專利名稱：一種復(fù)合微生物葉面肥菌劑及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生物葉面肥菌劑，特別涉及一種用于作物葉面噴施和灌根用的復(fù)合微生物葉面肥菌劑。本發(fā)明還涉及所述復(fù)合微生物葉面肥菌劑的生產(chǎn)方法以及其用途。
背景技術(shù)：
進(jìn)入九十年代后，葉面肥的作用已被廣泛重視，發(fā)展也非常迅速。目前市場(chǎng)上葉面肥的種類越來越多，其范圍已超出最初的定義，與植物生長調(diào)節(jié)劑、農(nóng)藥的界限越來越模糊，并且有滲透融合趨勢(shì)。按所含主要成分可將葉面肥粗略劃分為1.礦質(zhì)營養(yǎng)型主要成分為氮、磷、鉀及微量元素的無機(jī)形態(tài)，如植物動(dòng)力2003、綠旺、高樂等；2.有機(jī)營養(yǎng)型主要成分含有氨基酸、腐殖酸等有機(jī)形態(tài)的營養(yǎng)元素或生理活性物質(zhì)，如高美施、惠滿豐、葉面寶等；3.植物生長調(diào)節(jié)劑型主要成分含有植物生長調(diào)節(jié)劑，如增產(chǎn)靈、豐產(chǎn)素、植物營養(yǎng)素等；4.復(fù)合型主要成分含有有機(jī)、無機(jī)形態(tài)的養(yǎng)分或還含有植物生長調(diào)節(jié)劑、農(nóng)藥等其它成分，如噴施寶等；5.其它主要成分含有微生物代謝產(chǎn)物或稀土元素等。
最近幾年出現(xiàn)的一些微生物制劑產(chǎn)品，有的屬微生物發(fā)酵液體產(chǎn)物，有的為微生物活體葉面肥料，效果比較顯著，并有替代傳統(tǒng)葉面肥的趨勢(shì)。
國內(nèi)目前在復(fù)合微生物制劑篩選培養(yǎng)過程中，由于缺乏基本的理論指導(dǎo)以及成熟的生產(chǎn)工藝，對(duì)復(fù)合培養(yǎng)的發(fā)酵過程及其各菌群之間的相互作用及其機(jī)理較為生疏，導(dǎo)致產(chǎn)品活菌總數(shù)不能保持一定水平，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，影響了其在使用過程中的效果。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，公開了一種復(fù)合微生物葉面肥菌劑，用于植物葉面的噴施或灌溉。本發(fā)明還公開了該菌劑的生產(chǎn)方法和用途。
(二)技術(shù)方案本發(fā)明從30個(gè)不同屬、種中篩選出最佳穩(wěn)定共生菌種組合，通過單獨(dú)培養(yǎng)篩選高產(chǎn)菌種。篩選出的菌種為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、植物乳桿菌(lactobacillus plantarum)、總狀毛霉(Mucorracemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)。
根據(jù)上述篩選結(jié)果，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種復(fù)合微生物葉面肥菌劑，包括釀酒酵母5.0×108～1.0×1010cfu/mL、植物乳桿菌5.0×108～1.0×1010cfu/mL、總狀毛霉1.0×102～5.0×104cfu/mL、米曲霉1.0×103～5.0×104cfu/mL；優(yōu)選地，釀酒酵母1.0×109～6.0×109cfu/mL、植物乳桿菌1.0×109～6.0×109cfu/mL、總狀毛霉5.0×102～5.0×103cfu/mL、米曲霉4.0×103～1.0×104cfu/mL。
本發(fā)明所述的復(fù)合微生物葉面肥菌劑的生產(chǎn)方法，包括如下步驟1).斜面培養(yǎng)將釀酒酵母、植物乳桿菌、總狀毛霉、米曲霉原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，將釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15～38℃條件下培養(yǎng)2～6天，植物乳桿菌15～42℃條件下培養(yǎng)1～3天，使菌種活化；2).一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15～38℃條件下，100～200r/min搖床培養(yǎng)2～6天，植物乳桿菌15～42℃條件下靜止培養(yǎng)1～3天，單菌種液體培養(yǎng)OD600值3.0-4.0之間時(shí)停止培養(yǎng)，制得一級(jí)種子；3).二級(jí)種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5～20％的接種量，將一級(jí)種子分別接種于發(fā)酵罐中，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15～38℃條件下，攪拌速度為100～200r/min，通氣量為1∶0.5～1.5，培養(yǎng)2～6天，植物乳桿菌15～42℃條件下培養(yǎng)1～3天，制得二級(jí)種子；4).混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5～20％的接種量，將二級(jí)種子接種于發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑。
其中，步驟1)、2)、3)中釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉所用的培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)基，植物乳桿菌所用的培養(yǎng)基是MRS培養(yǎng)基。固態(tài)培養(yǎng)基與液態(tài)培養(yǎng)基的區(qū)別在于固態(tài)培養(yǎng)基在制備過程中添加了適量的瓊脂。
其中，步驟4)所用的培養(yǎng)基的配方按質(zhì)量百分比為糖蜜3～20％、硫酸銨0.5～10％、蛋白胨0.5～5％、碳酸鈣0.5～3％，余量為水；所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)可以采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)(FBC)方式，其中補(bǔ)料碳源為葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一種或其混合物；氮源為硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨其中任一種或其混合物。
并且，培養(yǎng)過程分階段調(diào)控發(fā)酵pH、溶解氧、攪拌轉(zhuǎn)速和溫度等條件。具體地說發(fā)酵培養(yǎng)過程包括a、有氧培養(yǎng)階段起始0～24小時(shí)內(nèi)，間隔通氣，保持在有氧條件發(fā)酵，通氣量1∶1～1.5，調(diào)控發(fā)酵溶解氧5～15％，攪拌轉(zhuǎn)速150～200r/min，攪拌間隔時(shí)間1～3小時(shí)，攪拌1～3分鐘，溫度25～35℃；b、微溶氧和厭氧培養(yǎng)階段24～96小時(shí)，保持發(fā)酵液上層微溶氧狀態(tài)，靜止培養(yǎng)，間隔攪拌，攪拌間隔時(shí)間3～5小時(shí)，攪拌3～5分鐘，使用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH保持穩(wěn)定在3.8～4.5之間，溫度25～35℃。
本發(fā)明所述復(fù)合微生物葉面肥菌劑可作為肥料用于植物葉面噴施或灌溉。
(三)有益效果本發(fā)明用于植物葉面的噴施或灌溉，能夠促進(jìn)植物根、葉生長和改良種植土壤，能促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的構(gòu)成總菌數(shù)為 3.1×109cfu/mL釀酒酵母 1.6×109cfu/mL植物乳桿菌 1.5×109cfu/mL總狀毛霉 4.1×102cfu/mL米曲霉 6.2×103cfu/mL實(shí)施例2 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的構(gòu)成總菌數(shù)為 1.0×1010cfu/mL釀酒酵母 1.0×1010cfu/mL植物乳桿菌 5.0×108cfu/mL總狀毛霉 5.0×104cfu/mL米曲霉 1.0×103cfu/mL實(shí)施例3 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的構(gòu)成總菌數(shù)為 1.0×1010cfu/mL
釀酒酵母 5.0×108cfu/mL植物乳桿菌 1.0×1010cfu/mL總狀毛霉 1.0×102cfu/mL米曲霉 5.0×104cfu/mL實(shí)施例4 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的構(gòu)成總菌數(shù)為 6.0×109cfu/mL釀酒酵母 1.0×109cfu/mL植物乳桿菌 5.0×109cfu/mL總狀毛霉 5.0×102cfu/mL米曲霉 4.0×103cfu/mL實(shí)施例5 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的構(gòu)成總菌數(shù)為 6.0×109cfu/mL釀酒酵母 5.0×109cfu/mL植物乳桿菌 1.0×109cfu/mL總狀毛霉 5.0×103cfu/mL米曲霉 1.0×104cfu/mL實(shí)施例6 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的生產(chǎn)方法1).斜面培養(yǎng)將釀酒酵母、植物乳桿菌、總狀毛霉、米曲霉原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，將釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉30℃條件下培養(yǎng)3天，植物乳桿菌37℃條件下培養(yǎng)2天；2).一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉30℃條件下，150r/min搖床培養(yǎng)3天，植物乳桿菌37℃條件下靜止培養(yǎng)2天，制得一級(jí)種子，結(jié)束培養(yǎng)時(shí)釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉以及植物乳桿菌各菌懸液光密度OD600值均達(dá)到4.0；3).二級(jí)種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為10％的接種量，將一級(jí)種子分別接種到100L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液的總體積為60L，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉30℃條件下，攪拌速度為150r/min，通氣量為1∶1，培養(yǎng)3天，植物乳桿菌37℃條件下培養(yǎng)2天，制得二級(jí)種子；4).混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為15％的接種量，將二級(jí)種子接種到1噸的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基總體積為700L，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑，其中，步驟1)、2)、3)中釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉所用的培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)基，植物乳桿菌所用的培養(yǎng)基是MRS培養(yǎng)基。
其中，步驟4)所用的培養(yǎng)基的配方按質(zhì)量百分比為糖蜜10％、硫酸銨5％、蛋白胨2.5％、碳酸鈣2％，余量為水；高密度發(fā)酵培養(yǎng)采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，其中補(bǔ)料碳源為葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜；氮源為硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨。
發(fā)酵培養(yǎng)過程包括a、有氧培養(yǎng)階段起始0～24小時(shí)內(nèi)，間隔通氣，保持在有氧條件發(fā)酵，通氣量1∶1.2，調(diào)控發(fā)酵溶解氧10％，攪拌轉(zhuǎn)速180r/min，攪拌間隔時(shí)間2小時(shí)，攪拌2分鐘，溫度30℃；b、微溶氧和厭氧培養(yǎng)階段60小時(shí)，保持發(fā)酵液上層微溶氧狀態(tài)，靜止培養(yǎng)，間隔攪拌，攪拌間隔時(shí)間4小時(shí)，攪拌4分鐘，使用碳酸鈣調(diào)節(jié)穩(wěn)定pH4.0，溫度30℃。
實(shí)施例7 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的生產(chǎn)方法1).斜面培養(yǎng)將釀酒酵母、植物乳桿菌、總狀毛霉、米曲霉原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，將釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15℃條件下培養(yǎng)6天，植物乳桿菌42℃條件下培養(yǎng)1天；2).一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15℃條件下，200r/min搖床培養(yǎng)6天，植物乳桿菌15℃條件下靜止培養(yǎng)3天，制得一級(jí)種子，結(jié)束培養(yǎng)時(shí)釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉以及植物乳桿菌各菌懸液光密度OD600值均達(dá)到3.0；3).二級(jí)種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5％的接種量，將一級(jí)種子分別接種到100L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液的總體積為60L，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15℃條件下，攪拌速度為200r/min，通氣量為1∶0.5，培養(yǎng)6天，植物乳桿菌42℃條件下培養(yǎng)1天，制得二級(jí)種子。
4).混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為20％的接種量，將二級(jí)種子接種到1噸的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基總體積為700L，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑。
其中，步驟1)、2)、3)中釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉所用的培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)基，植物乳桿菌所用的培養(yǎng)基是MRS培養(yǎng)基。
其中，步驟4)所用的培養(yǎng)基的配方按質(zhì)量百分比為糖蜜3％、硫酸銨10％、蛋白胨5％、碳酸鈣0.5％，余量為水；高密度發(fā)酵培養(yǎng)采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，其中補(bǔ)料碳源為葡萄糖、甘油；氮源為牛肉膏、蛋白胨。
發(fā)酵培養(yǎng)過程包括a、有氧培養(yǎng)階段起始0～24小時(shí)內(nèi)，間隔通氣，保持在有氧條件發(fā)酵，通氣量1∶1，調(diào)控發(fā)酵溶解氧5％，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，攪拌間隔時(shí)間3小時(shí)，攪拌3分鐘，溫度35℃；b、微溶氧和厭氧培養(yǎng)階段96小時(shí)，保持發(fā)酵液上層微溶氧狀態(tài)，靜止培養(yǎng)，間隔攪拌，攪拌間隔時(shí)間3小時(shí)，攪拌3分鐘，使用碳酸鈣調(diào)節(jié)穩(wěn)定pH4.5，溫度35℃。
實(shí)施例8 復(fù)合微生物葉面肥菌劑的生產(chǎn)方法1).斜面培養(yǎng)將釀酒酵母、植物乳桿菌、總狀毛霉、米曲霉原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，將釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉38℃條件下培養(yǎng)3天，植物乳桿菌15℃條件下培養(yǎng)3天；2).一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉38℃條件下，100r/min搖床培養(yǎng)2天，植物乳桿菌42℃條件下靜止培養(yǎng)1天，制得一級(jí)種子，結(jié)束培養(yǎng)時(shí)釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉以及植物乳桿菌各菌懸液光密度OD600值均達(dá)到3.0；3).二級(jí)種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為20％的接種量，將一級(jí)種子分別接種到100L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液的總體積為60L，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉38℃條件下，攪拌速度為100r/min，通氣量為1∶1.5，培養(yǎng)2天，植物乳桿菌15℃條件下培養(yǎng)3天，制得二級(jí)種子。
4).混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5％的接種量，將二級(jí)種子接種到1噸的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基總體積為700L，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑。
其中，步驟1)、2)、3)中釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉所用的培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)基，植物乳桿菌所用的培養(yǎng)基是MRS培養(yǎng)基。
其中，步驟4)所用的培養(yǎng)基的配方按質(zhì)量百分比為糖蜜20％、硫酸銨0.5％、蛋白胨0.5％、碳酸鈣3％，余量為水；高密度發(fā)酵培養(yǎng)采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，其中補(bǔ)料碳源為蔗糖、糖蜜；氮源為硫酸銨、牛肉膏。
發(fā)酵培養(yǎng)過程包括a、有氧培養(yǎng)階段起始0～24小時(shí)內(nèi)，間隔通氣，保持在有氧條件發(fā)酵，通氣量1∶1.5，調(diào)控發(fā)酵溶解氧15％，攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，攪拌間隔時(shí)間1小時(shí)，攪拌1分鐘，溫度25℃；b、微溶氧和厭氧培養(yǎng)階段24小時(shí)，保持發(fā)酵液上層微溶氧狀態(tài)，靜止培養(yǎng)，間隔攪拌，攪拌間隔時(shí)間5小時(shí)，攪拌5分鐘，使用碳酸鈣調(diào)節(jié)穩(wěn)定pH3.8，溫度25℃。
實(shí)施例9 大豆供試大豆品種九三95-144，保苗2萬株/畝施肥方案A、大豆分枝期+初花期，噴施本葉面肥菌劑各100ml/畝葉面；B、大豆分枝期，噴施本葉面肥菌劑100ml/畝葉面；C、大豆分枝期，噴施本葉面肥菌劑200ml/畝葉面；D、對(duì)照不噴施本葉面肥菌劑種植時(shí)間5月4日機(jī)械播種，9月14日收獲結(jié)果本葉面肥菌劑能增加大豆產(chǎn)量，對(duì)大豆增產(chǎn)有較好的效果。
表1 大豆使用本葉面肥菌劑效果

實(shí)施例10 水稻供試水稻品種空育131施肥方案
A、本葉面肥菌劑于水稻孕穗期、抽穗期100ml/畝各噴一次；B、本葉面肥菌劑于水稻孕穗期、抽穗期200ml/畝各噴一次；C、相同時(shí)期等量清水。
種植時(shí)間5月17日機(jī)械插秧，10月14日收獲結(jié)果本葉面肥菌劑在水稻上應(yīng)用有較明顯的增產(chǎn)作用表2 水稻使用本葉面肥菌劑效果

實(shí)施例11 棉花棉花品種美國33B使用方法本葉面肥菌劑施用采取浸種、噴灑、滴灌的方法，以植株噴灑為主。
結(jié)果從9月15日到11月6日下苦霜期間，試驗(yàn)田棉葉濃綠不掉葉，而對(duì)照田棉葉到10月25日掉完。
表3、2001年9月15日田間單株調(diào)查

試驗(yàn)田伏前桃為18個(gè)占47％，對(duì)照田10個(gè)占37％，試驗(yàn)田伏桃明顯高于對(duì)照田10％，試驗(yàn)總產(chǎn)315斤，對(duì)照田為265斤，試驗(yàn)棉絮潔白度高對(duì)照田，棉花纖維比對(duì)照田長0.5CM。
表4、2002年9月15日田間單株調(diào)查 2002年又發(fā)現(xiàn)施用本葉面肥菌劑地塊桃大，有五分之一桃開五瓣花，霜前花每瓣9粒籽，比對(duì)照田多2粒籽，霜后花每瓣多1粒籽。試驗(yàn)田畝產(chǎn)730斤，對(duì)照田畝產(chǎn)410斤，增產(chǎn)320斤，增效620元。
實(shí)施例12 生菜使用方法在植物生長期，用本葉面肥菌劑稀釋液(100倍)進(jìn)行葉面噴施，一般10～15一次。浸種處理時(shí)，濃度為稀釋100倍。
結(jié)果試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用本葉面肥菌劑的生菜株均鮮重為3.6克，干重為0.2克；而對(duì)照株均鮮重為1.7克，干重為0.1克。
實(shí)施例13 甘藍(lán)使用方法在植物生長期，用本葉面肥菌劑稀釋液(100倍)進(jìn)行葉面噴施，一般10～15天一次。浸種處理時(shí)，濃度為稀釋100倍。
結(jié)果試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用本葉面肥菌劑的甘藍(lán)株均鮮重為7.2克，干重為0.5克；而對(duì)照株均鮮重為5.3克，干重為0.4克。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合微生物葉面肥菌劑，其特征在于該菌劑包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5.0×108～1.0×1010cfu/mL、植物乳桿菌(lactobacillus plantarum)5.0×108～1.0×1010cfu/mL、總狀毛霉(Mucorracemosus)1.0×102～5.0×104cfu/mL、米曲霉(Aspergillus oryzae)1.0×103～5.0×104cfu/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物葉面肥菌劑，其特征在于該菌劑包括釀酒酵母1.0×109～6.0×109cfu/mL、植物乳桿菌1.0×109～6.0×109cfu/mL、總狀毛霉5.0×102～5.0×103cfu/mL、米曲霉4.0×103～1.0×104cfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合微生物葉面肥菌劑，其特征在于該菌劑包括釀酒酵母1.6×109cfu/mL、植物乳桿菌1.5×109cfu/mL、總狀毛霉4.1×102cfu/mL、米曲霉6.2×103cfu/mL。
4.一種如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的復(fù)合微生物葉面肥菌劑的生產(chǎn)方法，其特征是包含如下步驟1).斜面培養(yǎng)將釀酒酵母、植物乳桿菌、總狀毛霉、米曲霉原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，將釀酒酵母、總狀毛霉米曲霉15～38℃條件下培養(yǎng)2～6天，植物乳桿菌15～42℃條件下培養(yǎng)1～3天；2).一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15～38℃條件下，100～200r/min搖床培養(yǎng)2～6天，植物乳桿菌15～42℃條件下靜止培養(yǎng)1～3天，單菌種液體培養(yǎng)OD600值3.0-4.0之間時(shí)停止培養(yǎng)，制得一級(jí)種子；3).二級(jí)種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5～20％的接種量，將一級(jí)種子分別接種于發(fā)酵罐中，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉15～38℃條件下，攪拌速度為100～200r/min，通氣量為1∶0.5～1.5，培養(yǎng)2～6天，植物乳桿菌15～42℃條件下培養(yǎng)1～3天，制得二級(jí)種子；4).混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5～20％的接種量，將二級(jí)種子接種于發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑，其中，所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，其中補(bǔ)料碳源為葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一種或其混合物；氮源為硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨其中任一種或其混合物，發(fā)酵培養(yǎng)過程包括a、有氧培養(yǎng)階段起始0～24小時(shí)內(nèi)，間隔通氣，保持在有氧條件發(fā)酵，通氣量1∶1～1.5，調(diào)控發(fā)酵溶解氧5～15％，攪拌轉(zhuǎn)速150-200r/min，攪拌間隔時(shí)間1～3小時(shí)，攪拌1～3分鐘，溫度25～35℃；b、微溶氧和厭氧培養(yǎng)階段24～96小時(shí)，保持發(fā)酵液上層微溶氧狀態(tài)，靜止培養(yǎng)，間隔攪拌，攪拌間隔時(shí)間3～5小時(shí)，攪拌3～5分鐘，使用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH保持穩(wěn)定在3.8～4.5之間，溫度25～35℃。
5.一種如權(quán)利要求4所述的復(fù)合微生物葉面肥菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于1).斜面培養(yǎng)將釀酒酵母、植物乳桿菌、總狀毛霉、米曲霉原始菌種無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，將釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉30℃條件下培養(yǎng)3天，植物乳桿菌37℃條件下培養(yǎng)2天；2).一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉30℃條件下，150r/min搖床培養(yǎng)3天，植物乳桿菌37℃條件下靜止培養(yǎng)2天，單菌種液體培養(yǎng)OD600值3.0-4.0之間時(shí)停止培養(yǎng)，制得一級(jí)種子；3).二級(jí)種子培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為10％的接種量，將一級(jí)種子分別接種于發(fā)酵罐中，釀酒酵母、總狀毛霉、米曲霉30℃條件下，攪拌速度為150r/min，通氣量為1∶1，培養(yǎng)3天，植物乳桿菌37℃條件下培養(yǎng)2天，制得二級(jí)種子；4).混合發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為15％的接種量，將二級(jí)種子接種于發(fā)酵罐中，進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，獲得菌劑，其中所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方式，其中補(bǔ)料碳源為糖蜜；氮源為蛋白胨，發(fā)酵培養(yǎng)過程包括a、有氧培養(yǎng)階段起始0～24小時(shí)內(nèi)，間隔通氣，保持在有氧條件發(fā)酵，通氣量1∶1.2，調(diào)控發(fā)酵溶解氧10％，攪拌轉(zhuǎn)速180r/min，攪拌間隔時(shí)間2小時(shí)，攪拌2分鐘，溫度30℃；b、微溶氧和厭氧培養(yǎng)階段60小時(shí)，保持發(fā)酵液上層微溶氧狀態(tài)，靜止培養(yǎng)，間隔攪拌，攪拌間隔時(shí)間4小時(shí)，攪拌4分鐘，使用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH保持穩(wěn)定在4.0，溫度30℃。
6.一種如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的復(fù)合微生物葉面肥菌劑在作為植物葉面肥中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生物葉面肥菌劑及其生產(chǎn)方法和用途。該菌劑包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、總狀毛霉(Mucor racemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)，經(jīng)過斜面培養(yǎng)、一級(jí)種子、二級(jí)種子以及混合培養(yǎng)發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)了復(fù)合菌生物量及其不同菌種配比的最優(yōu)化，復(fù)合菌劑有效活菌數(shù)大于3×10
文檔編號(hào)C12N1/20GK1966663SQ20061007858
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月12日
發(fā)明者李季, 康文力, 彭生平 申請(qǐng)人:李季