專利名稱：采用甲基磺酸乙酯誘變木本植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用甲基磺酸乙酯(以下簡稱EMS)誘變木本植物的方法，尤其是一種采用愈傷組織胚性細(xì)胞來進(jìn)行EMS誘變獲得木本植物變異體的方法。

背景技術(shù)：
EMS是一種應(yīng)用很好的誘變劑。
期刊《中草藥》2004 Vol.35 No.11 P.1293-1296公開了一種EMS誘變的長春花細(xì)胞系突變研究，其研究表明用不同濃度的EMS處理長春花愈傷組織與對照相比，不僅生長快，并且吲哚總堿含量高，變異種是所期望的比較理想的細(xì)胞系。
期刊《玉米科學(xué)》2003 Vol.11No.3 P.74-75，84公開了一種EMS對玉米自交系誘變效應(yīng)的研究，其研究表明在M1代引起了較大的生理損傷和生物學(xué)效應(yīng)，M2代質(zhì)量性狀未發(fā)生明顯變異，但株高、穗位高、莖周長和穗長、葉片長等數(shù)量形狀出現(xiàn)了較高的突變頻率。
可見，EMS這種誘變劑的誘變效應(yīng)可用兩高一廣來評價，即效率高、頻率高和范圍廣。
與其它誘變劑相比，EMS誘變后產(chǎn)生的突變頻率高，且多為顯性突變體，易于突變體的篩選。此外它可以產(chǎn)生范圍較廣的突變類型，如轉(zhuǎn)換、顛換等。
現(xiàn)在應(yīng)用比較多的是用EMS處理植物種子、花粉、幼苗，生長點等，這些一般只限于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，進(jìn)行誘變的主要是農(nóng)作物等草本植物。而對于木本植物，比如楊樹來說，如果也采取這些方法獲得變異體，在實際操作中便會遇到許多困難，因為它們個體大，生長周期長，而且受誘變率低的限制，必須處理眾多的個體才能獲得目的數(shù)量的變異體，這在實際操作中除用胚性細(xì)胞來處理之外是很難實現(xiàn)的。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種采用EMS誘變木本植物的方法，以木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞為誘變對象，從而解決EMS誘變木本植物個體大不易處理的困難，降低誘變所需成本。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供了一種采用EMS誘變木本植物的方法，以木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞為誘變對象，包括外植體的選擇及處理、脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)、誘變處理和篩選，其中，所述的外植體為木本植物組培苗，取切成1～2mm的莖段接種于培養(yǎng)基中，經(jīng)過脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)后，采用EMS進(jìn)行誘變處理。
所述的誘變處理方法是將木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞浸泡于EMS處理液中培養(yǎng)。
采用EMS誘變木本植物的方法，選取楊樹愈傷組織胚性細(xì)胞作為誘變對象，包括下述步驟 第一步選取楊樹組培苗為外植體； 第二步將選取的外植體切成1～2mm的莖段； 第三步將莖段接種在脫分化培養(yǎng)基MS+2，4-D 0-1.0mg/ml+KT0-0.5mg/ml+NAA 0-1.0mg/ml+ZT 0-0.5mg/ml上脫分化72～96小時； 第四步脫分化處理好的組織接種在再分化培養(yǎng)基MS+6-BA0-1.0mg/ml+KT 0-0.5mg/ml+IAA 0-1.0mg/ml+ZT 0-0.5mg/ml上再分化，經(jīng)過72～96小時，達(dá)到誘導(dǎo)胚性細(xì)胞大量發(fā)生時間段； 第五步在胚性細(xì)胞發(fā)生率最高的時間段，進(jìn)行誘變處理將胚性愈傷組織浸泡于含有體積濃度(V/V)1～8‰EMS的液體分化培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)2～96小時，完成誘變處理過程； 其中，EMS的體積濃度(V/V)為1‰，2‰，3‰，4‰，5‰，6‰，7‰，8‰中的一種。
第六步洗凈EMS處理殘留液，放于篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，獲得楊樹變異體所用胚性細(xì)胞，以獲得楊樹突變體。
本發(fā)明的優(yōu)點是 1、將木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞以EMS處理后，通過組織培養(yǎng)方法獲得變異的再生植株，從而方便開發(fā)新品種。
2、誘導(dǎo)調(diào)控木本植物發(fā)生胚性細(xì)胞并以EMS處理，在植物細(xì)胞的全能性表達(dá)中獲得變異體； 3、一次誘變處理的細(xì)胞可以達(dá)到以千萬計，誘導(dǎo)基因突變的細(xì)胞再生成突變的植株，就形成大量可供選擇具有新的遺傳基因型的變異體； 4、用EMS處理木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞，極大地提高了處理的誘變率，處理的個體為單個細(xì)胞，體積小，數(shù)目多，處理時所需藥品少，大大降低了成本。

具體實施例方式 一種采用EMS誘變木本植物的方法，以木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞為誘變對象，包括外植體的選擇及處理、脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)、誘變處理和篩選，其中，所述的外植體為木本植物組培苗，取切成1～2mm的莖段接種于培養(yǎng)基中，經(jīng)過脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)后，采用EMS進(jìn)行誘變處理。
所述的誘變處理方法是將木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞浸泡于EMS處理液中培養(yǎng)。
采用EMS誘變木本植物的方法，選取楊樹愈傷組織胚性細(xì)胞作為誘變對象，包括下述步驟 第一步歐美楊黑楊派光兆1#楊(Populus×euramericanaclGuangzhao No1.)，經(jīng)多代組織培養(yǎng)，選出優(yōu)良株系的組培苗作為外植體； 第二步將選取的外植體切成1～2mm的莖段； 第三步將莖段接種在脫分化培養(yǎng)基MS+2，4-D 0.5mg/ml+KT 0.2mg/ml上，培養(yǎng)溫度為室溫25±2℃，光照14小時/天，脫分化72～96小時； 第四步脫分化處理好的組織接種在分化培養(yǎng)基MS+6-BA0.2mg/ml+KT 0.2mg/ml+IAA 0.1mg/ml上，室溫下培養(yǎng)，光照14小時/天，再分化72～96小時，達(dá)到誘導(dǎo)胚性細(xì)胞大量發(fā)生時段； 第五步在胚性細(xì)胞發(fā)生率最高的時間段，進(jìn)行誘變處理將胚性愈傷組織浸泡于含有體積濃度5‰EMS的液體分化培養(yǎng)基MS+6-BA 0.2mg/ml+KT 0.2mg/ml+IAA 0.1mg/ml中，25℃下恒溫振蕩培養(yǎng)36小時，完成透變處理過程； 第六步洗凈處理液，放于篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，以獲得楊樹變異體。
權(quán)利要求
1、一種采用甲基磺酸乙酯誘變木本植物的方法，以木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞為誘變對象，包括外植體的選擇及處理、脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)、誘變處理和篩選，其特征在于所述的外植體為木本植物組培苗，取切成1～2mm的莖段接種于培養(yǎng)基中，經(jīng)過脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)后，以其愈傷組織胚性細(xì)胞為對象，采用甲基磺酸乙酯進(jìn)行誘變處理。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用甲基磺酸乙酯誘變木本植物的方法，其特征在于所述的誘變處理方法是將木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞浸泡于甲基磺酸乙酯處理液中培養(yǎng)。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的采用甲基磺酸乙酯誘變木本植物的方法，當(dāng)選取楊樹愈傷組織胚性細(xì)胞作為誘變對象時，包括下述步驟
第一步選取楊樹組培苗為外植體；
第二步將選取的外植體切成1～2mm的莖段；
第三步將莖段接種在脫分化培養(yǎng)基MS+2，4-D 0-1.0mg/ml+KT0-0.5mg/ml+NAA 0-1.0mg/ml+ZT 0-0.5mg/ml上脫分化72～96小時；
第四步脫分化處理好的組織接種在分化培養(yǎng)基MS+6-BA0-1.0mg/ml+KT 0-0.5mg/ml+IAA 0-1.0mg/ml+ZT 0-0.5mg/ml上再分化，經(jīng)過72～96小時，達(dá)到誘導(dǎo)胚性細(xì)胞大量發(fā)生時間段；
第五步在胚性細(xì)胞發(fā)生率最高的時間段，進(jìn)行誘變處理將胚性愈傷組織浸泡于含有體積濃度(V/V)1～8‰甲基磺酸乙酯的液體分化培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)2～96小時，完成誘變處理過程；
第六步洗凈甲基磺酸乙酯處理殘留液，放于篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，以獲得楊樹變異體。
全文摘要
一種采用甲基磺酸乙酯誘變木本植物的方法，尤指一種采用愈傷組織胚性細(xì)胞來進(jìn)行甲基磺酸乙酯誘變獲得木本植物變異體的方法。本發(fā)明以木本植物愈傷組織胚性細(xì)胞為誘變對象，包括外植體的選擇及處理、脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)、誘變處理和篩選，其中，所述的外植體為木本植物組培苗，取切成1～2mm的莖段接種于培養(yǎng)基中，經(jīng)過脫分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)后，對其愈傷組織胚性細(xì)胞采用甲基磺酸乙酯進(jìn)行誘變處理。本發(fā)明在植物細(xì)胞的全能性表達(dá)中獲得變異體，一次誘變處理的細(xì)胞可以千萬計，誘導(dǎo)基因突變的細(xì)胞再生成突變的植株，形成大量供選擇的變異體，極大地提高處理的誘變率，處理個體為單個細(xì)胞，體積小數(shù)目多，處理時所需藥品少，大大降低成本。
文檔編號C12N5/04GK1961648SQ20061011868
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月23日
發(fā)明者蘇敏, 宋學(xué)孟, 陳麗, 龐瑞華, 許雄山, 章振華, 王凌健, 張承妹 申請人:上海光兆植物速生技術(shù)有限公司