專利名稱：來自水稻的與株型相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物株型相關(guān)的基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，特別是涉及一個來源于水稻的與株型相關(guān)的基因及其編碼蛋白與其在改良植物株型中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
株型(plant type)，是指與作物品種產(chǎn)量能力有關(guān)的一組特征或植物體在空間的排列方式，即長勢長相。理想株型(Ideal plant type)亦稱為理想型(Ideotype)，指由有利植株光合作用、生長發(fā)育和籽粒產(chǎn)量的性狀所組成的理想化株型，它能最大限度地提高群體光能利用率，增加生物學(xué)產(chǎn)量和提高經(jīng)濟(jì)系數(shù)等。有關(guān)水稻株型的研究，20世紀(jì)50年代末期，日本科學(xué)家角田重三郎從他對水稻、大豆、甘蔗等的研究實踐中總結(jié)出適于多肥集約栽培的品種應(yīng)具有厚、小、直立且深綠色的葉片，短而堅韌的莖稈以及中等分蘗力的理想株型理論(角田重三郎.農(nóng)業(yè)及園藝.1987，62(1)25～29.)。不斷改良株型也是我國水稻超高產(chǎn)育種的基本經(jīng)驗。從農(nóng)家品種的高稈披葉型逐步改良為矮稈直葉型，從注重形態(tài)改良逐漸發(fā)展到形態(tài)和機(jī)能改良并重，不但改善了光能利用效率，增加了抗倒伏能力，還增強(qiáng)了水稻的生理功能。由于全球范圍內(nèi)的綠色革命基因的應(yīng)用產(chǎn)生了一批高產(chǎn)水稻品種。進(jìn)入20世紀(jì)90年代，為了解決水稻增產(chǎn)緩慢的問題和合理利用土壤和水分資源，支持開發(fā)新品種和改進(jìn)種植方式的建議已經(jīng)迫在眉睫。因此，提高單位土壤面積利用率，改變個體株形結(jié)構(gòu)，增加最適有效葉面積，開發(fā)改進(jìn)矮化品種的建議已經(jīng)得到專家的認(rèn)同。
目前，已有超過60個水稻矮化突變體得到鑒定，同時關(guān)于矮桿的基因在許多物種中已有分離，它們的遺傳模式和對植物激素，例如赤霉素(GA)和油菜素內(nèi)酯(BR)的反應(yīng)已經(jīng)得到廣泛深入的研究。最早在水稻中克隆的矮桿基因D1，編碼一個在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的GTP-結(jié)合蛋白，水稻“綠色革命”基因(SD1)是赤霉素生物合成途徑的一個關(guān)鍵酶，小麥“綠色革命”基因(RHT)則是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵成員-DELLA蛋白本身.禾本科植物中BR和矮化關(guān)系的研究卻十分薄弱，油菜素內(nèi)酯促進(jìn)細(xì)胞分化的研究主要集中在擬南芥上。1997年以來，科學(xué)家們在擬南芥BR識別缺陷突變體中分離到的基因的研究共同為BR的合成，識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)提供理論指導(dǎo)。但是我們的研究進(jìn)展看，分離到的Nal1候選基因是一類功能未知的新基因，可能編碼一類新型的受體蛋白，對其功能的深入研究將會為了解水稻葉片的形態(tài)建成機(jī)制提供創(chuàng)新性的知識積累，并有可能開拓新的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個來源于水稻的與株型相關(guān)的基因。
本發(fā)明所提供的與株型相關(guān)的基因，名稱為Nal1，來源于稻屬水稻(Oryzasativa)，其cDNA是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有改良植物株型作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO1由2168個堿基組成，其編碼框為自5’端第132-第1880位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
所述基因Nal1 cDNA序列的30bp缺失突變體的核苷酸序列為序列表中的SEQ IDNO7，與序列表中的SEQ ID NO1相比，該突變體序列缺失了SEQ ID NO1中的自5’端第1256-第1285位堿基。
序列表中的SEQ ID NO7由2138個堿基組成，其編碼框為自5’端第132-第1850位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO8的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
上述與株型相關(guān)基因的基因組基因，是下述核苷酸序列之一1)列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有改良植物株型作用的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №3有8947個堿基組成，自5′端第1-467位堿基為該基因組基因的第一個外顯子，自5′端第468-6455位堿基為該基因組基因的第一個內(nèi)含子，自5′端第6456-6598位堿基為該基因組基因的第二個外顯子，自5′端第6599-7316位堿基為該基因組基因的第二個內(nèi)含子，自5′端第7317-7556位堿基為該基因組基因的第三個外顯子，自5′端第7557-7893位堿基為該基因組基因的第三個內(nèi)含子，自5′端第7894-8393位堿基為該基因組基因的第四個外顯子，自5′端第8394-8549位堿基為該基因組基因的第四個內(nèi)含子，自5′端第8550-8947位堿基為該基因組基因的第五個外顯子。
上述與株型相關(guān)基因Nal1編碼的蛋白(Nal1)，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)將序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有改良植物株型作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQID NO2由582個氨基酸殘基組成。
所述缺失30bp的Nal1突變體編碼序列表中SEQ ID NO8的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID NO8由572個氨基酸殘基組成，與序列表中的SEQ ID NO2相比，該突變體序列缺失了SEQ ID NO2中的自氨基端第375-第384位氨基酸殘基。
含有本發(fā)明基因Nal1及其突變體的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增Nal1中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種改良植物株型的方法。
本發(fā)明所提供的改良植物株型的方法，是將所述與株型相關(guān)基因Nal1或其反義基因或Nal1缺失突變體基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，植物株型獲得改良。
所述與株型相關(guān)基因Nal1或其缺失突變體基因或Nal1的反義基因可通過含有所述與株型相關(guān)基因Nal1的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞。
用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它的參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)等均具有類似功能。
使用與株型相關(guān)基因Nal1或其反義基因或Nal1缺失突變體基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、根部特異表達(dá)啟動子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
具體來講，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pBI121、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等，優(yōu)選為pCAMBIA2300。
以pCAMBIA2300為出發(fā)載體，構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pActin::Nal1。
為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
攜帶有本發(fā)明Nal1或其反義基因或Nal1缺失突變體基因的植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。
上述改良植物株型的方法對所有植物都適用，既適用于水稻、玉米、小麥等單子葉植物，也適用于煙草、棉花、大豆、番茄等雙子葉植物。
本發(fā)明提供一個來源于水稻的與株型相關(guān)的基因及其編碼蛋白。與正常植株相比，Nal1部分片段缺失的nal1突變體最突出的表型是葉片顯著變窄、變短，葉色變深，另外，突變體主穗高度(52±3.5cm)比正常植株(74±3.5cm)明顯變矮，突變體單株穗數(shù)(22.5±1.8)比正常植株(11.7±2.4)明顯變多。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，利用過量表達(dá)或反義表達(dá)Nal1(nal1突變體本身就是反義表達(dá)品系)的轉(zhuǎn)基因材料，可以達(dá)到改良個體株形結(jié)構(gòu)，增加最適有效葉面積和改進(jìn)矮化品種的目的，從而得到具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因品系。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白將在植物(特別是農(nóng)作物)品種的改良中發(fā)揮巨大作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為Nal1基因圖位克隆的遺傳圖譜圖2為正常水稻植株和過量表達(dá)Nal1的轉(zhuǎn)基因水稻植株表型的比較圖3為載體pCAM2300-Actinl-ocs的物理圖譜圖4為正常野生型植株與nal1突變體葉片中間部位橫切圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。
實施例1、來源于水稻的與株型相關(guān)基因Nal1的獲得一、水稻nal1突變體的獲得以早秈稻品種浙輻802為輪回親本通過約十代回交獲得了窄葉矮稈材料的近等基因系(Dong Fenggao，Xiong Zhenmin，Qian Qian，Zu Xudong，Chen Shihua(1994).Breeding Near-isogenic lines of morphological markers in indica rice.ChineseJ.Rice Sci.8， 135-139。該突變體可購自中國水稻研究所)，將該突變體材料命名為nal1(narrow leaf 1)，與正常植株相比，nal1最突出的表型是主穗高度(52±3.5cm)比正常植株(74±3.5cm)明顯變矮，葉窄，葉色深，單株穗數(shù)(22.5±1.8)比正常植物(11.7±2.4)明顯變多。
二、用圖位克隆法獲得來自突變體nal1的與株型相關(guān)基因Nal1采用圖位克隆法從nal1中分離與株型相關(guān)基因Nal1，具體方法包括以下步驟1)以nal1突變體(粳稻背景)與浙輻802(秈稻背景)雜交所獲得的F2代分離群體為材料，從中鑒定到了2100個具有nal1突變體表型的個體進(jìn)行遺傳學(xué)分析，把Nal1基因定位到水稻第4號染色體的一個BAC克隆(AL662950)上。
2)利用秈稻(9311)、粳稻(日本晴)之間在該區(qū)域DNA序列的差別設(shè)計CAPS標(biāo)記，進(jìn)一步把目標(biāo)基因定位到一個30KB的范圍內(nèi)(見圖1，數(shù)字代表分子標(biāo)記與目的基因間重組體的個數(shù))，對該DNA片段進(jìn)行序列分析，經(jīng)分析該BAC克隆覆蓋4個基因(命名為ORF1、ORF2、ORF3、ORF4)，其中ORF1具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列，由2168個堿基組成，其編碼框為自5’端第132-1880位堿基，由1749個堿基組成，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；ORF2具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，由1602個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-1602位堿基；ORF3具有序列表中SEQ ID NO5的核苷酸序列，其編碼框為自5’端第1-228位堿基，由228個堿基組成；ORF4具有序列表中SEQ ID NO6的核苷酸序列，其編碼框為自5’端第1-1758位堿基，由1758個堿基組成。
3)利用遺傳學(xué)方法進(jìn)一步縮小目的基因的范圍。如果某個基因是Nal1基因的候選基因，就應(yīng)該在nal1突變體(粳稻背景)與浙輻802(秈稻背景)之間表現(xiàn)序列差異。具體方法為對上述4個ORF(ORF1、ORF2、ORF3、ORF4)分別進(jìn)行PCR檢測(ORF1檢測引物序列為5’-atgaagccttcggacgata-3’和5’-tcatttctccaggtcaaggct-3’，ORF2檢測引物序列為5’-atggctgtgctggaggat-3’和5’-ctagccgtcatgggtgactc-3’，ORF3檢測引物序列為5’-atgagctaccaaggtcct-3’和5’-tcagaagcacatgtcgagc-3’，ORF4檢測引物序列為5’-atgggccaagcccatattgt-3’和5’-tcatgcagccaacctagc-3’)，結(jié)果4個基因中僅ORF1在nal1突變體(粳稻背景)與浙輻802(秈稻背景)之間表現(xiàn)出序列差異，因此ORF1基因有可能是Nal1基因的候選基因。在基因組DNA和cDNA水平上，比較4個ORF基因在nal1突變體和正常材料間的序列多態(tài)性，其中，ORF1的基因組DNA由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，有8947個堿基組成，自5′端第1-467位堿基為該基因組基因的第一個外顯子，自5′端第468-6455位堿基為該基因組基因的第一個內(nèi)含子，自5′端第6456-6598位堿基為該基因組基因的第二個外顯子，自5′端第6599-7316位堿基為該基因組基因的第二個內(nèi)含子，自5′端第7317-7556位堿基為該基因組基因的第三個外顯子，自5′端第7557-7893位堿基為該基因組基因的第三個內(nèi)含子，自5′端第7894-8393位堿基為該基因組基因的第四個外顯子，自5′端第8394-8549位堿基為該基因組基因的第四個內(nèi)含子，自5′端第8550-8947位堿基為該基因組基因的第五個外顯子。序列分析結(jié)果表明與浙輻802(秈稻背景)相比，ORF1在nal1突變體內(nèi)產(chǎn)生30個堿基的缺失，該突變導(dǎo)致Nal1所編碼的氨基酸殘基序列中第375-384位氨基酸殘基缺失，而其它三個基因(ORF2、ORF3、ORF4)在基因組DNA和cDNA的水平上在nal1突變體和其野生型之間沒有差別。因此，推斷ORF1是Nal1的侯選基因。
三、轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灷棉D(zhuǎn)基因手段進(jìn)行功能互補(bǔ)實驗，從功能上驗證ORF1是否就是目的基因Nal1，具體方法為根據(jù)步驟一獲得的Nal1的cDNA序列及載體pCAM2300-Actinl-ocs(該載體的構(gòu)建方法為將actin基因(GenBank號AY212324)連接入載體pCAMBIA2300多克隆位點的EcoRI和Xma I酶切位點之間得到重組載體，命名為pCAM2300-Actinl-ocs，該載體的物理圖譜見圖3)適宜的酶切位點設(shè)計引物擴(kuò)增Nal1 cDNA，引物序列如下引物1(上游引物)5’-CCCGGGATGAAGCCTTCGGACGAT-3’(劃線部分堿基為Sma I識別位點)引物2(下游引物)5’-GTCGACTCATTTCTCCAGGTCAAGG-3’(劃線部分堿基為Sal I識別位點)。
提取水稻常規(guī)品種日本晴的總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增Nal1 cDNA，反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化2168bp的DNA片段，將其用限制性內(nèi)切酶Sma I和Sal I進(jìn)行雙酶切后與經(jīng)相同酶酶切的載體pCAM2300-Actinl-ocs連接，得到Nal1 cDNA的植物表達(dá)載體，命名為pActin::Nal1，再將pActin::Nal1轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL1，篩選陽性重組子，然后在其介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化nal1突變體，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)表型分析，如圖2所示，結(jié)果pActin::Nal1轉(zhuǎn)基因植株恢復(fù)正常野生型表型，從而斷定ORF1就是本發(fā)明要保護(hù)的與株型相關(guān)的基因Nal1。
實施例2、正常野生型植株與nal1突變體的共電聚焦分析選取正常野生型浙輻802植株(對照，WT)與nal1突變體的葉片和明顯縮短的第四節(jié)間進(jìn)行共電聚焦分析顯示，結(jié)果如圖4所示(bar＝100um)，nal1突變體葉片(blade)中小維管束(sv)總數(shù)與野生型正常植株相比內(nèi)有明顯減少，同時nal1突變體葉片(blade)中兩相鄰大維管束(lv)之間的小維管束(sv)數(shù)與野生型正常植株相比內(nèi)也明顯減少，從而導(dǎo)致nal1突變體葉片明顯變窄。上述檢測結(jié)果表明Nal1基因可能通過調(diào)控葉片(blade)中小維管束(sv)的形成影響葉片的寬窄和大小，同時Nal1基因?qū)S管束的形成方式也起到重要的調(diào)控作用。
序列表<160>8<210>1<211>2168<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa)<400>1cgctttcggc attcgttatc tacctgtcca ttagccttca ggatcatgct ttctgacttg 60cttgttctca ttcttagggc cataacttca gcttctccca tctataatag gttcgcaaac120tgttcagcac aatgaagcct tcggacgata aggcgcagct ctcaggtttg gcgcaatcag180aagaatcgtc acttgatgtg gatcaccagt catttccttg ttctccatca atccaaccgg240ttgcttctgg gtgcacacac acagagaaca gcgcagcata cttcttatgg ccgacatcca300acctacagca ttgtgcagcc gagggacgtg caaactactt tggaaacctt cagaaaggat360tgttgccaag gcaccctggt cggttgccca aaggtcagca agcaaatagc ttgcttgact420tgatgactat aagagctttc catagcaaga tattgcggcg ttttagcctc gggacagcag480tgggattccg catcaggaaa ggggatctaa cagatatccc tgcaatcctt gtctttgttg540ctcgcaaggt tcataagaag tggcttaatc cagcacaatg tcttcctgct attcttgagg600gtccaggagg tgtttggtgt gatgttgatg ttgttgaatt ttcgtactac ggtgcaccgg660ctcaaacacc taaagagcaa atgttcagtg agcttgttga taagttatgt ggcagtgacg720aatgtattgg ttcaggctct caggttgcaa gccatgaaac ttttggtact ttgggtgcaa780ttgtgaaacg gcgcactggc aacaagcagg ttggtttcct cactaaccat catgtcgcgg840ttgacttgga ctaccctaat cagaagatgt ttcatccatt accacccaat cttgggcctg900gcgtttatct tggagctgtt gaaagagcaa cttctttcat cacagatgac gtttggtatg960gaatctatgc tggaacaaac ccagagacat ttgtacgagc tgacggtgca tttatcccat 1020ttgctgatga ctttgacatt tccaccgtca cgactgtagt taggggagtc ggtgacattg 1080gggatgtcaa ggttatagat ctgcagtgtc cgctcaatag cctcataggg aggcaagtat 1140gcaaagttgg cagaagctct ggtcacacaa ctgggactgt gatggcctat gcccttgagt 1200acaatgacga gaaaggaata tgcttcttca cagacatcct tgttgttggt gagaaccgcc 1260aaacatttga tttggaaggt gatagcggaa gccttattat cctgactagc caagatggtg 1320
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His Pro Gly Arg Leu Pro Lys Gly Gln Gln Ala Asn Ser Leu Leu Asp85 90 95Leu Met Thr Ile Arg Ala Phe His Ser Lys Ile Leu Arg Arg Phe Ser100 105 110Leu Gly Thr Ala Val Gly Phe Arg Ile Arg Lys Gly Asp Leu Thr Asp115 120 125Ile Pro Ala Ile Leu Val Phe Val Ala Arg Lys Val His Lys Lys Trp130 135 140Leu Asn Pro Ala Gln Cys Leu Pro Ala Ile Leu Glu Gly Pro Gly Gly145 150 155 160Val Trp Cys Asp Val Asp Val Val Glu Phe Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro165 170 175Ala Gln Thr Pro Lys Glu Gln Met Phe Ser Glu Leu Val Asp Lys Leu180 185 190Cys Gly Ser Asp Glu Cys Ile Gly Ser Gly Ser Gln Val Ala Ser His195 200 205Glu Thr Phe Gly Thr Leu Gly Ala Ile Val Lys Arg Arg Thr Gly Asn210 215 220Lys Gln Val Gly Phe Leu Thr Asn His His Val Ala Val Asp Leu Asp225 230 235 240Tyr Pro Asn Gln Lys Met Phe His Pro Leu Pro Pro Asn Leu Gly Pro245250255Gly Val Tyr Leu Gly Ala Val Glu Arg Ala Thr Ser Phe Ile Thr Asp260 265 270Asp Val Trp Tyr Gly Ile Tyr Ala Gly Thr Asn Pro Glu Thr Phe Val275 280 285Arg Ala Asp Gly Ala Phe Ile Pro Phe Ala Asp Asp Phe Asp Ile Ser290 295 300Thr Val Thr Thr Val Val Arg Gly Val Gly Asp Ile Gly Asp Val Lys305 310 315 320Val Ile Asp Leu Gln Cys Pro Leu Asn Ser Leu Ile Gly Arg Gln Val325 330 335
Cys Lys Val Gly Arg Ser Ser Gly His Thr Thr Gly Thr Val Met Ala340 345 350Tyr Ala Leu Glu Tyr Asn Asp Glu Lys Gly Ile Cys Phe Phe Thr Asp355 360 365Ile Leu Val Val Gly Glu Asn Arg Gln Thr Phe Asp Leu Glu Gly Asp370 375 380Ser Gly Ser Leu Ile Ile Leu Thr Ser Gln Asp Gly Glu Lys Pro Arg385 390 395 400Pro Ile Gly Ile Ile Trp Gly Gly Thr Ala Asn Arg Gly Arg Leu Lys405 410 415Leu Thr Ser Asp His Gly Pro Glu Asn Trp Thr Ser Gly Val Asp Leu420 425 430Gly Arg Leu Leu Asp Arg Leu Glu Leu Asp Ile Ile Ile Thr Asn Glu435 440 445Ser Leu Gln Asp Ala Val Gln Gln Gln Arg Phe Ala Leu Val Ala Ala450 455 460Val Thr Ser Ala Val Gly Glu Ser Ser Gly Val Pro Val Ala Ile Pro465 470 475 480Glu Glu Lys Ile Glu Glu Ile Phe Glu Pro Leu Gly Ile Gln Ile Gln485 490 495Gln Leu Pro Arg His Asp Val Ala Ala Ser Gly Thr Glu Gly Glu Glu500 505 510Ala Ser Asn Thr Val Val Asn Val Glu Glu His Gln Phe Ile Ser Asn515 520 525Phe Val Gly Met Ser Pro Val Arg Asp Asp Gln Asp Ala Pro Arg Ser530 535 540Ile Thr Asn Leu Asn Asn Pro Ser Glu Glu Glu Leu Ala Met Ser Leu545 550 555 560His Leu Gly Asp Arg Glu Pro Lys Arg Leu Arg Ser Asp Ser Gly Ser565 570 575Ser Leu Asp Leu Glu Lys580
<210>3<211>8947<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa)<400>3atgaagcctt cggacgataa ggcgcagctc tccggtttgg cgcaatcaga agaatcgtca 60cttgatgtgg atcaccagtc atttccttgt tctccatcaa tccaaccggt tgcttctggg120tgcacacaca cagagaacag cgcagcatac ttcttatggc cgacatccaa cctacagcat180tgtgcagccg agggacgtgc aaactacttt ggaaaccttc agaaaggatt gttgccaagg240caccctggtc ggttgcccaa aggtcagcaa gcaaatagct tgcttgactt gatgactata300agagctttcc atagcaagat attgcggcgt tttagcctcg ggacagcagt gggattccgc360atcaggaaag gggatctaac agatatccct gcaatccttg tctttgttgc tcgcaaggtt420cataagaagt ggcttaatcc agcacaatgt cttcctgcta ttcttgaggt gcggaaactt480aatctccatt gttgtttgaa tttggtttgg gacggtctaa gtttttctgc taaatctttc540acttagttgg atcattaaca gggtccagga ggtgtttggt gtgtaggaat aagtcttggc600tggttggtct tggtcttgtg gtgccttttt cctgcttttc agctttctag gacagcatct660ctactttcag tttggatgct ctaggacagt taggacagca gtttgttgag atgctctagg720acagtttgtt gggatgctct gctctaggac agtttgttgg gatgctgaca gcaccctctt780agactagcat ggctgcatgg ctgctacaag cagctataaa tatgtatcca atcctctttg840ggaggacatg gcttttgtgt ttagtgaatg aagaaaacca gaaaattgcc ccatctcgag900tgccatcctc ttctcaatga gagtaaccat tgaaattcta acatctggta tcagagccac960actttcctgt aggctaaaca tctcttgttc caccccttcc caagctcggt tgagctctca 1020gccagcagca gcagcagcag caccggttgc ccctccttcc cctttccctt ccccctctcc 1080acacagcagc cccccggagg tgcgccatgt ccgacgctcg gtctcggcgt tcggtcgcct 1140cgagcactcg gcgtcagcag gacgccgagc tcgccgcagc agaagagcgc aggcgagcaa 1200cggctcagac cgctgcagca gcagcgaggg cggccagact ggcggcagcg gagttggcag 1260cagccagggc ggaggcggag gcggaggcgg cggaagatgc ggcacgtgcg gcggaggtag 1320aggttgagac cttgcgcagc agcatcaacg gctccatcgc cggcgacatc accgctgaca 1380gggagcttga ggagctggca agaggaaggg cacgggagcg agcagagcgg tgggcagcag 1440cccacctcca cggcggcggc ggcggcccaa gggaccgtgc gcccgccgac gggaacccag 1500acgggcgcgg gcgtgccggc ggcagcccgg agcccgcacg cggccctcgc aggcggcacg 1560gctccctctc ccctgaccgg cgccatggtc accacggcgt ccagacggtg gtcagggatt 1620ttggtcccgg cggtgggtgg cctaccctca ccaaaaccaa ctacatcgag tgggccgcgg 1680tgatgagggt gaggctccag gtgcggcaca tgtgggaggc agtccggtac ggtgacgtcg 1740actacgacga ggatcggcgg gcactggatg ccctcatcgc tgcagttccg cccgagatgc 1800
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1 5 10 15Glu Glu Ser Ser Leu Asp Val Asp His Gln Ser Phe Pro Cys Ser Pro20 25 30Ser Ile Gln Pro Val Ala Ser Gly Cys Thr His Thr Glu Asn Ser Ala35 40 45Ala Tyr Phe Leu Trp Pro Thr Ser Asn Leu Gln His Cys Ala Ala Glu50 55 60Gly Arg Ala Asn Tyr Phe Gly Asn Leu Gln Lys Gly Leu Leu Pro Arg65 70 75 80His Pro Gly Arg Leu Pro Lys Gly Gln Gln Ala Asn Ser Leu Leu Asp85 90 95Leu Met Thr Ile Arg Ala Phe His Ser Lys Ile Leu Arg Arg Phe Ser100 105 110Leu Gly Thr Ala Val Gly Phe Arg Ile Arg Lys Gly Asp Leu Thr Asp115 120 125Ile Pro Ala Ile Leu Val Phe Val Ala Arg Lys Val His Lys Lys Trp130 135 140Leu Asn Pro Ala Gln Cys Leu Pro Ala Ile Leu Glu Gly Pro Gly Gly145 150 155 160Val Trp Cys Asp Val Asp Val Val Glu Phe Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro165 170 175Ala Gln Thr Pro Lys Glu Gln Met Phe Ser Glu Leu Val Asp Lys Leu180 185 190Cys Gly Ser Asp Glu Cys Ile Gly Ser Gly Ser Gln Val Ala Ser His195 200 205Glu Thr Phe Gly Thr Leu Gly Ala Ile Val Lys Arg Arg Thr Gly Asn210 215 220Lys Gln Val Gly Phe Leu Thr Asn His His Val Ala Val Asp Leu Asp225 230 235 240Tyr Pro Asn Gln Lys Met Phe His Pro Leu Pro Pro Asn Leu Gly Pro245 250 255Gly Val Tyr Leu Gly Ala Val Glu Arg Ala Thr Ser Phe Ile Thr Asp
260 265 270Asp Val Trp Tyr Gly Ile Tyr Ala Gly Thr Asn Pro Glu Thr Phe Val275 280 285Arg Ala Asp Gly Ala Phe Ile Pro Phe Ala Asp Asp Phe Asp Ile Ser290 295 300Thr Val Thr Thr Val Val Arg Gly Val Gly Asp Ile Gly Asp Val Lys305 310 315 320Val Ile Asp Leu Gln Cys Pro Leu Asn Ser Leu Ile Gly Arg Gln Val325 330 335Cys Lys Val Gly Arg Ser Ser Gly His Thr Thr Gly Thr Val Met Ala340 345 350Tyr Ala Leu Glu Tyr Asn Asp Glu Lys Gly Ile Cys Phe Phe Thr Asp355 360 365Ile Leu Val Val Gly Glu Ser Gly Ser Leu Ile Ile Leu Thr Ser Gln370 375 380Asp Gly Glu Lys Pro Arg Pro Ile Gly Ile Ile Trp Gly Gly Thr Ala385 390 395 400Asn Arg Gly Arg Leu Lys Leu Thr Ser Asp His Gly Pro Glu Asn Trp405 410 415Thr Ser Gly Val Asp Leu Gly Arg Leu Leu Asp Arg Leu Glu Leu Asp420 425 430Ile Ile Ile Thr Asn Glu Ser Leu Gln Asp Ala Val Gln Gln Gln Arg435 440 445Phe Ala Leu Val Ala Ala Val Thr Ser Ala Val Gly Glu Ser Ser Gly450 455 460Val Pro Val Ala Ile Pro Glu Glu Lys Ile Glu Glu Ile Phe Glu Pro465 470 475 480Leu Gly Ile Gln Ile Gln Gln Leu Pro Arg His Asp Val Ala Ala Ser485 490 495Gly Thr Glu Gly Glu Glu Ala Ser Asn Thr Val Val Asn Val Glu Glu500 505 510His Gln Phe Ile Ser Asn Phe Val Gly Met Ser Pro Val Arg Asp Asp
515 520 525Gln Asp Ala Pro Arg Ser Ile Thr Asn Leu Asn Asn Pro Ser Glu Glu530 535 540Glu Leu Ala Met Ser Leu His Leu Gly Asp Arg Glu Pro Lys Arg Leu545 550 555 560Arg Ser Asp Ser Gly Ser Ser Leu Asp Leu Glu Lys565 570
權(quán)利要求
1.來自水稻的與株型相關(guān)基因的cDNA序列，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有改良植物株型作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.來自水稻的與株型相關(guān)基因的基因組序列，是下述核苷酸序列之一1)列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有改良植物株型作用的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1或2所述基因編碼的蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO2；2)將序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有改良植物株型作用的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1所述的來自水稻的與株型相關(guān)基因的cDNA序列的缺失突變體，其核甘酸序列如SEQ ID NO7所示。
5.權(quán)利要求4所述來自水稻的與株型相關(guān)基因的cDNA序列缺失突變體的編碼蛋白，其氨基酸殘基序列如SEQ ID NO8所示。
6.含有權(quán)利要求1或2或4或5所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
7.一種改良植物株型的方法，是將權(quán)利要求1或2所述與株型相關(guān)的基因或其反義基因或權(quán)利要求4所述與株型相關(guān)的基因的cDNA序列的缺失突變體導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，植物株型獲得改良。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述與株型相關(guān)的基因或其反義基因或所述與株型相關(guān)的基因的cDNA序列的缺失突變體通過含有所述基因的植物表達(dá)載體導(dǎo)入外植體；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA2300；以pCAMBIA2300為出發(fā)載體構(gòu)建的植物表達(dá)載體為pActin∷Nall。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻、玉米或小麥；所述雙子葉植物為煙草、棉花、大豆或番茄。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個來自水稻的與株型相關(guān)的基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。其目的是提供一個來自水稻的與株型相關(guān)的基因及其編碼蛋白與其在改良植物株型中的應(yīng)用。該基因的cDNA序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID No1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有改良植物株型作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的基因及其編碼蛋白將在植物(特別是農(nóng)作物)品種的改良中發(fā)揮巨大作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/82GK1970767SQ20061014419
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日
發(fā)明者李傳友, 齊靜, 錢前, 孫加強(qiáng), 李常保, 蔣紅玲, 吳曉燕 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所