專利名稱：一種采用酶法拆分制備L-酪氨酸-¹⁵N的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外消旋化合物的拆分方法，是一種生化制品的制備方法， 尤其是一種采用酶法拆分制備L一酪氨酸-"N的方法。1846年，Liebig熔融粗的酪蛋白和固體氫氧化鉀，再用熱水溶解殘余物質(zhì)， 添加冰醋酸進(jìn)行水解后發(fā)現(xiàn)了L-酪氨酸。1848年，DeLaRue從胭脂蟲干標(biāo)本中 分離得到L一酪氨酸并首次正確報道了L一酪氨酸的性質(zhì)。以后人們從不同的蛋 白酸水解液中分離出L一酪氨酸。L一酪氨酸分子式C9HnN03，分子量為181.2， 為白色結(jié)晶，溶于堿溶液，難溶于水和乙醇，不溶于醚，[a]D2G=-11.0±0.5° (c =4， HC1) 。 L一酪氨酸的結(jié)構(gòu)式如下所示L一酪氨酸是典型的中性氨基酸，是芳香族氨基酸，非必需氨基酸，但也是人 體不可缺少的一種氨基酸，它是合成神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺的前體,缺乏酪氨酸人體就會 出現(xiàn)生長異常，智能低下等現(xiàn)象,因此國內(nèi)外已普遍開始重視食品中酪氨酸含量的添 加。在醫(yī)藥上，L-酪氨酸是合成甲狀腺素、多巴、腎上腺素的前體，臨床上用于生背景技術(shù)L(一) 一酪氨酸<formula>formula see original document page 4</formula>
殖避孕療效研究，國外，已將L-酪氨酸用于腎臟病患者氨基酸輸液以及氨基酸營 養(yǎng)液配方中。在飼料工業(yè)中常需添加酪氨酸以校正飼料中氨基酸的平衡提高蛋白質(zhì) 利用率，節(jié)省蛋白質(zhì)飼料?；ど?，用作腐蝕抑制劑、堿水解反應(yīng)催化劑、溶解金 屬銅的溶劑等。"N-L-酪氨酸作為一種獨特的示蹤劑在生理醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究 中有著廣泛的應(yīng)用，在研究藥物在體內(nèi)的代謝中有著不可替代的作用。Chemistry of the amino acid,Vo13，1961報道了一種用粗羧肽酶拆分從氯一 乙酰一DL—酪氨酸中獲得L一酪氨酸的方法。J.Biol.chem.180， 473， (1949) 報道了一種用氨基?；笍穆纫灰阴Ｒ籇L—酪氨酸中獲得L一酪氨酸的方法。 American Chemical Society，VoL17，No.23，1978報道了一種用羧肽酶拆分從N— 三氟乙酰一DL—酪氨酸中獲得L—酪氨酸的方法，但采用這些方法獲得的L-酪氨酸收率均不高，沒有化學(xué)純度的報告，所得產(chǎn)品為天然豐度，所用羧肽酶 價格昂貴。采用氨基?；覆鸱址ㄖ苽銵一酪氨酸一"N目前國內(nèi)沒有報道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供一種產(chǎn) 品收率高、光學(xué)純度高、化學(xué)純度高、產(chǎn)物的同位素豐度與氮源原料的同位素 豐度相比沒有降低的采用酶法拆分制備L一酪氨酸一"N的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種采用酶法拆分制備L一酪氮酸一"N的方法，其特征在于，該方法步 驟如下(1) 酶反應(yīng)底物的配制取一定量的N—三氟乙酰一DL —酪氨酸一"N， 用磷酸鹽緩沖溶液溶解后，調(diào)節(jié)溶液的pH值為4.5 8.0，定容使溶液的濃度 為0.01~0.50mol/L作為酶反應(yīng)底物；(2) 保溫反應(yīng)按照每克底物加入l 10g游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.01 0.5g氨基?；该阜鄣谋壤龑⒂坞x的米曲霉菌體細(xì)胞或氨基酰化酶酶粉加入(1)中配制好的酶反應(yīng)底物中，在30 50°C、 一定的搖床轉(zhuǎn)速下，保溫反應(yīng) 10 50小時；(3) 萃取保溫反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液用鹽酸調(diào)pH至1 3，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取1 4次；(4) 脫色萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮至一定體積，加入適量的活性炭脫色；(5) 脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀NaOH調(diào)pH至等電點，在 0 4'C下過夜，再用冰水洗去雜質(zhì)，過濾后烘干即得L-酪氨酸-"N產(chǎn)品。所述的底物濃度為0.02 0.30mol/L較佳。 所述的底物pH為5.0 7.0之間較佳。所述的游離米曲霉菌體細(xì)胞的加入量為每克底物1 8g較佳。 所述的氨基?；该阜鄣募尤肓繛槊靠说孜?.03 0.2g較佳。 所述的調(diào)節(jié)溶液的pH值采用稀NaOH、 LiOH、氨水中一種與鹽酸或醋酸 調(diào)節(jié)。所述的保溫反應(yīng)溫度為30 40'C較佳，反應(yīng)時間為10 40小時較佳。 所述的保溫反應(yīng)的搖床為水浴搖床，該搖床轉(zhuǎn)速為100 150轉(zhuǎn)/min。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用游離米曲霉菌體細(xì)胞或氨基?；该阜鄄鸱?N—三氟乙酰一DL—酪氨酸—"N制備L一酪氨酸一"N的方法，通過萃取有效 的分離了酶反應(yīng)液中的N—三氟乙酰一D—酪氨酸一"N和L一酪氨酸一"N， 萃取后的酯相可另行處理獲得D—酪氨酸一"N產(chǎn)品，該工藝方法簡練，設(shè)備 易得，所得的L一酪氨酸一"N產(chǎn)品收率高、光學(xué)純度高、化學(xué)純度高、產(chǎn)物 的同位素豐度與氮源原料的同位素豐度相比沒有降低。


圖1為本發(fā)明反應(yīng)流程圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本發(fā)明的采用游離米曲霉菌體細(xì)胞或氨基?；该阜鄄鸱諲—三氟乙酰一DL 一酪氨酸一15N制備L—酪氨酸一15N的方法，以外消旋N—三氟乙酰一DL—酪氨 酸-^ (N—Tfa—DL—Tyr—15N)為原料，以游離米曲霉菌體細(xì)胞中的氨基酰化 酶(EC.3，5,14)或氨基酰化酶酶粉為水解催化劑，將N—三氟乙酰一DL—酪氨酸 —15N按照0.02-0.3mol/L的濃度，每克底物加入l 8g游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.03 0.2g氨基?；该阜?，于3(K40"C， 一定的搖床轉(zhuǎn)速下，反應(yīng)10 40小時。 反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液經(jīng)乙酸乙脂萃取處理后，有效的分離了酶反應(yīng)液中的N—三氟 乙?！狣 —酪氨酸一"N和L一酪氨酸一"N，同時得到1^一酪氨酸一15>1產(chǎn)品。具 體工藝路線如圖1所示。 實施例1稱取5g N—三氟乙酰一DL—酪氨酸一"N (豐度為99.1%),用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用稀NaOH與鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4.5，定容至500mL。稱取 10g濕的游離米曲霉菌體細(xì)胞混入配制的底物中，將裝有底物和酶的三角燒瓶 放入120轉(zhuǎn)/min的水浴搖床中在37。C下，保溫反應(yīng)30小時后停止反應(yīng)。反應(yīng) 液用鹽酸調(diào)pH至2，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓 濃縮至一定體積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽 酸和稀NaOH調(diào)pH至等電點，(^C過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘 干獲得L-酪氨酸-"N1.20g，純度為99.5%，單程收率為73.4%，豐度為99.1%, 旋光度
020=-11.0± 5。 (c=4，HCl)。實施例2稱取5g N—三氟乙酰一DL—酪氨酸一"N (豐度為99.1%)，用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用氨水與醋酸調(diào)pH值為5.0，定容至300mL。稱取15g濕的 游離米曲霉菌體細(xì)胞混入配制的底物中，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入100 轉(zhuǎn)/min的水浴搖床中35。C下，保溫反應(yīng)35小時后停止反應(yīng)。反應(yīng)液用鹽酸調(diào) pH至l，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮至一定 體積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀NaOH 調(diào)pH至等電點，4^C過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘干獲得L-酪氨 酸-"N 1.29g，純度為99.5%，單程收率為78.9%，豐度為99.1%,旋光度 [a]D20=-11.0±5。 (c=4,HCl)。實施例3稱取5g N—三氟乙酰一DL—酪氨酸一"N (豐度為99.1%)，用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用稀LiOH與鹽酸調(diào)pH值至8.0，定容至600mL。稱取lg 氨基?；该阜刍烊肱渲频牡孜镏?，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入150轉(zhuǎn) /min的水浴搖床中38。C下，保溫反應(yīng)40小時后停止反應(yīng)。反應(yīng)液用鹽酸調(diào)pH
至3，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮至一定體 積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀NaOH 調(diào)pH至等電點，^C過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘干獲得L-酪 氨酸-"N 1.15g，純度為99.5%，單程收率為70.4%，豐度為99.1%，旋光度 [a]D20=-11.0±5o (c=4，HCl)。 實施例4稱取5g N—三氟乙?！狣L—酪氨酸—15N (豐度為99.1%)，用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用稀NaOH與鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7，定容至550mL。稱取1.2g 氨基?；该阜刍烊牖烊肱渲频牡孜镏?，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入120 轉(zhuǎn)/min的水浴搖床中在37。C下，保溫反應(yīng)40小時后停止反應(yīng)。反應(yīng)液用鹽酸 調(diào)pH至2，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮至一 定體積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀 NaOH調(diào)pH至等電點，()GC過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘干獲得 L-酪氨酸-"N 1.31g，純度為99.5%，單程收率為80.36%，豐度為99.1%，旋光 度[ci]d2Li1.0士50 (c=4，HC1)。實施例5稱取5g N—三氟乙酰一DL—酪氨酸一15N (豐度為99.1%),用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用稀LiOH與醋酸調(diào)節(jié)pH值為5.5，定容至600mL。稱取30g 濕的游離米曲霉菌體細(xì)胞混入配制的底物中，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入 120轉(zhuǎn)/min的水浴搖床中在37CC下，保溫反應(yīng)30小時后停止反應(yīng)。反應(yīng)液用 鹽酸調(diào)pH至2，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮 至一定體積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和 稀NaOH調(diào)pH至等電點，()GC過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘干獲 得L-酪氨酸-"N 1.19g，純度為99.5%，單程收率為72.8%，豐度為99.1%,旋 光度
020=-11.0±50 (c=4，HCl)。實施例6稱取5g N—三氟乙酰一DL—酪氨酸-"N (豐度為99.1%)，用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用稀氨水與鹽酸調(diào)節(jié)pH值為6.5，定容至400mL。稱取1.6g 氨基酰化酶酶粉混入配制的底物中，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入120轉(zhuǎn) /min的水浴搖床中在37。C下，保溫反應(yīng)38小時后停止反應(yīng)。反應(yīng)液用鹽酸調(diào) pH至3，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮至一定 體積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀NaOH 調(diào)pH至等電點，(A:過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘干獲得L-酪氨 酸-"N 1.25g,純度為99.5%，單程收率為76.5%,豐度為99.1%,旋光度 [a]D20=-11.0±5o(c=4,HCl)。 實施例7稱取5g N—三氟乙酰-DL—酪氨酸一"N (豐度為99.1%)，用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用稀LioH與醋酸調(diào)節(jié)pH值為7，定容至700mL。稱取50g 濕的游離米曲霉菌體細(xì)胞混入配制的底物中，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入 120轉(zhuǎn)/min的水浴搖床中在37eC下，保溫反應(yīng)25小時后停止反應(yīng)。反應(yīng)液用 鹽酸調(diào)pH至2，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮 至一定體積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和 稀NaOH調(diào)pH至等電點，()GC過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘干獲 得L-酪氨酸-"N1.26g，純度為99.5%，單程收率為77.1%，豐度為99.1%,旋光 度1>]020=-11.0±50 (c=4,HCl)。實施例8稱取5g N—三氟乙酰一DL—酪氨酸一15N (豐度為99.1%)，用磷酸鹽緩 沖溶液溶解后，再用氨水與鹽酸調(diào)節(jié)pH值為6.0,定容至450mL。稱取1.4g 氨基?；该阜刍烊肱渲频牡孜镏?，將裝有底物和酶的三角燒瓶放入120轉(zhuǎn) /min的水浴搖床中在37。C下，保溫反應(yīng)30小時后停止反應(yīng)。反應(yīng)液用鹽酸調(diào) pH至2，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取3次。萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮至一定 體積，加入適量的活性炭脫色。脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀NaOH 調(diào)pH至等電點，()GC過夜，用冰水洗去NaCl等雜質(zhì)，過濾后烘干獲得L-酪氨 酸-"N 1.17g，純度為99.5%,單程收率為71.6%,豐度為99.1%，旋光度 [a]D20=-11.0±5o (c=4，HCl)。
權(quán)利要求
1.一種采用酶法拆分制備L-酪氨酸-15N的方法，其特征在于，該方法步驟如下(1)酶反應(yīng)底物的配制取一定量的N-三氟乙酰-DL-酪氨酸-15N，用磷酸鹽緩沖溶液溶解后，調(diào)節(jié)溶液的pH值為4.5～8.0，定容使溶液的濃度為0.01～0.50mol/L作為酶反應(yīng)底物；(2)保溫反應(yīng)按照每克底物加入1～10g游離米曲霉菌體細(xì)胞或0.01～0.5g氨基酰化酶酶粉的比例將游離的米曲霉菌體細(xì)胞或氨基?；该阜奂尤?1)中配制好的酶反應(yīng)底物中，在30～50℃、一定的搖床轉(zhuǎn)速下，保溫反應(yīng)10～50小時；(3)萃取保溫反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液用鹽酸調(diào)pH至1～3，用等體積的乙酸乙酯錯流萃取1～4次；(4)脫色萃取后的水相經(jīng)減壓濃縮至一定體積，加入適量的活性炭脫色；(5)脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀NaOH調(diào)pH至等電點，在0～4℃下過夜，再用冰水洗去雜質(zhì)，過濾后烘干即得L-酪氨酸-15N產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種釆用酶法拆分制備L一酪氨酸一"N 的方法，其特征在于，所述的底物濃度為0.02 0.30mol/L較佳。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用酶法拆分制備L一酪氨酸一"N的方法， 其特征在于，所述的底物pH為5.0 7.0之間較佳。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用酶法拆分制備1^一酪氨酸一151^的方法， 其特征在于，所述的游離米曲霉菌體細(xì)胞的加入量為每克底物1 8g較佳。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用酶法拆分制備L一酪氨酸一"N的方法， 其特征在于，所述的氨基?；该阜鄣募尤肓繛槊靠说孜?.03 0.2g較佳。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種采用酶法拆分制備L一酪氨酸一"N 的方法，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)溶液的pH值釆用稀NaOH、 LiOH、氨水 中一種與鹽酸或醋酸調(diào)節(jié)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種采用酶法拆分制備L一酪氨酸一"N的方法，其特征在于，所述的保溫反應(yīng)溫度為30 40'C較佳，反應(yīng)時間為10 40小時較佳。
8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種采用酶法拆分制備L一酪氨酸一"N 的方法，其特征在于，所述的保溫反應(yīng)的搖床為水浴搖床，該搖床轉(zhuǎn)速為100 150轉(zhuǎn)/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用酶法拆分制備L-酪氨酸-¹⁵N的方法，該方法步驟如下(1)酶反應(yīng)底物的配制；(2)保溫反應(yīng)；(3)萃??；(4)脫色；(5)脫色液濃縮至一定體積后，用稀鹽酸和稀NaOH調(diào)pH至等電點，在0～4℃下過夜，再用冰水洗去雜質(zhì)，過濾后烘干即得L-酪氨酸-¹⁵N產(chǎn)品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡練，設(shè)備易得，使用該方法獲得的L-酪氨酸-¹⁵N產(chǎn)品收率高、光學(xué)純度高、化學(xué)純度高、豐度不下降。
文檔編號C12P13/00GK101153301SQ200610116469
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日
發(fā)明者征 任, 呂志賢, 徐建飛, 李良君, 杜曉寧 申請人:上?；ぱ芯吭?br>