一種輔助篩選抗條銹病小麥的方法及其專(zhuān)用引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種輔助篩選抗條誘病小麥的方法及其專(zhuān)用引 物。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)侵匾氖澜缧约Z食作物，21世紀(jì)W來(lái)，其平均每年種植面積約2362萬(wàn)hm2。 小麥產(chǎn)量影響著我國(guó)人民生活和國(guó)家糧食安全，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是我國(guó)小麥生產(chǎn)中的一件大事。 小麥條誘?。≒ucciniastriiformisf.sp.tritici)是世界上最嚴(yán)重的小麥病害之一。小 麥條誘病是一種分布廣泛的氣傳病害，在氣候冷涼、濕度大和高海拔地區(qū)尤為嚴(yán)重，具有流 行頻率高、爆發(fā)性強(qiáng)、發(fā)生范圍廣和危害性大等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著小麥的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，因此如 何控制其流行危害，越來(lái)越受到人們的高度重視。全世界有4300萬(wàn)hm2條誘病易發(fā)區(qū)，占總 種植面積的19. 4%。我國(guó)是世界上條誘病最大的流行地區(qū)，約2000萬(wàn)hm2,特別在西北和 西南地區(qū)連年發(fā)生。20世紀(jì)50年代至今，我國(guó)先后出現(xiàn)8次條誘病大流行，給小麥生產(chǎn)造 成巨大損失，其中1950年、1964年、1990年和2002年四次大流行發(fā)生面積最大、危害最重， 分別引起小麥產(chǎn)量損失600萬(wàn)噸、320萬(wàn)噸、180萬(wàn)噸和130萬(wàn)噸，前兩次發(fā)病面積高達(dá)1333 萬(wàn)hm2W上，后兩次發(fā)病面積為733萬(wàn)hm2W上。隨著小麥廣譜毒性條誘菌新生理小種條中 32號(hào)（條誘菌小種CYR32)和條中33號(hào)（條誘菌小種CYR32)的出現(xiàn)及其迅速蔓延，致使我 國(guó)大部分麥區(qū)抗病品種喪失抗性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2004-09年我國(guó)條誘病每年平均發(fā)生面積約420 萬(wàn)hm2,最大年份667萬(wàn)hm2左右，給小麥生產(chǎn)造成巨大損失。
[0003] 生產(chǎn)實(shí)踐中，可W用化控措施對(duì)條誘病進(jìn)行防治，但容易對(duì)環(huán)境及人畜帶來(lái)安全 隱患，利用抗病品種無(wú)疑是防治小麥條誘病最為經(jīng)濟(jì)、安全、有效的措施。目前已經(jīng)命名的 小麥抗條誘病基因分布于67個(gè)位點(diǎn)燈rl-Yr67)，除化18、化29、化30、化36、化39、化46、 化48、化49、和化52 (成株抗病基因）外，其余已命名的抗條誘病基因多為具有生理專(zhuān)化性 的主效抗病基因，由于其對(duì)條誘病表現(xiàn)高抗且易于田間選擇而深受育種家的喜愛(ài)。為了避 免大面積播種抗源單一而造成抗性頻繁喪失，需要持續(xù)發(fā)掘利用新的抗病基因及其連鎖標(biāo) 記。為了利用抗病品種，科研工作者提出了如多系品種、聚合育種及抗性品種的合理布局等 許多理論。運(yùn)些理論和方法的核屯、是抗病基因的合理利用，即實(shí)現(xiàn)抗病基因在時(shí)空分布上 多元化，使抗病基因和病菌毒性基因互作趨于穩(wěn)定狀態(tài)，從而延緩毒性小種產(chǎn)生和發(fā)展。要 實(shí)現(xiàn)小麥品種抗條誘病基因多樣化，必需掌握豐富的抗病基因明確的抗源，并不斷發(fā)掘和 創(chuàng)制新的抗源，擴(kuò)大和充實(shí)抗病基因庫(kù)，為培育抗病品種提供更加豐富廣泛的抗源和抗病 基因。
[0004] 分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assistedselection,MA巧是在作物遺傳改良過(guò)程 中用分子標(biāo)記作為輔助選擇的手段，其原理是選用與目標(biāo)基因緊密連鎖或者共分離的分子 標(biāo)記對(duì)后代株系進(jìn)行目標(biāo)基因或染色體區(qū)段的篩選，進(jìn)而在早代即可獲得含有目標(biāo)基因的 優(yōu)良單株，提高選擇效率。分子標(biāo)記在小麥抗病育種中表現(xiàn)諸多優(yōu)勢(shì)，其標(biāo)記量大，基因 位點(diǎn)豐富，不受環(huán)境條件及植物生長(zhǎng)因素影響，該技術(shù)使檢測(cè)多個(gè)抗病基因?qū)牍ぷ鞒蔀?可能，極大地提高基因聚合效率。小麥育種中常用的分子標(biāo)記包括連鎖標(biāo)記（SSR等）和 依據(jù)基因序列開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記（STS等）兩大類(lèi)。單核巧酸多態(tài)性（Singlenucleotide polymorphism,SN巧是基因組中最常見(jiàn)的遺傳多態(tài)性，隨著下一代測(cè)序技術(shù)（NG巧的發(fā)展， 使用高密度SNP微陣列忍片對(duì)大量樣本進(jìn)行掃描成為MAS的新方向。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明的目的是提供一種輔助篩選抗條誘病小麥的方法及其專(zhuān)用引物。
[0006] 本發(fā)明提供了一種引物組合，為如下（a)或化）或（C):
[0007] (a)wmc658 引物對(duì)和"3噸_6義_。10555_17235832 引物組；
[0008] 化）所述wmc658引物對(duì)；
[0009] (C)所述訊3噸_6義_。10555_17235832 引物組；
[0010] 所述wmc658引物對(duì)為能擴(kuò)增片段A的引物對(duì)；所述片段A為W小麥基因組DNA為 模板采用序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成 的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的片段；
[0011] 所述wsnp_ex_cl0555_17235832引物組為能擴(kuò)增片段B的引物對(duì)；所述片段B為 W小麥基因組DNA為模板采用序列表的序列3所示的單鏈DNA分子、序列表的序列4所示 的單鏈DNA分子和序列表的序列5所示的單鏈DNA分子組成的引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的 片段。 陽(yáng)01引所述wmc658引物對(duì)由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所 示的單鏈DNA分子組成。
[0013] 所述wsnp_ex_cl0555_17235832引物組由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子、 序列表的序列4所示的單鏈DNA分子和序列表的序列5所示的單鏈DNA分子組成。
[0014] 所述引物組合（a)中，每個(gè)引物對(duì)單獨(dú)包裝。所述引物組合（a)中，每條引物單獨(dú) 包裝。所述引物組合化）中，每條引物單獨(dú)包裝。所述引物組合（C)中，每條引物單獨(dú)包裝。
[0015] 所述引物組合的用途為如下（I)或（II) : (I)輔助篩選抗條誘病植物；（II) 輔助鑒定植物的抗條誘病性狀。
[0016] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途為如下 (I)或（II):(I)輔助篩選抗條誘病植物；（II)輔助鑒定植物的抗條誘病性狀。
[0017] 本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下（I)或 (II):(I)輔助篩選抗條誘病植物；（II)輔助鑒定植物的抗條誘病性狀。
[0018] 本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將所述引物組合中的每條引物獨(dú)立包 裝的步驟。
[0019] W上任一所述抗條誘病植物可為抗條誘病小麥，具體可為小麥品種"濟(jì)麥22"、小 麥品種"AvocetS"、小麥品種"濟(jì)麥22"的衍生品種或小麥品種"濟(jì)麥22"與其它小麥品種 的雜交后代。W上任一所述抗條誘病植物可為小麥品種"濟(jì)麥22"和小麥品種"AvocetS" 的雜交后代。
[0020] W上任一所述植物可為小麥。W上任一所述抗條誘病性狀可為侵染型口 = 0-2。
[0021] W上任一所述條誘病具體可為條誘菌小種CYR32引起的條誘病。
[0022] 本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測(cè)小麥的抗條誘病性狀的方法，包括如下步驟：
[0023] W待測(cè)小麥的基因組DM為模板，分別采用所述wmc658引物對(duì)和所述wsnp_ex_ cl0555_17235832引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0024] 如果采用所述wmc658引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中具有242bp的特異 片段且采用所述wsnp_ex_cl0555_17235832引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中目標(biāo) SNP的基因型為非CC純合型，待測(cè)小麥為候選的具有抗條誘病性狀的小麥；如果采用所述 wmc658引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中不具有242bp的特異片段且采用所述wsnp_ ex_cl0555_17235832引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中所述目標(biāo)SNP的基因型為CC 純合型，待測(cè)小麥為候選的具有感條誘病性狀的小麥；所述非CC純合型為T(mén)T純合型或TC 雜合型；所述目標(biāo)SNP為小麥基因組中的序列表的序列8所示核巧酸序列中的第24位核巧 酸。
[00巧]本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測(cè)小麥的抗條誘病性狀的方法，包括如下步驟：
[0026] W待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用所述wmc658引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0027] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中具有24化P的特異片段，待測(cè)小麥為候選的具有抗條誘病性 狀的小麥；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不具有242bp的特異片段，待測(cè)小麥為候選的具有感條誘病 性狀的小麥。
[0028] 本發(fā)明還保護(hù)一種輔助鑒定待測(cè)小麥的抗條誘病性狀的方法，包括如下步驟：
[0029] W待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，采用所述wsw_ex_cl0555_17235832引物組進(jìn) 行PCR擴(kuò)增；
[0030] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中目標(biāo)SNP的基因型為非CC純合型，待測(cè)小麥為候選的具有抗 條誘病性狀的小麥；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中所述目標(biāo)SNP的基因型為CC純合型，待測(cè)小麥為 候選的具有感條誘病性狀的小麥；所述非CC純合型為T(mén)T純合型或TC雜合型；所述目標(biāo)SNP 為小麥基因組中的序列表的序列8所示核巧酸序列中的第24位核巧酸。
[0031] 本發(fā)明還保護(hù)一種輔助篩選抗條誘病小麥的方法，包括如下步驟：按照W上任一 所述方法鑒定待測(cè)小麥的抗條誘病性狀性狀，篩選具有高抗條誘病性狀的小麥。
[0032] 采用wmc658 引物對(duì)時(shí)的PCR擴(kuò)增的程序：94°C5min;94°C30s、60°CImin、 72°Clmin，35 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin。
[0033] 具體可通過(guò)6 %變性聚丙締酷胺凝膠電泳和