專利名稱：通過(guò)活化血紅蛋白清除劑受體生產(chǎn)血細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員以生產(chǎn)血細(xì)胞的方法和組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及刺激血細(xì)胞生成的方法，包括分別通過(guò)刺激干細(xì)胞以及紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系祖細(xì)胞以刺激紅細(xì)胞生成和髓細(xì)胞生成。
背景技術(shù)：
最近已經(jīng)鑒定了單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的血紅蛋白清除劑受體(Kristiansen，2001)。該受體通過(guò)介導(dǎo)觸珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物的胞吞作用而清除血紅蛋白。該受體已經(jīng)鑒定為M130/CD163，是急性期調(diào)節(jié)的跨膜蛋白質(zhì)，據(jù)報(bào)道專門(mén)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)。CD163屬于富含半胱氨酸的B基團(tuán)清除劑受體超家族，該受體家族包括分別存在于B、T和CD4-8-γδT淋巴細(xì)胞上的CD5、CD6和WC1。血紅蛋白和多聚體觸珠蛋白的復(fù)合物與血紅蛋白和二聚體觸珠蛋白的復(fù)合物相比，對(duì)CD163的功能性親和力更高。
先前對(duì)培養(yǎng)的單核細(xì)胞上抗體介導(dǎo)的CD163交聯(lián)進(jìn)行研究已經(jīng)證明表面CD163的連接誘導(dǎo)酪氨酸激酶依賴性信號(hào)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣的動(dòng)員、肌醇三磷酸產(chǎn)生以及抗炎癥細(xì)胞因子(包括白細(xì)胞介素6(IL-6)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF))分泌增強(qiáng)(van den Heuvel等人，1999)。
紅細(xì)胞生成作用定義為血細(xì)胞的產(chǎn)生和發(fā)育，包括紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞(esoinophils)、嗜堿性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞(Wintrobe，1999)。發(fā)生紅細(xì)胞生成作用是造血干細(xì)胞增殖和分化的結(jié)果。造血干細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，能夠產(chǎn)生血液中發(fā)現(xiàn)的多個(gè)細(xì)胞系。造血干細(xì)胞存在于骨髓中，其生長(zhǎng)、增殖和分化受造血生長(zhǎng)因子和骨髓內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞的影響。干細(xì)胞被認(rèn)為平常以靜止的非分裂狀態(tài)存在，直至受到特異的生長(zhǎng)因子的刺激，其于是分裂并產(chǎn)生高度增殖性祖細(xì)胞，產(chǎn)生一種或多種血細(xì)胞系，例如紅細(xì)胞系、髓細(xì)胞系或淋巴細(xì)胞系。
稱為血細(xì)胞減少癥的某些臨床疾病，其特征在于循環(huán)血液中特定類型細(xì)胞的水平降低。例如中性粒細(xì)胞減少癥是循環(huán)中的中性粒細(xì)胞水平減低的一種疾病。該疾病可利用兩種不同的造血生長(zhǎng)因子GM-CSF或G-CSF治療。然而，使用這些生長(zhǎng)因子常常伴隨高發(fā)的不良副作用。例如，同種異體的骨髓移植后給藥G-CSF可引起呼吸困難、胸痛、惡心、低氧血癥、發(fā)汗、過(guò)敏性反應(yīng)、昏厥和面色潮紅(Khoury等人，2000)。
中性粒細(xì)胞減少癥也和AIDS相關(guān)，其當(dāng)前用生長(zhǎng)因子治療(Dubreuil-Lemaire等人，2000)。還有嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥的形式(Dale等人，2000)，其中生長(zhǎng)因子給藥治療對(duì)很低百分比的患者無(wú)效。
貧血癥是血紅蛋白不足以滿足身體對(duì)氧運(yùn)輸需求的病理結(jié)果。歷史上，利用血液或紅細(xì)胞輸血治療某些貧血癥。多種輸血相關(guān)的并發(fā)癥(包括溶血、發(fā)熱和變態(tài)反應(yīng)，以及傳播疾病的可能性)使這種療法不夠理想。在治療貧血癥中需要刺激紅細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育(紅細(xì)胞生成)。貧血癥有幾種病因，包括過(guò)量失血、紅細(xì)胞破壞增加、紅細(xì)胞合成降低以及血紅蛋白產(chǎn)生異常。缺鐵(飲食、胃腸道吸收不良(maladsorption)、發(fā)育紅細(xì)胞運(yùn)輸鐵或利用鐵的效率低)、紅細(xì)胞生成素(Epo)生成不足(腎功能障礙)或者骨髓衰退可引起紅細(xì)胞產(chǎn)生減少。既然在鐵和Epo依賴性貧血癥中骨髓的紅細(xì)胞生成活性完好，可以分別用鐵或Epo治療這種貧血癥。
缺鐵性貧血癥一般通過(guò)口服或靜脈內(nèi)給予鐵進(jìn)行治療。慢性腎衰竭患者由于腎臟不能生成Epo，一般患有Epo依賴性貧血癥。這些患者經(jīng)受透析，并90％是臨床上貧血的。傳統(tǒng)治療透析患者的貧血癥包括多次輸血，其已經(jīng)基本由給予EPO所取代。實(shí)際上，大約88％的透析患者用Epo治療。Epo治療的患者中，三分之一發(fā)展為高血壓，一般利用抗高血壓藥物進(jìn)行糾正。紅細(xì)胞系祖細(xì)胞經(jīng)Epo刺激分化為成熟紅細(xì)胞，并合成紅細(xì)胞的主要蛋白質(zhì)，血紅蛋白。
Epo治療的主要限制因素是長(zhǎng)期治療的費(fèi)用。慢性腎衰竭患者一般使用的Epo劑量為225單位/公斤/周，分三次給藥。在美國(guó)，對(duì)于Epo治療的醫(yī)療保險(xiǎn)每1,000單位償付$10.00，因此70公斤患者一般每年的費(fèi)用將是大約$8,000。1995年，175,000名美國(guó)患者透析，僅該病的市場(chǎng)就超過(guò)八億八千三百萬(wàn)美元。估計(jì)1996年治療費(fèi)用為約11億美元。因此，可降低治療貧血癥所需Epo的新療法對(duì)患者和保健系統(tǒng)均有益。發(fā)現(xiàn)能夠降低治療Epo依賴性貧血癥所需Epo的其它藥物將有益處。
此外，很多貧血癥對(duì)Epo治療沒(méi)有響應(yīng)。該類貧血癥的例子包括化療誘導(dǎo)的貧血癥以及慢性疾病(包括惡性腫瘤)的貧血癥。獲得性免疫缺陷患者也會(huì)患有貧血癥，用AZT治療的AIDS患者也如此?？赡苡捎贓po生成抑制或者骨髓對(duì)Epo的反應(yīng)性降低而致無(wú)效性紅細(xì)胞生成，從而引起該類貧血癥。治療這類貧血癥包括治療其原發(fā)的病癥。然而，如果原發(fā)病癥不容易治療，那么貧血癥的治療可包括紅細(xì)胞輸血。輸血不利的副作用包括急性和遲延性溶血反應(yīng)，以及潛在的輸血傳播性疾病。
由此看來(lái)，本領(lǐng)域有必要開(kāi)發(fā)通過(guò)刺激患者血細(xì)胞生成而增加血細(xì)胞數(shù)目的改進(jìn)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)確定活化血紅蛋白清除劑受體CD163能夠刺激紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系祖細(xì)胞兩者的生長(zhǎng)、增殖和分化，導(dǎo)致血細(xì)胞生成增加。本發(fā)明人還證明CD34+造血干細(xì)胞表達(dá)CD163。
因此，本發(fā)明提供了刺激能夠表達(dá)CD163受體、或者能夠?qū)υ撌荏w刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行應(yīng)答的干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的方法，包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化干細(xì)胞CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明也提供刺激血細(xì)胞生成的方法，包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供刺激紅細(xì)胞生成的方法，包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明還提供刺激髓細(xì)胞生成的方法，包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明也包括藥物組合物，其包含有效量的、與適當(dāng)?shù)南♂寗┗蜉d體混合的、能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明另外提供細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，其用于增強(qiáng)干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞以及細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員，其包含有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
本發(fā)明也提供選擇樣品中干或祖細(xì)胞的方法，包含(a)將樣品與能夠結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。
根據(jù)以下詳細(xì)說(shuō)明書(shū)，顯而易見(jiàn)本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。然而應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明書(shū)以及表示本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的特定實(shí)施例僅以說(shuō)明方式給出，因?yàn)樵诒景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變更和修改對(duì)本詳細(xì)說(shuō)明書(shū)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明將結(jié)合附圖進(jìn)行描述，其中

圖1為利用抗CD163抗體的CD34+細(xì)胞的Western印跡分析。
圖2表明造血集落形成試驗(yàn)中CD163抗體的影響。
圖3表明從BFU-E集落制備的細(xì)胞裂解物中可檢測(cè)到CD163免疫反應(yīng)性。
發(fā)明詳述I.發(fā)明方法如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明CD34+干細(xì)胞表達(dá)血紅蛋白清除劑受體CD163。因此，本發(fā)明提供了刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的方法，其包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化干細(xì)胞上CD163的物質(zhì)。本發(fā)明也提供了有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的用途。本發(fā)明另外提供了有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的藥物的用途。
此處所用短語(yǔ)″能夠活化CD163的物質(zhì)″包括能夠結(jié)合、交聯(lián)或者連接細(xì)胞上CD163血紅蛋白清除劑受體或者CD163相關(guān)受體、并導(dǎo)致刺激該細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的所有物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包括能夠激活因響應(yīng)CD163或CD163相關(guān)受體的活化而活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的任何物質(zhì)。例如，該物質(zhì)可激活因響應(yīng)CD163的活化而活化的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括而不限于酪氨酸激酶、鈣動(dòng)員以及肌醇三磷酸(IP3)和肌醇四磷酸(IP4)動(dòng)員。短語(yǔ)″能夠活化CD163途徑的物質(zhì)″進(jìn)一步包括，可阻斷因響應(yīng)CD163或CD163相關(guān)受體的活化而活化的任何信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑失活的任何物質(zhì)。
此處所用短語(yǔ)″刺激干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員″是指與不存在該物質(zhì)時(shí)的干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員相比，能夠刺激或增強(qiáng)干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的物質(zhì)。
此處所用術(shù)語(yǔ)″有效量″是指在達(dá)到所希望的結(jié)果(例如，刺激干細(xì)胞、紅細(xì)胞系和/或髓細(xì)胞系祖細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員和/或刺激血細(xì)胞生成、紅細(xì)胞生成或髓細(xì)胞生成)所需的劑量和時(shí)間的有效量。
此處所用術(shù)語(yǔ)″動(dòng)物″包括動(dòng)物界的所有成員，優(yōu)選人類。給予動(dòng)物一種物質(zhì)包括體內(nèi)和離體給藥。
此處所用術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞″包括單個(gè)細(xì)胞以及多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群體。給予細(xì)胞一種物質(zhì)包括體外和體內(nèi)給藥。
此處所用術(shù)語(yǔ)″干細(xì)胞″是指能夠在動(dòng)物中分化為包括造血細(xì)胞在內(nèi)的任何細(xì)胞的細(xì)胞。干細(xì)胞表達(dá)或者能夠表達(dá)CD163受體或者應(yīng)答該受體刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
優(yōu)選的干細(xì)胞是CD34+干細(xì)胞。傳統(tǒng)上認(rèn)為CD34+細(xì)胞是″干″細(xì)胞是由于它們能夠自我更新并用各系造血細(xì)胞重新增殖為個(gè)體。利用共同表達(dá)的其它標(biāo)志(例如CD38)及其再輸入并重新增殖造血系統(tǒng)的能力，將CD34+細(xì)胞進(jìn)一步分為亞群(例如Henon等人，2001)。
刺激干細(xì)胞可促進(jìn)從血管外骨髓處到循環(huán)血液的干細(xì)胞動(dòng)員，這是將供者外周血用于自體或異體移植所需的方案。重組人G-CSF廣泛用來(lái)動(dòng)員CD34+干細(xì)胞(綜述參見(jiàn)Korbling，1998)。本發(fā)明人已經(jīng)證明CD34+細(xì)胞表達(dá)CD163，刺激該細(xì)胞的CD163途徑很可能會(huì)使其生長(zhǎng)和增殖，并可能動(dòng)員到外周血中。代之以使用CD163的刺激物(例如交聯(lián)的抗體)或聯(lián)用減量的G-CSF可以動(dòng)員可移植的干細(xì)胞，而沒(méi)有與細(xì)胞因子給藥有關(guān)的副作用。
本發(fā)明人已經(jīng)表明，活化CD163途徑可用于刺激多系血細(xì)胞生成，因?yàn)橐呀?jīng)證明能夠通過(guò)活化CD163刺激紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系祖細(xì)胞。刺激血細(xì)胞生成用于產(chǎn)生血細(xì)胞以及免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，包括紅細(xì)胞、髓細(xì)胞(例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和巨核細(xì)胞)和淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞)，以及髓樣和淋巴樣起源的樹(shù)突狀細(xì)胞。
因此，本發(fā)明提供刺激血細(xì)胞生成的方法，其包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激血細(xì)胞生成的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激血細(xì)胞生成的藥物的用途。
刺激血細(xì)胞生成用于治療多種疾病，包括細(xì)胞減少癥，并用于刺激血細(xì)胞發(fā)育以供移植之用，或者刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞以用于治療免疫缺陷。
此處所用短語(yǔ)″刺激血細(xì)胞生成″是指與不存在該物質(zhì)時(shí)的適血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員相比，能夠刺激或增強(qiáng)造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞(例如紅細(xì)胞系、髓細(xì)胞系或淋巴細(xì)胞系祖細(xì)胞)生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的物質(zhì)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定能夠活化CD163的物質(zhì)是否能刺激血細(xì)胞生成。例如，集落形成試驗(yàn)是定量造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法(McCulloch，1984)。在集落形成試驗(yàn)中，將細(xì)胞鋪于半固體培養(yǎng)基例如甲基纖維素，其中含有支持造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化的各種細(xì)胞因子。形成的造血集落種類包括紅細(xì)胞系爆式集落形成單位(BFU-E)、紅細(xì)胞系集落生成單位(CFU-E)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞系集落形成單位(CFU-GM)、巨噬細(xì)胞系集落形成單位(CFU-M)、巨核細(xì)胞系集落形成單位(CFU-Meg)以及粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞系(GEMM)集落。在半固體試驗(yàn)中，干或祖細(xì)胞可應(yīng)答各種細(xì)胞因子，已經(jīng)針對(duì)紅細(xì)胞系祖細(xì)胞(例如聯(lián)用IL-3和EPO)的生長(zhǎng)和分化或成粒細(xì)胞系/單核細(xì)胞系集落(例如IL-10、IL-6和SCF)優(yōu)化了這些細(xì)胞因子的組合。需要某些組合(除計(jì)數(shù)更原始的″混合″集落以外)來(lái)分別計(jì)數(shù)髓細(xì)胞系和紅細(xì)胞系集落(例如，包括G-CSF和GM-CSF的組合，綜述參見(jiàn)Messner；1991，718-22)。每個(gè)干細(xì)胞或祖細(xì)胞增殖并分化形成形態(tài)不同的集落。根據(jù)其在半固體培養(yǎng)基中生成形態(tài)上可識(shí)別的集落的能力來(lái)鑒定兩種功能不同的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞(BFU-E和CFU-E)。BFU-E代表最原始的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞，形成大的多叢(multi-clustered)血紅蛋白化集落。CFU-E是更加分化的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞，形成較小的血紅蛋白化集落。BFU-E是可以確認(rèn)的最原始祖細(xì)胞，完全負(fù)責(zé)紅細(xì)胞生成，并比較成熟的CFU-E具有更大的自我更新能力。紅細(xì)胞系祖細(xì)胞集落的發(fā)育一般需要培養(yǎng)基中存在紅細(xì)胞生成素(Epo)。然而在初期，原始的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞以Epo非依賴方式增殖。
集落形成試驗(yàn)提供了定量造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法，也為獲得有關(guān)影響干和祖細(xì)胞后代增殖和分化的因素的信息提供了方法。例如，紅細(xì)胞系祖細(xì)胞集落起源于單個(gè)祖細(xì)胞的分裂和分化，因此成熟集落主要由血紅蛋白化的有核紅細(xì)胞組成。形態(tài)學(xué)上，紅細(xì)胞系集落的大小可提供有關(guān)紅細(xì)胞系祖細(xì)胞后代增殖的速率或幅度的信息。此外，較紅的紅細(xì)胞系集落提示血紅蛋白含量較多，并且有核紅細(xì)胞的分化度可能較高。
如前所述，本發(fā)明人已經(jīng)表明CD163活化可增強(qiáng)紅細(xì)胞系細(xì)胞的增殖和分化。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供刺激紅細(xì)胞生成的方法，其包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激紅細(xì)胞生成的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激紅細(xì)胞生成的藥物的用途。
此處所用短語(yǔ)″刺激紅細(xì)胞生成″是指與不存在該物質(zhì)時(shí)紅細(xì)胞系細(xì)胞或紅細(xì)胞系祖細(xì)胞或干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、分化和/或動(dòng)員相比能夠刺激或增強(qiáng)紅細(xì)胞系細(xì)胞或紅細(xì)胞系祖細(xì)胞或干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定能夠活化CD163的物質(zhì)是否能刺激紅細(xì)胞生成。例如，可以使用如上所述以及實(shí)施例中所述的集落形成試驗(yàn)。
刺激紅細(xì)胞生成可用于治療貧血癥。因此，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療貧血癥的方法，其包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)治療貧血癥的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備治療貧血癥的藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明人也已表明，活化CD163可增強(qiáng)髓細(xì)胞系細(xì)胞的增殖。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供刺激髓細(xì)胞生成的方法，其包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)刺激骨髓細(xì)胞生成的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備刺激骨髓細(xì)胞生成的藥物的應(yīng)用。
此處所用短語(yǔ)″刺激髓細(xì)胞生成″是指與不存在該物質(zhì)時(shí)髓細(xì)胞或髓細(xì)胞系祖細(xì)胞或干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員相比，能夠刺激或增強(qiáng)髓細(xì)胞或髓細(xì)胞系祖細(xì)胞或干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定能夠活化CD163的物質(zhì)是否能刺激髓細(xì)胞。例如，可以使用如上所述以及實(shí)施例中所述的集落形成試驗(yàn)。
刺激骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員可用于治療中性粒細(xì)胞減少癥。通過(guò)CD163途徑活化CD163而刺激骨髓細(xì)胞可以取代或增強(qiáng)生長(zhǎng)因子對(duì)于克服骨髓移植相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少的效果，而且具有副作用較小的好處。該方法還能用來(lái)治療AIDS相關(guān)的中性粒細(xì)胞減少癥或者嚴(yán)重的先天性中性粒細(xì)胞減少癥。因此，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療中性粒細(xì)胞減少癥的方法，其包含給予有此需要的細(xì)胞或動(dòng)物有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明還提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)治療中性粒細(xì)胞減少癥的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)制備治療中性粒細(xì)胞減少癥的藥物的應(yīng)用。
此處所用以及本領(lǐng)域所理解的″治療″是為了獲得有利的或者期望得到的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。有利的或者期望得到的臨床結(jié)果可包括而不限于，減輕或改善一種或多種癥狀或病情、降低疾病程度、穩(wěn)定(即不惡化)疾病狀況、預(yù)防疾病傳播、延遲或減緩疾病發(fā)展、改善或緩和病況以及緩解(無(wú)論部分或全部)，無(wú)論其是否可以檢測(cè)到?！逯委煛暹€可以意味著與若不接受治療的預(yù)期存活相比存活延長(zhǎng)。
II.活化CD163的物質(zhì)本發(fā)明包括可活化CD163(如上所述)的任何和所有物質(zhì)在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。該物質(zhì)可以是任何類型的物質(zhì)，包括而不限于蛋白質(zhì)(例如抗體)、肽、核酸、碳水化合物、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、小分子、藥物、CD163配基、CD163受體的可溶性形式、CD163的任何和所有激動(dòng)劑以及抑制CD163拮抗劑的任何和所有物質(zhì)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，活化CD163的物質(zhì)是與所治療細(xì)胞的CD163受體結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)合CD163的物質(zhì)的例子包括抗體和CD163配基。
(a)抗體在特定的實(shí)施方案中，可活化CD163的物質(zhì)是與CD163受體結(jié)合的抗體。CD163的抗體可來(lái)自易于得到的商業(yè)來(lái)源，例如Serotec Inc.或Maine Biotechnology Services。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本領(lǐng)域已知技術(shù)很容易制備CD163的抗體，例如Kohler和Milstein，Nature 1975，256495以及美國(guó)專利NO.RE 32,011；4,902,614；4,543,439和4,411,993所述技術(shù)，在此引入以供參考。(也參見(jiàn)Monoclonal Antibodies，HybridomasA New Dimension inBiological Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearn，andBechtol(eds.)，1980，以及AntibodiesA Laboratory Manual，Harlow and Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988，也在此引入以供參考)。
例如，利用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)使用CD163的肽可制備多克隆抗血清或單克隆抗體?？梢杂迷诓溉閯?dòng)物中引發(fā)抗體反應(yīng)的免疫原性肽免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠、倉(cāng)鼠或兔)。給予肽免疫原性的技術(shù)包括結(jié)合載體或者本領(lǐng)域公知的其它技術(shù)。例如，可以在佐劑存在下給予蛋白質(zhì)或肽?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)血漿或者血清中的抗體滴度監(jiān)測(cè)免疫進(jìn)程。標(biāo)準(zhǔn)ELISA或者其它的免疫測(cè)定方法能夠以免疫原為抗原來(lái)評(píng)定抗體的水平。免疫之后，可以得到抗血清，如果需要，還可從血清中分離多克隆抗體。
為了制備單克隆抗體，可以從免疫動(dòng)物收集抗體產(chǎn)生細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，利用標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合方法與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而使這些細(xì)胞永生化，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。該技術(shù)為本領(lǐng)域所公知(例如，Kohler和Milstein最先開(kāi)發(fā)的雜交瘤技術(shù)(Nature 256，495-497(1975))以及其它技術(shù)，例如人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，Immunol.Today 4，72(1983))，制備人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy(1985)Allen R.Bliss，Inc.，pages 77-96)，以及組合抗體文庫(kù)的篩選(Huse等人，Science246，1275(1989))。免疫化學(xué)篩選可產(chǎn)生與肽特異性反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞，分離單克隆抗體。
此處所用術(shù)語(yǔ)″抗體″意在包括也與CD163特異性反應(yīng)的其片段或其肽?？贵w可以利用傳統(tǒng)方法片斷化，并利用上述相同方法篩選該片段。例如，可以通過(guò)用胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生F(ab′)2片段。得到的F(ab′)2片段經(jīng)處理還原二硫鍵制備Fab′片段。
嵌合抗體衍生物(即結(jié)合非人動(dòng)物可變區(qū)和人恒定區(qū)的抗體分子)也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。嵌合抗體分子可包括例如小鼠、大鼠或其它物種抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及人的恒定區(qū)?？捎贸Ｒ?guī)方法來(lái)制備包含識(shí)別CD163抗原的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體。(例如參見(jiàn)Morrison等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda等人，Nature 314，452(1985)，Cabilly等人，美國(guó)專利No.4,816,567；Boss等人，美國(guó)專利No.4,816,397；Tanaguchi等人，歐洲專利公開(kāi)EP171496；歐洲專利公開(kāi)0173494，英國(guó)專利GB 2177096B)?？梢云谕逗峡贵w比相應(yīng)的非嵌合抗體在人類受試者中的免疫原性可能更小。
此處所述的與本發(fā)明的蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的單克隆或嵌合抗體，可以通過(guò)制備人恒定區(qū)的嵌合體而進(jìn)一步人源化，其中可變區(qū)部分，特別是抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的保守框架區(qū)來(lái)源于人，只有高變區(qū)是非人類來(lái)源?？衫帽绢I(lǐng)域已知技術(shù)制備這種免疫球蛋白分子(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80，7308-7312(1983)；Kozbor等人，Immunology Today，4，7279(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982))，以及PCT公開(kāi)WO92/06193或EP0239400)。人源化抗體還可以是商業(yè)上制備的(Scotgen Limited，2Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain.)也可以通過(guò)篩選編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達(dá)文庫(kù)(在細(xì)菌中表達(dá)由編碼CD163或其部分的核酸分子產(chǎn)生的肽)產(chǎn)生與CD163反應(yīng)的特異性抗體或抗體片段。例如，可以利用噬菌體表達(dá)文庫(kù)在細(xì)菌中表達(dá)完整的Fab片段、VH區(qū)和FV區(qū)(例如參見(jiàn)Ward等人，Nature341，544-546(1989)；Huse等人，Science 246，1275-1281(1989)；以及McCafferty等人，Nature 348，552-554(1990))。另外，SCID-hu小鼠(例如Genpharm Inc開(kāi)發(fā)的模型)可用于制備抗體或其片段。
本發(fā)明的抗體也包括雙功能抗體，其包含與干細(xì)胞表面上另一抗原的特異性抗體直接連接的CD163特異性抗體。將一個(gè)抗體與另一抗體化學(xué)偶聯(lián)(例如使用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二巰基)丙酸酯(SPDP))可制備雙功能抗體。本發(fā)明的C35抗體還包括雙特異性抗體。雙特異性抗體包含CD163特異性抗體的可變區(qū)以及特異性針對(duì)所靶向的干細(xì)胞表面上至少一種抗原的可變區(qū)。雙特異性抗體可通過(guò)形成雜合的雜交瘤來(lái)制備。雜合的雜交瘤可利用本領(lǐng)域已知的方法制備，例如Staerz&Bevan(1986，PNAS(USA)831453)以及Staerz&Bevan(1986，Immunology Today，7241)公開(kāi)的方法。雙特異性抗體也可通過(guò)化學(xué)方法構(gòu)建，例如利用Staerz等人(1985，Nature，314628)以及Perez等人(1985，Nature，316354)描述的方法，或者通過(guò)表達(dá)重組免疫球蛋白基因構(gòu)建體的方法構(gòu)建。
(b)其它物質(zhì)除抗體之外，可活化CD163的其它物質(zhì)也可以鑒定并用于本發(fā)明的方法中。例如，可通過(guò)將CD163與可能結(jié)合CD163的物質(zhì)反應(yīng)，然后檢測(cè)在CD163和該物質(zhì)之間是否形成復(fù)合物來(lái)鑒定可以結(jié)合干細(xì)胞或祖細(xì)胞上CD163的物質(zhì)?？梢赃M(jìn)一步評(píng)價(jià)在此分析中結(jié)合CD163的物質(zhì)以確定其是否適用于本發(fā)明的方法。
因此，本發(fā)明也包括可結(jié)合CD163的物質(zhì)的鑒定方法，包含以下步驟(a)在能夠使CD163和待測(cè)物質(zhì)形成復(fù)合物的條件下，將CD163和待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)，以及(b)分析CD163和待測(cè)物質(zhì)的復(fù)合物、游離的該物質(zhì)或者未復(fù)合的CD163，其中存在復(fù)合物表明待測(cè)物質(zhì)能夠結(jié)合CD163。
可考慮諸如該物質(zhì)和該蛋白質(zhì)的性質(zhì)和量因素，選擇使該物質(zhì)和CD163的復(fù)合物形成的條件。
可利用常規(guī)分離技術(shù)(例如鹽析、層析、電泳、凝膠過(guò)濾、分級(jí)分離、吸附、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝集或其組合)分離物質(zhì)-CD163復(fù)合物、游離物質(zhì)或未復(fù)合的蛋白質(zhì)。為了便于組分分析，可使用針對(duì)CD163或該物質(zhì)的抗體、或標(biāo)記的CD163、或標(biāo)記的物質(zhì)?？梢杂每蓹z測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記抗體、CD163或該物質(zhì)。
本發(fā)明方法使用的CD163或待測(cè)物質(zhì)可以是不溶性的。例如，CD163或該物質(zhì)可結(jié)合合適的載體。合適載體的例子有瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、Sephadex、Sepharose、聚苯乙烯羧甲基纖維素、濾紙、離子交換樹(shù)脂、塑料膜、塑料管、玻璃珠、二氧化硅、聚胺-甲基乙烯基-醚-馬來(lái)酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-馬來(lái)酸共聚物、尼龍、絲等。載體可能是例如管、試驗(yàn)板、珠、圓盤(pán)、球等形狀。
可利用已知的化學(xué)或物理方法，例如溴化氰偶聯(lián)，通過(guò)該物質(zhì)與合適的不溶性載體反應(yīng)而制備不溶性的CD163或物質(zhì)。
上述分析中，CD163或待測(cè)物質(zhì)也可表達(dá)在細(xì)胞表面上。
III.組合物本發(fā)明也包括包含可活化CD163的物質(zhì)的藥物組合物，其用于刺激血細(xì)胞生成、刺激紅細(xì)胞生成、刺激髓細(xì)胞生成或刺激干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員。因此，本發(fā)明提供刺激血細(xì)胞生成的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明也提供刺激紅細(xì)胞生成的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明也提供刺激髓細(xì)胞生成的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步提供刺激干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步提供刺激紅細(xì)胞系的和/或髓細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的藥物組合物，其包含與合適的稀釋劑或載體混合的有效量的能夠活化CD163的物質(zhì)。
為了刺激紅細(xì)胞生成，該藥物組合物可另外包含一種或多種造血生長(zhǎng)因子，例如紅細(xì)胞生成素。為了刺激髓細(xì)胞生成，該藥物組合物可另外包含一種或多種造血生長(zhǎng)因子，例如G-CSF，GM-CSF，IL-3等。
這種藥物組合物可以傷口內(nèi)、靜脈內(nèi)、表面、直腸、非腸道、局部、吸入或皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)腹膜、口腔和腦內(nèi)使用。該組合物可以是液體、固體或半固體形式，例如丸、片、膏、膠囊(gelatincapsules)、膠囊(capsules)、栓、軟膠囊、凝膠、膜、小管、溶液或混懸液。
本發(fā)明的藥物組合物可用于人或動(dòng)物給藥。給藥劑量取決于個(gè)體需求、預(yù)期效果和選擇的給藥途徑。
可以利用本身已知的制備可給予病人的藥物可接受的組合物的方法來(lái)制備藥物組合物，這樣將有效量的活性物質(zhì)與藥物可接受的賦形劑組合成混合物。例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences描述了合適的賦形劑(Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。
在此基礎(chǔ)上，該藥物組合物包含而不僅僅限于活性化合物或物質(zhì)，其結(jié)合一種或多種藥物可接受的賦形劑或稀釋劑，并包含于合適pH以及與生理性液體等滲的緩沖液中。該藥物組合物也另外包含其它的藥劑，例如可以刺激血細(xì)胞生成、紅細(xì)胞生成或髓細(xì)胞生成、或者可以刺激干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的其它藥劑。
IV.培養(yǎng)添加劑可活化CD163的物質(zhì)可用作培養(yǎng)基的添加劑增強(qiáng)哺乳動(dòng)物祖細(xì)胞或干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員，或者刺激血細(xì)胞生成、紅細(xì)胞生成或髓細(xì)胞生成。因此，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)祖細(xì)胞和/或干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，其包含有效量的可活化CD163的物質(zhì)?；罨疌D163的物質(zhì)可以添加到傳統(tǒng)上用于造血干細(xì)胞表達(dá)的無(wú)血清培養(yǎng)基中。例如，添加生長(zhǎng)因子(例如干細(xì)胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素3(IL-3)、GM-CSF、Flt配基(FL)、血小板生成素(TPO)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF))的無(wú)血清培養(yǎng)基(Kobari等人，2000所述)能夠補(bǔ)充可活化CD163的物質(zhì)。
V.細(xì)胞富集或檢測(cè)如上所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明來(lái)源于臍帶血液或者成人骨髓或外周血的CD34+細(xì)胞上存在CD163受體。這些細(xì)胞上存在CD163提供了重要的研究和臨床工具，因?yàn)槟軌蜻M(jìn)一步檢查CD34+/CD163+亞群細(xì)胞再移植和重新增殖造血系統(tǒng)各部分的能力。此外，可以根據(jù)CD163的表達(dá)富集或分選各種來(lái)源(骨髓、動(dòng)員的外周血或臍帶血)的″干″細(xì)胞。
因此，本發(fā)明提供選擇樣品中造血祖細(xì)胞或干細(xì)胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該物質(zhì)是可結(jié)合CD163的抗體，利用免疫化學(xué)技術(shù)選擇細(xì)胞。例如，利用抗CD163抗體，將抗體與固相支持物復(fù)合，將CD163陽(yáng)性細(xì)胞從樣品的其它細(xì)胞中去除，然后從固相支持物上去除CD163陽(yáng)性細(xì)胞，可以″分選″或選擇表達(dá)CD163受體的干細(xì)胞。例如，抗CD163抗體可以與磁珠復(fù)合。CD163陽(yáng)性細(xì)胞可以結(jié)合抗體，并利用磁力源與樣品中其它細(xì)胞分開(kāi)。與非CD163陽(yáng)性細(xì)胞分離后，將CD163陽(yáng)性細(xì)胞和磁珠分離。另外，利用熒光標(biāo)記的抗CD163通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選(FACS)，干細(xì)胞上CD163的表達(dá)可用于分選這些細(xì)胞。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，許多純化CD163陽(yáng)性細(xì)胞的其它方法應(yīng)當(dāng)是顯而易見(jiàn)的。該方法可用于選擇能夠形成紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系集落的細(xì)胞，或者潛在地能夠利用紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系細(xì)胞重新繁殖生物體的細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供選擇能夠形成紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系集落的細(xì)胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞，其中結(jié)合的細(xì)胞能夠形成紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系集落。本發(fā)明也提供選擇潛在地能夠利用紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系細(xì)胞重新繁殖生物體的細(xì)胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞，其中結(jié)合的細(xì)胞潛在地能夠利用紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系細(xì)胞重新繁殖生物體。
本發(fā)明還包括在陰性選擇方案中可結(jié)合CD163的物質(zhì)(例如抗體)從樣品中去除祖細(xì)胞或干細(xì)胞的應(yīng)用。因此，本發(fā)明提供從樣品中去除造血細(xì)胞的方法，包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)從樣品中去除與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。
以下非限制性實(shí)施例闡釋本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例1CD34+細(xì)胞表達(dá)CD163來(lái)源于冷凍保存的成人骨髓(ABM)的CD34+細(xì)胞，利用Cytofix/Cytoperm溶液(Pharmingen Transduction Laboratories，adivision of BD BioSciences；Becton，Dickson and Company)4℃滲透30分鐘，洗滌后與熒光標(biāo)記的同型對(duì)照抗體(IgG1-FITC)或熒光標(biāo)記的Mac-158小鼠抗人CD163單克隆抗體(MBS；Mac158-FITC)溫育。在平行實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自相同骨髓樣品的細(xì)胞也用熒光標(biāo)記的抗CD34(HPCA-2-PE)和抗CD45(H130-FITC)進(jìn)行細(xì)胞外染色。利用EPICSXL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，Inc)分析樣品。結(jié)果如表1所示，表明超過(guò)95％的骨髓細(xì)胞是CD34/CD45+，這些細(xì)胞大部分也可用抗CD163抗體染色。
表1CD34+骨髓細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析
實(shí)施例2Western印跡可檢測(cè)CD34+細(xì)胞表達(dá)的CD163在含有蛋白酶抑制劑混合物的CHAPS緩沖液(0.5％ CHAPS、10mMTris、1mM MgC12、1mM EDTA和10％甘油)中重懸來(lái)源于成人骨髓的CD34+細(xì)胞來(lái)制備細(xì)胞裂解物。重懸細(xì)胞冰浴30分鐘。離心裂解物，將上清液轉(zhuǎn)到新管中。在非還原性SDS載樣緩沖液中重懸上清液供Western印跡分析。然后樣品通過(guò)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)到尼龍膜。用包含脫脂奶粉的溶液封閉尼龍膜，然后先用Mac-158抗人CD163抗體、繼之以偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(BIO-RAD Laboratories，Inc.)的山羊抗小鼠抗體進(jìn)行檢測(cè)。利用Amersham plc的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)結(jié)合的二抗。
如圖1表明，在從CD34+細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解物中檢測(cè)出CD163免疫反應(yīng)性。
實(shí)施例3在CD34+細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)CD163利用流式細(xì)胞術(shù)分析冷凍保存的來(lái)源于成人骨髓和臍帶血(UCB)低密度單核細(xì)胞(LDMNC)的CD34+細(xì)胞確定CD34+細(xì)胞胞外表達(dá)的CD163水平。細(xì)胞用熒光標(biāo)記的抗CD34(HPCA-2-PE)和抗CD163(Mac158-FITC)抗體染色，然后利用EPICS XL流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果如表2所示。
表2CD163和CD34的共表達(dá)
n＝樣本數(shù)大部分CD163+細(xì)胞可用抗CD34抗體共同染色，表明CD34+細(xì)胞表達(dá)CD163。人CD163受體先前描述為只在單核/巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞上表達(dá)的受體。這些資料表明人造血干細(xì)胞群也表達(dá)CD163。
實(shí)施例4刺激CD163受體導(dǎo)致紅細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)利用集落形成試驗(yàn)，在支持紅細(xì)胞系祖細(xì)胞集落(BFU-E)的條件下，檢測(cè)小鼠抗人抗CD163單克隆抗體(EDHu-1，Serotec)的影響。由單個(gè)原始的紅細(xì)胞系祖細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中形成這些集落相對(duì)較大，且是多叢的。培養(yǎng)12-16天后，集落內(nèi)的細(xì)胞一般血紅蛋白化。將臍帶血(UCB)富集的CD34+細(xì)胞，或者來(lái)源于成人骨髓(ABM)的CD34+細(xì)胞在有或無(wú)50ug/mL抗CD163抗體存在的情況下接種到含10ng/mL白細(xì)胞介素-3(IL-3)和2U/mL紅細(xì)胞生成素(Epo)的甲基纖維素中。評(píng)價(jià)該抗體對(duì)紅細(xì)胞系祖細(xì)胞數(shù)目的影響，結(jié)果如表3所示表3由抗CD163抗體(Ab)刺激的CFA中的ABM或UCB的CD34+細(xì)胞
*相對(duì)增加倍數(shù)
50ug/ml抗CD163抗體比相應(yīng)的對(duì)照平板產(chǎn)生更多的BFU-E。利用不同的抗CD163抗體(Mac158)刺激CD163也得到類似結(jié)果。通過(guò)CD163受體刺激CD34+細(xì)胞可增強(qiáng)臍血或成人骨髓中紅細(xì)胞系祖細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例5刺激CD163增強(qiáng)紅細(xì)胞系細(xì)胞的增殖和分化利用集落形成試驗(yàn)，在支持紅細(xì)胞系祖細(xì)胞集落形成的條件下，檢測(cè)活化的抗CD163抗體的影響。將從臍血LDMNC富集的CD34+細(xì)胞在存在同型對(duì)照抗體(50ug/mL)或抗CD163抗體(EDHu-1；50ug/mL)的情況下接種到含10ng/mL IL-3和2.0U/mL Epo的甲基纖維素中(1,000細(xì)胞/mL)。在濕潤(rùn)的恒溫箱中于5％CO2、37℃溫育甲基纖維素平板。14天后計(jì)數(shù)集落(BFU-E)，評(píng)價(jià)其形態(tài)學(xué)。除實(shí)施例4表明的紅細(xì)胞系集落數(shù)目增加以外，與同型對(duì)照相比，抗CD163抗體也增加紅細(xì)胞系祖細(xì)胞集落的大小和紅色(圖2)。利用不同的抗CD163抗體(Mac158)刺激CD163也得到類似結(jié)果。利用來(lái)源于成人骨髓的CD34+細(xì)胞也得到類似結(jié)果。這些資料提示刺激CD163增強(qiáng)BFU-E集落中紅細(xì)胞系細(xì)胞的增殖(增加集落大小)和分化(增加血紅蛋白的生成，并因而產(chǎn)生較紅的集落)。
實(shí)施例6紅細(xì)胞系細(xì)胞表達(dá)CD163將成人骨髓CD34+細(xì)胞接種到含10ng/mL IL-3以及0.5或2.0U/mL Epo甲基纖維素(1,000細(xì)胞/mL)中。在濕潤(rùn)的恒溫箱中于5％CO2、37℃溫育甲基纖維素平板。14天后，從平板收集BFU-E集落的細(xì)胞，洗滌、計(jì)數(shù)并沉淀。細(xì)胞沉淀-80℃冷凍。從等量細(xì)胞制備細(xì)胞裂解物，如實(shí)施例3所述，將等體積裂解物進(jìn)行Western印跡分析。
如圖3所示，在從BFU-E集落制備的細(xì)胞裂解物中很容易檢測(cè)出CD163免疫反應(yīng)性。此外，在降低Epo濃度的條件下，CD163的免疫反應(yīng)性水平提高，提示Epo可調(diào)節(jié)CD163的表達(dá)。
實(shí)施例7CD163刺激補(bǔ)償最適度下的EPO濃度也用無(wú)血清集落形成試驗(yàn)檢測(cè)CD163抗體的影響。將成人外周血低密度單核細(xì)胞(APB LDMNC)細(xì)胞在有或無(wú)兩種不同的抗CD163抗體EDHu-1或Mac158的情況下接種到含1％ BSA、10ug/mL胰島素、200ug/mL人轉(zhuǎn)鐵蛋白、10ng/mL IL-3和0.2或2.0U/mL Epo的甲基纖維素中(1×105細(xì)胞/mL)。平板在37℃、5％CO2下溫育14天，然后計(jì)數(shù)紅細(xì)胞系祖細(xì)胞集落。如表4表明，與未處理細(xì)胞相比，抗CD163抗體處理的細(xì)胞檢測(cè)到更多的BFU-E集落。此外，在抗CD163抗體存在下形成的集落與沒(méi)有該抗體的情況下相比更大并更紅。因而CD163活化導(dǎo)致紅細(xì)胞系祖細(xì)胞的增殖增強(qiáng)，并對(duì)于有血清和無(wú)血清集落形成試驗(yàn)中的BFU-E集落紅細(xì)胞系細(xì)胞的增殖和分化增強(qiáng)。在減少EPO的條件下，用EDHu-1或Mac158刺激CD163導(dǎo)致紅細(xì)胞系祖細(xì)胞集落的數(shù)目增加(表4)。這些集落也比對(duì)照平板的集落大并紅。利用從成人骨髓或臍帶血分離的CD34+細(xì)胞得到類似結(jié)果。在含血清集落形成試驗(yàn)中也得到類似結(jié)果。缺少Epo時(shí)，不論是否存在抗CD163抗體，集落形成試驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞系集落。
這些資料提示刺激CD163增強(qiáng)紅細(xì)胞系祖細(xì)胞的增殖，并且對(duì)于EPO濃度降低的有血清和無(wú)血清分析增強(qiáng)其紅細(xì)胞系細(xì)胞的增殖和分化。然而，在紅細(xì)胞系集落的形成中，刺激CD163不能完全取代EPO。
表4高和低濃度的EPO、有或沒(méi)有抗CD163抗體(Ab)的情況下在無(wú)血清CFA中刺激BFU-E
*相對(duì)增加倍數(shù)實(shí)施例8刺激CD163增強(qiáng)CFU-GM祖細(xì)胞的增殖在針對(duì)髓細(xì)胞系祖細(xì)胞(CFU-GM)集落生長(zhǎng)優(yōu)化的條件下(50ng/mlSCF、4pg/ml IL-1β、6.25ng/ml IL-6)，利用集落形成試驗(yàn)檢測(cè)交聯(lián)的抗CD163抗體(EDHu-1)的影響。在有或沒(méi)有50ug/mL抗CD163抗體的情況下，將來(lái)源于臍帶血的CD34+按2×103細(xì)胞/ml的濃度接種甲基纖維素。37℃培養(yǎng)14天后，評(píng)價(jià)抗CD163抗體對(duì)CFU-GM數(shù)目的影響，如表5所示。
表5抗CD163抗體刺激CFU-GM增殖CFU-GM/2×103細(xì)胞對(duì)照130+50ug/ml EDHu-1 21950ug/ml時(shí)，與對(duì)照樣品相比，EDHu-1抗體使CFU-GM數(shù)目增加1.7倍。這提示早期髓細(xì)胞系祖細(xì)胞表達(dá)CD163受體，刺激該受體可增強(qiáng)這些細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例9CFU-GM集落中的骨髓細(xì)胞表達(dá)CD163，其表達(dá)不限于CD14+細(xì)胞在針對(duì)髓細(xì)胞系祖細(xì)胞(CFU-GM)集落生長(zhǎng)優(yōu)化的條件下(50ng/ml SCF、4pg/ml IL-1b、6.25ng/ml IL-6)，將來(lái)源于臍帶血細(xì)胞的CD34+按2×103細(xì)胞/ml接種甲基纖維素，于37℃、5％CO2下濕潤(rùn)的恒溫箱中培養(yǎng)。14天后，從產(chǎn)生的集落中收集細(xì)胞，洗滌、計(jì)數(shù)，并分別利用TUK4和Mac158熒光標(biāo)記抗體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14和CD163的表達(dá)。結(jié)果如表6所示。
表6CFU-GM集落細(xì)胞上CD163和CD14的表達(dá)
已經(jīng)參考目前認(rèn)為優(yōu)選的實(shí)施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于公開(kāi)的實(shí)施例。相反，本發(fā)明意在涵蓋所附權(quán)利要求書(shū)精神和范圍內(nèi)包括的各種修改及等效方案。
所有出版物、專利和專利申請(qǐng)等全文在此引入以供參考，如同明確而逐一指明全文引入各個(gè)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)以供參考。
權(quán)利要求
1.選擇樣品中造血干或祖細(xì)胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中干或祖細(xì)胞是CD34陽(yáng)性細(xì)胞。
3.選擇能夠形成紅細(xì)胞系和髓細(xì)胞系集落的細(xì)胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。
4.選擇能夠利用髓細(xì)胞系和紅細(xì)胞系細(xì)胞再增殖生物體的細(xì)胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)選擇與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。
5.選擇樣品中干或祖細(xì)胞的方法，其包含(a)用可結(jié)合CD163的物質(zhì)接觸樣品，以及(b)從樣品中去除與該物質(zhì)結(jié)合的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的方法，其中可結(jié)合CD163的物質(zhì)是抗體。
全文摘要
本發(fā)明描述了刺激干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和/或動(dòng)員的方法和組合物。該方法涉及給予有效量的可活化CD163血紅蛋白清除劑受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。該方法和組合物用于刺激血細(xì)胞生成，并治療多種疾病，包括血細(xì)胞減少癥、貧血癥，以及用于制備供移植的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1952119SQ20061014396
公開(kāi)日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月26日
發(fā)明者S·G·米勒, D·貝爾, K·E·馬修斯 申請(qǐng)人:赫姆索爾有限合伙公司