專利名稱：一種豇豆銹病抗性的分子標記檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蔬菜分子遺傳育種技術領域，尤其涉及一種利用分子標記技術準確、快速檢測豇豆銹病抗性的檢測方法。
背景技術：
豇豆銹病(Uromyces vignae Barclay)為豇豆生產上普遍發(fā)生的一種全國性病害，主要危害葉片和豆莢，葉片發(fā)病導致葉片變形，提前脫落，嚴重影響產量；豆莢染病后不堪食用。溫度20～25℃，相對濕度90％左右時易發(fā)此病。盛發(fā)期在華北地區(qū)為7～8月份，華南地區(qū)為5～10月份(汪雁峰.豇豆.中國農業(yè)科學技術出版社，北京2004.)。施用藥劑防治、實行輪作換茬對豇豆銹病的防治有一定的效果，但藥劑防治在生產上會造成農藥殘留，實行輪作換茬在豇豆主產區(qū)很難實現(xiàn)，因此選育抗銹病品種是防治豇豆銹病發(fā)生的最經(jīng)濟、安全和有效的途徑。
目前豇豆抗銹病育種中主要依賴于田間接種鑒定和植株表型選擇，這要求育種家有豐富的經(jīng)驗和長達數(shù)年甚至十幾年的時間。豇豆銹病由真菌豇豆單孢銹病菌侵染引起，屬于專性寄生菌，只能在活體上存活，無法進行人工培養(yǎng)，因此，豇豆銹病的發(fā)生受季節(jié)限制，在非發(fā)病季節(jié)對該病的田間鑒定工作則較難進行(王漢榮等.豇豆品種(系)對豇豆銹病的抗性鑒定與評價研究.中國農學通報，200016(2)60-61)；接種時豇豆植株的大小會直接影響到抗性鑒定的準確性；由于豇豆銹病的發(fā)生適宜在溫度20～25℃、相對濕度90％左右的氣候條件，因此，豇豆銹病的抗性鑒定需創(chuàng)造特殊環(huán)境進行?？傊?，傳統(tǒng)的田間接種鑒定由于受病原菌來源、發(fā)病季節(jié)、接種環(huán)境和植株大小等因素的影響，導致傳統(tǒng)的豇豆抗銹病鑒定準確性差、抗銹病育種周期長(長達數(shù)年至十幾年)，而且育種成本較高。因此，豇豆育種和生產上急需一種能早期、周年、快速、準確鑒定豇豆銹病抗性的方法。
分子標記輔助育種(molecular marker-assisted selection，簡稱MAS)是現(xiàn)代分子生物學與傳統(tǒng)遺傳育種學相結合，借助分子標記對育種材料從DNA水平上進行選擇，從而可以快速選擇得到具有目的性狀的后代(方宣鈞，吳為人，唐紀良.作物DNA標記輔助育種.北京科學出版社，2001.)。通過找到與抗病基因緊密連鎖的分子標記，不但能在遺傳背景不同的育種材料中特異性的檢測目的基因的存在與否，而且可以在任一生育階段同時對多個抗性基因進行篩選，這種間接的迅速、穩(wěn)定、可靠的選擇方法，因不受其它效應和環(huán)境因素的影響，可使育種家擺脫對表型性狀抗性的依賴，在早世代進行選擇，快速地將多個抗病基因聚合，培育出持久抗病品種，從而大大提高育種效率。應用MAS，理論上只要回交3代就可以選擇到理想的材料。因此，研究開發(fā)實用性強、成本低、準確性高的與豇豆抗銹病基因連鎖的分子標記，可以顯著加快豇豆抗銹病育種速度，提高選擇的效率和準確性，在豇豆抗銹病育種中極具應用價值。但目前尚未見與豇豆抗銹病相關基因連鎖的分子標記研究的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于，針對已有豇豆銹病抗性鑒定方法中存在的費時、費力、成本高、準確性低的缺點，提供一種基于PCR技術的具有快速、簡便、成本低廉、靈敏度高等特性的豇豆銹病抗性分子標記檢測技術。
本發(fā)明的主要依據(jù)是根據(jù)已獲得的和豇豆抗銹病基因緊密連鎖的AFLP分子標記，將其轉化為基于PCR、簡便、快速、成本低廉、穩(wěn)定性好的SCAR分子標記。研究已表明豇豆的銹病抗性為質量性狀，由單顯性基因控制(張衍榮，方木王，黃健坤.長豇豆銹病抗性遺傳研究.中國蔬菜，1997，(6)10-12)。所以可以通過檢測豇豆基因組內是否存在和抗銹病基因緊密連鎖的特異片段來判定其銹病抗性，即如果檢測出特異片段，則說明被檢植株為抗性株；如果沒有檢測出特異片段，則說明被檢植株為感病植株。
本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)一種豇豆銹病抗性的分子標記檢測方法，包括以下步驟1)、待檢測豇豆葉片樣品的采集取豇豆植株頂部較為幼嫩的葉片，每份0.2-0.3克，采集后現(xiàn)用或在-20℃下冷凍保存；2)、陰性對照品種(之豇282)植株和陽性對照品種(南辰豆角2號)植株葉片樣品的采集取豇豆頂部較為幼嫩的葉片，每份0.2-0.3克，采集后現(xiàn)用或在-20℃下冷凍保存；3)、樣品基因組DNA的提取采用常規(guī)的CTAB法或基因組提取試劑盒提取基因組DNA，TE溶解或雙蒸水融解，現(xiàn)用或在-20℃冷凍保存；4)、根據(jù)已獲得的和豇豆抗銹病基因緊密連鎖的AFLP標記全序列設計一對引物，擴增片段長度為98bp，引物序列為引物I5’---TCAACAGTGTCAGACCAAAC---3’引物II5’---GTTGAAGATTGTGGAAAGCT---3’5)、最佳擴增體系的建立利用正交試驗，摸索建立和豇豆抗銹病基因連鎖特異片段的最佳擴增體系；6)、樣本檢測與判定根據(jù)待檢測樣品和對照樣品的特異片段的擴增結果，對被檢測豇豆植株是否為抗性株進行判定。
本發(fā)明的有益效果為1、簡便易行只需采集待檢豇豆植株的幼嫩葉片0.2-0.3克，采用實驗室常規(guī)PCR技術，通過一次PCR擴增，就可以判斷出所檢測的豇豆品種或單株是否為抗銹病品種或植株，而無需進行田間接種抗性鑒定，因此，周年均可在實驗室內進行。
2、快速、靈敏、特異性檢測從取樣到檢測擴增結果，一般只需8個小時左右，通過特異性擴增產物的有無即可進行準確、直觀的判斷，具備簡單分子生物學技術的人員就可以應用；而常規(guī)田間接種鑒定，在具備病原菌、接種所需溫、濕度的前提下，僅培養(yǎng)幼苗就需時3周左右，加上接種后2周才能進行判定，可見常規(guī)接種鑒定需時在5周以上，期間影響發(fā)病的因素較多，容易影響結果的準確性。
3、成本低廉按檢測100個樣本推算，應用本發(fā)明檢測一個樣本的成本低于1.5元，常規(guī)田間接種鑒定需10元以上，因此應用該發(fā)明可以大幅度降低抗性鑒定的成本。
4、通過早期檢測，可縮短豇豆抗銹病育種或市場種子鑒定周期前者在豇豆發(fā)芽期即可對其銹病抗性進行早期檢測，顯著縮短豇豆抗銹病育種周期；后者可以快速準確鑒定和確認市場上銷售的豇豆品種對銹病的抗性，為豇豆品種糾紛提供科學的檢測依據(jù)，有效打擊商業(yè)欺詐行為，保障菜農的權益，有利于規(guī)范豇豆種子市場。
因此，本檢測技術具備快速、簡便、準確、成本低廉等特點，易于在豇豆抗性育種機構和豇豆種子市場推廣使用。


圖1、豇豆葉片基因組DNA提取瓊脂糖凝膠檢測結果2、豇豆抗銹病特異片段擴增結果圖MDNA Marker；1-10F2代感病植株；11-20F2代抗病植株；21陰性對照；22陽性對照；具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但以下描述不對本發(fā)明的保護范圍構成任何意義上的限定。
實施例(以豇豆幼嫩葉片組織為樣品對豇豆銹病抗性進行檢測的方法)步驟1待檢豇豆幼嫩葉片樣品的采集植株葉片采自浙江省農業(yè)科學院海寧基地，共22份樣品。其中，親本各一份，母本為抗性品種‘南辰豆角2號’，父本為感病品種‘之豇282’；F2代單株20份，其中10份為抗病株，10份為感病株。各采植株頂部幼嫩葉片0.2克，-20℃凍存；步驟2葉片樣品的基因組DNA提取采用常規(guī)的CTAB法提取葉片樣品的基因組DNA，在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測為高質量的基因組DNA后(見圖1)，用TE溶解，最后在-20℃凍存。
步驟3特異片段引物設計與擴增根據(jù)已獲得的和豇豆抗銹病基因緊密連鎖的AFLP標記的全序列(150bp)GACTGCGTACCAATTCAAGGTAATGTACAAATATTCAACAGTGTCAGACCAAACAATTtCCAACAATGATGCTTTCAATGTGAGATATTTCATGGTAGCCCAGTCCAAATGCAGCTTTCCACAATCTTCAACAGTTACTCAGGACTCATC
設計一對引物作為特異片段的引物。擴增片段長度為98bp，由上海生物工程公司合成，引物序列為引物I5’---TCAACAGTGTCAGACCAAAC---3’引物II5’---GTTGAAGATTGTGGAAAGCT---3’PCR最佳擴增體系為模板DNA 1.0μL，引物I 2μL(30ng·μL-1)，引物II2μL(30ng·μL-1)，dNTPs 0.4μL(10mM)，10×PCR Buffer 2μL，MgCl21.6μL(25mM)，TaqE 0.2μL(5U·μL-1)，ddH2O 11.3μL，總體積為20μL。
PCR擴增程序先94℃預變性4min，然后進行94℃30s，62℃30s，72℃1min；共28個循環(huán)；最后72℃延伸7min。
PCR擴增產物在2％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，獲得98bp的擴增條帶(見圖2)。
步驟4樣本檢測與判定根據(jù)被檢測樣品的抗銹病特異片段的擴增結果，對被檢測樣品的銹病抗性進行判定，其具體判定過程為所用樣品共有22個；其中，將經(jīng)過多年育種實踐確定的感銹病品種“之豇282”定為陰性對照，編號為21；將抗銹病品種“南辰豆角2號”定為陽性對照，編號為22；另將該親本組合的20個F2代統(tǒng)一進行了田間接種鑒定，病原菌為當年采集的銹菌(Uromyces vignae Barclay)夏孢子，經(jīng)鑒定明確感病植株有10株，分別編號為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10；抗病植株有10株，分別編號為11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。
從基因組DNA提取結果看(圖1)，得到的DNA質量完全可以滿足特異片段的PCR擴增要求；接著用設計的特異引物對基因組DNA進行擴增；從圖2中可以看出，21號陰性對照沒有擴增產物，而22號陽性對照則擴增出98bp的特異片段；在所檢測的20個F2代單株樣品中，樣品1，2，3，4，5，6，7，8，9，10均沒有擴增出特異片段，而樣品11，12，13，14，15，16，17，18，19，20均擴增出該特異片段。上述檢測結果表明，陰性對照與編號為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的植株均沒有擴增出98bp的特異片段，而陽性對照與編號為11，12，13，14，15，16，17，18，19，20的植株均擴增出該片段，這與田間接種鑒定結果完全符合，說明本發(fā)明所建立的檢測方法能準確、快速的鑒定出豇豆樣品對銹病的抗性能力。
本發(fā)明為科學研究和生產實踐提供了一種簡便、快速、靈敏、特異、成本低廉的檢測豇豆銹病抗性的技術。
權利要求
1.一種豇豆銹病抗性的分子標記檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)、待檢測豇豆葉片樣品的采集取豇豆植株頂部較為幼嫩的葉片，每份0.2-0.3克，采集后現(xiàn)用或在-20℃下冷凍保存；2)、陰性對照品種植株和陽性對照品種植株葉片樣品的采集取豇豆頂部較為幼嫩的葉片，每份0.2-0.3克，采集后現(xiàn)用或在-20℃下冷凍保存；3)、樣品基因組DNA的提取采用常規(guī)的CTAB法或基因組提取試劑盒提取基因組DNA，TE溶解或雙蒸水融解，現(xiàn)用或在-20℃冷凍保存；4)、根據(jù)已獲得的和豇豆抗銹病基因緊密連鎖的AFLP標記全序列設計一對引物，擴增片段長度為98bp，引物序列為引物I5’---TCAACAGTGTCAGACCAAAC---3’引物II5’---GTTGAAGATTGTGGAAAGCT---3’；5)、最佳擴增體系的建立利用正交試驗，摸索建立和豇豆抗銹病基因連鎖特異片段的最佳擴增體系；6)、樣本檢測與判定根據(jù)待檢測樣品和對照樣品的特異片段的擴增結果，對被檢測豇豆植株是否為抗性株進行判定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豇豆銹病抗性的分子標記檢測方法，屬于蔬菜分子遺傳育種技術領域。該方法包括待檢測豇豆和陰性對照及陽性對照植株樣品的采集；樣品基因組DNA的提?。灰锏脑O計；最佳擴增體系的建立；樣本檢測與判定等步驟。本發(fā)明具簡便易行，快速、靈敏、特異性強，一般只需8個小時左右，成本低廉，檢測一個樣本低于1.5元，通過早期檢測，可明顯縮短豇豆抗銹病育種或市場種子種性鑒定的周期等特點。該方法可在豇豆抗銹病育種或市場種子種性鑒定中應用。
文檔編號C12Q1/68GK1995392SQ20061015547
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月26日 優(yōu)先權日2006年12月26日
發(fā)明者李國景, 朱祝軍, 劉永華, 吳曉花, 汪寶根, 魯忠富 申請人:浙江省農業(yè)科學院