專利名稱：紫外線誘變獲得耐低溫鹽藻及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鹽藻，尤其是涉及一種采用紫外線誘變鹽藻(鹽藻，Dunaliellabardawil)，通過選育獲得能耐低溫(3～10℃)的突變株及其鑒定的方法。
背景技術(shù)：
鹽藻(Dunaliellasp.)是一類單細胞真核綠藻，天然沒有細胞壁，容易被消化。鹽藻細胞中灰分含量較低，富含甘油、蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、碳水化合物以及一定量的不飽和脂肪酸和維生素，是較為理想的保健食品之一，也可以作為動物的優(yōu)質(zhì)餌料和飼料，因此成為人類主要的養(yǎng)殖微藻之一，在商業(yè)開發(fā)中具有很高的利用價值。鹽藻的最適生長溫度為25～30℃，當(dāng)溫度低于10℃時，鹽藻生長緩慢，甚至不生長，形成胞囊細胞。冬季氣溫低，鹽藻難以露天或無溫室養(yǎng)殖。因此世界幾個主要的鹽藻養(yǎng)殖國家，如澳大利亞、美國和以色列都只能在熱帶或亞熱帶的氣溫較高的地區(qū)進行養(yǎng)殖。在氣溫較低的冬季整個養(yǎng)殖場只能閑置，導(dǎo)致養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益不夠高。如果能獲得一種在較低溫度(3～10℃)下還能比對照生長快得多的鹽藻，則既能明顯提高現(xiàn)有鹽藻養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益，又能使鹽藻的養(yǎng)殖區(qū)北移(北半球)和/或南移(南半球)，具有十分顯著的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的鹽藻只能在熱帶或亞熱帶的氣溫較高的地區(qū)進行養(yǎng)殖的問題，提供一種耐低溫鹽藻突變株，以及采用紫外線誘變、低溫選育鹽藻的技術(shù)路線及其鑒定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是以紫外線誘變的方法獲得在低溫(3～10℃)條件下比對照生長快2.1～21倍的鹽藻突變藻株。
本發(fā)明所述的耐低溫鹽藻突變株的特征為1)在3～10℃下光照培養(yǎng)還能生長，達到(1.05～8.11)×106個細胞/mL，藻液的細胞密度為對照的2.1～21倍；2)鹽藻耐低溫突變株與野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)I為0.680～0.910；3)鹽藻耐低溫突變株與野生型原出發(fā)株相比，在進行SDS-PAGE電泳時將出現(xiàn)一至若干條新的蛋白帶，如在大約36和158kDa處各多出一條新的蛋白帶，同時也可能喪失一至若干條蛋白帶；或在某一位置的蛋白帶前者比后者的表達量高，如在大約27和29kDa處耐低溫突變株表達的蛋白量比野生型原出發(fā)株高，或者反過來的情況也有出現(xiàn)。
本發(fā)明所述的耐低溫鹽藻的誘變、選育及其鑒定方法的具體步驟如下1)將人工海水培養(yǎng)基分裝封口、滅菌；2)取出滅菌過的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，接種鹽藻；3)分別經(jīng)光照和黑暗的光周期誘導(dǎo)，鹽藻出現(xiàn)同步化生長；4)以碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽藻，取樣計算藻液中鹽藻細胞的密度；5)取處于指數(shù)生長期的鹽藻藻液，傾注于培養(yǎng)皿中，置紫外燈下照射進行照射誘變，然后暗培養(yǎng)；6)將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液混勻，涂布到鹽藻瓊脂培養(yǎng)基上，低溫光照培養(yǎng)；7)挑取生長迅速的單藻落分別接種到少量培養(yǎng)液中，在低溫光照下擴大培養(yǎng)；8)取步驟7)培養(yǎng)所得的鹽藻和野生型原出發(fā)株移接到含新鮮培養(yǎng)液的容器中擴大培養(yǎng)；9)取樣檢測、比較鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株在低溫光照下的生長曲線；10)提取各鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA，并以10聚核苷酸隨機引物對總DNA進行隨機多態(tài)性擴增DNA(RAPD)比較；11)根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)；12)提取鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果；13)比較鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株兩者的蛋白電泳圖譜，找出鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間蛋白條帶的共同點與不同之處；14)根據(jù)在低溫環(huán)境下比對照生長快2.1～21倍的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認獲得耐低溫鹽藻突變株。
在步驟1)中，所述的將人工海水培養(yǎng)基分裝封口、滅菌是指將人工海水培養(yǎng)基分裝在100～250mL的錐形瓶中，每瓶裝量20～50mL，棉花塞塞緊或用8層紗布封口，包上牛皮紙，把上述培養(yǎng)基放置在高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15～20min，所述的人工海水培養(yǎng)基的組成如表1所示。
在步驟2)中，所述的接種鹽藻是指在超凈工作臺中取1～5mL鹽藻藻液接種在無菌培養(yǎng)基中搖勻，重新塞上棉花塞或封好紗布。
在步驟3)中，所述的光周期誘導(dǎo)是在25～30℃的培養(yǎng)箱中每天以2000～4000燭光(lx)光照12h，黑暗12h，連續(xù)培養(yǎng)2～5d；可以是靜止培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s，或在可控光照的搖床上以30～150rpm的速度搖動。獲得同步化生長的鹽藻。
表1 鹽藻培養(yǎng)基組成

在步驟4)中，所述的以碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽藻，取樣計算藻液中鹽藻細胞的密度是指每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽藻，立即取樣在血球計數(shù)板上計算藻液中鹽藻細胞的密度。所述的計算藻液中鹽藻細胞的密度可重復(fù)計數(shù)3次，取平均值，繪制鹽藻的生長曲線。所用的碘液為碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水100mL。先用少量蒸餾水溶解碘和碘化鉀，待完全溶解后再定容到100mL。所用的溴酚藍溶液為0.25％的溴酚藍溶解在40％的蔗糖溶液中。鹽藻細胞密度的計算也可以用光密度法，即取出藻液注入比色杯中，在OD630處讀取數(shù)值，依據(jù)公式“細胞密度＝899.08OD630-12.544”換算成藻液細胞密度。以鹽藻培養(yǎng)時間為橫軸，以培養(yǎng)基中的藻細胞密度為縱軸，繪制鹽藻的生長曲線。
在步驟5)中，所述的處于指數(shù)生長期的鹽藻藻液置于超凈工作臺中紫外燈下照射進行誘變，所用超凈工作臺事先擦凈并以紫外線殺菌15～20min；每個無菌培養(yǎng)皿中盛5～30mL藻液；超凈工作臺中的紫外燈為20～30w，紫外燈與培養(yǎng)皿的距離為12～18cm，紫外線照射時間為50～100s；照射后關(guān)閉紫外燈，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用不透光的紙或布包好培養(yǎng)皿進行暗培養(yǎng)；暗培養(yǎng)的溫度為20～30℃，時間為48～72h。
在步驟6)中，所述的藻液和新鮮培養(yǎng)基按質(zhì)量比為1∶(1～10)，混勻后吸取50～500μL均勻地涂布到鹽藻瓊脂培養(yǎng)基上，蓋好培養(yǎng)皿，以封口膜密封上下皿蓋間的縫隙，防止培養(yǎng)基水分逃逸，培養(yǎng)皿要倒扣培養(yǎng)防止水珠產(chǎn)生。所述的鹽藻瓊脂培養(yǎng)基指的是在鹽藻人工海水培養(yǎng)液中添加1.0％～2.0％的瓊脂；在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培養(yǎng)。
在步驟7)中，所述的單藻落是指由單個鹽藻細胞長成的細胞集落；所述的生長迅速的單藻落是指在同等條件下長得比較大的藻落；以無菌接種環(huán)挑取較大藻落的藻細胞分別接種到含3～8mL鹽藻培養(yǎng)液的試管中，在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)。所述的鹽藻培養(yǎng)液的試管應(yīng)斜放成15～45°，每天手工搖動數(shù)次，每次10～20s，或在光照搖床上以30～150rpm的速度搖動。
在步驟8)中，所述的擴大培養(yǎng)可在無菌超凈工作臺中取各誘變藻液和對照藻液0.5～2.0mL，加入到裝有50～200mL鹽藻培養(yǎng)液的錐形瓶中，塞上棉花塞或封好紗布，其標準就是使各藻液的起始細胞密度(OD值)盡可能一致或十分接近；放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中，每天手工搖動數(shù)次，每次10～20s；或在光照搖床上以30～150rpm的速度搖動。
在步驟9)中，所述的取樣檢測是每1～3d取出0.5～4.0mL藻液，按步驟4)所述方法測定各藻液的細胞密度。
在步驟10)中，所述的提取各鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA是按常規(guī)方法提取植物總DNA，在紫外分光光度計上檢測該DNA的OD260與OD280的比值。若該比值小于1.8，則說明DNA的純度不夠，應(yīng)進一步提純；若該比值大于或等于1.8，則可以進行后述實驗。所述的10聚核苷酸隨機引物是計算機隨機設(shè)計的、由10個脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA(可從上海生工生物工程有限公司等處購買)；所述的隨機引物對總DNA進行隨機多態(tài)性擴增是以各藻的總DNA為模板，分別以單鏈10聚核苷酸為引物進行的PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖含量0.8％～1.2％)，在凝膠成像系統(tǒng)掃描和記錄。所選取的引物至少要達到25～30個，每個引物至少重復(fù)進行兩次PCR反應(yīng)，兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。從這些擴增結(jié)果中遴選條帶清晰、重復(fù)性良好的引物進行正式擴增。
在步驟11)中，所述的計算鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)，其公式為I＝2Nij/(Ni+Nj)，式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。
在步驟12)中，所述的提取鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)可采用對細胞反復(fù)凍融裂解的方法分別提取鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)，保持兩者蛋白濃度的一致性；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的分離膠濃度為10～12，濃縮膠濃度為4～5。
在步驟13)中，所述的比較鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株兩者的蛋白電泳圖譜是檢測它們之間的蛋白泳帶是否有增加或/和減少，或者在兩者蛋白濃度基本一致的條件下，其中一條或幾條的蛋白泳帶比對方相對位置上的蛋白更濃些(含量更高)或更淡些(含量更低)。
由于突變株具有穩(wěn)定的可在較低溫度(3～10℃)下比對照生長快2.1～21倍的新特點，同時RAPD和SDS-PAGE檢測都證明突變株與原出發(fā)株在DNA和蛋白質(zhì)水平基本相同，但也都各自出現(xiàn)一些不同的突變，因此可以確定已經(jīng)獲得耐低溫鹽藻突變株。
鹽藻養(yǎng)殖一般都是在露天或室外的淺池中進行，氣候因素對其生長具有決定性的影響。具備耐低溫特征的鹽藻將能顯著延長鹽藻的露天或室外的養(yǎng)殖時間，大大提高養(yǎng)殖場的生產(chǎn)效益；此外耐低溫鹽藻還能使鹽藻的養(yǎng)殖區(qū)域北移，有利于開辟我國北方養(yǎng)殖鹽藻的新局面?？梢姡景l(fā)明獲得在低溫(3～10℃)下比對照生長快2.1～21倍的突變藻株，必將對延長一年中鹽藻的養(yǎng)殖周期、提高養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益具有重要意義。


圖1為耐低溫鹽藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株在5℃的生長曲線。在圖1中，橫坐標為培養(yǎng)天數(shù)/d，縱坐標為細胞數(shù)量(×106個/mL)，Ba代表野生型原出發(fā)株。
圖2為耐低溫鹽藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株的RAPD擴增圖譜。在圖2中，M代表DNA分子量標志物，單位為bp，即堿基對；圖上方的英文字母和數(shù)字的組合(S260、S264、S265)代表各種10聚核苷酸隨機引物；5148、2027、1375和831分別代表DNA分子量為5148、2027、1375和831個堿基對。
圖3為耐低溫鹽藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株用另三種10聚核苷酸隨機引物的RAPD擴增圖譜。在圖3中，M代表DNA分子量標志物，其單位為bp，即堿基對；圖上方的英文字母和數(shù)字的組合(S282、S283、S284)代表各種10聚寡核苷酸隨機引物；5148、2027、1375和947代表分別代表DNA分子量為5148、2027、1375和947個堿基對。
圖4為耐低溫鹽藻突變株L-5與野生型原出發(fā)株的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜。在圖4中，M為蛋白質(zhì)分子量標志物，單位為kDa(千道爾頓)；Ba代表野生型原出發(fā)株。在大約36和158kDa處L-5比野生型原出發(fā)株各多出一條新的蛋白帶，同時在大約27和29kDa處L-5表達的蛋白量比對照高得多。圖右側(cè)的數(shù)字158、116、66、56、43、36和27分別代表蛋白質(zhì)分子量為158、116、66、56、43、36和27kDa(千道爾頓)。
具體實施例方式以下實施例將對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1紫外線誘變和培育耐低溫鹽藻，需先配制培養(yǎng)鹽藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培養(yǎng)液，將各成分事先分組配成50～1000倍的母液，使用時再按需稀釋配制成培養(yǎng)液。配制培養(yǎng)鹽藻的人工海水培養(yǎng)液的組成如表1所示。將人工海水培養(yǎng)液分裝在100mL的錐形瓶中，每瓶裝量20mL，棉花塞塞緊，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15min。取出滅菌過的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，取1mL鹽藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，塞上棉花塞。在20℃的培養(yǎng)箱中每天以4000lx光照12h，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)2d，獲得同步化生長的鹽藻，即出現(xiàn)大量細胞分裂現(xiàn)象。每天定時取出藻液0.3mL，以等量的碘液滅活鹽藻，取樣用血球計數(shù)板計算藻液中鹽藻細胞的密度。超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌15min。取處于指數(shù)生長期(即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi))的鹽藻藻液，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿5mL。置超凈工作臺中20w紫外燈下，距離12cm照射100s進行誘變，20℃暗培養(yǎng)72h。
將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶1的比例混勻，吸取混勻藻液50μL涂布到含瓊脂1.0％的鹽藻固體培養(yǎng)基上，低溫5℃光照1000lx，不間斷光照培養(yǎng)。挑取生長迅速的單藻落分別接種到含3mL鹽藻培養(yǎng)液的試管中，15°斜放，在5℃以1000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次至藻液呈深綠色。取0.5mL上述長成的鹽藻藻液移接到含50mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在5℃以1000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s。每3天取樣0.5mL在血球計數(shù)板計數(shù)藻液中耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株在低溫培養(yǎng)時的細胞密度，描繪出各自的生長曲線(參見圖1)。由圖1可見，L-5在低溫5℃的情況下仍能基本正常生長，而野生型原出發(fā)株在第48d就已進入生長平衡期，且藻液的細胞密度低得多。實驗觀察到，在5℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，耐低溫鹽藻突變株L-5藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過57d培養(yǎng)，其藻液細胞密度達到8.11×106個細胞/mL，是原始細胞密度的33.8倍，是野生型原出發(fā)株的2.59倍；野生型原出發(fā)株一直到第24d都沒有明顯增長，從第27d才緩慢進入指數(shù)生長期，而到第48d就已經(jīng)達到生長平衡期，其最終藻液密度僅為3.13×106個細胞/mL。提取各鹽藻總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以25個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究；每個引物至少重復(fù)進行兩次PCR反應(yīng)，并將反應(yīng)產(chǎn)物在含瓊脂糖0.8％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中1個引物不產(chǎn)生任何條帶，7個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，17個能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復(fù)性良好的12個引物(參見表2)進行正式擴增。實驗共檢測到125個位點，其中12個引物擴增出差異條帶(參見圖2)。
根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫鹽藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。根據(jù)表2計算耐低溫鹽藻突變株L-5和野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I為0.768，符合變異株的特征。提取耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為10％，濃縮膠濃度為4％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果(參見圖3)。比較兩者的蛋白電泳圖譜(參見圖3)，可以看到，在大約36kDa和158kDa處耐低溫鹽藻突變株L-5比野生型原出發(fā)株各多出一條新的蛋白帶，同時在大約27kDa和29kDa處耐低溫鹽藻突變株L-5表達的蛋白量比原出發(fā)株高得多(箭頭指處)。根據(jù)在低溫環(huán)境(5℃)下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫鹽藻突變株。
表2.12個10聚核苷酸隨機引物序列及其擴增結(jié)果

實施例2與實施例1類似，其區(qū)別在于配制培養(yǎng)鹽藻(Dunaliella salina)的人工海水培養(yǎng)液，將人工海水培養(yǎng)液分裝在250mL的錐形瓶中，每瓶裝量50mL，8層紗布封口，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌20min。取出滅菌過的培養(yǎng)液，冷卻至室溫后，取5mL鹽藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，8層紗布封口。在30℃的培養(yǎng)箱中每天光照12h，2000lx，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)5d，獲得同步化生長的鹽藻，即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi)，鹽藻出現(xiàn)大量細胞分裂。隔天定時取出藻液0.5mL，以等量的溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽藻，取樣用血球計數(shù)板計算藻液中鹽藻細胞的密度。
超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌20min。取處于指數(shù)生長期的鹽藻(即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi))，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿30mL。置超凈工作臺中30w紫外燈下距離18cm照射50s進行誘變，30℃暗培養(yǎng)48h。將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶10的比例混勻，吸取混勻藻液500μL涂布到含瓊脂2.0％的鹽藻固體培養(yǎng)基上，低溫3℃光照強度4000lx，不間斷光照培養(yǎng)。挑取生長迅速的單藻落分別接種到含8mL鹽藻培養(yǎng)液的試管中，45°斜放，在3℃以4000lx的光照強度，10rpm搖床培養(yǎng)至藻液呈深綠色。取2.0mL上述長成的鹽藻藻液移接到裝有200mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在3℃以3000lx的光照強度，150rpm搖床培養(yǎng)。每天取樣4.0mL在分光光度計檢測耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株在低溫培養(yǎng)時的藻液細胞密度，描繪出各自的生長曲線。實驗觀察到，在本培養(yǎng)條件下，耐低溫鹽藻突變株藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過60d培養(yǎng)，其藻液密度達到1.05×106個細胞/mL，是原始細胞密度的29.2倍。野生型原出發(fā)株一直沒有明顯增長，實驗結(jié)束時其最終藻液細胞密度僅為0.051×106個細胞/mL，與實驗開始時基本無異。
提取耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以30個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究。每個引物至少重復(fù)進行兩次PCR反應(yīng)，并將反應(yīng)產(chǎn)物在含瓊脂糖1.2％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中2個引物不產(chǎn)生任何條帶，9個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，19個引物能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復(fù)性良好的16個引物進行正式擴增。實驗共檢測到136個位點，其中14個引物擴增出差異條帶。
根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫鹽藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝0.680，符合變異株的特征。提取耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為5％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果。比較兩者的蛋白電泳圖譜可以看到，在大約37kDa和150kDa處耐低溫鹽藻突變株比野生型原出發(fā)株各多出一條新的蛋白帶。根據(jù)在低溫環(huán)境(3℃)下基本能生長的新特征和RAPD研究及蛋白分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫鹽藻突變株。
實施例3與實施例1類似，其區(qū)別在于配制培養(yǎng)鹽藻(Dunaliella bardawil)的人工海水培養(yǎng)液，將人工海水培養(yǎng)液分裝在150mL的錐形瓶中，每瓶裝量30mL，棉花塞塞緊，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15min。取出滅菌過的培養(yǎng)液，冷卻至室溫后，取3mL鹽藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，塞上棉花塞。在25℃的培養(yǎng)箱中每天光照12h，3000lx，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)3d，獲得同步化生長的鹽藻，即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi)，鹽藻出現(xiàn)大量的細胞分裂。每天定時取出藻液5mL，在分光光度計檢測藻液的OD630數(shù)值，換算成藻液中鹽藻細胞的密度。超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌15min。取處于指數(shù)生長期的鹽藻藻液，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿20mL。置超凈工作臺中25w紫外燈下距離15cm照射70s進行誘變，25℃暗培養(yǎng)60h。將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶5的比例混勻，吸取200μL涂布到含瓊脂1.5％的鹽藻固體培養(yǎng)基上，低溫10℃，光強3000lx，不間斷光照培養(yǎng)。
挑取生長迅速的單藻落分別接種到含5mL鹽藻培養(yǎng)液的試管中，30°斜放，在10℃以3000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s，培養(yǎng)至藻液呈深綠色。取1.0mL上述長成的鹽藻藻液移接到含100mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在10℃以2000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s。每3天取樣1.5mL在分光光度計測OD630數(shù)值，換算成它們的細胞密度，描繪出各自的生長曲線。實驗觀察到，在10℃光照培養(yǎng)下，耐低溫鹽藻突變株藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過60d培養(yǎng)，其藻液細胞密度可達7.88×106個細胞/mL，是原始細胞密度的31.2倍，是野生型原出發(fā)株的2.32倍；野生型原出發(fā)株一直到第21d都沒有明顯增長，從第24d開始才緩慢進入指數(shù)生長期，而到第45d就已經(jīng)達到生長平衡期，其最終藻液細胞密度僅為3.40×106個細胞/mL。
分別提取耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以28個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究。每個引物至少重復(fù)進行兩次PCR反應(yīng)，并將反應(yīng)產(chǎn)物在含瓊脂糖1.0％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中3個引物不產(chǎn)生任何條帶，5個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，20個能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復(fù)性良好的15個引物進行正式擴增。實驗共檢測到135個位點，其中13個引物擴增出差異條帶。
根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫鹽藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。經(jīng)計算，耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I為0.910，符合變異株的特征。分別提取耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為11％，濃縮膠濃度為4％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果。比較兩者的蛋白電泳圖譜?？梢钥吹?，耐低溫鹽藻突變株比野生型原出發(fā)株多出兩條新的蛋白帶，同時在大約67kDa處，前者表達的蛋白量比后者高得多。根據(jù)在低溫環(huán)境(10℃)下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫鹽藻突變株。
實施例4與實施例1類似，其區(qū)別在于配制培養(yǎng)鹽藻(Dunaliella salina)的人工海水培養(yǎng)液，將人工海水培養(yǎng)液分裝在200mL的錐形瓶中，每瓶裝量40mL，8層紗布封口，包上牛皮紙。把包裝好的上述培養(yǎng)液放置在高壓滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15min。取出滅菌過的培養(yǎng)液，冷卻至室溫后，取4mL鹽藻藻液接種在無菌培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，8層紗布封口。在28℃的培養(yǎng)箱中每天光照12h，2500lx，黑暗12h。連續(xù)培養(yǎng)4d，獲得同步化生長的鹽藻，即從暗培養(yǎng)6h后到光照培養(yǎng)開始2h內(nèi)，鹽藻出現(xiàn)大量的細胞分裂。隔天定時取出藻液4mL。在分光光度計測藻液的OD630數(shù)值，換算成藻液中鹽藻細胞的密度，并進行記錄。
超凈工作臺事先打開紫外燈殺菌20min。取處于指數(shù)生長期的鹽藻藻液，傾注于無菌培養(yǎng)皿中，每皿10mL。置超凈工作臺中25w紫外燈下，距離17cm照射60s進行誘變，28℃暗培養(yǎng)52h。將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液以1∶3的比例混勻，吸取300μL涂布到含瓊脂1.5％的鹽藻固體培養(yǎng)基上，低溫7℃，光強2000lx，不間斷光照培養(yǎng)。挑取生長迅速的單藻落分別接種到裝有4mL鹽藻培養(yǎng)基的試管中，20°斜放，在7℃以2000lx的光照強度不間斷培養(yǎng)，以150rpm的速度搖床培養(yǎng)至藻液呈深綠色。取1.5mL上述長成的鹽藻藻液移接到含200mL新鮮培養(yǎng)液的錐形瓶中，在7℃以4000lx的光照強度，150rpm的速度搖床培養(yǎng)。每3天取樣3.0mL在分光光度計測OD630數(shù)值，換算成藻液中耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株在低溫培養(yǎng)時的細胞密度，描繪出各自的生長曲線。實驗觀察到，在7℃光照培養(yǎng)下，耐低溫鹽藻突變株藻液的細胞密度逐漸增大，經(jīng)過60d培養(yǎng)，其藻液細胞密度可達6.01×106個細胞/mL，是原始細胞密度的31.9倍，是野生型原出發(fā)株的2.11倍；野生型原出發(fā)株一直到第18d都沒有明顯增長，從第21d開始才緩慢進入指數(shù)生長期，而到第48d就已經(jīng)達到生長平衡期，其最終藻液密度僅為2.84×106個細胞/mL。分別提取耐低溫鹽藻和野生型原出發(fā)株的總DNA，經(jīng)檢測純度合格后，以27個10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)比較研究。每個引物至少重復(fù)進行兩次PCR反應(yīng)，并將反應(yīng)產(chǎn)物在含瓊脂糖0.9％的凝膠上進行電泳。兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果。實驗發(fā)現(xiàn)，其中3個引物不產(chǎn)生任何條帶，6個引物產(chǎn)生不清晰和無法檢測的產(chǎn)物，18個能產(chǎn)生多態(tài)性條帶。從中遴選條帶清晰、重復(fù)性良好的14個引物進行正式擴增。實驗共檢測到121個位點，其中12個引物擴增出差異條帶。
根據(jù)上述統(tǒng)計數(shù)字計算耐低溫鹽藻突變株與野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I，I＝2Nij/(Ni+Nj)。式中Ni+Nj為兩樣品經(jīng)過隨機引物擴增后各自顯示的帶數(shù)之和，Nij為兩樣品共有的帶數(shù)。經(jīng)計算，耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)I為0.831，符合變異株的特征。提取耐低溫鹽藻突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。分離膠濃度為11％，濃縮膠濃度為5％。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果。比較兩者的蛋白電泳圖譜可以看到，前者比后者多出3條新的蛋白帶，同時發(fā)現(xiàn)在大約56kDa處前者表達的蛋白量比后者低得多。根據(jù)在低溫環(huán)境(7℃)下基本能正常生長的新特征和RAPD研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認已經(jīng)獲得耐低溫鹽藻突變株。
權(quán)利要求
1.耐低溫鹽藻突變株，其特征在于1)在3～10℃不間斷1000～4000lx光照培養(yǎng)下生長速度是對照的2.1～21倍，達到(1.05～8.11)×106個細胞/mL；2)鹽藻耐低溫突變株L-5與野生型原出發(fā)株之間的遺傳相似系數(shù)I為0.680～0.910；3)鹽藻耐低溫突變株L-5比野生型原出發(fā)株在36kDa和158kDa處分別多出一條新的蛋白帶，同時在大約27kDa和29kDa處L-5表達的蛋白量比對照高得多。
2.如權(quán)利要求1所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于其步驟為1)將鹽藻的人工海水培養(yǎng)基分裝封口、滅菌；2)取出滅菌過的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，接種鹽藻；3)分別經(jīng)光照和黑暗的光周期誘導(dǎo)，鹽藻出現(xiàn)同步化生長；4)取出藻液，以碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽藻，取樣計算藻液中鹽藻細胞密度；5)取處于指數(shù)生長期的鹽藻藻液，傾注于培養(yǎng)皿中，置紫外燈下照射進行誘變，然后暗培養(yǎng)；6)將暗培養(yǎng)后的藻液和新鮮培養(yǎng)液混勻，涂布到鹽藻固體培養(yǎng)基上，低溫光照培養(yǎng)；7)挑取生長迅速的單藻落分別接種到少量培養(yǎng)液中，在低溫光照下擴大培養(yǎng)；8)取步驟7培養(yǎng)所得的鹽藻和野生型原出發(fā)株移接到含新鮮培養(yǎng)液的容器中擴大培養(yǎng)；9)取樣檢測、比較鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株在低溫光照下的生長曲線；10)提取各鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA，并以10聚核苷酸隨機引物對這些總DNA進行隨機擴增多態(tài)DNA研究比較；11)按比較后的統(tǒng)計數(shù)字計算鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株間的遺傳相似系數(shù)；12)提取鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總蛋白質(zhì)進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R250染色，掃描記錄結(jié)果；13)比較鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株兩者的蛋白電泳圖譜，找出鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株之間的共同點與不同之處；14)根據(jù)在低溫環(huán)境下生長速度比對照快2.1倍以上的新特征和隨機擴增多態(tài)DNA研究及蛋白質(zhì)分析結(jié)果，確認獲得耐低溫鹽藻突變株。
3.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在步驟1)中，配制培養(yǎng)鹽藻的人工海水培養(yǎng)液的組成如表1表1 鹽藻培養(yǎng)液組成
將人工海水培養(yǎng)液分裝在100～250mL的錐形瓶中，每瓶裝量20～50mL，棉花塞塞緊或用8層紗布封口，包上牛皮紙，把包裝好的培養(yǎng)液放置在高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃，壓力0.1mPa滅菌15～20min。
4.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在步驟3)中，所述的光周期誘導(dǎo)是在25～30℃的培養(yǎng)箱中每天以2000～4000燭光，光照12h，黑暗12h，連續(xù)培養(yǎng)2～5d；可以是靜止培養(yǎng)，每天手搖數(shù)次，每次10～20s，或在可控光照的搖床上以30～150rpm的速度搖動，獲得同步化生長的鹽藻。
5.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在步驟4)中，所述的以碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽藻，取樣計算藻液中鹽藻細胞的密度是指每天或隔天取出0.3～0.5mL藻液，以等量的碘液或溴酚藍液混勻藻液，滅活鹽藻，立即取樣在血球計數(shù)板上計算藻液中鹽藻細胞的密度；所述的計算藻液中鹽藻細胞的密度可重復(fù)計數(shù)3次，取平均值，繪制鹽藻的生長曲線；所述的碘液為碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水100mL。先用少量蒸餾水溶解碘和碘化鉀，待完全溶解后再定容到100mL；所述的溴酚藍溶液為0.25％的溴酚藍溶解在40％的蔗糖溶液中；鹽藻細胞密度的計算也可以用光密度法，即取出藻液注入比色杯中，在OD630處讀取數(shù)值，依據(jù)公式“細胞密度＝899.08OD630-12.544”換算成藻液細胞密度；以鹽藻培養(yǎng)時間為橫軸，以培養(yǎng)基中的藻細胞密度為縱軸，繪制鹽藻的生長曲線。
6.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在步驟5)中，取處于指數(shù)生長期的鹽藻藻液傾注于無菌培養(yǎng)皿中，置超凈工作臺中紫外燈下照射進行誘變，所用超凈工作臺事先擦凈并以紫外線殺菌15～20min；每個無菌培養(yǎng)皿中盛5～30mL藻液；超凈工作臺中的紫外燈為20～30w，紫外燈與培養(yǎng)皿的距離為12～18cm，紫外線照射時間為50～100s；照射后關(guān)閉紫外燈，蓋上培養(yǎng)皿蓋，用不透光的紙或布包好培養(yǎng)皿進行暗培養(yǎng)；暗培養(yǎng)的溫度為20～30℃，時間為48～72h。
7.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在在步驟6)中，所述的藻液和新鮮培養(yǎng)基按質(zhì)量比為1∶1～10，混勻后吸取50～500μL均勻地涂布到鹽藻瓊脂培養(yǎng)基上，蓋好培養(yǎng)皿，以封口膜密封上下皿蓋間的縫隙，防止培養(yǎng)基水分逃逸，培養(yǎng)皿要倒扣培養(yǎng)防止水珠產(chǎn)生；所述的鹽藻瓊脂培養(yǎng)基指的是在鹽藻人工海水培養(yǎng)液中添加1.0％～2.0％的瓊脂；在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在步驟7)中，所述的單藻落是指由單個鹽藻細胞長成的細胞集落；所述的生長迅速的單藻落是指在同等條件下長得比較大的藻落；以無菌接種環(huán)挑取較大藻落的藻細胞分別接種到含3～8mL鹽藻培養(yǎng)液的試管中，在低溫3～10℃、光照度1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)；所述的鹽藻培養(yǎng)液的試管應(yīng)斜放成15～45°，每天手工搖動數(shù)次，每次10～20s，或在光照搖床上以30～150rpm的速度搖動。
9.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在在步驟8)中，所述的擴大培養(yǎng)可在無菌超凈工作臺中取各誘變藻液和對照藻液0.5～2.0mL，加入到裝有50～200mL鹽藻培養(yǎng)液的錐形瓶中，塞上棉花塞或封好紗布，其標準就是使各藻液的起始細胞密度盡可能一致或十分接近；放在3～10℃、1000～4000lx、24h光照的光照培養(yǎng)箱中，每天手工搖動數(shù)次，每次10～20s；或在光照搖床上以30～150rpm的速度搖動。
10.如權(quán)利要求2所述的耐低溫鹽藻突變株的誘變、選育和鑒定方法，其特征在于在步驟10)中，所述的提取各鹽藻耐低溫突變株和野生型原出發(fā)株的總DNA是按常規(guī)方法提取植物總DNA，在紫外分光光度計上檢測該DNA的OD260與OD280的比值；若該比值小于1.8，則說明DNA的純度不夠，應(yīng)進一步提純；若該比值大于或等于1.8，則可以進行后述實驗，所述的10聚核苷酸隨機引物是計算機隨機設(shè)計的、由10個脫氧核糖核苷酸組成的單鏈DNA；所述的隨機引物對總DNA進行隨機多態(tài)性擴增是以各藻的總DNA為模板，分別以單鏈10聚核苷酸為引物進行的PCR擴增反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖含量0.8％～1.2％，在凝膠成像系統(tǒng)掃描和記錄，所選取的引物至少要達到25～30個，每個引物至少重復(fù)進行兩次PCR反應(yīng)，兩次都出現(xiàn)同樣的條帶才能認可該引物的擴增結(jié)果；從這些擴增結(jié)果中遴選條帶清晰、重復(fù)性良好的引物進行正式擴增。
全文摘要
紫外線誘變獲得耐低溫鹽藻及其鑒定方法，涉及一種鹽藻。提供一種耐低溫鹽藻突變株，以及采用紫外線誘變、低溫選育鹽藻的技術(shù)路線及其鑒定方法。耐低溫鹽藻突變株的特征為在3～10℃下光照培養(yǎng)能生長，達(1.05～8.11)×10
文檔編號C12Q1/04GK1944643SQ20061014344
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月26日
發(fā)明者劉廣發(fā), 周韜 申請人:廈門大學(xué)