專利名稱：真菌麥角菌(Fr.)Tul.的工業(yè)生產(chǎn)菌株的制作方法
真菌麥角菌(Fr.) Tul.的工業(yè)生產(chǎn)菌株發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物堿的麥角菌(C/owce， ，^wrea)菌株。更具 體地說，涉及麥角菌(C/owce^戶，^^ (Fr.)菌株Tul.，該菌株在寄生生長 于谷物時生產(chǎn)高含量的總麥角肽生物堿并且P -麥角環(huán)肽的含量高于a -麥角環(huán) 肽的含量。發(fā)明背景
麥角肽生物堿(Ergot peptide alkaloids)又名麥角肽石咸，是用來生產(chǎn) 藥物的天然產(chǎn)品。麥角肽堿(ergopeptines)的大類包括一組對治療有用的稱為 麥角環(huán)月太(ergokiyptines)的化合物。麥角環(huán)肽包括兩禾中同分異構(gòu)體a-麥角環(huán) 肽和P-麥角環(huán)肽，兩者都用于藥用制劑。a-麥角環(huán)肽的結(jié)構(gòu)最初是Stoll和 Ho&iann描述的(Helv. Chim. Acta 26， 1570， 1943)。 麥角環(huán)肽的結(jié)構(gòu)最初 是Schlientz等人描述的(Expenentia23， 991， 1967)。a -麥角環(huán)肽P -麥角環(huán)肽
麥角環(huán)肽是重要的藥物材料。在藥物中，通常與其他活性物質(zhì)齢 用于劑型的P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽，往往以氫化形式作為甲磺酸雙氫麥角毒 堿(codergocnne) (DH-麥角柯寧堿、DH-ergoknstine、 DH-a-麥角環(huán)膚禾口 DH-|3-麥角環(huán)肽的甲磺酸鹽混合物-參見英國藥典2004， I巻，第534-535頁)的組 分。a畫和P-二氫麥角環(huán)肽或者12'陽羥基-2'畫(l匿甲基乙基)隱5'-a"畫(2-甲基丙 基)-9，10-二氫-麥角它曼(ergotaman) -3'，6',18-三酮是已知的化合物，衍生于天 然生物堿a-或P-麥角環(huán)肽的9,10位雙鍵的氫化作用。麥角環(huán)肽也可以用作生 產(chǎn)半合成的生物堿衍生物(例如尼麥角林(nicergoline)、培高利特(pergolide) 禾口卡麥角林(cabergoline))的起始豐才料。由分離于麥角菌C7awce/w/7M^7wm2) 新菌株菌核(sderotia)的生物堿制備的具有這些活性物質(zhì)的藥物具有廣譜作用 并且可用作a-交殿申經(jīng)阻Y帶藥、多巴胺能藥、抗血清素藥、催乳素抑制劑、抗 偏頭疼藥(antimigraine agents)、抗高血壓藥，以及用于外周代謝和脈管紊亂的 治療，諸如血栓閉塞性脈管炎、腦血管動脈硬化、老年腦病及本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的其他疾病。
P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽可分離于寄生生長于田間作物黑麥或其 他谷^li:的真菌麥角菌(Fr.) Tul.形成的菌核(sderotm)。保藏于捷克微生物保 藏中心(CCM)編號為CCMF-721的專有菌株在生長于黑麥上時，形成具有相 對生物質(zhì)干重的總生物堿平均含量為0.56 wt。/。的菌核。該菌株通常用來生產(chǎn)P -麥角環(huán)月太禾B a -麥角環(huán)肽(如CS 225 272 "New industrial strain of microorganism Qaviceps purpurea ( Fr. ) Tul. , CCM F-721" ( "Nov^ prCimyslov^ kmen mikroorganismuC7av,ce/2s'/7wpwa7 (Fr.) Tul. CCM F-721")中的描述一僅僅在捷克公開)。由CCM F-721生產(chǎn)的a-麥角環(huán)肽對p麥角環(huán)肽的比率是1.15:1。然 而，幾種已知的其他麥角菌菌株生產(chǎn)更高量的a-麥角環(huán)肽或者僅生產(chǎn)a形。商 業(yè)的藥物制劑中a -麥角環(huán)S樹P -麥角環(huán)肽的 比率是2:1 。因此，在其制備 中的常規(guī)操作是將P -生產(chǎn)菌株的發(fā)酵產(chǎn)品和a -生產(chǎn)菌株的發(fā)酵產(chǎn)品結(jié)合在一 起。4頓可生產(chǎn)相對更高量P型的菌株是有益的，因為為了達(dá)到a-和P-麥角環(huán) 肽的優(yōu)選比剩每需要更少的菌株。
因此，本發(fā)明的第一個方面是提供麥角菌C/m^'e戸戶r戶reaXFr.) 菌株Td.或其突變體菌株，該菌株在寄生生長于谷物時，生產(chǎn)P-麥角環(huán)肽的量發(fā)明和M高于a -麥角環(huán)肽的量，即P -麥角環(huán)肽對a -麥角環(huán)肽的重量比大于1:1 。另一個 方面，本發(fā)明提供麥角菌(Oawce戸戸，^^(Fr.)菌株Tul.或其突變體菌株， 其相對于CCMF隱721生產(chǎn)含有較高含量麥角肽生物堿(ergot peptide alkaloids) 的菌核。另一個方面，本發(fā)明提供麥角菌(Ctowce戸；7^wed (Fr.)菌株Tul. (保藏號CCM8360)或其突變體菌株，該菌株寄生生長于谷物時，生產(chǎn)含有P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽生物堿的菌核。本發(fā)明也提供生產(chǎn)a -麥角環(huán)肽和3 -麥 角環(huán)肽生物堿的方法，該方法包括培養(yǎng)所述的麥角菌菌株。也提供制備具有這 些性質(zhì)的CCM F-721或者CCM 8360突變體的方法。 發(fā)明詳述
驚奇地發(fā)現(xiàn)，在麥角菌的新菌株(保藏號CCM 8360)中，麥角肽 生物堿的含量增加并且a -麥角環(huán)肽對^ -麥角環(huán)肽的比率在利于e -麥角環(huán)肽的 方向發(fā)生改變，該新菌株Mil菌株CCM F-721突變和篩選方法獲得。
除非另外定義，本文使用的技斜訴斗學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域技 術(shù)人員常規(guī)知曉的含義。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在實行本發(fā)明時利用已知的任何適 當(dāng)禾才料或者方法。
如本文使用的，"菌株"表示基于遺傳背景的具有相同表型和基因型 特征的一群細(xì)胞、真菌組織和絲體。
如本文使用的，"菌核(sclerotium)"表示寄生的C/,ce戸真菌生 活周期的一個階段。菌核在C/awceAv孢子侵染子房后發(fā)育(參見Tenberge， K. B.(1999 ): Biology and Life Strategy of the Ergot Fungi ， V Kf en和L. Cvak編輯 ERGOT. The Genus C/顯.c， Harwood Acad. Publ.，第25-56頁)。
如本文使用的，"寄生生長"表示麥角菌生活周期的一部分，它以孢子侵染谷物子房為起點(diǎn)，然后發(fā)育和生長菌核并以形成具有最大麥角生物堿含量的成熟菌核為終點(diǎn)(參見N6meth， E (1999): Parasitic Production of Ergot Alkaloids. V. Kfen和L. Cvak編輯ERGOT. The Genus aowce戸.Harwood Acad. Publ.，第303-320頁)。
如本文使用的，"腐生生長"表示麥角菌屬真菌(Clavicepsfiingus) 在人工條件下的生長，在本發(fā)明的上下文它指真菌菌絲生長和分生孢子生成(參 見Malinka, Z. (1999 ): Saprophytic cultivation of Claviceps. V Kfen禾口 L. Cvak編 輯ERGOT. The Genus Claviceps. Hanvood Acad. Publ.，第321 -371頁)。
如本文使用的，"分生孢子"表示各種真菌的無性孢子。在本發(fā)明的上下文它是可用于侵染谷物谷穗子房的麥角菌的無性孢子(參見N6meth， R (1999): Parasitic Production of ErgotAlkaloids. V Kfen和L. Cvak編輯ERGOT. The Genus Claviceps. Harwood Acad. Publ.，第303-320頁及Pa^outov6， S.和 Parbery ， D. P. (1999): The Taxonomy and Phylogeny of Claviceps. V Kf en禾卩L. Cvak 編輯ERGOT. The Genus Claviceps. Harwood Acad Publ.，第57-78頁)。
對于麥角肽生物堿的大規(guī)模田地產(chǎn)物，可利用具有開放花序花的谷類或者禾本科植物。它們的4OT使得麥角侵染可以傳播。主要利用黑麥物種，，沒有可育花粉的cms(細(xì)胞質(zhì)雄性不育)黑麥或者其他品種。(參見N6meth， E.(1999): Parasitic Production of Ergot Alkaloids. V Kfen和L. Cvak編輯:ERGOT. The Genus Claviceps. Harwood Acad. Publ.，第303-320頁及Geiger， H.H.和 Bausback ， G A. (1979 ) Untersuchimgen ueber die Eignung pollensterilen Roggens zur parasitischen Mutterkomerzeugung. Z. Pflanzenzuechtg. ， 83 ， 163-175 )。
如本文使用的，"干重(drymass)"表示10(TC干燥2小時后得到的 菌核質(zhì)量。
本發(fā)明提供麥角菌(C/ov/ce戸戶vw化a, (Fr.)菌株Tul.，該菌株在 寄生生長于谷物例如黑麥時，生產(chǎn)含有P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽生物堿的菌 核。認(rèn)為該菌株是非天然存在的。
本發(fā)明也提供麥角菌(C/awce戸，r戸^^ (Fr.)菌株Tul.或其突變 體菌株，該菌株在寄生生長于谷物時，生產(chǎn)含有P-麥角環(huán)肽和a-麥角環(huán)肽生物 堿的菌核。與起始菌株CCM F-721相比，P-麥角環(huán)肽和a-麥角環(huán)肽生物堿的 含量高。所述菌株生產(chǎn)比a -麥角環(huán)肽更多的P -麥角環(huán)肽(即，重量比率大于1 )。
本發(fā)明進(jìn)一步提供麥角菌C/m^取v戶^w陀W (Fr.)菌株Tul.(保 藏號CCM8360)，該菌株在寄生生長于谷物時，相對于CCMF-721生產(chǎn)含有相 對高含量麥角肽生物堿的菌核及重量比大于1:1的P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽生 物堿。也提供制備具有這些性質(zhì)的CCMF-721或者CCM 8360突變體的方法。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約將菌株CCM 8360樣本保藏于捷克共和國 Tvrd6ho14， Bmo馬薩里克大學(xué)的國際保藏單位捷克微生物保藏中心(CCM)。 該菌株在寄生生長于谷物時，生產(chǎn)含有麥角肽生物堿尤其是P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽的菌核。合適的谷類的典型實例是黑麥或黑小麥(tnticale)。
—般地，"高"表示存在于生產(chǎn)菌株的麥角菌核中的麥角肽生物堿的量并且表明該生產(chǎn)菌株中的水平大于親本菌株(CCMF-721)。
通過菌株CCM 8360生產(chǎn)的菌核中麥角肽生物堿的含量范圍是總麥 角肽生物MM量占生物質(zhì)干重的0.6-1.92 wt%。通常，總麥角肽生物堿的含量范 圍是總麥角肽生物堿為生物質(zhì)干重的0.94-1.58 wt%，平均含量是1.38 wt%。如 本文使用的，"wt%"表示麥角環(huán)肽的重量除以生物質(zhì)干重再乘以100。除非另 有說明。/o值表示wt。/。值。申請人已發(fā)現(xiàn)菌株CCMF-721生產(chǎn)總麥角肽生物fet 生物質(zhì)干重平均含量為0.56 wty。的菌核。該菌株通常用來生產(chǎn)a -麥角環(huán)肽和P -麥角環(huán)肽。a-麥角環(huán)月樹e-麥角環(huán)肽的比率是U5:l。
菌核中麥角肽生物堿的含量范圍為3743%的01-麥角環(huán)肽、47-58% 的P-麥角環(huán)肽及5-10%的麥角柯寧堿(ergocomine)，平均比例為41%的"麥 角環(huán)肽、52%的P -麥角環(huán)肽及7%的麥角柯寧堿。
a-麥角環(huán)狀對3-麥角環(huán)肽的比率范圍為0.63:l到0.91:1，平均含量 為0.79:1。這意瞎當(dāng)考慮a-麥角環(huán)肽對P-麥角環(huán)肽的比率時，CCM 8360菌 株生產(chǎn)多于50wt。/。的3 -生物堿。
3-麥角環(huán)肽和a-麥角環(huán)肽的含量大于總生物堿含量的90wt%，通 常P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽為總生物堿含量的90-96wt%。
菌核中高含量的麥角肽生物堿使生物堿的提取和提純更高效。提取 可利用描述于Cvak， L. (1999): Industrial Production of Ergot Alkaloids. V Kf en 和L. Cvak編輯ERGOT. The Genus Claviceps. Harwood Acad. Publ.第373410 頁的甲苯提取方法和進(jìn)一步的純化步驟。也可以利用描述在WO/2005082910中 的方法實現(xiàn)從高生物堿含量的菌核中分離生物堿。這些生物堿可用于藥物生產(chǎn)， 例如Secatoxin、 DCCK、 Derginal、 D-Ergotox、 Progenl、 Geroplus、 Zodalin、 Permax、 Nikotergoline、 Sermion、 Dopergin、 Parlodel、 Ergotop及Dostinex。
本發(fā)明的菌株可容易地生長(如實施例l描述的)，并且當(dāng)與常規(guī)麥 角肽生物堿的生產(chǎn)菌株相比時，不需任何補(bǔ)充技術(shù)條件即可收獲所形成的菌核。 這些方法可放大。
本發(fā)明的菌株允許
段中描述的現(xiàn)有提取和分離方法用于生產(chǎn) a和e-麥角環(huán)肽。也可更有效地提取半合成的衍生物并且顯著增加回收率。菌 核中更高含量的a和P -麥角環(huán)肽使得提取時可獲得更高的產(chǎn)量。
當(dāng)與親本菌株CCM F-721相比時，由于菌核中高含量的a-麥角環(huán) 肽禾口 P -麥角環(huán)肽可實現(xiàn)增加的回收率。為了生產(chǎn)1公斤a和P -麥角環(huán)J級麥角 柯寧堿的粗提物，需要CCMF-721菌株的250公斤菌核。如果使用本發(fā)明的菌 株僅僅需要100-150公斤的菌核。
在農(nóng)田規(guī)模培養(yǎng)中，當(dāng)4細(xì)麥角培養(yǎng)的當(dāng)前農(nóng)業(yè)方法時，產(chǎn)量范圍 為700 kg/ha到2200 kg/ha，平均產(chǎn)量為1000 kg/ha。實施例實施例1菌株CCM 8360的生長特性 處姓長
在瓊脂-稠化的麥芽汁培養(yǎng)基(35 g麥，取物、5 g蛋白胨、13 g 瓊脂、1000 ml水)中腐生生長時，麥角菌(Dowce;^/7^pM/raJ (Fr.)菌株Tul. CCM8360形成腐敗的空心菌絲體的集落。該菌絲體最初是白色而光滑的，但在 培養(yǎng)約27天后，菌絲體變成淡米色并且起鈹。該菌絲體由分枝的菌絲和分生 包 子組成，分生孢子是橢圓形并約8微米長5微米寬。教主長
在寄生生長于黑麥時，該真菌產(chǎn)生深紫色、有顏色的平均重量為33 mg的菌核。單個菌核含有生物質(zhì)干重的0.6-1.92 wt。/。量的麥角生物堿?？偵?堿平均含量的范圍為0.94-1.58 wt%，通常為1.38wt。/。，其中總生物堿的47%-58 wt。/。是P-麥角環(huán)月太。農(nóng)娜微長
從所需量的菌株CCM 8360的可儲存干麥角接種制劑制備分生孢子 的水懸浮液(參見CS 276 530 "Process for production of the storable preparations with the high content of living spores of filamentous fungi" ("Zpfisob \^roby skladovatelnfch pfipravkfi s vysok^m obsahem 2iv^ch sp6r vMkn妙ch hub")-僅僅在 捷克公開)。其他類型的接種制劑公開在CS 243 009 "Process of fermentation production of the ergot inoculating preparation" (Zpiisob fermenta6ni p飾ravy n^melov6 o汰ovaci Mtky")-僅僅在捷克公開；EvaN6meth， E. (1999): Parasitic Production of Ergot Alkaloids. V Kfen禾卩L. Cvak編車葺ERGOT. The Genus Claviceps.HarwoodAcad.Publ.第303-320頁；及Malinka， Z. (1999): Saprophyticcultivation of Qaviceps V Kfen禾口 L. Cvak編車葺ERGOT. The Genus Qaviceps. Harwood Acad. Publ.第321-371頁。通常使用如N6meth， K (1999): Parasitic Production of Ergot Alkaloids. V Kfen禾口 L. Cvak編輯ERGOT. The Genus Claviceps. Harwood Acad. Publ.第303-320頁描述的接種機(jī)，在生長的抽穗階段 (heading phase)對不育黑麥(cms)品種Hyclaro穗接種該分生孢T^浮液， 以便每公頃使用3.2x10"的有發(fā)育力的分生孢子。
在黑麥成熟時(穗變干)，當(dāng)接種后約55天菌核開始從其床脫落時， ^ffl聯(lián)合收割^幾收獲菌核?？偸斋@量1094 kg^ia的深紫色菌核在干生物質(zhì)菌核 中平均含有1.38 wtn/。的總生物堿，總生物堿的93 wty。是P -麥角環(huán)肽和a -麥角 環(huán)肽并且總生物堿的58%是|5 -麥角環(huán)欣。
如
段中的描述提取所獲得的菌核，所獲得的提取物用來生產(chǎn) 肽類麥角生物堿或麥角毒堿(ergotoxine)和/鋼來生產(chǎn)半合成的生物堿，供如 Cvak， L.: Industrial Production of Ergot Alkaloids. V Kfen和L. Cvak編輯ERGOT. The Genus Claviceps. Harwood Acad. Publ. 1999第373-410頁描述的不同劑型藥 物生產(chǎn)之用。實施例2突變和篩選(或者分離)方法
從專有菌株F-721培育新的工業(yè)生產(chǎn)微生物麥角菌(T/ov/ce戸 (Fr.)菌株Tul.CCM8360。該菌株的菌核轉(zhuǎn)入腐生培養(yǎng)一菌核表面殺 菌并移到瓊脂稠化的麥芽汁培養(yǎng)基。在25'C溫度下28天后，分生孢子的生物質(zhì) (biomass)覆蓋瓊脂表面。對生物質(zhì)利用0.2MN-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍溶 液突變8小時。禾擁注射器在黑麥上接種突變的分離物，并對生長的菌核進(jìn)行 麥角生物堿含量的定性和定量分析。具有最高含量的菌核再一次轉(zhuǎn)入腐生培養(yǎng)， 利用0.2M乙基甲烷磺酸酯處理16小時使其發(fā)生突變。禾擁注射驗黑麥上接 種如此獲得的突變分離物，并分析生長的菌核。在小塊土地規(guī)模(small-plot scale, 約lm2)試驗中在黑麥上使具有最高含量的菌核傳代。將這些菌株的菌核轉(zhuǎn)入 腐生培養(yǎng)，處于輻射劑量為3000 Gy的y射線條件下。利用注射器在黑麥上接 種輻射的分離物，并對生長的菌核進(jìn)行麥角生物堿含量的定性和定量分析。在 中等規(guī)模(pilot-scale,約lha)逸驗中在黑麥上使具有最高含量的菌核傳代。將 從這些地塊收獲的最高含量的菌核轉(zhuǎn)入腐生培養(yǎng)，并保藏于捷克共和國Tvrd6ho14， Brno馬薩里克大學(xué)的捷克微生物保藏中心(CCM)，保藏編號CCM 8360。 與起始菌株CCMF-721相比，結(jié)合附性篩選的，突變方法導(dǎo)致CCM8360菌 株菌核中麥角生物堿的平均含量增加為146 wt%。同時，ilil朝利于所希望的 P-麥角環(huán)肽的方向改變a-麥角環(huán)月樹e-麥角環(huán)肽的比率從U5:l到0.79:1而改善各生物堿的譜質(zhì)量。
然后利用注射器在黑麥上接種突變的分離物。在菌核已發(fā)生生長后， 對菌核進(jìn)行麥角生物堿含量的定性和定量分析?？赏ㄟ^高效液相色譜(HPLC) (柱HypersilODSC18， 250x4.6mm，流動相49.5%乙腈、49.5%水、1%三 乙胺)，或者通過如歐洲藥典5.0， 2004，第1347-1348頁描述的液相色譜測定生 物堿含量。將具有最高含量麥角生物堿的菌核轉(zhuǎn)入腐生培養(yǎng)。菌核表面殺菌并 移到瓊脂稠化的麥芽汁培養(yǎng)基。在25匸溫度下培養(yǎng)28天后，分生孢子的生物質(zhì) 覆蓋瓊脂表面。利用0.2M乙基甲烷磺酸酯處理16小時使分生孢子發(fā)生突變。
隨后禾,注射器在黑麥上接種突變分離物，并分析所獲得的菌核。 在小塊土地規(guī)模(約lm2)試驗中在黑麥上使具有最高麥角生物堿含量的菌核 傳代。將這些菌株的菌核轉(zhuǎn)入腐生培養(yǎng)并處于輻射劑量為3000 Gy的Y射線條 件下。利用注射器在黑麥上接種輻射后的分離物，然后如
段的描,所獲 得的菌核進(jìn)行麥角生物堿含量的定性和定量分析。
在中等規(guī)模(約lha)試驗中在黑麥上使具有最高含量的菌核傳代。 收獲具有最高含量的菌核并轉(zhuǎn)入腐生培養(yǎng)。該新菌株目前保藏于捷克共和國 Tvrd6ho 14， Bmo馬薩里克大學(xué)的捷克tt生物保藏中心(CCM),保藏編號CCM 8360。
與祖先菌株CCM F-721相比，結(jié)合陽性篩選的i^突變方法導(dǎo)致 CCM8360菌株菌核中麥角生物堿的平均含量增加為146wtQ/。。同時，通過向利 于更希望的P -麥角環(huán)肽的方向增加a -麥角環(huán)肽對P -麥角環(huán)肽的比率從1.15:1 到0.79:1而使a -和0 -麥角肽生物堿的生產(chǎn)驚人地改善。
可對CCM F-721或CCM 8360應(yīng)用相同的誘變流程，隨后選擇那些 生產(chǎn)麥角肽生物堿含量高于CCM F-721并且生產(chǎn)的P-麥角環(huán)肽高于a-麥角環(huán) 肽的突變株。因此，本發(fā)明的此方面涉及一禾中生產(chǎn)CCM F-721和CCM 8360突 變體并選擇或者鑒定那些比CCM F-721生產(chǎn)更高含量麥角肽生物堿且e-麥角 環(huán)肽的量高于a-麥角環(huán)肽的突變體的方法。該方法需要誘變CCM F-721或者CCM 8360，隨后分析突變體以確定其是否比CCM F-721生產(chǎn)更多含量的麥角 肽生物堿，并且卜麥角環(huán)肽的量高于a-麥角環(huán)肽。如該實施例說明的，通常通 過在適當(dāng)?shù)臈l件下與包含化學(xué)誘變齊啲培養(yǎng)基接觸或在該i咅養(yǎng)基中培養(yǎng)CCM F-721或CCM 8360禾口/或?qū)⒄婢┞队诜洁l(xiāng)線進(jìn)fiH秀變。
在一些實施方案中，該方法需要CCM F-721或CCM 8360的至少一 裕秀變，其中對來自前一輪的生產(chǎn)麥角肽生物堿含量高于CCM F-721且P -麥角 環(huán)肽的量高于a-麥角環(huán)肽的菌核實施追加輪次的誘變。因此，在一些實施方案 中，該方法需要誘變CCM F-721或CCM 8360，例如通過將菌株的菌核轉(zhuǎn)移到 腐生培養(yǎng)；菌核表面殺菌并轉(zhuǎn)移該殺菌的部分到適當(dāng)?shù)?例如瓊脂-稠化麥芽) 培養(yǎng)基；在適當(dāng)?shù)臅r間和溫度條件下培養(yǎng)該菌核(例如在25'C溫度下培養(yǎng)28 天)；將表面覆蓋有分生 包子生物質(zhì)的培養(yǎng)基處于化學(xué)誘變處理劑溶液中(例如 0.2 M N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍)適當(dāng)?shù)臅r間(例如8小時)以形成CCM F-721 或CCM 8360突變體；在谷物諸如黑麥上處理(例如接種)該突變體；并對由 此生長的菌核麥角生物堿的含量進(jìn)行定性和定量分析；篩選具有最高含量麥角 肽生物堿的菌核，并將該篩選的菌核轉(zhuǎn)移到存在化學(xué)誘變劑(例如0.2M乙基甲 烷磺酸酯)的腐生培養(yǎng)培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間(諸如16小時)，以產(chǎn)生CCMF-721或 CCM 8360的進(jìn)一步突變體；將該突變tt谷物諸如黑麥上處理，并篩選由此生 長的菌核間具有最高麥角肽生物堿含量的菌核；轉(zhuǎn)移該菌核到腐生培養(yǎng)并將該 培養(yǎng)物暴露于方婦寸線(例如劑量為3000Gy的Y射線)；在谷物諸如黑麥上處理 (例如接種)輻射分離物，并對由此生長的菌核進(jìn)行麥角生物堿含量的定性和 定量分析。 實施例3由a-麥角環(huán)肽和P-麥角環(huán)肽生產(chǎn)尼麥角林(mcergoline)、培高利特 (pergolide)禾口卡麥角林(cabergoline)
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知由麥角環(huán)肽生物堿到半合成的生物堿衍生物諸 如尼麥角林(nicergoline)、培高利特(pergolide)和卡麥角林(cabergoline)的 轉(zhuǎn)換。首先，麥角環(huán)S太生物堿轉(zhuǎn)換為麥角酸(lysergic acid) (Jacobs, W.A.和Craig， L.C.: The degradation ergotinine with alkali. Lysergic acid. J. biol. Chem. 104， 547-551 (1934))。然后，麥角酉細(xì)于制備半合成的麥角生物堿，根據(jù)EP0003667 公開的方法制備培高利特，根據(jù)CZ 287047公開的方法制備尼麥角林及根據(jù)CZ287176公開的方法制備卡麥角林。Cvak， L. (1999): Industrial Production of Ergot Alkaloids. V Kfen禾口 L. Cvak編車茸ERGOT. The Genus Claviceps. Harwood Acad. Publ.，第373410頁提供了由麥角環(huán)肽制備麥角酸和由麥角酸制備半合成的麥 角生物堿的綜述。
說明書中弓閱的全部出版物，包括專利出版物和非專利出版物都表 明本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平。未艦弓l用而加入的任何出版物 此 1引用而加入，達(dá)到如同每個個體出版物是具體地個別;bH31弓閱而加 入的相同程度。
盡管本發(fā)明己參考具體實施方案進(jìn)行了描述，將理解這些實施方案 僅僅是本發(fā)明原理和應(yīng)用的說明。因此應(yīng)理解，可對作例證的實施方案進(jìn)行很 多修改并且正如附加權(quán)利要求所定義的其他可能的設(shè)計方案在不脫離本發(fā)明的 精神和范圍的情況下可被設(shè)計出來。
權(quán)利要求
1.麥角菌(Clavicepspurpurea)(Fr.)菌株Tul.，該菌株在寄生生長于谷物時生產(chǎn)β-麥角環(huán)肽的含量高于α-麥角環(huán)肽的含量。
2. 權(quán)利要求1的菌株，其中谷物是黑麥的常規(guī)品種。
3. 權(quán)利要求1或2的菌株，其中黑麥的常規(guī)品種是細(xì)胞質(zhì)雄性不育黑麥品種。
4. 權(quán)利要求1-3任一項的菌株，其中菌核干重中總生物堿的含量是干重的 0.60-1.92 wt%。
5. 權(quán)禾腰求l-4任一項的菌株，其中干重中總生物堿的含量是1.38wty。。
6. 權(quán)利要求1-5任一項的菌株，其中菌核中麥角肽生物堿的含量范圍為 37-43 wt。/。的a -麥角環(huán)肽、47-58 wt。/。的P -麥角環(huán)肽和5-10 wt。/。的麥角柯寧堿。
7. 權(quán)利要求l-6任一項的菌株，其中菌核中麥角肽生物堿的含量是41wt13/。 的a -麥角環(huán)肽、52 wt。/。的3 -麥角環(huán)肽和7 wt。/。的麥角柯寧堿。
8. 權(quán)利要求1-7任一項的菌株，其中e-麥角環(huán)B樹a-麥角環(huán)肽的比率范 圍為0.63:1到0.91:1。
9. 權(quán)利要求1-8任一項的菌株，其中卜麥角環(huán)月樹ci-麥角環(huán)肽的比率是 0.79:1。
10. 權(quán)利要求l-9任一項的菌株，其中菌核中P-麥角環(huán)肽和a-麥角環(huán)肽的 含量大于總麥角肽生物堿含量的90%。
11. 權(quán)利要求1-10任一項的菌株，其中菌核中P -麥角環(huán)肽和a -麥角環(huán)肽的 含量是總麥角肽生物堿含量的90%-96%。
12. 權(quán)利要求1-11任一項的菌株，其中菌核干重的產(chǎn)量范圍為700-2200 kg/ 公頃。
13. 權(quán)利要求1-12的菌株，相對于CCMF-721生產(chǎn)含有高含量麥角肽生物 堿的菌核。
14. 權(quán)利要求1-13任一項的菌株，具有保藏編號CCM8360。
15. 麥角菌(O謂ce戸戶r戸rra, (Fr.)菌株Tul.，已根據(jù)布達(dá)佩斯條約保 藏于捷克共和國Tvrd6ho 14， Bmo馬薩里克大學(xué)的國際保藏單位捷克微生物保 藏中心(CCM)，保藏編號CCM8360。
16. 麥角菌Ctowce戸pwpwra, C ):)菌株Tul.，相對于CCMF-721生產(chǎn) 含有高含量麥角肽生物堿的菌核。
17. 衍生于CCMF-721菌株的麥角菌菌株，其具有的麥角肽生物堿的平均 含量高于存在于CCMF-721中的。
18. 權(quán)利要求15-17的麥角菌菌株，其中麥角肽生物堿的含量是0.6/0.56 wt。/。到1.92/0.56 wt%，高于CCM F-721 。
19. 權(quán)利要求18的麥角菌菌株，其中麥角肽生物堿的含量是0.94/0.56 wt% 到1.58/0.56 wt%，高于CCM F-721 。
20. 生產(chǎn)a誦麥角環(huán)肽禾口 P畫麥角環(huán)肽生物堿的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)任一項前 述豐又利要求的麥角菌菌株。
21. 權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括將麥角環(huán)肽生物堿轉(zhuǎn)換為半合成的生 物堿衍生物諸如a-二氫麥角環(huán)肽、P-dihydrokiyptine、尼麥角林、培高利特和 卡麥角林。
22. 權(quán)利要求20或21的方法，進(jìn)一步包括將麥角環(huán)肽生物堿或半合成的 生物堿與藥用賦形劑混合。
23. 生產(chǎn)CCM F-721突變體的方法，該突變體生產(chǎn)的麥角肽生物堿含量比 CCMF-721高，并且P-麥角環(huán)肽的含量比a-麥角環(huán)肽的含量高，該方、 跑括誘 變CCM F-721,從而產(chǎn)生CCM F-721突變體，并確定是否該突變體生產(chǎn)的麥角 生物堿含量高于CCM F-721 ，并且|3 -麥角環(huán)肽的量比a -麥角環(huán)肽的量高。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中通過將CCMF-721與化學(xué)誘變劑接Mit行所 述誘變。
全文摘要
本發(fā)明公開的是真菌麥角菌(Claviceps purpurea)(Fr.)菌株Tul.，在寄生生長于谷物時，該菌株生產(chǎn)高含量的麥角肽生物堿并且β-麥角環(huán)肽的量高于α-麥角環(huán)肽的量。
文檔編號C12N15/01GK101238208SQ200680029114
公開日2008年8月6日 申請日期2006年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月7日
發(fā)明者J·博哈克, J·瓦利克, T·科瓦羅瓦 申請人:伊瓦克斯制藥有限公司