專利名稱：感染性丙型肝炎病毒顆粒高效生產(chǎn)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及感染性人丙型肝炎病毒顆粒的高效生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
人丙型肝炎病毒(HCV)是通過持續(xù)性地感染引發(fā)慢性肝炎的單鏈 RNA病毒。目前，在世界范圍得到承認的慢性肝炎的主要原因是HCV 持續(xù)感染。實際上，持續(xù)感染者的50%左右均患慢性肝炎，其中約20% 的患者經(jīng)過10年 20年轉(zhuǎn)化為肝硬化，并且其中一部分進展為肝癌這樣 的致死病態(tài)。
妨礙上述重大疾病治療方法的開發(fā)研究的主要原因在于沒有在 HCV增殖方面高效的細胞培養(yǎng)體系；沒有適當(dāng)?shù)腍CV感染的小動物模 型；低水平的病毒復(fù)制；以及病毒基因組的遺傳異質(zhì)性。
因此，期待細胞培養(yǎng)系中的HCV基因組的復(fù)制系統(tǒng)的開發(fā)，以了 解病毒的復(fù)制、病毒與細胞的相互作用，提供由HCV引發(fā)的疾病治療 藥的評價體系。
最近，作為來自HCV的具有自主復(fù)制能力的RNA,制作了 HCV 亞基因組RNA復(fù)制子(專利文獻1、專利文獻2和非專利文獻1-3),使 用培養(yǎng)細胞分析HCV的復(fù)制機理成為可能。這些HCV亞基因組RNA 復(fù)制子是將存在于HCV基因組RNA的5'非翻譯區(qū)中的HCV IRES的下 游的結(jié)構(gòu)蛋白用新霉素抗性基因和與其下游連接的EMCV-IRES置換所 得。將該RNA復(fù)制子導(dǎo)入到人肝癌細胞Huh7中，在新霉素的存在下進 行培養(yǎng)，則可證明在Huh7細胞內(nèi)RNA復(fù)制子自主復(fù)制。但是，該實驗 體系是只能對HCV病毒增殖復(fù)制過程中的病毒RNA復(fù)制進行評價的實 驗體系，不產(chǎn)生病毒顆粒，因此無法對HCV顆粒在感染細胞內(nèi)的形成 和向細胞外的釋放、還有對新的細胞的感染的過程進行評價。
針對該課題，有人報道了通過培養(yǎng)細胞系生產(chǎn)病毒顆粒的方法。這 是不使用RNA復(fù)制子而利用HCV全基因組RNA的cDNA的系統(tǒng)。
Lim等人嘗試將在四環(huán)素應(yīng)答啟動子的下游連接基因型lb的 HCV-S1抹基因組RNA的cDNA得到的表達載體導(dǎo)入Huh7細胞中，將所得細胞抹用四環(huán)素進行處理，嘗試生產(chǎn)HCV顆粒。他們確認了在該 培養(yǎng)上清中有1 6xl()S拷貝/mL的HCV顆粒存在，但記載該HCV顆粒 的感染性低(非專利文獻4)。
但是，使HCV cDNA在CMV等RNA聚合酶II型啟動子控制下表 達，則在被轉(zhuǎn)錄的RNA的5，末端附加有帽結(jié)構(gòu)，3'末端附加有PolyA 鏈，因此在核糖體被利用作蛋白質(zhì)合成的模板，所轉(zhuǎn)錄的RNA不會發(fā) 生復(fù)制。
為解決該問題，Heller等人制備了下述構(gòu)成在HCV基因組的5， 末端和3'末端連接核酶序列，在細胞內(nèi)用RNA聚合酶II進行轉(zhuǎn)錄，然 后用核酶切斷，由此可在細胞內(nèi)合成未附加帽和PolyA的HCVRNA(非 專利文獻5)。通過核酶使5'末端不附加帽的方法可用于在細胞內(nèi)合成發(fā) 夾型RNA的方法(非專利文獻6)。實際上，將具有由兩個核酶夾持的 HCV構(gòu)成的表達栽體在Huh7中表達，顯示由此生成lxlO卩拷貝/mL的 HCV顆粒。但對于該顆粒是否具有感染性則未進行研究。
并且最近的研究顯示可由HCV全基因組RNA在細胞培養(yǎng)體系生 產(chǎn)具有感染能力的HCV顆粒(專利文獻3、非專利文獻7、非專利文獻 8)。該系統(tǒng)的HCV顆粒的生產(chǎn)量約為lxiO 拷貝/mL。另夕卜，對于將HCV 的基因型lb的conl林非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)置換為基因型2a的病毒抹的基因所 得的嵌合病毒RNA，顯示可通過細胞培養(yǎng)體系生產(chǎn)具有感染能力的 HCV顆粒(非專利文獻9)。并未公開該體系的HCV顆粒生產(chǎn)量的具體數(shù) 值。
由以上結(jié)果可知，可以建立對HCV顆粒在感染細胞內(nèi)的形成、向 細胞外的釋放、以及進一 步感染新的細胞的過程進行評價的實驗體系。
但是，Lim等人的體系產(chǎn)率低、Heller等人的體系的感染性不明確， 在使用HCV全基因組RNA的體系中，可能在RNA復(fù)制時發(fā)生變異。 已知如果HCV基因組發(fā)生變異，則可能不再發(fā)生復(fù)制。實際上已顯示 如果HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B蛋白質(zhì)中的GDD氨基酸序列變異為GND, 則不再發(fā)生復(fù)制。另一方面，關(guān)于HCV顆粒的生產(chǎn)量，兩者均為約lx107 拷貝/mL,人們期待能夠更進一步提高生產(chǎn)量。
作為提高HCV病毒顆粒生產(chǎn)量的方法，研究了制做復(fù)制子生產(chǎn)量 高的細胞。HCV病毒的復(fù)制中使用來自人肝臟的Huh7細胞，由該抹派 生的細胞有幾種克隆。其中，命名為Huh7.5的細胞顯示可復(fù)制親林約3倍的HCVRNA復(fù)制子(非專利文獻10)。
鑒于以上狀況，可以想象使用HCV全基因組RNA的cDNA開發(fā)感 染性HCV顆粒的高效生產(chǎn)體系是很重要的。
使用與RNA病毒的基因組RNA對應(yīng)的cDNA生產(chǎn)病毒顆粒的體系 已知有使用在流感病毒(負鏈的RNA病毒)動物細胞系內(nèi)生產(chǎn)中所使用 的RNA聚合酶I啟動子和終止子的體系(非專利文獻11)。但是，上述的 使用RNA聚合酶I啟動子和終止子的流感病毒顆粒的生產(chǎn)體系;f艮難說 在生產(chǎn)量方面比以往的流感病毒顆粒生產(chǎn)體系更優(yōu)異。另外，非專利文 獻11中對于作為正鏈RNA病毒的HCV生產(chǎn)體系沒有任何記載。
專利文獻1:日本特開2001-17187號公報
專利文獻2: WO2004/104198A1
專利文獻3: WO05080575A1
非專利文獻1: Blight等人.，Science, 290 (2000) 1972-1974頁 非專利文獻2: FrieBe等人.,J. Virol.,75 (2001) 12047-12057頁 非專利文獻3: Kato, T.等人.gastroenterology, 125(2003) 1808-1817
頁
非專利文獻4: Lim SP.等人.，Virology., 303 (2002) 79-99頁 非專利文獻5:Heller， T.等人.Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 102 (2005) 2579-83頁
非專利文獻6: Sinagawa， T.和Ishii, S., Gene Dev., 17 (2003) 1340-45
頁
非專利文獻7: Wakita等人，Nature Med. 11 (2005) 791-96頁 非專利文獻8: Lindenbach BD.等人.，Science. 309 (2005) 623-26頁 非專利文獻9: Pietschmann T.等人.，11th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses, (2004)
非專利文獻10: Blight, KJ.等人.，J. Virol., 76 (2002) 13001-14頁 非專利文獻11: Neumann, G.等人.，Virology, 202 (1994) 477-479頁

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供在培養(yǎng)細胞系中由重組DNA高效生產(chǎn)感染 性丙型肝炎病毒顆粒的方法。
本發(fā)明人為了構(gòu)建在細胞內(nèi)由HCV基因組cDNA合成具有復(fù)制能力的HCV基因組RNA的方法，對基因型不同的HCV基因組、用于使 其表達的啟動子/終止子進行了研究，發(fā)現(xiàn)了復(fù)制HCV基因組RNA的新 型的組合。接著，培養(yǎng)了合成該HCV基因組RNA的細胞，確認可比以 往報道的產(chǎn)率高地生產(chǎn)感染性HCV顆粒，從而完成了本發(fā)明。 即，本發(fā)明涉及以下的(a) (c)。
(a) 生產(chǎn)感染性HCV顆粒的方法，該方法是生產(chǎn)感染性丙型肝炎病 毒(HCV)顆粒的方法，該方法包含以下步驟將含有下述DNA的表達載 體導(dǎo)入可接受HCV增殖的細胞中的步驟，其中，所述DNA是在來自核 糖體RNA基因的RNA聚合酶I識別的啟動子下游含有來自JFH1林的 HCV基因組cDNA,且在其下游進一步含有來自核糖體RNA基因的 RNA聚合酶I識別的終止子的DNA。
(b) (a)的生產(chǎn)感染性HCV顆粒的方法，其中，可接受HCV增殖的 細胞選自Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2以及由這些細胞所派生 的細胞才木(株化細胞)。
(c) 表達載體，該表達載體用于生產(chǎn)感染性丙型肝炎病毒(HCV)顆 粒，該表達載體含有下述DNA:在來自核糖體RNA基因的RNA聚合 酶I識別的啟動子的下游含有來自JFH1抹的HCV基因組cDNA,且在 其下游進一步含有來自核糖體RNA基因的RNA聚合酶I識別的終止子 的DNA。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)感染性丙型肝炎病毒(HCV)顆粒的方法，該方法 包含以下步驟將含有下述DNA的表達栽體導(dǎo)入可接受HCV增殖的細 胞的步驟，其中所述DNA是在RNA聚合酶I啟動子的下游含有編碼 HCV的5，非翻譯區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白以及任意的非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA序列，和 編碼來自HCV JFH1林的非結(jié)構(gòu)蛋白和3'非翻譯區(qū)的DNA序列，并且 在其下游進一步含有RNA聚合酶I終止子。
更具體地說，本發(fā)明涉及以下(l)-(4)的方法。
(1)生產(chǎn)感染性丙型肝炎病毒(HCV)顆粒的方法，該方法包含將以 下的i)或ii)的表達載體導(dǎo)入由Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2以 及由這些細胞派生的細胞抹中選擇的細胞中的步驟
i)含有下述DNA的表達栽體，該DNA在RNA聚合酶I啟動子的 下游含有編碼來自HCV林的5'非翻譯區(qū)、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、 p7蛋白、NS2蛋白的DNA序列，和編碼來自HCV JFH1抹的NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻譯區(qū)的DNA序列，并且在其下 游進一步含有RNA聚合酶I終止子；或者
ii)含有下述DNA的表達載體，該DNA在RNA聚合酶I啟動子的 下游含有編碼來自HCV抹的5，非翻譯區(qū)、核心蛋白、El蛋白、E2蛋白、 p7蛋白的DNA序列，和編碼來自HCVJFH1抹的NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻譯區(qū)的DNA序列，并且在其下 游進一步含有RNA聚合酶I終止子。
(2) 上述(l)的方法，其中，上述HCV抹是基因型1或基因型2的 HCV林。
(3) 上述(2)的方法，其中，基因型1的HCV林選自H77c林、l抹、 H抹、HC-J1林、Jl林、conl抹、TH林、J抹、JT抹、BK抹。
(4) 上述(2)的方法，其中，基因型2的HCV抹選自J6CF林、JFH1 林、JCH1林、HC-J8抹。
根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)細胞系中由重組DNA生產(chǎn)感染性丙型肝炎病 毒顆粒的方法中，與以往的方法相對，可以以約60倍的高密度高產(chǎn)率 生產(chǎn)具有感染性的HCV顆粒。


圖1A表示使用RNA聚合酶I啟動子/終止子系的HCV表達載體的
構(gòu)建圖。
圖1B表示pHHH77c、 pHHJFHl、 pHH JFH1/GND的圖語。
圖1C表示pHH H77c(C-p7)/JFHl 、 p朋J6(C-p7)/JFHl 、 pHH Jl(C-p7)/JFHl和p朋J1(C-NS2)/JFH1的圖譜。
圖2是在導(dǎo)入了 RNA聚合酶I啟動子/終止子系的HCV表達載體的 細胞中，確認HCVRNA被轉(zhuǎn)錄的實驗結(jié)果的照片。泳道l、 3是將pHH JFH1分別導(dǎo)入到Huh7和HepG2中時的結(jié)果，泳道2、 4是將pHH JFH1/GND分別導(dǎo)入到Huh7和HepG2中的結(jié)果。
圖3表示通過聚合酶I啟動子/終止子系的表達載體轉(zhuǎn)錄的HCV RNA的5，末端的序列。在導(dǎo)入了 PHHJFH1和pHHJFHl/GND的細胞中 轉(zhuǎn)錄的HCVRNA的5'末端與JFH1基因組RNA的序列相同。
圖4是在導(dǎo)入了 RNA聚合酶I啟動子/終止子系的HCV表達栽體的 細胞中，對于HCV蛋白質(zhì)是否被翻譯進行確認的實驗結(jié)果照片。在導(dǎo)入了 pHH JFH1的細胞中，顯示核心蛋白和NS5A蛋白被翻譯。在導(dǎo)入 了 pHHH77c和pHHJFHl/GND的細胞中，HCV蛋白質(zhì)未被翻譯。
圖5是將pHH JFH1和pHH JFH1/GND與GFP表達栽體一起導(dǎo)入到 Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2和293T細胞中后，通過GFP的表 達顯示這些細胞中HCV蛋白的表達和載體的導(dǎo)入效率的照片。pHH JFH1在293T以外的細胞中表達核心蛋白。pHH JFH1/GND在任何細胞 中都未表達核心蛋白。
圖6B表示通過蔗糖密度離心將導(dǎo)入了 pHH JFH1的HepG2細胞培養(yǎng)液 進行分級得到的試樣的核心蛋白質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)了 pHH JFH1培養(yǎng)上清O) 的核心蛋白的比重為1.15 g/mL的級分，顯示核心蛋白以病毒顆粒的形 式分泌。另一方面，表達核心、El、 E2、 p7的細胞的培養(yǎng)上清(x)成為 寬峰。
圖7是表示在將導(dǎo)入了 pHH JFH1的HepG2細胞培養(yǎng)液進行NP40 處理時，與未處理進行比較，核心蛋白的峰發(fā)生變動。與NP40未處理(令) 進行比較，如果用NP40進行處理(B),則核心蛋白的峰位移至比重1.20 g/mL。顯示比重輕的表面膜通過NP40從病毒顆粒上剝離。
圖8是表示將導(dǎo)入了用超濾膜濃縮的pHH JFH1的HepG2細胞培養(yǎng) 液(A)或Huh7細胞培養(yǎng)液(B)接種于Huh7.5.1中，4天后用抗NS5A抗體 進行染色的結(jié)果照片。表示檢測出抗NS5A抗體陽性細胞(感染細胞)。
圖9是表示在pHH JFH1中插入了在SV40啟動子控制下表達Zeocin 抗性基因的盒的載體的圖語。
圖10A中，圖10是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖10A是其最靠近5，末端一側(cè)的序列。
圖10B中，圖IO是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖IOB表示與圖IOA的序列的3'—側(cè)連接的序列。
圖10C中，圖10是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖IOC表示與圖10B的序列的3'—側(cè)連接的序列。
圖10D中，圖10是表示插入片段J6(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖IOD表示與圖IOC的序列的3'—側(cè)連接的最靠近3，末端的序列。
圖11A中，圖11是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 圖，圖11A是其最靠近5，末端一側(cè)的序列。圖11B中，圖11是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 圖，圖IIB表示與圖IIA的序列的3'—側(cè)連接的序列。
圖11C中，圖10是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 圖，圖IIC表示與圖11B的序列的3，一側(cè)連接的序列。
圖11D中，圖11是表示插入片段H77c(C-p7)JFHl的DNA序列的 圖，圖IID表示與圖11C的序列的3，一側(cè)連接的最靠近3，末端的序列。
圖12A中，圖12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖12A是其最靠近5，末端一側(cè)的序列。
圖UB中，圖12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖12B表示與圖12A的序列的3'—側(cè)連接的序列。
圖12C中，圖12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖12C表示與圖12B的序列的3，一側(cè)連接的序列。
圖12D中，圖12是表示插入片段Jl(C-p7)JFHl的DNA序列的圖， 圖12D表示與圖12C的序列的3'—側(cè)連接的最靠近3，末端的序列。
圖13A中，圖13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的圖， 圖13A是其最靠近5'末端一側(cè)的序列。
圖13B中，圖13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的圖， 圖13B表示與圖13A的序列的3'—側(cè)連接的序列。
圖13C中，圖13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的圖， 圖13C表示與圖13B的序列的3'—側(cè)連接的序列。
圖13D中，圖13是表示插入片段J1(C-NS2)JFH1的DNA序列的圖， 圖13D表示與圖13C的序列的3'—側(cè)連接的最靠近3，末端的序列。
具體實施例方式
1.使用RNA聚合酶I啟動子/終止子體系的HCV表達栽體的構(gòu)建 已知轉(zhuǎn)錄RNA的RNA聚合酶有三種。RNA聚合酶I由核糖體RNA
基因轉(zhuǎn)錄rRNA, RNA聚合酶II由編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄mRNA, RNA
聚合酶III由tRNA基因轉(zhuǎn)錄tRNA。
通過該終止子序列終止轉(zhuǎn)錄。而在利用RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄中無需終 止子序列。該轉(zhuǎn)錄終止的方式尚未明確，但可以認為對于mRNA的3， 末端的形成，重要的并不是轉(zhuǎn)錄終止本身，而是初次轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的切斷反應(yīng)。
與RNA聚合酶I和m啟動子下游連接的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，與在 RNA聚合酶II啟動子下游的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同，其5，和3'末端并未分 別附加帽、polyA。天然的HCV基因組RNA的5，和3，末端未附加帽和 polyA。由此顯示，通過RNA聚合酶I或III啟動子使HCV基因組DNA 表達，可以轉(zhuǎn)錄與HCV病毒基因組RNA同樣的RNA。
可利用的啟動子只要是在被轉(zhuǎn)錄的RNA的5，和3，末端未分別附加 帽、polyA即可，優(yōu)選RNA聚合酶I啟動子，進一步優(yōu)選來自rRNA基 因的啟動子。另外，啟動子的來源只要是來自動物即可，但優(yōu)選來自小 鼠、人。特別優(yōu)選的RNA聚合酶I啟動子是人核糖體RNA (rRNA)基因 的啟動子。
并且，終止子序列可以是RNA聚合酶I終止子，優(yōu)選來自rRNA基 因的終止子。終止子的來源只要是來自動物即可，但優(yōu)選來自小鼠、人。 特別優(yōu)選的RNA聚合酶I終止子是小鼠核糖體RNA (rRNA)基因的終止子。
RNA聚合酶I啟動子/終止子體系用于流感病毒顆粒的再構(gòu)成 (Neumann, G.等人.，Virology, 202 (1994) 477-479頁、Neumann, G.和 Kawaoka, Y., Virology, 287 (2001) 243-250頁、日本特表2003-520573)。 本發(fā)明的方法中，可以使用作為RNA聚合酶I啟動子/終止子體系載體 的pHH21 (Neumann, G.等人.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) 9345-9350頁)。pHH21是含有人RNA聚合酶I啟動子作為啟動子、含 有小鼠RNA聚合酶I終止子作為終止子的表達載體。
使用PCR在HCV基因組cDNA的5，端和3'端分別附加限制酶 BsmBI識別序列，然后用BsmBI消化，將HCV基因組插入到pHH21的 BsmBI位點，則在啟動子/終止子與HCV基因組cDNA之間不含有多余 的堿基序列地將它們連接。
通過將上述啟動子、HCV基因組cDNA和終止子適當(dāng)連接，可以新 構(gòu)建本發(fā)明的方法中使用的表達栽體。
使用HCV抹的堿基序列的系統(tǒng)分析法中，HCV被分為基因型la、 基因型lb、基因型2a、基因型2b、基因型3a、基因型3b共六個類型， 并且各類型均分成幾個亞型。關(guān)于HCV的多種基因型，其基因組全長 堿基序列已得到確定(Simmonds， P.等人.,Hepatology, 10 (1994)1321-1324頁、和Choo, Q. L等人.,Science, 244 (1989) 359-362頁、 Okamoto, H等人.,J. Gen. Virol., 73 (1992) 673-679頁、Mori, S.等人 Biochem. Biophis. Res. Commun. 183 (1992) 334-342頁)。
本發(fā)明中，作為HCV林，具體可使用基因型1 (包含基因型la和 lb)的H77c (H77株的共有序列GenBank登錄號AF011751)、 1抹 (GenBank登錄號M62321)、 H林(GenBank登錄號M67463)、 HC-J1林 (GenBank登錄號D10749)、 Jl抹(GenBank登錄號D89815)、 conl林 (GenBank登錄號AJ238799)、TH株(Wakita,T.等人.，J. Biol. Chem., (1994) 269, 14205-14210頁)、J林(GenBank登錄號D90208)、 JT林(GenBank 登錄號D01171)、 BK抹(GenBank登錄號M58335)等，基因型2(包含基 因型2a和2b)的J6CF抹(GenBank登錄號AF177036)、 JFH1抹(GenBank 登錄號AB047639,也稱為JFH-1抹)、JCH1林(GenBank登錄號 AB047640)、 HC-J8株(GenBank登錄號D01221)等。關(guān)于其它的抹也已 在GenBank登錄號的清單中有報告(Tokita,T.等人.，J. Gen. Virol. (1998)79, 1847-1857頁、Cristina J.&Colina R. Virolgy Journal, (2006) 3, 1-8頁)，可以獲得。
插入到RNA聚合酶I啟動子/終止子系載體中的、來自HCV基因組 RNA的cDNA可以利用上述基因型的任何類型，并且可以利用含有它們 的嵌合型的基因型。優(yōu)選來自在導(dǎo)入到Huh7等可接受HCV的細胞中時 發(fā)生HCV基因組RNA的自主復(fù)制的基因型的(Wakita,T.等人.，Nat. Med.， 11, (2005), 791-796頁、Lindenbach BD.，等人.，Science, 309 (2005) 623-626頁)，進一步優(yōu)選與基因型2a的JFH1抹(日本特開2002-171978 號公報)的基因組RNA對應(yīng)的基因組cDNA序列(GenBank登錄號 AB047639, Kato,T等人.，Gastroenterology, 125 (2003) 1808-1817頁，SEQ ID N0.27)。
丙型肝炎病毒(HCV)的基因組是含有約9600個核苷酸的(+)鏈單鏈 RNA。該基因組RNA含有5，非翻譯區(qū)(也表示為5，NTR或5'UTR)、由 結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)構(gòu)成的翻譯區(qū)以及3，非翻譯區(qū)(也表示為3'NTR或 3'UTR)。在該結(jié)構(gòu)區(qū)中編碼HCV的結(jié)構(gòu)蛋白，在非結(jié)構(gòu)區(qū)中編碼多種 非結(jié)構(gòu)蛋白。
上述HCV的結(jié)構(gòu)蛋白(核心、E1、E2和p7)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B)是在被從翻譯區(qū)翻譯成一系列多蛋白后，通過蛋白酶進行限定分解(限定濾)，使其游離并生成。這些結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(即HCV的病毒蛋白)中，Core是核心蛋白，E1和E2是包 膜蛋白。已知非結(jié)構(gòu)蛋白是與病毒自身復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，NS2具有金 屬蛋白酶活性，NS3具有絲氨酸蛋白酶活性(N末端一側(cè)的3分之l)和解 旋酶活性(C末端一側(cè)的3分之2)。并且，NS4A是NS3的蛋白酶活性的 輔因子，NS5B具有依賴于RNA的RNA聚合酶活性。本發(fā)明的生產(chǎn)HCV顆粒的方法中使用的表達栽體具有下述DNA， 所述DNA含有在RNA聚合酶I所識別的啟動子(RNA聚合酶I啟動子) 的下游依次排列HCV基因組cDNA的5'非翻譯區(qū)、核心蛋白編碼序列、 El、 E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列、NS2、 NS3、 NS4(包含NS4A 和NS4B)、 NS5A和NS5B蛋白編碼序列以及3，非翻譯區(qū)的序列，并且 在其下游可以含有RNA聚合酶I所識別的終止子(RNA聚合酶I終止子)。 這些序列被翻譯成一系列的多蛋白后，通過蛋白酶進行限定分解，使其 游離并生成，生產(chǎn)HCV顆粒。生產(chǎn)本發(fā)明的HCV顆粒的方法中，使用含有下述DNA片段的表達 載體，該DNA片段是在RNA聚合酶I啟動子的下游連接由來自任意的 HCV抹的HCV基因組RNA合成的cDNA,再在其下游連接RNA聚合 酶I終止子所得。與RNA聚合酶I啟動子的下游和RNA聚合酶I終止 子的上游連接的上述HCV cDNA可以是與來自一種HCV抹(優(yōu)選為 JFH1抹)的基因組RNA對應(yīng)的基因組cDNA，也可以是由來自兩種以上 HCV林(優(yōu)選至少其中一種為JFH1林)的基因組RNA合成的cDNA所衍 生的嵌合核酸。在RNA聚合酶I啟動子和RNA聚合酶I終止子之間連 接的上述HCV cDNA優(yōu)選為將編碼HCV的5'非翻譯區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白(核心、 El、 E2和p7)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B) 以及3，非翻譯區(qū)的DNA序列按此順序含有各一個的HCV全基因組樣 cDNA序列。特別是，含有下述DNA片段的嵌合HCV表達載體的感梁性HCV 生產(chǎn)能力高，因而非常優(yōu)選，其中所述DNA片段在RNA聚合酶I啟動 子的下游依次含有分別編碼來自HCV林(優(yōu)選基因型1或2的HCV林) 的5'非翻譯區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白的DNA序列，以及根據(jù)需要編碼來自HCV林 的非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA序列，接著是分別編碼來自HCV JFH1抹的非結(jié) 構(gòu)蛋白和3，非翻譯區(qū)的DNA序列，并且在其下游進一步含有RNA聚合酶I終止子。
本發(fā)明的更優(yōu)選的表達栽體是含有下述DNA的表達栽體，其中所 述DNA是在RNA聚合酶I啟動子的下游含有HCV基因組cDNA序列， 在其下游進一步含有RNA聚合酶I終止子，其中所述HCV基因組cDNA 包含來自任意的HCV株的HCV基因組cDNA (即，編碼HCV基因組 RNA全長的DNA)的5，非翻譯區(qū)編碼序列、核心蛋白編碼序列、El、 E2 蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列、NS2蛋白編碼序列，以及來自JFH1 抹的HCV基因組cDNA的NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白編 碼序列以及3，非翻譯區(qū)編碼序列。另外，其它優(yōu)選的表達栽體含有以下 DNA:在RNA聚合酶I啟動子的下游含有HCV基因組cDNA序列，在 其下游進一步含有RNA聚合酶I終止子的DNA，其中所述HCV基因組 cDNA序列包含來自任意的HCV抹的HCV基因組cDNA的5，非翻譯 區(qū)、核心蛋白編碼序列、El、 E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列，以 及來自JFH1抹的HCV基因組cDNA的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B蛋白編碼序列以及3'非翻譯區(qū)編碼序列。
上述表達載體中，任意的HCV抹優(yōu)選為基因型1或2的HCV抹。 上述表達載體中的5'非翻譯區(qū)編碼序列優(yōu)選為來自JFH1抹的序列或來 自選自基因型1和基因型2的HCV抹中的兩種以上HCV林的嵌合序列， 為嵌合序列時，進一步優(yōu)選含有來自JFH1抹的序列。作為基因型1的 HCV林，例如可使用H77c抹、l抹、H抹、HC-J1株、Jl抹、conl抹、 TH林、J株、JT抹、BK林等。作為基因型2的HCV抹，例如可使用 J6CF株、JFH1抹、JCH1抹、HC-J8抹等。更優(yōu)選的HCV林有JFH1抹、 J6CF株、Jl抹、H77c林。
作為一個例子，在來自JFH1林的全長基因組cDNA中，可整合到 本發(fā)明的表達載體中的、編碼由5，非翻譯區(qū)至NS2蛋白的區(qū)域在SEQ ID
基編號1-3430,編碼°由NS3蛋白至3'非翻譯區(qū)的區(qū)^是堿基編號 3431-9678。同樣，在來自JFH1林的全長基因組cDNA中，編碼由5，
編號1-2779,編碼由NS2蛋白至3，非翻譯區(qū)的區(qū)域是堿基編號 2780-9678。對于其它的來自HCV株的基因組cDNA上的各區(qū)的位置， 也可以以該JFH1林的基因組cDNA序列為基準確定。本發(fā)明的特別優(yōu)選的表達載體的例子是含有后述實施例所示的DNA片段J6(C-p7)JFHl (SEQ ID N0.29)、 H77c(C-p7)JFHl (SEQ ID NO.30)、 Jl(C-p7)JFHl(SEQIDN0.31)、 J1(C-NS2)JFH1 (SEQ ID N0.32) 中的任意序列的表達載體。優(yōu)選這些DNA片段在載體中的表達啟動子 的控制下插入。如果HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B中的GDD氨基酸序列突變?yōu)镚ND， 則無法發(fā)生自主復(fù)制(Kato，T. 等人.，Gastroenterology, 125 (2003)1808-1817頁)，因此作為實驗的對照，可以使用氨基酸序列突變 為GND的NS5B蛋白。2. 細胞內(nèi)HCVRNA的合成的確認可將上述制備的本發(fā)明的表達載體導(dǎo)入細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)錄HCV RNA。 DNA向細胞的導(dǎo)入可使用電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法等常規(guī)方法進行。由表達載體DNA轉(zhuǎn)錄的HCV RNA的分析可通過通常的分子生物 學(xué)方法(Molecular Cloning 3rd Edition Sambrook & Russell Cold Spring Harbor Laboratory Press 200l)分析。具體來說，可使用RNA印跡法、核 糖核酸酶保護測定法、RT-PCR法和RACE法等，對所轉(zhuǎn)錄的RNA的量 或序列進行分析。對RNA進行定量時，可以采用RNA印跡法、RT-PCR 法，對RNA的序列進行分析時可以采用RACE法。對在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的HCVRNA的5'末端的序列進行分析時，可使用 RNA連接酶將特定序列的合成RNA接頭與HCV RNA連接，以此為模 板，使用與HCV RNA互補的合成DNA引物，通過反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。 接著，由接頭內(nèi)的序列和之前使用的引物5，側(cè)的引物進行PCR,擴增與 HCVRNA互補的片段，克隆到質(zhì)粒載體中，然后確定堿基序列，由此 可以對在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的HCVRNA的序列進行分析。最初的PCR未擴增 DNA片段時，通過嵌套式PCR法進行也可以進行分析。3. 細胞內(nèi)HCV蛋白表達的確認在感染了HCV、并有HCV基因組RNA復(fù)制的細胞中，上述HCV 蛋白表達。因此，如果從由HCV基因組RNA復(fù)制細胞中提取的蛋白質(zhì) 中檢測出HCV蛋白質(zhì)，則可以判斷該細胞正在復(fù)制HCV基因組RNA。HCV蛋白質(zhì)的檢測可按照公知的任意蛋白質(zhì)檢測方法進行，例如，可將
蛋白反應(yīng)來進行:更^具體地說，例如將由細胞^取的蛋i質(zhì)試樣轉(zhuǎn)印在 硝基纖維素膜上，使抗HCV蛋白抗體(例如抗NS3特異性抗體、或由丙 型肝炎患者采集的抗血清)與其反應(yīng)，再檢測該抗HCV蛋白抗體來進行。 表達HCV蛋白質(zhì)的宿主細胞只要是可繼代培養(yǎng)的細胞即可，沒有 特別限定，優(yōu)選為真核細胞，更優(yōu)選為人細胞，進一步優(yōu)選來自人肝臟 的細胞、來自人子宮頸的細胞、或來自人胎兒腎的細胞。細胞優(yōu)選含有 癌細胞抹、干細胞抹等的增殖性細胞，更優(yōu)選Huh7細胞(ATCC CCL-185)、 HepG2細胞(ATCC HB 8065)、 IMY-N9細胞(Date，T.等人., J.Biol. Chem.， (2004) 279, 22371-22376頁)、HeLa細胞(ECACC 93021013)、 RCYM1RC細胞(Mumkami, K.，等人.，Virology， 351, 381-392, 2006)、 5-15RC細胞(Pietschmann T.,等.,J Virol. (2001) 75, 1252-1264頁) 以及由這些細胞所派生的細胞抹等。特別優(yōu)選的細胞有Huh7細胞、 RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞以及由這些細胞派生的細 胞抹。這些細胞可以利用市售的商品，也可以由細胞保藏機構(gòu)獲得并使 用，可以使用由任意的細胞(例如癌細胞或干細胞)抹化的細胞。由Huh7 細胞派生的細胞抹有Huh7.5細胞(Blight, KJ.等人.,Virol.， (2002) 76, 13001-13014頁)和Huh7.5.1細胞(Zhong， J.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci USA, (2005) 102, 9294-9299頁)。前者是在Huh7細胞中基因?qū)霃?fù)制子， 然后建立復(fù)制子復(fù)制細胞、將其用干擾素處理、排除復(fù)制子、由此得到 的hcv復(fù)制能力高的細胞，后者是通過干擾素y處理，從用Huh7.5細 胞制備的復(fù)制子復(fù)制細胞中排除復(fù)制子而得到的復(fù)制效率好的細胞。
4. HCV顆粒產(chǎn)生的確認
將本發(fā)明的表達栽體導(dǎo)入HCV可接受性細胞(可接受HCV增殖的 細胞)，培養(yǎng)該細胞，由此可產(chǎn)生具有由本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)錄的HCV 基因組RNA的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒。HCV可接受性細胞優(yōu)選使用 Huh7細胞、RCYM1RC細胞、5-15RC細胞、HepG2細胞以及由這些細 胞所派生的細胞抹等。上述生成的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒保持對其它 細胞的感染性。本發(fā)明涉及上述感染性丙型肝炎病毒顆粒的生產(chǎn)方法。
細胞的病毒顆粒生產(chǎn)能力可使用公知的任意的病毒檢測法確認。例:i口， 3t 反Vv刀it咎廣王辨母顆 分級，測定各級分的密度、HCV核心蛋白濃度以及HCV基因組RNA 的量，如果HCV核心蛋白與HCV基因組RNA的峰一致，并且檢測出 該峰的級分的密度比將培養(yǎng)上清用0.25% NP40 (聚氧乙烯(9)辛基苯基醚，Polyoxyethylene(9)Octylphenyl Ether)處理之后分級時的相同級分的密度輕， 則可以判定該細胞具有病毒顆粒產(chǎn)生能力。有報道稱，游離的HCV顆 粒的比重是1.14-1.16 g/mL (Kaito, M.等人.，J. Gen. Virol. 75 (1994) 1755-1760頁)，也可以與該值進行比較。釋放到培養(yǎng)液中的HCV病毒顆粒例如可使用核心蛋白、El蛋白或 E2蛋白的抗體檢測。培養(yǎng)液中的HCV病毒顆粒所含有的HCV基因組 RNA可以通過使用特異性引物的RT-PCR法擴增并檢測，由此可以間接 檢測HCV病毒顆粒的存在。5.本發(fā)明的HCV顆粒對其它細胞的感染通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的HCV病毒顆粒對細胞(優(yōu)選HCV可接受 性(感受性)細胞)具有感染能力。本發(fā)明提供丙型肝炎病毒感染細胞的制 備方法，該方法包含將導(dǎo)入了使用RNA聚合酶I啟動子/終止子體系的 HCV表達載體的細胞進行培養(yǎng)，將所得培養(yǎng)物(優(yōu)選培養(yǎng)液)中的病毒顆 粒感染其它細胞(優(yōu)選HCV感受性細胞)。這里，HCV可接受性細胞是 指具有HCV基因組RNA的復(fù)制能力和/或被HCV感染的能力的細胞。 HCV可接受性細胞優(yōu)選為肝臟細胞或淋巴細胞系細胞，但并不限于此。 具體來說，作為肝臟細胞，可列舉原代肝臟細胞、Huh7細胞、HepG2 細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞等，作為淋巴細胞系細胞， 可列舉Molt4細胞、HPB-Ma細胞、Daudi細胞等，但并不限于這些。 作為特別優(yōu)選的HCV可接受性細胞，可列舉Huh7細胞、RCYM1RC細 胞、:5-15RC細胞、HepG2細胞以及由這些細胞所派生的(制備的)細胞株。 作為由Huh7細胞派生的細胞中優(yōu)選的細胞，可列舉Huh7.5細胞和 Huh7.5.1細胞。導(dǎo)入到細胞中，用該細胞中產(chǎn)生的HCV顆粒感染細胞(例如HCV可接 受性細胞)，則在該感染細胞中，HCV基因組RNA被復(fù)制，進而形成病 毒顆粒。導(dǎo)入到細胞中，將該細胞中產(chǎn)生的HCV病毒顆粒感染黑猩猩等可感染 HCV病毒的動物，可引發(fā)HCV引起的肝炎。
導(dǎo)入到細胞中，該細胞中產(chǎn)生的HCV顆粒是否具有感染性，可以如下 判斷將導(dǎo)入了本發(fā)明的使用RNA聚合酶I啟動子/終止子系的HCV表 達栽體的細胞進行培養(yǎng)，將所得的上清對HCV可接受性細胞(例如Huh7) 進行處理，例如在48小時后用細胞抗核心抗體進行免疫染色，對感染 細胞數(shù)進行計數(shù)，或者通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠對細胞提取物進行電 泳，通過蛋白質(zhì)印跡法^r測核心蛋白。
6.感染性HCV顆粒產(chǎn)生細胞株的獲得
穩(wěn)定地導(dǎo)入了本發(fā)明的使用RNA聚合酶I啟動子/終止子系的HCV 表達載體的細胞可持續(xù)地生產(chǎn)感染性HCV顆粒。為了獲得穩(wěn)定地表達 本發(fā)明的使用RNA聚合酶I啟動子/終止子系的HCV表達載體的細胞 抹，優(yōu)選將抗藥性基因整合到該栽體中。作為抗藥性基因，可列舉G418 抗性基因、潮霉素抗性基因、噪呤霉素抗性基因、2eocin抗性基因、殺 稻痘素抗性基因等。以抗藥性為指標篩選的克隆的HCV顆粒生產(chǎn)能力 可通過采用RNA印跡、定量RT-PCR檢測這些克隆的培養(yǎng)上清中的核 心蛋白質(zhì)量或由克隆復(fù)制的HCV RNA的量來推定。
本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)主張基礎(chǔ)的日本特許出愿 2005-287646號說明書和/或附圖所記載的內(nèi)容》
本說明書中所引用的所有刊物、專利和專利申請全體均作為參照可I 用到本說明書中。
實施例
以下給出實施例更具體地說明本發(fā)明。但這些實施例只是用于說 明，并不限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。 [實施例1]
使用RNA聚合酶I啟動子/終止子系的HCV表達載體的構(gòu)建 作為HCV基因組RNA的cDNA，使用來自基因型2a的JFH1株的 基因組RNA的cDNA (GenBank登錄號AB047639、 Kato, T.等人,Gastroenterology, 125(2003) 1808-1817頁)、來自發(fā)生了 DNA序列變 換的JFHl林的基因組RNA的cDNA,其中JFHl林的NS5B中的GDD 氨基酸序列變異為GND(Wakita等人，Nat Med.， 11 (200》791-796頁)、 來自J6CF抹的基因組RNA的cDNA (GenBank登錄號AF 177036、Yanagi, M.等人.，Virology, 262(1999) 250-263頁)、來自基因型la的H77c林的 基因組RNA的cDNA(GenBank登錄號AF011751 、 Yanagi， M.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997) 8738-8743頁)、以及來自基因型lb的Jl 林的基因組RNA的cDNA (GenBank登錄號D89815、 Aizaki， H.等人. Hepatology, 27 (1998) 621-627頁)。
使用PCR，分別在上述HCV基因組cDNA (JFHl 、 JFH1/GND和H77c) 的5'端和3'端附加限制酶BsmBI識別序列。利用BsmBI的切斷位點與 該酶的識別位點有一定距離的性質(zhì)，在啟動子/終止子與HCV基因組之 間沒有多余堿基序列地將HCV基因組插入到具有人RNA聚合酶I啟動 子和小鼠RNA聚合酶I終止子序列的p腦l載體(Neumann， G.等人， Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 96 (1999) 9345-9350頁)的BsmBI位點(圖 1A)。另夕卜，各克隆的圖譜如圖1B所示。所得的含有HCV基因組cDNA 的載體分別稱為pHH JFHl 、 pHH JFH1/GND和pHH H77c。
并且，分別來自J6CF和JFH1、 H77c和JFHl、 Jl和JFHl的基因 組cDNA的嵌合HCV表達載體的制備按以下方法進行。
PHH J6(C-p7)/JFHl的制備
將與來自JFHl株的基因組RNA全部區(qū)域?qū)?yīng)的cDNA克隆到 pUC19質(zhì)粒中，由此構(gòu)建作為質(zhì)粒DNA的pJFHl (Wakita,T.等人.，Nat. Med, 11 (2005), 791-796頁、國際公開WO2004/104198),將其用Agel 消化后，再用Bcll進行部分消化，純化由Agel位點至最初的Bell位點 的片段(2672 bp)被除去的質(zhì)粒DNA片段。另夕卜，將來自J6CF抹的基因 組cDNA用Agel和Bell部分消化，將所得的2672 bp片段與上述片段 連接，得到pUC J6/JFH1。
接著，將pHH JFHl用Noel消化，得到約4.3 kb的片段；將pUC J6/JFH1用Noel消化，得到約8.2 kb的片段，將它們用連接酶連接，得 到表達栽體pHH J6(C-p7)/JFHl 。該pHH J6(C-p7)/JFHl的插入片段 (J6(C-p7)JFHl， SEQIDN0.29,圖10A-D)含有分別編碼來自JFHl抹和 J6CF林的嵌合的5，非翻譯區(qū)、來自J6CF林的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白、以及p7蛋白的DNA序列，以及分別編碼來自JFH1林的NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3'非翻譯區(qū)的DNA序歹U 。
dHHH77c〖C-d7VJFH1的制備
以上述JFH1基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR試劑盒(夕力 ，六4才社)所附帶的10x緩沖液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10pM引物5-JFH-S (SEQ ID NO. 10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和 5-JFH-A (SEQ ID NO. 11: TCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1 pL， 最后加入去離子水，使總量為49 ^L。接著加入1 |aL Takara LA Taq (夕 力，戶xf才社)，然后進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、 64。C2分鐘、72。C3分鐘的步驟作為一個循環(huán)，進行30個循環(huán)。將所得 PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物no丄接著，以JFHl基因組cDNA為模板，分 別加入LA-PCR試劑盒(夕力才制備)所附帶的10x緩沖液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 pM引物3-JFH-S (SEQ ID NO.12: GGCATACGCA丁ATGACGCACC丁GTGCACGG)和3JFH-A(SEQ ID NO. 13: GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC)各1 ^L,最后力口入去離子水，使總量 為49iiL。接著加入lpLTakamLAT叫(夕力才公司)，然后進行 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、64。C2分鐘、72°C3分鐘的 步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物 no.2。再以上述H77c基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR試劑盒(夕 力，"、4才社)所附帶的10x緩沖液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 pL、 10 j^M引物5-H77-S (SEQ ID NO. 14 ACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACC) 和5誦H77-A (SEQ ID NO. 15: GMGCCGCACGTMGGGTATCGA丁G:)各1 pL， 最后加入去離子水，使總量為49 nL。接著加入lpL Takara LA Taq (夕 力，A4才社)，然后進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、 64匸2分鐘、72。C3分鐘的步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得 PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物no丄再以上述H77c基因組cDNA為模板，分 別加入LA-PCR試劑盒(夕力，"4才社)所附帶的10x緩沖液5 nL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 pM引物3-H77-S (SEQ ID N0.16: CATTGTGCCCGCAAAGAGCGTGTGT )和 3-H77-A (SEQ ID NO. 17 : GTGCGTCATATGCGTATGCCCGCTGAGGCA)各1 ，最后加入去離子7JC， 使總量為49pL。接著加入lpLTakaraLAT叫(夕力才社)，然后進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、64。C2分鐘、72°C3分 鐘的步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn) 物no.4。
接著，將各PCR產(chǎn)物進行純化，溶解于50 ^L水中。將PCR產(chǎn)物 no.l和PCR產(chǎn)物no.3的DNA稀釋100倍，各取1 混合。以該混合 液為模板，不加入引物，在上述條件下進行5個循環(huán)的PCR。然后添加 引物5-JFH-S (SEQ ID NO.10)和5-H77-A (SEQ ID NO. 15)，再進行25個 循環(huán)的PCR，由此純化擴增的嵌合DNA片段。將該片段克隆到質(zhì)粒載 體pCRII上，確定該DNA片段的堿基序列，確認堿基序列正確。將嵌 合DNA片段克隆到pCRII上，將所得的該質(zhì)粒命名為pCR5HJ。接著， 將PCR產(chǎn)物no.2和PCR產(chǎn)物no.4的DNA稀釋100倍，各取1 pL混合。 以該混合液為;f莫板，不加入引物，在上述條件下進行5個循環(huán)的PCR。 然后添加引物3-H77-S (SEQ ID N0.16)和3-JFH-A (SEQ ID NO.13),再 進行25個循環(huán)的PCR，由此純化擴增的嵌合DNA片段。將該片段克隆 到質(zhì)粒載體pCRII上，確定該DNA片段的堿基序列，確認堿基序列正 確。將嵌合DNA片段克隆到pCRII上，將所得的該質(zhì)粒命名為pCR3HJ。
接著，將pCR5HJ用限制酶Agel和Kpnl 、將H77c基因組cDNA用 限制酶Kpnl和Ascl、將pCR3HJ用限制酶Ascl和Notl消化，將各HCV cDNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分級，純化。將該三個DNA片段 與將pHH JFH1用Agel和Notl消化得到的載體連接。將該載體命名為 pHH H77c(C-p7)/JFH。該表達載體pHH H77c(C-p7)/JFH的插入片段 (H77c(C-p7)/JFH; SEQIDNO.30,圖11A-D)含有分別編碼來自JFH1抹 和H77c抹的嵌合的5'非翻譯區(qū)、來自H77c株的核心蛋白、El蛋白、 E2蛋白和p7蛋白的DNA序列，以及分別編碼來自JFH1抹的NS2、NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白和3，非翻譯區(qū)的DNA序列。
PHH Jl〖C-p7)/JFHl的制備
以上迷JFH1基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR試劑盒(夕力 ，八4才社)中所附帶的10x緩沖液5pL、 2.5 mM dNTP混合液5 nL、 10|iM引物5曙JFH-S (SEQ ID NO. 10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和 5-JFH-A2 (SEQ ID N0.1& TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1 pL, 最后加入去離子水，使總量為49 ^L。接著加入1 pL Takara LA T叫(夕
20力，^4才社)，然后進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、 64。C2分鐘、72。C3分鐘的步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得 PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物no.5。
接著，以JFHl基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR試劑盒(夕 力，乂《4才社)中所附帶的10x緩沖液5 nL、 2.5 mM dNTP混合液5 pL、 10pM 引 物 3陽JFH-S2 (SEQ ID N0.19 : AGCTTACGCCTATGACGCACCTGTGCACGG )和3-JFH-A (SEQ ID NO. 13: GCTCTGACGAAGTACGGCACATGTGTC )各1 ,最后加入去離子水，{吏總量 為49 ^L。接著加入1 nL Takam LA Taq (夕力，,才社)，然后進行PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、64。C2分鐘、72°C3分鐘的步驟 作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物no.6。
接著，以與來自基因型lb的Jl抹的基因組RNA對應(yīng)的cDNA (GenBank登錄號D89815、 Aizaki, H.等人,Hepatology, 27 (1998) 621-627 頁)為才莫板，分別加入LA-PCR試劑盒(夕力，六4才社)中所附帶的10x 緩沖液5 pL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 引物3-J1-S (SEQ ID NO.20 : ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC )和 5J1-A (SEQ ID N0.21: AAGCGGGATGTACCCCATGAG)各1 最后加入去離子水，使總
量為49piL。接著加入1 ]iLTakaraLATaq(夕力，乂、M才社)，然后進行 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、64。C2分鐘、72°C3分鐘的 步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物 no.7。
接著，以來自上述Jl抹的基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR 試劑盒(夕力，"4才社)中所附帶的10x緩沖液5 iaL、 2.5mMdNTP混 合液 5 nL 、10 pM 引物 3-J1-S (SEQ ID N0.22 : CGGCTGTACATGGATGAATAGCAC丁GGGTT )和 3-J1-A (SEQ ID N0.23 : GTGCGTCATAGGCGTMGCTCGTGGTGGTA )各1 ^,最后力口入去離子水，使
總量為49^iL。接著加入lpLTakaraLATaq(夕力，戸4才社)，然后進 行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、64。C2分鐘、72°C3分鐘 的步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物 no. 8。
接著，將各PCR產(chǎn)物進行純化，溶解于50 nL水中。將PCR產(chǎn)物 no.5和PCR產(chǎn)物no.7的DNA稀釋100倍，各取1 混合。以該混合液為模板，不加入引物，在上迷條件下進行5個循環(huán)的PCR。然后添加 引物5-JFH-S (SEQ ID NO.10)和5-J1-A (SEQ ID N0.21),再進行25個循 環(huán)的PCR,由此純化擴增的嵌合DNA片段。將該片段克隆到質(zhì)粒載體 pCRII上，確定該DNA片段的堿基序列，確認堿基序列正確。將嵌合 DNA片段克隆到pCRII上，將所得的該質(zhì)粒命名為pCR5JJ。
再將PCR產(chǎn)物no.6和PCR產(chǎn)物no. 8的DNA稀釋100倍，各取1 pL 混合。以該混合液為模板，不加入引物，在上述條件下進行5個循環(huán)的 PCR。然后添加引物3-J1-S (SEQ IDN0.22)和3-JFH-A (SEQ IDN0.13), 再進行25個循環(huán)的PCR，由此純化擴增的嵌合DNA片段。將該片段克 隆到質(zhì)粒載體pCRII上，確定該DNA片段的堿基序列，確認堿基序列 正確。將嵌合DNA片段克隆到pCRII上，將所得的該質(zhì)粒命名為pCR3JJ。
接著，將pCR5JJ用限制酶Agel和Clal、將Jl基因組cDNA用限 制酶Clal和AvrII、將pCR3JJ用限制酶AvII和Kpnl消化，將各HCV cDNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分級，純化。將該三個DNA片段 與將pHH JFH1用Agel和Kpnl消化得到的載體連接。將該載體命名為 pHH Jl(C-p7)/JFH 。該表達載體pHH Jl(C-p7)/JFH的插入片段 (Jl(C-p7)/JFH; SEQIDN0.31,圖12A-D)含有分別編碼來自JFH1抹和 Jl抹的嵌合的5，非翻譯區(qū)、來自Jl抹的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和 p7蛋白的DNA序列，以及分別編碼來自JFH1林的NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白和3'非翻譯區(qū)的DNA序列。
pHH J1〖C-NS2VJFH1的制備
以上述JFH1基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR試劑盒(夕力 ，乂《^f才社)中所附帶的10x緩沖液5iiL、 2.5mMdNTP混合液5^iL、 10 pM引物5-JFH曙S (SEQ ID NO.10: GCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT)和 5-JFH國A2 (SEQ ID N0.1& TTGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)各1 pL， 最后加入去離子水，使總量為49pL。接著加入1 nLTakaraLATaq(夕 力，^J才社)，然后進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、 64。C2分鐘、72。C3分鐘的步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得 PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物no.9。
接著，以JFHl基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR試劑盒(夕 力，,《4才社)中所附帶的10x緩沖液5nL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、lOpM 引 物 3-JFH-NS3曙S (SEQ ID N0.24 : GCGAC丁CCTTGCTCCCATCACTGCTTATGC)和3-JFH-NS3-A (SEQ ID N0.25: TGGGAGACCTTGTAACAACGTCGAGTGT)各1 最后加入去離子水，使總
量為49 pL。接著加入1 nL Takara LA Taq (夕力，乂《4才社)，然后進行 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94。Cl分鐘、64。C2分鐘、72°C3分鐘的 步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物 no.10。
接著，以來自基因型lb的Jl抹的基因組RNA的cDNA (GenBank 登錄號D89815、 Aizaki, H.等人.Hepatology, 27 (1998) 621-627頁)為模板， 分別加入LA-PCR試劑盒(夕力，^4才社)中所附帶的10x緩沖液5 nL、 2.5 mM dNTP混合液5 ^L、 10 |iM引物5-J1-S (SEQ ID N0.2(h ACCGTGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC)和5-J1-A (SEQ ID NO.21 : AAGCGGGATGTACCCCATGAG)各1 ^L,最后加入去離子水，使總量為49 |iL。 接著加入1 pL Takara LA Taq (夕力，"、4才社)，然后進行PCR反應(yīng)。 PCR反應(yīng)是以含有94。C1分鐘、64°C2分鐘、72°C3分鐘的步驟作為一 個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物no.ll。
接著，以來自Jl林的基因組cDNA為模板，分別加入LA-PCR試 劑盒(夕力，乂《4才社)中所附帶的10x緩沖液5 piL、 2.5 mM dNTP混合 液 5 pL 、 10 pM 引物 3-J1-S (SEQ ID N0.22 : CGGCTGTACATGGATGAATAGCACTGGGTT)和3-Jl-NS3國A (SEQ ID N0.26: CATAAGCAGTGATGGGAGCAAGGAGTCGCC )各1 jiL,最后力口入去離子水，使 總量為49pL。接著加入l 1iLTakaraLATaq(夕力，^M才社)，然后進 行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是以含有94°C1分鐘、64。C2分鐘、72°C3分鐘 的步驟作為一個循環(huán)，進行25個循環(huán)。將所得PCR產(chǎn)物作為PCR產(chǎn)物 no. 12。
將各PCR產(chǎn)物進行純化，溶解于50pL水中。將PCR產(chǎn)物no.9和 PCR產(chǎn)物no.ll的DNA稀釋100倍，各取1 pL混合。以該混合液為才莫 板，不加入引物，在上述條件下進行5個循環(huán)的PCR。然后添加5-JFH-S (SEQ ID NO.10)和5-J1-A (SEQ ID N0.21)作為引物，再進行25個循環(huán)的 PCR，由此純化擴增的嵌合DNA片段。將該片段克隆到質(zhì)粒栽體pCRII 上，確定該DNA片段的堿基序列，確認堿基序列正確。將嵌合DNA片 革殳克隆到pCRII上，將所得的該質(zhì)粒命名為pCR5JJ。再將PCR產(chǎn)物no.lO和PCR產(chǎn)物no.12的DNA稀釋100倍，各取 lliL混合。以該混合液為模板，不加入引物，在上述條件下進行5個循 環(huán)的PCR。然后添加3-J1-S (SEQ ID N0.22)和3-JFH-NS3-A (SEQ ID N0.25)作為引物，再進行25個循環(huán)的PCR,由此純化擴增的嵌合DNA 片段。將該片段克隆到質(zhì)粒載體pCRII上，確定該DNA片段的堿基序 列，確認堿基序列正確。將嵌合DNA片段克隆到pCRII上，將所得的 該質(zhì)粒命名為pCR3JJNS3。
接著，將pCR5JJ用限制酶Agel和Clal、將Jl基因組cDNA用限 制酶Clal和AvrII、將pCR3JJNS3用限制酶AvII和BspDI消化，將各 HCV cDNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分級，純化。將該三個DNA 片段與將pHH JFH1用Agel和BspDI消化得到的載體連接。將該載體命 名為pHH J1(C-NS2)/JFH。該表達載體pHH J1(C-NS2)/JFH的插入片段 (J1(C-NS2)/JFH; SEQ ID N0.32,圖13A-D)含有分別編碼來自JFH1 抹和Jl抹的嵌合的5，非翻譯區(qū)、來自Jl抹的核心蛋白、El蛋白、E2 蛋白、p7蛋白和NS2蛋白的DNA序列，以及分別編碼來自JFH1抹的 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻譯區(qū)的DNA序列。
各表達載體克隆的圖譜如圖1C所示。
細胞內(nèi)HCV RNA合成的確認
使用Fugene6 (口 〉二社)，按照所附說明書，將實施例1中制備的 pHH JFH1和pHH JFH1/GND導(dǎo)入到Huh7和HepG2細胞中。24小時后， 通過Isogen(日本^一7社)，按照所附說明書，由各細胞制備RNA。
以這些RNA為模板，如下通過RACE法確認是否由pHH JFH1和 pHH JFH1/GND合成了 HCV RNA。
通過T4RNA連接酶(Takara社)，使用所附緩沖液，將2pg上述制 備的RNA 和2.5pM RNA 接頭(SEQ ID NO.l : GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA )連接。接著， 以連接有RNA接頭的RNA為模板，使用與HCV RNA互補的引物(SEQ ID N0.2: gtaccccatgaggtcggcaaag)，通過反碑爭錄酶Superscript III (^f》匕'卜 口r工7社)，按照所附說明書合成cDNA。
接著，以合成的上述cDNA為模板，使用5，末端RNA接頭的正義引物(SEQ ID N0.3: GCTGATGGCGATGAATGAACACTG)和3'末端的反義引物 (SEQIDN0.4: gaccgctccgaagttttccttg)兩種引物，通過PCR擴增DNA。再 以擴增的DNA為模板，使用含有擴增的DNA內(nèi)側(cè)序列的5'末端的引物 (SEQ ID N0.5: GMCACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG)和3'末端的引物(SEQ ID N0.6: cgccctatcaggcagtaccacaag)的引物對進行第二次PCR。該PCR是使 用市售的試劑盒Ex Taq (Takara)，在96。C加熱處理5分鐘，然后以96°C 1 分鐘、55"C1分鐘、72。C2分鐘的反應(yīng)循環(huán)進行35個循環(huán)，之后在4°C 下保存。接著，為了確認是否得到了上述第二次的PCR產(chǎn)物，將反應(yīng)液 的一部分通過瓊脂糖凝膠電泳確認。結(jié)果(圖2),在Huh7細胞和HepG2
況。并且，將第二次的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-TE:sy (Promega社)載體 中。在所得質(zhì)粒DNA中克隆的DNA堿基序列用DNA測序儀(ABI PRISM 377)確定。結(jié)果，由pHH JFH1和pHH JFH1/GND轉(zhuǎn)錄的HCV RNA的5， 末端序列與HCV基因組的5'末端相同。圖3中給出了由pHHJFHl轉(zhuǎn)錄 的HCV RNA的5，末端和接頭序列。
細胞內(nèi)的HCV蛋白質(zhì)表達的確認
在導(dǎo)入了 pHHJFHl、 pHHH77c和pHHJFHl/GND的細胞中，確認 轉(zhuǎn)錄之后是否發(fā)生了 HCV蛋白質(zhì)的翻譯。
使用Fugene6 (口 i>工社)，按照所附說明書，將pHH JFH1 、pHH H77c 和pHH JFHl/GND導(dǎo)入到Huh7細胞中。培養(yǎng)4天后，按照常規(guī)方法制 備細胞提取液。接著，通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法對這些提取液中 的蛋白質(zhì)進行分析。分析時，將含有核心基因的表達質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn) 染Huh7細胞，以所得細胞提取液作為陽性對照。并且，將由未轉(zhuǎn)染的 Huh7細胞得到的細胞提取液作為陰性對照。將由各細胞克隆提取的試 樣進行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印PVDF膜(Immobilon-P, Millipore社制)，使 用抗核心特異性抗體(兔多克隆抗體)、以及小鼠單克隆抗體(Austral社) 和識別這些抗體的HRP標記二次抗體作為抗NS5A抗體，通過ECL(7
t ^厶7 7Vk7 、:> 7社)檢測在細胞內(nèi)被翻譯的核心蛋白和NS5A蛋 白。
結(jié)果如圖4所示，在導(dǎo)入了 pHHJFHl的細胞中，可見核心和NS5A蛋白的表達。但在導(dǎo)入pHH H77c和pHH JFH1/GND的細胞中未檢測出 這些蛋白質(zhì)的表達。由該結(jié)果可認為，在導(dǎo)入了 pHH JFH1的細胞中， 由pHH JFH1轉(zhuǎn)錄為RNA之后，該RNA在細胞內(nèi)復(fù)制，然后發(fā)生蛋白 質(zhì)的翻譯，達到了蛋白質(zhì)可檢測的水平，而在導(dǎo)入了 pHHJFHl/GND的 細胞中，由pHH JFH1/GND轉(zhuǎn)錄RNA后，該RNA變異為NS5B,因此 在細胞內(nèi)無法復(fù)制，未達到可檢測蛋白質(zhì)的水平。另一方面，HCV基因 組RNA雖然在培養(yǎng)細胞中自主復(fù)制(">1& Lemon ST.， J. Virol" 78 (2004) 7904-7915頁)，但在pHHH77c中未能檢測HCV蛋白的表達的原 因尚不明確。
下面，對于在什么樣的細胞林中表達HCV蛋白進行研究。使用 Fugen6 (口 、〉 -社)，按照所附說明書，將pHH JFH1和pHH JFH1/GND 與GFP表達載體(pGreenLantern:Life Technologies Inc.)—起導(dǎo)入到Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2和293T細胞中。導(dǎo)入4天后，通過焚光 顯微鏡觀察GFP的表達，確認導(dǎo)入到各載體中后，由各細胞制備細胞提 取液。接著，通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法對這些提取液中的核心蛋 白進行分析。核心蛋白的檢測是使用抗核心特異性兔多克隆抗體和識別 該抗體的HRP標記二次抗體，通過ECL (7* "T 、〉々厶7 7 i> 7*社) 進行。結(jié)果如圖5所示，在Huh7、 RCYM1RC、 5-15RC、 HepG2細胞中 ^r測出了核心蛋白。 HCV顆粒的生成
接著，為了確認是否由pHHJFHl導(dǎo)入細胞生成了 HCV顆粒，對培 養(yǎng)上清中的核心蛋白進行分析。作為pHH JFH1和對照，使用Fugene6, 向HepG2細胞中導(dǎo)入表達核心、El、 E2和p7的載體pCAG327JFHl， 2 天后除去培養(yǎng)上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)兩天。接著回收細胞和 培養(yǎng)液，由細胞提取蛋白質(zhì)，按照實施例3所示的方法對細胞中的核心 蛋白的表達進行分析。結(jié)果確認了核心蛋白的表達(圖6A)。為了確認培 養(yǎng)液中HCV顆粒的存在，通過蔗糖密度梯度對培養(yǎng)液進行分級。在 10-60% (重量/重量)的密度梯度蔗糖溶液(溶解于50 mM Tris pH 7.5/0.1 M NaCl/1 mM EDTA中)再鋪0.2 mL樣品的培養(yǎng)上清。將其用《少夕t 7口一夕一SW41E、以35,000 RPM、 4。C離心16小時，離心結(jié)束后，從離心管底將各級分回收0.5 mL。對各級分的密度、HCV核心蛋白濃 度進行定量。HCV核心蛋白的測定是使用才一y HCV抗原IRMA測試儀 進行(Aoyagi等人.，J. Clin. Microbiol., 37 (1999) 1802-1808頁)。
如圖6B所示，在1.15 U8mg/mL的級分中可見核心蛋白的峰。與 此相對，在表達核心、El、 E2和p7的細胞中未觀察到核心蛋白的峰。
存在于1.15-1.18 mg/mL級分中的核心蛋白和HCV RNA如果形成 HCV顆粒，則應(yīng)該對表面活性NP40的處理具有感受性。因此，將pHH JFH1導(dǎo)入HepG2中，將2~4天的培養(yǎng)液用0.2%的NP40處理20分鐘， 然后通過蔗糖密度梯度分級。如圖7所示，通過進行NP40處理，在1.20 mg/mL的級分中可見核心蛋白的峰。即，含有脂質(zhì)的比重輕的表面膜由 于NP40而從病毒顆粒上剝離，形成未保持類病毒結(jié)構(gòu)的核酸和只有核 心蛋白的核心顆;險，比重變重。
由以上結(jié)果可以確認，通過將pHHJFHl導(dǎo)入HepG2細胞，由HCV 基因組cDNA轉(zhuǎn)錄病毒RNA后，發(fā)生病毒蛋白的合成和病毒RNA的復(fù) 制，形成病毒顆粒，分泌到培養(yǎng)液中。
HCV顆粒的感染性確認
對實施例4所得的HCV顆粒是否具有感染性進行研究。使用 Fugene6將pHH JFH1導(dǎo)入到Huh7細胞和HepG2細胞中，將培養(yǎng)3 5 天的培養(yǎng)上清用超濾膜(截留分子量lxl05Da)濃縮30倍。接著，在IOO 濃縮的含有HCV顆粒的培養(yǎng)液中將Huh7.5.1細胞在15 mm蓋玻片上 培養(yǎng)，4天后，將細胞用抗NS5A抗體焚光染色。記數(shù)抗NS5A抗體染 色陽性，即感染細胞數(shù)，結(jié)果如圖8所示，可見部分感染細胞。由這些 結(jié)果可知，通過將pHH JFH1導(dǎo)入到Huh7或HepG2細胞中，分泌到培 養(yǎng)液中的HCV顆粒具有感染的能力。
感染性HCV顆粒產(chǎn)生細胞抹的獲得
利用上述實施例所示的系統(tǒng)，嘗試建立持續(xù)生產(chǎn)感染性HCV顆粒 的細胞株。
將pHH JFH1用Nhel消化，將pSV40/Zeo2 (Invitrogen)用Nhe I和Xbal消化，獲得SV40啟動子，在SV40啟動子下游連接Zeocin抗性基 因，再在其下游連接附加有SV40 polyA的信號，將所得的表達單元(SV40 啟動子/Zeo/polyA)整合到上述pHH JFH1用Nhel消化的位點，制備栽體。 將該載體命名為pHH/ZeoJFHl (圖9)。
通過Fugene6,將pHH/ZeoJFHl導(dǎo)入到HepG2細胞中。用含有Zeocin 的培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后每周更換兩次培養(yǎng)液，用含有Zeocin的培養(yǎng)基繼續(xù) 培養(yǎng)。上述培養(yǎng)21天后，由培養(yǎng)皿克隆存活細胞的細胞集落，繼續(xù)培 養(yǎng)。通過上述集落的克隆獲得了 100個細胞克隆。這些克隆的培養(yǎng)上清 中的核心蛋白質(zhì)量是使用才一乂 HCV抗原IRMA測試儀進行(Aoyagi等 人.，J. Clin. Microbiol., 37 (1999) 1802-1808頁)，篩選出核心蛋白表達量 多的克隆HepG2/No59細胞。
使用10cm的培養(yǎng)皿，用8mL的培養(yǎng)基培養(yǎng)2xl()6個HepG2/No59 細胞。48小時后回收培養(yǎng)上清。
測定培養(yǎng)上清中的核心蛋白，結(jié)果可以確認HepG2/No59細胞產(chǎn) 生了 1，400 fmol/L的核心蛋白。
由培養(yǎng)上清制備RNA,由該RNA進行HCV基因組RNA量的測定。 HCV RNA的定量RT-PCR檢測是按照Takeuchi等人的方法(Takeuchi T 等人.，Gastroenterology, 116(1999) 636-642頁)，檢測HCV RNA的5，非 翻譯區(qū)的RNA來進行。具體來說，使用以下的合成引物和EZrTthRNA PCR試劑盒(Applied Biosystems),對由細胞提取的RNA中所含的HCV RNA進行PCR擴增，通過ABI Prism 7700測序系統(tǒng)(Applied Biosystems) 檢測。探針
R6—130—S17:5，—CGGGAGAGCCATAGTGG—3'(SEQ ID No. 7 )
R6-290-R19:5'-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3， (SEQ ID No. 8 )
TaqMan探針，R6-148-S21FT:5,-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (SEQ ID No. 9 )
結(jié)果可知，HepG2/No59細胞培養(yǎng)上清中的HCV RNA為6.^108拷 貝/mL。該產(chǎn)生量比目前報道的量高約60倍。
進一步使用超濾膜(截留分子量lx105 Da)，將HepG2/No59細胞培 養(yǎng)上清濃縮30倍，用100nL濃縮的含有HCV顆粒的培養(yǎng)液，在15mm 蓋玻片上培養(yǎng)Huh7.5.1細胞，4天后，將細胞用抗NS5A抗體免疫染色。結(jié)果，可檢測出抗NS5A抗體染色陽性、即感染細胞。由以上可以確認， 分泌到HepG2/No59細胞培養(yǎng)液中的HCV顆粒具有感染能力。
表達栽體導(dǎo)入栽體3天后的核心蛋白質(zhì)量
(fmol/L)
未導(dǎo)入0
p冊JFH1252.164
pHH J6(C-p7)/JFHl2272. 878
p朋H77c(C-p7)/JFHl29. 555
p朋Jl(C-p7)/JFHl0.403
pHH J1(C-NS2)/JFH111,004
法導(dǎo)入到Huh7.5.1細胞中，將導(dǎo)入3天后的培養(yǎng)上清用超濾膜(截留分 子量lxl()SDa)濃縮。加入100^L濃縮的含有HCV顆粒的培養(yǎng)上清，將 Huh7.5.1細胞在15mm蓋玻片上培養(yǎng)，4天后用抗NS5A抗體進行免疫染色。結(jié)果，用由導(dǎo)入了 pHH J6(C-p7)/JFHl的細胞得到的培養(yǎng)上清處 理的細胞中可見被抗NS5A抗體強烈染色的細胞。另一方面，用由導(dǎo)入 了 pHH Jl(C-p7)/JFHl的細胞得到的培養(yǎng)上清處理的細胞中，與pHH J6(C-p7)/JFHl比較，抗NS5A抗體染色強度弱，但與對照細胞比較則明 顯被染色。以上表明，導(dǎo)入了 pHH J6(C-p7)/JFHl和pHHJl(C-p7)/JFHl 的細胞中產(chǎn)生了感染性HCV。
4妄照實施例6所示的方法，向pHH Jl(C-p7)/JFHl中插入Zeocin抗 性基因表達單元，制備pHH/Zeo Jl(C-p7)/JFHl。接著，將pHH/Zeo Jl(C-p7)/JFHl導(dǎo)入Huh7.5.1，得到在含有Zeocin的培養(yǎng)基中增殖、可 穩(wěn)定表達病毒顆粒的細胞。將8mL該細胞的培養(yǎng)上清用超濾膜(截留分 子量lxl()SDa)濃縮。該濃縮的培養(yǎng)上清中的HCV核心蛋白質(zhì)量是2365 fmol/L。使用100pL該濃縮培養(yǎng)上清，使Huh7.5.1感染，4天后將細胞 用抗NS5A抗體免疫染色。結(jié)果，由導(dǎo)入了 pHH/Zeo Jl(C-p7)/JFHl的穩(wěn) 定表達性細胞得到培養(yǎng)上清，在用該培養(yǎng)細胞處理的細胞中可見被抗 NS5A抗體強烈染色的細胞。由此表明由本細胞產(chǎn)生了感染性HCV。
HCV。
序列表自由文本
SEQ ID NO. 1的序列表示合成RNA。
SEQ ID N0.2 SEQ ID N0.9的序列表示合成DNA。
SEQ ID NO. 10~26的序列表示引物。
SEQ ID N0.29~32的序列表示嵌合DNA。
SEQ ID N0.33 45的序列表示合成DNA。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)感染性丙型肝炎病毒(HCV)顆粒的方法，該方法包含將以下的i)或ii)的表達載體導(dǎo)入由Huh7、RCYM1RC、5-15RC、HepG2以及由這些細胞派生的細胞株中選擇的細胞中的步驟i)含有下述DNA的表達載體，該DNA在RNA聚合酶I啟動子的下游含有編碼來自HCV株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白的DNA序列，和編碼來自HCV JFH1株的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻譯區(qū)的DNA序列，并且在其下游含有RNA聚合酶I終止子；或者ii)含有下述DNA的表達載體，該DNA在RNA聚合酶I啟動子的下游含有編碼來自HCV株的5’非翻譯區(qū)、核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白的DNA序列，和編碼來自HCV JFH1株的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3’非翻譯區(qū)的DNA序列，并且在其下游含有RNA聚合酶I終止子。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中，上述HCV抹是基因型1或基因 型2的HCV株。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中，上述基因型1的HCV抹選自 H77c林、l抹、H抹、HC-J1抹、Jl株、conl抹、TH株、J抹、JT株、 BK林。
4. 權(quán)利要求2所述的方法，其中，上述基因型2的HCV株選自J6CF 抹、JFH1株、JCH1林、HC-J8抹。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)感染性丙型肝炎病毒(HCV)顆粒的方法，該方法包含將含有以下DNA片段的表達載體導(dǎo)入到可接受HCV增殖的細胞中的步驟，其中所述DNA片段在RNA聚合酶I啟動子的下游含有編碼HCV的5’非翻譯區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白以及任意非結(jié)構(gòu)蛋白的DNA序列、以及編碼來自HCV JFH1株的非結(jié)構(gòu)蛋白和3’非翻譯區(qū)的DNA序列，并且在其下游含有RNA聚合酶I終止子。
文檔編號C12N15/09GK101321865SQ200680044939
公開日2008年12月10日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者宮村達男, 曾根三郎, 田邊純一, 石井孝司, 脅田隆字, 鈴木亮介, 鈴木哲朗 申請人:日本國立感染癥研究所;財團法人東京都醫(yī)學(xué)研究機構(gòu);東麗株式會社