專利名稱：一種高產(chǎn)納米磁小體的磁螺菌突變株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)磁小體的磁細(xì)菌突變株，其構(gòu)建方法，以及該菌株的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌磁小體(magnetosomes)是由趨磁細(xì)菌(magnetotactic bacteria)合成的一種Fe3O4顆粒，具有順磁性，它們粒度分布范圍窄，晶型穩(wěn)定、均一，一般直徑為納米級(jí)(30～50nm)，均包有磷脂雙分子膜，膜上嵌有極少量的蛋白，在細(xì)胞內(nèi)排列成鏈狀。根據(jù)以往報(bào)道及我室的研究，細(xì)菌磁小體在醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)等領(lǐng)域具有十分廣泛的應(yīng)用前景，如可作為固定化酶載體、免疫檢測(cè)中抗體載體、DNA和RNA的高效吸附劑、靶向定位治療中的藥物載體等。
趨磁細(xì)菌是微好氧菌，對(duì)環(huán)境要求苛刻，難以人工大量培養(yǎng)。通常采用的液體靜置培養(yǎng)方法，5～7天后，細(xì)胞光密度只能達(dá)到OD6000.2，無(wú)法獲得大量細(xì)胞和磁小體，限制了趨磁細(xì)菌的研究與其磁小體的應(yīng)用。為了解決這一問(wèn)題，許多學(xué)者對(duì)趨磁細(xì)菌的培養(yǎng)及其磁小體的合成條件進(jìn)行了研究。德國(guó)學(xué)者D.Schuler(1997)等用乙酸鈉為碳源，以控制通氣流量的液體培養(yǎng)法培養(yǎng)磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)，70小時(shí)后細(xì)胞密度達(dá)OD4001.4(相當(dāng)于OD600的0.7)，培養(yǎng)液中磁小體含量為2.6mg/l；日本學(xué)者M(jìn)atsunaga(2001)以琥珀酸鈉為碳源培養(yǎng)磁螺菌(Magnetospirillum sp.AMB-1)，144小時(shí)后，培養(yǎng)液中磁小體的含量為7.4mg/L。 Yang，C.D等(2001)采用分批補(bǔ)料的培養(yǎng)方法將磁小體產(chǎn)量提升至14.8mg/L。我室的姜偉等(2002)采用深層液體培養(yǎng)法培養(yǎng)磁螺菌(M.gryphiswaldense)，每升培養(yǎng)液可收獲20mg～28mg磁小體。
然而，通過(guò)培養(yǎng)方法來(lái)進(jìn)一步提高磁小體的產(chǎn)量，相對(duì)比較困難。為此，需要另辟途徑，以提高磁小體的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株高產(chǎn)納米磁小體的磁螺菌突變株；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該菌株的構(gòu)建方法；本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供培養(yǎng)該菌株的方法。
本發(fā)明以野生型菌株M.gryphiswaldense MSR-1(DSM6361)作為出發(fā)菌株，通過(guò)接合的方式，用miniTn5隨機(jī)誘變M.gryphiswaldenseMSR-1；在含有卡那霉素(kanamycin)的乳酸鈉-谷氨酸鈉培養(yǎng)基篩選顏色較黑接合子，電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的PHB顆粒，故將該菌株命名為M.gryphiswaldense NPHB(該菌株已于2006年11月09日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1831)。研究發(fā)現(xiàn)，該突變株P(guān)HB合成減少，而磁小體合成量增加。
miniTn5插入染色體后，采用反向PCR擴(kuò)增出插入位點(diǎn)周圍序列，分析后發(fā)現(xiàn)該片斷包含三個(gè)完整的開放閱讀框架(ORF)，而miniTn5插入了中間的一個(gè)ORF(該序列如序列表SEQ ID NO.1所示)的前端。將該ORF序列輸入GenBank中進(jìn)行同源檢索發(fā)現(xiàn)，突變部位序列與一些菌株的蛋白翻譯延伸因子EF-G有較高同源性。
本發(fā)明的M.gryphiswaldense NPHB菌株細(xì)胞直徑為0.5μm，長(zhǎng)為2.8～3.5μm，細(xì)胞似梭狀，裂殖。最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適生長(zhǎng)pH值7.2。在乳酸鈉培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)5天，可長(zhǎng)出直徑為1mm的菌落，菌落呈褐色。對(duì)碳源乳酸鈉的需求量為3～6g/L，對(duì)氮源氯化銨的需求量為0.4～0.8g/L。在液體培養(yǎng)條件下，30℃培養(yǎng)30hr，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)磁小體數(shù)量可達(dá)50～60個(gè)。
本發(fā)明進(jìn)一步建立了M.gryphiswaldense NPHB的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)條件是20℃～40℃，150～180rpm，培養(yǎng)時(shí)間為38～42hr。優(yōu)選為，30℃，160rpm，培養(yǎng)時(shí)間為40hr。
每升培養(yǎng)基含有乳酸鈉3～6g、NH4Cl 0.4～0.8g、酵母粉0.1g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、硫代乙醇酸鈉0.05g、礦質(zhì)元素混合液5ml、檸檬酸鐵(0.01mol/L)6～14ml，pH7.2。優(yōu)選為，乳酸鈉4.5g、NH4Cl 0.61g、酵母粉0.1g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.1g、硫代乙醇酸鈉0.05g、礦質(zhì)元素混合液5ml、檸檬酸鐵(0.01mol/L)12ml，pH7.2。其中，礦物元素混合物液的配方見(jiàn)表2。
本發(fā)明提供的磁螺菌突變株M.gryphiswaldense NPHB，磁小體在菌體中的含量比野生型提高35.62％，在單位培養(yǎng)液中的產(chǎn)量提高28.6％，而PHB的含量只有野生型的25％，發(fā)酵培養(yǎng)可達(dá)到50～60mg(磁小體)/L。


圖1是野生型磁螺菌的電鏡照片，箭頭所示之處為PHB顆粒；圖2是本發(fā)明磁螺菌突變株M.gryphiswaldense NPHB的電鏡照片。
具體實(shí)施例方式
下面詳述本發(fā)明菌株的構(gòu)建過(guò)程、培養(yǎng)方法。
實(shí)施例1 M.gryphiswaldense NPHB的獲得(1)轉(zhuǎn)座誘變本次試驗(yàn)將使用如下質(zhì)粒和菌株如表1所示。
表1使用的菌株和質(zhì)粒

Kenneth N.Timmis的工作單位是德國(guó)GBF-National ResearchCentre for Biotechnology。他建立Mini-Tn5的誘變體系，并于1990年在細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteria)上發(fā)表文章，題為Mini-Tn5Transposon Derivatives for Insertion Mutagenesis，Promoter Probing，andChromosomal Insertion of Cloned DNA in Gram-Negative Eubacteria.Vol.172，No.11，p.6568-6572。
大腸桿菌的培養(yǎng)條件是每100ml LB液體培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，37℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm；磁螺菌的培養(yǎng)條件是每100ml乳酸鈉液體培養(yǎng)基裝于150ml三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100rpm。
將含有質(zhì)粒pUT miniTn5 lacZ2(具有氨芐青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，其中后者位于miniTn5插入序列上)的大腸桿菌(Escherichia coli)CC118(λpir)和M.gryphiswaldenseMSR-1(DSM6361)分別培養(yǎng)至OD6000.3-0.5時(shí)，各取兩毫升培養(yǎng)液混合，在無(wú)菌條件下加壓，使培養(yǎng)基通過(guò)細(xì)菌濾膜(孔徑0.25μm)。將濾膜及附著于其上的兩種細(xì)菌放在固體乳酸鈉培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，以利于二菌接合；乳酸鈉培養(yǎng)基配方如下(每升含)乳酸鈉2.25g、NH4Cl 0.61g、酵母粉0.1g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、硫代乙醇酸鈉0.05g、礦質(zhì)元素混合液5ml、檸檬酸鐵溶液(0.01mol/L)6ml。
表2礦質(zhì)元素混合液(每升)Nitrilotriacetic acid(氨三乙酸) 1.5gMgSO4·7H2O(硫酸鎂) 3gMnSO4·2H2O(硫酸錳) 0.5gNaCl(氯化鈉) 1gFeSO4·7H2O(硫酸亞鐵) 0.1gCoSO4·7H2O(硫酸鈷) 0.18gCaCl2·2H2O(氯化鈣) 0.1gZnSO4·7H2O(硫酸鋅) 0.18g
CuSO4·5H2O(硫酸銅) 0.01gKAl(SO4)2·12H2O(硫酸鋁鉀) 0.02gH3BO3(硼酸) 0.01gNa2MoO4·2H2O(鉬酸鈉)0.01gNiCl2·6H2O(氯化鎳) 0.025gNa2SeO3·5H2O(亞硒酸鈉) 0.3mg(2)接合子的篩選用少許無(wú)菌生理鹽水洗下濾膜上的細(xì)菌，均勻地涂布在含有卡那霉素的乳酸鈉-谷氨酸鈉培養(yǎng)基上。由于M.gryphiswaldense不能在卡那霉素抗性平板上生長(zhǎng)；同時(shí)磁螺菌沒(méi)有λpir基因，不支持質(zhì)粒pUT miniTn5 lacZ2的復(fù)制。該菌只有使miniTn5插入染色體，才能擁有卡那抗性。而大腸桿菌不能利用谷氨酸鈉作為氮源。因此，只有接合子才能生長(zhǎng)。
乳酸鈉-谷氨酸鈉培養(yǎng)基配方如下(每升含)乳酸鈉2.25g、谷氨酸鈉4g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、硫代乙醇酸鈉0.05g、礦質(zhì)元素混合液5ml、檸檬酸鐵溶液(0.01mol/L)6ml。
在512個(gè)接合子中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)顏色較黑的接合子，通過(guò)電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)它可以合成磁小體，但未發(fā)現(xiàn)PHB顆粒，故將該菌命名為M.gryphiswaldense NPHB。
實(shí)施例2突變株M.gryphiswaldense NPHB的培養(yǎng)及其生產(chǎn)磁小體能力分析在2L搖瓶試驗(yàn)中，將野生型菌株與突變株分別培養(yǎng)于乳酸鈉培養(yǎng)基，比較它們?cè)诰w密度和磁小體產(chǎn)量之間的差異。
具體條件為培養(yǎng)基的裝量為1.5L，培養(yǎng)條件為30±5℃，160±10rpm。培養(yǎng)40hr。
突變株只能在這種培養(yǎng)基上長(zhǎng)到OD5650.8，而野生型能長(zhǎng)到OD5651.5以上。分析表明，突變株消耗乳酸的強(qiáng)度比野生型大，在OD5650.8左右，即將乳酸耗盡。因此，需要增加培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的濃度。
將乳酸鈉培養(yǎng)基中的乳酸鈉和檸檬酸鐵加倍，配制成改良乳酸鈉培養(yǎng)基，其配方為(每升含)乳酸鈉4.5g、NH4Cl 0.61g、酵母粉0.1g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、硫代乙醇酸鈉0.05g、礦質(zhì)元素混合液5ml、檸檬酸鐵(0.01 mol/L)12ml。
在于上述培養(yǎng)條件相同的情況下培養(yǎng)，最后野生型菌體密度(OD565)平均為1.31，突變體菌體密度(OD565)平均為1.24。
兩種菌體收集后，用超純水洗滌兩次后，再以PBS緩沖液洗滌兩次，重懸于50ml PBS緩沖液中，超聲波破碎，功率為200W，工作4秒，間歇7秒，共90次，重復(fù)4遍。破碎后的菌懸液用磁鐵吸附磁小體，棄去上清后，重新用PBS緩沖液懸浮，超聲波洗滌，然后再吸附、重懸，重復(fù)10次以上。收集到的磁小體用濾紙吸干水分后稱重。野生型菌株14.15mg/L(10.78 mg/L/OD565)；突變體18.2mg/L(14.62mg/L/OD565)，突變株比野生型的磁小體產(chǎn)量提高28.62％，含量提高35.62％。上述單位mg/L/OD565是用來(lái)表示磁螺菌中磁小體的相對(duì)含量，OD565是指培養(yǎng)后最終光密度即OD565時(shí)的光密度，野生型為1.31，突變型為1.24。
同時(shí)對(duì)突變株中的PHB含量檢測(cè)在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)40小時(shí)后，離心收集菌體，菌體經(jīng)超純水洗滌兩次后，再用丙酮抽提，烘干后研磨，酯化，經(jīng)氣相色譜法測(cè)定PHB含量，M.gryphiswaldense MSR-1中PHB含量為41％，突變株中PHB含量為11％，僅為野生型菌株中PHB含量的25％。
在7.5升自動(dòng)發(fā)酵罐中培養(yǎng)40小時(shí)左右，野生型菌株OD565為2.8，產(chǎn)量為45.3mg/L，含量為16.2mg/L/OD565；突變株OD565為1.9，產(chǎn)量為54mg/L(比野生菌提高19.2％)，含量為16.2mg/L/OD565(比野生菌提高75.3％)(由于野生菌合成較多PHA，單個(gè)細(xì)胞的體積比突變株大，所以O(shè)D565值較高，但同時(shí)磁小體含量遠(yuǎn)低于突變株。此外，在罐上菌體中磁小體的含量遠(yuǎn)高于搖瓶)。
突變株在42升自動(dòng)發(fā)酵罐的培養(yǎng)結(jié)果可達(dá)50～60mg(磁小體)/L，與7.5升自動(dòng)發(fā)酵罐結(jié)果相近。
實(shí)施例3突變株M.gryphiswaldense特征描述M.gryphiswaldense NPHB菌株細(xì)胞直徑為0.5μm，長(zhǎng)為2.8～3.5μm，細(xì)胞類似梭狀，裂殖。在乳酸鈉培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)5天，可長(zhǎng)出直徑為1mm的菌落，菌落呈褐色。對(duì)碳源乳酸鈉的需求量為3～6g/L，氮源氯化銨的需求量為0.4～0.8g/L。在液體培養(yǎng)條件下，30℃培養(yǎng)30hr，細(xì)胞內(nèi)磁小體數(shù)量可達(dá)50～60個(gè)。
序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種高產(chǎn)納米磁小體的磁螺菌突變株<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2031<212>DNA<213>M. gryphiswaldense MSR-1<400>1atgactggca agacagtttc gcttccgcgt gccgccgccc tggtggggcc gttttccagc 60ggcaagacca gcctgctgga ggcgctgttg ttccgcgcgg aagccatccc ccgtcaaggt120cgcatcaagg atggcaacac cgtcggtgat gcaagcgtgg aagcccgcgc ccggctgatg180agcgtcgagc ccaatctggc cggggtcgag tatctgggcg aacgctggac cttcatcgac240tgccccggct cggtggttca gcaagacacg tataatgtgc tgatggcggt ggacgccgcc300atcgtggtgt gcgaacccga tcccgcccgc gcggtaatgg tggcgccact gttgaagttt360ctggatgaac acggtgtgcc gcatctcctg ttcatcaaca agatcgacag caacggcacc420cggctgcgtg agacgctgga ggcgctgcaa ggcgtgtccg accgcccgct ggtgctgcgc480gaggttccca tccgcgaggg cgagcaggtc accggcttca tcgatctggt cagcgagcgg540gcctataagt accgccccgg ccagaaatcc gacctgatca agattcccga tgccatcaag600gaggaggaac aattggcccg ccaggaaatg ctggagcatc tggccgattt cgacgaccac660ctgatggaag aattgctcga agacatcacc ccaccgcagc aagagcttta cgacgacctg720gcccgcgatc tggccgatga tttgatcgtg ccggtgttct tcggctcggc cgaaaacgat780ggtggcatca cccggctgtg gaaggcgttg cgccatgacg tgccggcccc caccgccacc840gccgcccgtt tgggtttcac caatggcgga gccgccaccg cccaggtgtt caagaccgtc900catgccgccc ataccggcaa gctgtcctgg gctcgcgtgt tgcgcggcga gttcgccgat960gcccaggcct tggccggcgg caaggtgtcg gggctgtatc tgcccgctgt gggcaccgcc 1020gccaagatga ccaaggcggg cctgggcgac gtggtcggtt tcggtcgtct ggacaatgcc 1080cagaccggtg atgtgctggg cggtgacgac cagggcggca ccctttggcc caagccgctg 1140gagcccctgt tcgccctggc gctggaagcc gagaaaaagg gcgacgacgt caagctttcg 1200ggggcgctga ccaaactggc cgaggaagac ccgtcctatc ggctggaaca gaacgccgaa 1260tcgggcgaaa ccgtgctgtg gggccaaggc gaaatccacc tgctggtggc gttggaacgg 1320ctgaaaagcc ggttcggcct gggtgtcgtc acccacaagc cgacggtgcc ctataaggaa 1380accatcaaga agccggtcag cgtccatggc cgccacaaga agcaateggg tgggcatggc 1440cagttcggcg acgtccacgt ggacattcgc ccgcagccgc gcggcgccgg tttcgtcttc 1500gaggacaaga tcgtcggcgg cgcggtaccg cgtcagtata ttccggcggt ggaagacggt 1560gtggtcgatt tcctcaagca gggcgccctt ggcttcccgg tggtggacat cgccgtcacc 1620ttgaccgacg gcagctatca cgcggtggae agttccgaca tggccttcaa gacggcggcg 1680cgcatcgcca tggccgaagg catgccgcaa tgcgacccgg tgctgctgga acccatcctg 1740
gcggtggaaa tctcggttcc caccgatttc acctcgaaag cccagcgtat catcaccgga 1800cggcgcggcc agatcctggg cttcgacgcc aaggaaggct gggctggctg ggatcaggtg 1860tcagcctatc tgccgcaggc ggaaatgggg gacctgatcg ttgaactgcg gtccctgacc 1920atgggggtcg gcacgttcgg ctggcgtttc gaccatttgc aggaactgtc ggggcgggcc 1980gccacccagg tggtggatgc gcgcaaggaa tccctggcga aaaaggggtg a 203權(quán)利要求
1.一種磁螺菌M.gryphiswaldense NPHB CGMCC No.1831，其具有生產(chǎn)磁小體的能力。
2.一種生產(chǎn)磁小體的方法，其特征在于用權(quán)利要求1所述的菌株在含有乳酸鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集并提純磁小體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于培養(yǎng)條件是20℃～40℃，150～180rpm，pH7.2。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述培養(yǎng)條件是30℃，160rpm，pH7.2。
5.如權(quán)利要求2～4所述的方法，其中所述的培養(yǎng)基的配方是每升培養(yǎng)基含乳酸鈉3～6g、NH4Cl0.4～0.8g、酵母粉0.1g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.1g、硫代乙醇酸鈉0.05g、礦質(zhì)元素混合液5ml、0.01mol/L的檸檬酸鐵6～14ml，pH7.2。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)納米磁小體的磁螺菌突變株M.gryphiswaldense NPHB CGMCC No.1831。本發(fā)明菌株通過(guò)miniTn5隨機(jī)誘變野生型M.gryphiswaldense MSR－1，經(jīng)篩選后獲得。磁小體在菌體中的含量比野生型提高35.62％，在單位培養(yǎng)液中的產(chǎn)量提高28.6％，而PHB的含量只有野生型的25％，發(fā)酵培養(yǎng)可達(dá)到50～60mg(磁小體)/L。
文檔編號(hào)C12P3/00GK1970740SQ200610144160
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日
發(fā)明者田杰生, 劉江寧, 姜偉, 李穎, 李季倫 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)