與其它活性成分相容，并且對(duì)受試者無害。這些載體可以根據(jù)施用所需的制劑形式而具有多種形式，如，口服的、舌下的、直腸的、鼻的、靜脈內(nèi)的、或腸胃外的。例如，HIV-抑制化合物可以與例如卵白蛋白或血清白蛋白等載體蛋白在施用前復(fù)合，以增強(qiáng)穩(wěn)定性和藥理學(xué)性質(zhì)。可以以多種形式，例如粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠嚢劑等制備藥物組合物。制劑中治療活性化合物的濃度按重量占0.1-100%。可通過藥學(xué)領(lǐng)域中任何公知的方法制備治療制劑?？梢酝ㄟ^任何可用于治療的有效手段遞送治療制劑。參見，如，Goodman&Gilman的ThePharmacologicalBasesofTherapeutics,Hardman等編輯，McGraw-HillProfessional(第10版，2001);Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,Gennaro編輯，LippincottWilliams和Wilkins(第20版，2003);和PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,Ansel等編輯，LippincottWilliams和Wmkins(第7版，1999)。治療制劑可以以單位劑型方便地給予，并以合適的治療劑量施用。合適的治療劑量可以通過任何眾所周知的方法進(jìn)行確定，如對(duì)哺乳動(dòng)物物種進(jìn)行臨床研究以確定最大耐受劑量和對(duì)正常人類受試者進(jìn)行臨床研究以確定安全劑量。除了可能需要較高劑量的特定情況之外，HIV抑制化合物的優(yōu)選劑量一般在每天約0.001至約lOOOmg的范圍之間，更常見在約0.01至約500mg之間。HIV-抑制化合物的優(yōu)選劑量和施用方式可根據(jù)受試者不同而改變，取決于治療醫(yī)師評(píng)論的個(gè)體因素，例如待治療疾病、待施用組合物的選擇，包括特定的HIV抑制化合物、個(gè)體受試者年齡、體重和應(yīng)答、受試者癥狀的嚴(yán)重性以及選擇的施用途徑。通常，HIV抑制化合物的施用量是可以有效和可靠地防止或減輕受試者狀況的最小劑量。因此，上述劑量范圍旨在為此處的教導(dǎo)提供一般指導(dǎo)和支持，而非旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例提供以下實(shí)施例來闡明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1.一般材料和方法細(xì)胞系及維持通過NIH,NIAID艾滋病部門的艾滋病研究與參考試劑計(jì)劃(Kimpton，J.Virol.66:2232-9,1992),從MichaelEmerman博士處獲得HeLaCD4Pgal細(xì)胞。細(xì)胞在補(bǔ)充10%胎牛血清，1x青霉素/鏈霉素/L-谷氨酰胺，0.2mg/mLG418和0.1mg/mL潮霉素B的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充10%胎牛血清和1x青霉素/鏈霉素/L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基中。所有的細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自Invitrogen。在HeLaCD4Pgal細(xì)胞中篩選cDNA:基本上根據(jù)Chanda等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:12153-8，2003中所描述的方法進(jìn)行HeLaCD4Pgal細(xì)胞的高通量cDNA逆轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)言之，將包含15，000個(gè)基因的子基因組文庫的個(gè)體cDNA(詳細(xì)信息見http:〃function.gnf.org)、陰性對(duì)照Sport6GFPcDNA和陽性對(duì)照Sport6-Tat質(zhì)粒以40ng/孔點(diǎn)在55個(gè)白色不透明384孔板(Greiner)中。使用Multidrop裝置(Titertek)在每孔(10juL)中加入無血清Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中含有1Mg/mLHIV-LTR曙螢光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒(通過HxB2林的LTR序列PCR擴(kuò)增獲得)的1%GeneJuice(Novagen)溶液，允許形成復(fù)合體10分鐘。接著加入HeLaCD4Pgal細(xì)胞(IOOO個(gè)細(xì)胞/30|aL/孔，在DMEM/10。/。胎牛血清中)，將板溫育過夜，接著加入20jaL含有200ng/mLHIV-IIIb的p24(AdvancedBiotechnologies公司)的DMEM/10。/。胎牛血清。72小時(shí)后，使用BriteGlo(Promega),在CLIPR儀器(MolecularDevices)上讀數(shù)測(cè)量螢光素酶的產(chǎn)生對(duì)感染進(jìn)行評(píng)估。對(duì)整個(gè)文庫以一式兩份進(jìn)行測(cè)定。比較每種cDNA的數(shù)據(jù)和整個(gè)板的平均信號(hào)，表示為afa/mfa比值，其是平均激活倍數(shù)(afa)除以激活倍數(shù)的校正標(biāo)準(zhǔn)差(mfa)。如果重復(fù)測(cè)定之間的標(biāo)準(zhǔn)差高，那么mfa使激活倍數(shù)值降低。逐漸增加額外cDNA后通過在初始測(cè)定中測(cè)試確25認(rèn)命中，并測(cè)序證實(shí)其身份(EtonBioscience)。激酶失活MLK3的cDNA測(cè)試在12孔板中使用篩選測(cè)定的放大形式沿著MLK3Origene收集命中測(cè)試pcDNA3.1載體中MLK3和MLK3的激酶失活突變體(K144R)(Xu等，Mol.Cell.Biol.21:4713-24，2001)。簡(jiǎn)言之，在每孔中加入1.28|agcDNA/0.32|JgLTR-Luc/32ML，隨后加入320juL1%genejuice/Optimen，接著加入lmLDMEM/10。/o胎牛血清中的6x104HeLaCD4卩gal細(xì)胞。24小時(shí)后，使用90ngHIV-IIIb的p24感染培養(yǎng)物，在培育3天，使用BriteGIo(Promega)并在CLIPR儀器(MolecularDevices)上讀數(shù)，評(píng)估感染水平。siRNA:從Dharmacon獲得GL2螢光素酶siRNA(目錄號(hào)D-001100-01-20)、PITPNot(檢索號(hào)NM—006224)、TRIM28(檢索號(hào)NM_005762)、IFITl(檢索號(hào)NM—001548)、LYZ(檢索號(hào)NM—000239)、COROIA(檢索號(hào)NM—0t)7074)和DnaJC14(檢索號(hào)NM—032364)SmartpoolsiRNA。就GL2siRNA而言，也從Qiagen獲得了額外量的相同序列。合成并合并針對(duì)Tat的兩種siRNA，用作HIV感染抑制的陽性對(duì)照。設(shè)計(jì)并合成MLK3-1和MLK3-2siRNA，從Dharmacon(目錄號(hào)D-003577-03)獲得MLK3-3siRNA。在HeLaCD4Pgal細(xì)胞中篩選siRNA:siRNA文庫針對(duì)最可能是潛在藥物耙標(biāo)的5000種不同基因，每種基因用兩個(gè)不同的siRNA代表?；旧细鶕?jù)Aza-Blanc等，MolecularCell12:627-37，2003所述的方法進(jìn)行HeLaCD4egal細(xì)胞的siRNA逆轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)言之，在白色不透明或白色透明底的384孔板(Greiner)中以14ng/孔加入各siRNA，每孔含有一種siRNA序列。在每孔中加入10|aL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中的2%oligofectamine(Invitrogen)溶液，允許復(fù)合體形成15-20分鐘。使用Multidrop裝置(Titertek)進(jìn)行所有384孔的加樣。然后加入HeLaCD4Pgal細(xì)胞(1000個(gè)細(xì)胞/30pL/孔，在無血清Opti-MEM中)，將板溫育過夜，然后加入20pL含有200ng/mLHIV-IIIb(AdvancedBiotechnologies7>司.)的30。/。胎牛血清/DMEM。72小時(shí)后，使用等體積的GalScreen(AppliedBiosystems)測(cè)量P-半乳糖苷酶的產(chǎn)生來評(píng)估感染。使用CLIPR儀器(MolecularDevices)對(duì)所有384孔板讀數(shù)。每個(gè)384孔板平行測(cè)定十二次，數(shù)據(jù)表示為與陰性對(duì)照GL12siRNA相比的抑制百分比。在轉(zhuǎn)染后96小時(shí)測(cè)定siRNA的細(xì)胞毒性，通過加入等體積的1:4稀釋的CellTiterGlo(Promega)并使用CLIPR儀器對(duì)熒光讀數(shù)進(jìn)行所述測(cè)定，數(shù)據(jù)仍然以與GL2相比的抑制百分比表示。通過蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證siRNA:在6孔板中的250/aL無血清Opti-MEM(Invitrogen)中點(diǎn)樣siRNA(800ng)，隨后加入250juL無血清Opti-MEM中的1.5%Lipofectamin2000(Invitrogen)。將板在室溫溫育20分鐘以允許形成復(fù)合體。加入HeLaCD4卩gal細(xì)胞(3x105個(gè)細(xì)胞，在1.5mL無血清Opti-MEM中)，溫育過夜后加入lmL30。/。胎牛血清/DMEM。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)后刮下細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解緩沖液(20mMHEPESpH7.2/10mMKC1/1mMEDTA/1%TritonX-100/1x蛋白酶抑制劑，SigmaChemical公司)在冰上裂解1小時(shí)。使用Micro-BCA試劑盒(Promega)測(cè)定裂解物的總蛋白質(zhì)濃度，將相同量的蛋白質(zhì)裝入4-12%NuPageBis-Tris凝膠(Invitrogen)，按制造商的說明進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，使用含5%脫脂奶的PBST(含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖鹽水)封閉印跡，接著使用如下抗體進(jìn)行免疫印跡來自SantaCruzBiotechnology的兔多克隆抗-MLK3抗體和山羊抗-微管蛋白抗體、SigmaChemical公司的辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔二級(jí)抗體，Promega的辣根過氧化物酶綴合的驢抗山羊二級(jí)抗體。所有的抗體根據(jù)制造商所建議的稀釋比稀釋于含5%脫脂奶的PBST后使用。使用ECL-plus檢測(cè)試劑(Amersham)顯示條帶。JurkatT-細(xì)月包的siRNA轉(zhuǎn)染將JurkatT-細(xì)月包用PBS洗滌一次，以高密度(2.4x1()8/mL)重懸于無血清Opti-MEM(Invitrogen)中，取50|aL力口入含有l(wèi)nmolsiRNA(50|aL,20|uM)的0.2cm間隙杯(gapcuvette)中。使用BioRadGenePulserXcell模塊按照制造商建議的條件(140V，lOOOuF,指數(shù)衰減)對(duì)混合物進(jìn)行電穿孔，然后轉(zhuǎn)移至12mL補(bǔ)充10。/。胎牛血清的不含抗生素的RPMI中培養(yǎng)24小時(shí)。沉淀細(xì)胞，使用錐蟲藍(lán)排阻法對(duì)活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并以1.7x106/mL密度重懸于補(bǔ)充10%胎牛血清和1x青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺的RPMI中。對(duì)于轉(zhuǎn)染研究，在48孔板的每孔中加入300liLsiRNA處理后的細(xì)胞，并加入2ng或0.5ngHIV-nib,基于制造商所提供的病毒滴度分別對(duì)應(yīng)于0.0005和0.000125。額外的三天后，收獲細(xì)胞，用PBS洗滌三次，裂解細(xì)胞，通過細(xì)胞裂解物的p24ELISA測(cè)定感染。對(duì)于細(xì)胞毒性，將300jLiLsiRNA處理后的細(xì)胞加入48孔板的每孔中，三天后，使用CellTiterGlo(Prmega)在CLIPR儀器(MolecularDevices)上讀數(shù)來測(cè)定細(xì)胞活力，或者用AlarnarBlue(TREKsystems)在Acquest(LJLBiosystems)上讀數(shù)測(cè)定細(xì)胞活力。為了確定siRNA的功效，在電穿孔72小時(shí)后按照HeLaCD40galsiRNA驗(yàn)證研究中的方法的制備和分析細(xì)胞裂實(shí)施例2.從siRNA篩選中鑒定新的HIV相互作用宿主因子我們通過監(jiān)測(cè)HeLaCD4Bgal細(xì)胞中在HIVLTR啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因的表達(dá)對(duì)參與HIV感染的宿主蛋白質(zhì)進(jìn)行了子基因組siRNA篩選(Kimpton等人，JVirol66:2232-2239，1992)。通過NIH，NIAID艾滋病部門的艾滋病研究與參考試劑計(jì)劃從MichaelEmerman博士處獲得HeLa-CD4-Bgal細(xì)胞。使用逆轉(zhuǎn)染方案用作為陽性對(duì)照的針對(duì)Tat的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用HIV-IIIb攻擊細(xì)胞(Huang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:3456-61，2004)。為了能夠觀察到對(duì)感染的所有階段(從進(jìn)入到釋放，到在細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)散)的影響，感染持續(xù)三天。通過監(jiān)測(cè)HeLaCD4Pgal細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)，該系統(tǒng)可以檢測(cè)siRNA對(duì)HIV感染的任何調(diào)節(jié)作用。通過使用化學(xué)發(fā)光底物測(cè)定在病毒LTR啟動(dòng)子下產(chǎn)生的P-半乳糖苷酶的量，對(duì)感染進(jìn)行評(píng)估。整個(gè)篩選以一式兩份進(jìn)行，數(shù)據(jù)表示為平均激活倍數(shù)(afa)與激活倍數(shù)的校正標(biāo)準(zhǔn)差(mfa)之比，該值既考慮到了每個(gè)siRNA的影響，又考慮到了一式兩份之間的偏差。對(duì)于那些afa小于l的基因(感染抑制劑)，將值轉(zhuǎn)換為負(fù)激活倍數(shù)。實(shí)施例3從cDNA篩選中鑒定和表征HIV相互作用宿主因子我們進(jìn)行了含有15，000個(gè)獨(dú)特基因的cDNA文庫的高通量篩選，以尋找其過量表達(dá)將導(dǎo)致HIV-IIIb感染增強(qiáng)的新的原病毒因子。由于HeLaCD4Pgal細(xì)胞易于轉(zhuǎn)染，我們使用它們進(jìn)行篩選，并使用復(fù)制感受態(tài)HIV-IIIb對(duì)其攻擊。在含有文庫cDNA的384孔板的孔中(每孔一種基因)加入陰性對(duì)照(Sport6-gfp)和陽性對(duì)照(Tat-Sport6)cDNA，隨后加入包含應(yīng)答HIVTat的LTR-螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染試劑溶液。形成復(fù)合體后加入細(xì)胞，24小時(shí)后，每孔使用HIV-fflb感染。為了能夠觀察到對(duì)感染的所有階段(從進(jìn)入到釋放，到在細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)散)的影響，感染持續(xù)三天。然后通過測(cè)定經(jīng)由病毒LTR啟動(dòng)子產(chǎn)生的螢光素酶的量來評(píng)估感染。與陰性對(duì)照孔和空白孔相比，大多數(shù)的陽性對(duì)照TatcDNA孔表現(xiàn)出熒光增強(qiáng)。整個(gè)篩選以一式兩份進(jìn)行，數(shù)據(jù)表示為平均激活倍數(shù)(afa)與激活倍數(shù)的校正標(biāo)準(zhǔn)差(mfa)之比，該值既考慮到了每個(gè)siRNA的影響，又考慮到了一式兩份之間的偏差。在整個(gè)文庫中，315(2.1%)個(gè)基因使感染增加，其afa.mfa》2,這是為隨后實(shí)驗(yàn)所選的截?cái)嘀?。通過篩選鑒定一些已知參與HIV感染的基因(例如增強(qiáng)子S100A12、PP2A調(diào)節(jié)亞基B和核輸出蛋白CRM1)為增強(qiáng)子，它們作為內(nèi)部驗(yàn)證。按照篩選實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)綜述確定的前89個(gè)感染增強(qiáng)子用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所選增強(qiáng)子來自多種基因家族，大多數(shù)可以作為潛在的藥物靶標(biāo)，包括激酶、其它酶和轉(zhuǎn)錄因子，以及已知來自在HIV感染中重要的途徑，包括泛蛋白途徑和RNA加工因子。用小量制備規(guī)模再生長(zhǎng)每種cDNA命中，并使用最初測(cè)定法測(cè)試，其中再次證實(shí)19個(gè)命中。接著將它們大規(guī)模生長(zhǎng)，使用最初測(cè)定法測(cè)試，并測(cè)序以確保正確的命中身份。在這一階段，13個(gè)測(cè)序證實(shí)的命中與陰性對(duì)照相比繼續(xù)表現(xiàn)出活性增強(qiáng)，相對(duì)于Sport6-GFP陰性對(duì)照增強(qiáng)1.7倍至8.8倍(表1)。我們接著通過使用siRNA耗盡內(nèi)源性蛋白質(zhì)來研究最強(qiáng)的cDNA增強(qiáng)子對(duì)于HIV復(fù)制是否是必需的。對(duì)于表現(xiàn)出對(duì)照的約3倍或更大的6種基因，我們獲得了已驗(yàn)證的siRNA的Smartpools，并在HeLaCD4Pgal細(xì)胞中評(píng)估了它們對(duì)HIV-IIIb感染的影響。在測(cè)試的siRNA中，針對(duì)分子伴侶DnaJC14、含有三十四肽重復(fù)序列1的干擾素誘導(dǎo)蛋白質(zhì)(IFIT1)和磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白a(PITPNcc)的siRNA降低了HIV感染而無明顯的毒性，這進(jìn)一步增強(qiáng)了它們?cè)诟腥局械淖饔?，而其它siRNA對(duì)于病毒復(fù)制或細(xì)胞存活力無明顯影響(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，在這些基因中，過表達(dá)時(shí)增強(qiáng)感染、耗盡時(shí)阻斷感染的是千擾素誘導(dǎo)蛋白質(zhì)IFIT1,它在多種病毒感染(包括丙型肝炎(HCV)和星形M細(xì)胞的HIV感染)中被上調(diào)。雖然IFIT1的生物功能尚不清楚，但是有報(bào)道它能夠和Rho/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子作用，并可能因此幫助Rho蛋白激活。HIV可能使用干擾素誘導(dǎo)的蛋白促使其復(fù)制這一想法是吸引人的并值得進(jìn)一步研究。其它兩個(gè)具有雙重活性的兩種基因，即分子伴侶蛋白DnaJC14和參與嚢泡運(yùn)輸?shù)闹D(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)PITPNa，對(duì)于進(jìn)一步洞察病毒生物學(xué)也是有希望的。由于其清楚的生理學(xué)作用和作為治療靶標(biāo)的高潛力，接下來我們將關(guān)注強(qiáng)cDNA增強(qiáng)子混合譜系激酶3(MLK3)。這種絲氨^/蘇氨酸激酶參與激活下游Map激酶(包括JNK、p38和ERK)，并已證實(shí)在包括HIVgpl20介導(dǎo)的神經(jīng)元調(diào)亡的神經(jīng)元調(diào)亡中起重要作用。MLK3的化合物抑制劑CEP-1347已用于神經(jīng)變性疾病治療的臨床試驗(yàn)，這突出顯示了它在神經(jīng)元細(xì)胞死亡中的作用以及作為藥物耙標(biāo)的適用性(Bodner等人，ExperimentalNeurology188:246-53，2004)。為了說明MLK3激酶活性是否是引起使用cDNA所觀測(cè)到的感染增強(qiáng)的原因，我們獲得了一種激酶失活突變體(MLK3KI)，并檢測(cè)了它對(duì)HIV感染的影響。與野生型蛋白質(zhì)不同，MLK3KI不能增加感染，表明MLK3的功能對(duì)于感染增強(qiáng)至關(guān)重要(圖1)。由于MLK3在通過激活JNK后激活A(yù)P-1復(fù)合體中的作用，我們假設(shè)它可能通過定位在HIVLTR中的AP-1位點(diǎn)增強(qiáng)HIV轉(zhuǎn)錄。為了證明這種假設(shè)，將MLK3用LTR螢光素酶構(gòu)建體與Tat表達(dá)載體或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，以評(píng)估對(duì)LTR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的Tat-依賴性或Tat-獨(dú)立的影響。與對(duì)照相比，MLK3的表達(dá)使Tat-依賴的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)大約3倍，但對(duì)于Tat-獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄無顯著影響(圖2)，表明MLK3通過病毒特異轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)感染。根據(jù)過表達(dá)數(shù)據(jù)，我們最終研究了針對(duì)MLK3的siRNA是否會(huì)抑制HIV感染。我們獲得了靶定MLK3的3個(gè)獨(dú)特的siRNA序列，并在HeLa-CD4-13gal細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞中評(píng)估了它們抗HIV的效力。將各個(gè)MLK3siRNA轉(zhuǎn)染至HeLaCD4(3gal細(xì)胞或電穿孔至Jurkat細(xì)胞中。24小時(shí)后，使用HIV-IIIb攻擊細(xì)胞。對(duì)于HeLaCD4Pgal細(xì)胞，3天后使用化學(xué)發(fā)光底物(GalScreen)測(cè)定細(xì)胞中從穩(wěn)定的LTR-13gal報(bào)道基因產(chǎn)生的P-半乳糖苷酶來評(píng)估感染。對(duì)于Jurkat細(xì)胞，感染24小時(shí)后將加入的病毒移除，再過48小時(shí)后收集上清液，使用ELISA測(cè)試p24水平。還通過在平行的未感染培養(yǎng)物中使用CellTiterGlo測(cè)定每個(gè)siRNA的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果顯示，所有三種siRNA都能夠有效耗盡MLK3蛋白質(zhì)(圖.3B)，并降低HeLaCD4|3gal細(xì)胞中HIV感染大約40%(圖.3A)。與提出的影響Tat-依賴的轉(zhuǎn)錄機(jī)制相吻合，MLK3的耗盡對(duì)于早期逆轉(zhuǎn)錄物或整合的原病毒的水平無影響(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，MLK3siRNA還降低了Jurkat細(xì)胞中的HIV-IIIb感染，雖然其程度低于HeLa-CD4-Bgal細(xì)胞中所觀察到的(圖.3C)。蛋白質(zhì)印跡分析顯示Jurkat細(xì)胞中蛋白質(zhì)耗盡的量比HeLaCD4Bgal細(xì)胞中低，因此解釋了觀察到的較低抑制水平(圖.3D)。表1.HIV-IIIbHeLaCD4卩gal篩選一般結(jié)果命中范圍-8.9到+4.9倍afa.mfa原病毒因子(用siRNA抑制抑制了感^態(tài)庫命^#(7傲，#義岸)-8.9到-561(0.6%)-5到隱3280(2.8%)-3到-2741(7.41%)抗病毒因子(用siRNA抑制促進(jìn)了感染)fl/fl,附/fl龍風(fēng)命^弁(70A:,惑X岸)+2到+3365(3,65%)+3到+4.953(0.53%)表2.經(jīng)證實(shí)的通過siRNA篩選所鑒定的HIV相互作用宿主因子<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a平均激活倍數(shù)(afa)除以激活倍數(shù)的校正的標(biāo)準(zhǔn)差(mfa)，其考慮每種cDNA的影響和一式兩份之間的偏差。b陰性對(duì)照Sport6g印，與篩選中使用的相同。實(shí)施例4通過酵母雙雜交篩選鑒定的HIV相互作用宿主因子進(jìn)行酵母雙雜交篩選以鑒定在人白細(xì)胞cDNA文庫中編碼的新的相互作用宿主細(xì)胞因子。用GAL4和LexA融合蛋白完成在酵母中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的測(cè)定。使用Vpr特異引物通過PCR擴(kuò)增VprcDNA。將該cDNA插入LexADBD表達(dá)栽體pSLANS中。pSLANS是pBTM116的修飾形式(Bartel等人Biotechiques14:920-924，1993)。它經(jīng)修改后接受NotI插入片段并將gly4-ser-gly4-ser放置在LexA和誘何之間。將編碼LexADBD-Vpr融合蛋白的cDNA轉(zhuǎn)化到酵母林L40MATa中。將編碼Gal4AD-白細(xì)胞cDNA融合蛋白的cDNA轉(zhuǎn)化到540MAToc酵母林中。將兩種酵母林雜交，并在THUKL-缺乏的合成培養(yǎng)基中選擇含有兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，通過P-半乳糖苷酶濾膜測(cè)定分析蛋白質(zhì)相互作用。篩選大約兩百萬個(gè)二倍體轉(zhuǎn)化體，分離出大量陽性候選者。使用提取升高測(cè)定法(filterliftassay)測(cè)定陽性菌落的P-半乳糖苷酶活性，以進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。通過對(duì)候選的cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序并與Genbank數(shù)據(jù)庫相比較來鑒定如表4所列出的篩選命中表4通過酵母雙雜交篩選鑒定的HIV相互作用宿主因子檢索號(hào)<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>M31951.1PRF1匪012227.1GTPBP6結(jié)構(gòu)域2(EFTUD2)人穿孔蛋白(PRF1)基因，完整cds人GTP結(jié)合蛋白6(假想的)(GTPBP6)應(yīng)當(dāng)理解此處所描述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是為了說明的目的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以想到多種修飾和修改，這也應(yīng)包括在本申請(qǐng)的宗旨和范圍內(nèi)以及附錄的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然在實(shí)踐中或?qū)Ρ景l(fā)明的檢查中可以使用與此處所述類似或等同的任何方法和材料，但是本發(fā)明描述了最優(yōu)選的方法和材料。此處所引用的所有出版物、GenBank序列、ATCC保藏物、專利和專利申請(qǐng)為了所有目的在此處明確的整體引入作為參考，如同它們每一個(gè)被單獨(dú)指出引入一樣。權(quán)利要求1.鑒定抑制HIV感染的物質(zhì)的方法，該方法包括(a)篩選受試化合物以鑒定一種或多種調(diào)節(jié)化合物，所述調(diào)節(jié)化合物下調(diào)選自表2-4中所列成員的多核苷酸編碼的HIV相互作用宿主因子的生物活性或表達(dá)水平；和(b)測(cè)試所述調(diào)節(jié)化合物抑制HIV感染的能力。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子選自三十四肽重復(fù)序列l(wèi)(IFITl)、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白o(hù)c(PITPNoc)和混合譜系激酶3(MLK3)。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子是MLK3，并且篩選受試化合物抑制MLK3的激酶活性或其表達(dá)的能力。4.權(quán)利要求1的方法，其中通過監(jiān)測(cè)在HIVLTR啟動(dòng)子控制下的報(bào)道基因在HIV感染的細(xì)胞中的表達(dá)來檢查調(diào)節(jié)化合物抑制HIV感染的能力。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)胞為HeLa-CD4-Bgal。6.權(quán)利要求4的方法，其中報(bào)道基因?yàn)镻-半乳糖苷酶基因。7.斥又利要求4的方法，其中用HIV-IIIb感染所述細(xì)月包。8.權(quán)利要求l的方法，其中通過比較已經(jīng)接觸調(diào)節(jié)化合物的經(jīng)人工改造的HIV允許細(xì)胞中HIV復(fù)制和沒有接觸所述調(diào)節(jié)化合物的對(duì)照細(xì)胞中的HIV復(fù)制來檢查調(diào)節(jié)化合物抑制HIV-1感染的能力。9.權(quán)利要求8的方法，其中HIV允許細(xì)胞是HeLa-T4-PGalHIV細(xì)胞。10.4又利要求8的方法，其中通過p24抗原ELISA測(cè)定或反轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定來監(jiān)測(cè)HIV復(fù)制。11.權(quán)利要求l的方法，其中通過比較使用化合物處理的宿主細(xì)胞中假病毒的產(chǎn)生和沒有使用所述化合物處理的對(duì)照宿主細(xì)胞中的假病毒產(chǎn)生來檢查所述化合物抑制HIV感染的能力。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述宿主細(xì)胞是293THEK細(xì)胞。13.權(quán)利要求ll的方法，其中使用在細(xì)胞中產(chǎn)生HIV假病毒的假病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。14.權(quán)利要求l的方法，其中HIV相互作用宿主因子是酶，并且測(cè)定的生物活性是它的酶活性。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述酶為激酶。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述激酶為MLK3。17.抑制受試者中HIV感染的方法，其包括對(duì)受試者施用藥物組合物，該藥物組合物包含有效量的抑制選自表2-4中所列成員的多核苷酸編碼的HIV相互作用宿主因子的生物活性或表達(dá)的化合物。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子選自三十四肽重復(fù)序列l(wèi)(IFITl)、磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白o(hù)c(PITPNoc)和混合譜系激酶3(MLK3)。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述HIV相互作用宿主因子是MLK3，并且所述化合物抑制MLK3的激酶活性。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述化合物是K252a或CEP1347。全文摘要本發(fā)明提供了新的HIV相互作用宿主因子。本發(fā)明還提供了使用HIV相互作用宿主因子篩選抑制HIV感染的化合物的方法。該方法包括首先從受試化合物中篩選本文公開的HIV相互作用宿主因子的調(diào)節(jié)劑，然后進(jìn)一步篩選所鑒定的調(diào)節(jié)化合物抑制HIV感染的能力。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了治療與HIV感染相關(guān)的疾病和狀況的方法和藥物組合物。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101317091SQ200680044648公開日2008年12月3日申請(qǐng)日期2006年12月8日優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日發(fā)明者D·源,J·考德威爾,K·L·庫亨申請(qǐng)人:Irm責(zé)任有限公司