專利名稱：一種二甲基甲酰胺降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
一種二甲基甲酰胺降解菌及其生產(chǎn)的菌劑
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種二甲基甲酰胺降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，是 利用微生物的方法降解二甲基甲酰胺這種常用化工溶劑廢水處理。
背景技術(shù)：
二甲基甲酰胺(DMF)是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、沸點高、性能優(yōu)良的有機溶劑，密度為 0.94，沸點152.8°C，凝固點-61°C。除鹵代烴以外，能與水及多數(shù)有機溶劑以任意比互溶， 由于其良好的溶解能力，有“萬能溶劑”之稱。且DMF又是一種重要的農(nóng)藥醫(yī)藥中間體，多種 氣體的吸收劑在農(nóng)藥上，用以合成殺蟲脒；在醫(yī)藥上，用以合成磺胺嘧啶、強力霉素、可的 松和維生素B6等藥物；在石油化工中，用作氣體吸收劑，用以分離和精制氣體，如丁二烯抽 提；在聚胺脂合成革生產(chǎn)、聚丙烯腈抽絲工藝中用DMF作為溶劑，用DMF作為溶劑生產(chǎn)的腈 綸疏水性好，覆蓋性強等優(yōu)點。因此在以上化工產(chǎn)品生產(chǎn)過程排出的廢水中含有大量DMF， 每年僅制革行業(yè)排放的含DMF廢水約1億噸，對環(huán)境造成嚴重污染。DMF性質(zhì)穩(wěn)定，生物 降解性差，能夠刺激損害人的眼睛，并造成肝功能障礙，美國已確定DMF為人體可能致癌物 質(zhì)。DMF在我國地面水質(zhì)標準中允許最高濃度為25mg/L。目前對于中低濃度DMF廢水主要 以回收和生物降解去除為主。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實踐中的實際問題和需求，開發(fā)研制出一種 二甲基甲酰胺降解菌劑，使用本菌劑可以使一定濃度的DMF廢水中DMF的殘留量降低95% 以上，具有較廣的降解譜，生產(chǎn)和使用成本較低。技術(shù)方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容本發(fā)明提供一種二甲基甲酰胺的降解菌(圖1)，其菌株是一株革蘭氏染色反應(yīng) 陰性菌DMF3，于2010年5月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號CGMCC NO. 3854，經(jīng)鑒定為變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)菌體為不規(guī)則桿狀，大 小約0. 5 1. 0 μ mX 1. 5 5. 0 μ m，沒有菌柄也沒有鞘，不產(chǎn)生芽孢，需氧，進行嚴格的呼吸 性代謝，氧化酶陽性，接觸酶陽性，能以二甲基甲酰胺為唯一碳源、氮源進行生長，并將其徹 底礦化釋放出氨氮。使用上述二甲基甲酰胺降解菌生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面種一搖瓶種一種子罐一生 產(chǎn)罐一產(chǎn)品(包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑)。本發(fā)明的詳細實施步驟為1)將二甲基甲酰胺降解菌DMF3的試管種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對 數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生 長期。種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.8%，(NH4)2SO4 1%, K2HPO4 0.2%, MgSO40. 05%, NaCl 0. 01%, CaCO3 0. 3%，酵母膏 0. 02%，pH 值 7. 2-7. 5。3)將種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng) 基相同。在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0.6-1.2，攪拌速度為 180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35°C，整個工藝流程培養(yǎng)時間為48-60小時。發(fā)酵完成后 培養(yǎng)液即為菌劑。

使用該發(fā)明生產(chǎn)的二甲基甲酰胺降解菌劑具有生產(chǎn)使用成本低、使用方便、去除 效果好的優(yōu)點，適合在含有DMF的廢水處理中推廣使用。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人 類的身體健康，降低廢水處理的成本具有重要的意義。降解菌DMF3可以在以二甲基甲酰胺 為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長；按2%的接種量于含二甲基甲酰胺的無機鹽培養(yǎng)基中 接入降解菌DMF3，于30°C、pH7. 0條件下，振蕩培養(yǎng)3天后，能使廢水中一定濃度的DMF殘 留量降低95%以上，具有很好的降解效果(圖6)，降解菌DMF3具有較廣的降解譜，在甲酰 胺、甲胺、二甲胺等有機胺中也可以生長。大大降低了生產(chǎn)和使用過程中的工作量，降低了 生產(chǎn)和使用成本。
四

圖1菌株DMF3菌落照片圖2降解菌DMF3生長情況與對DMF降解情況的關(guān)系圖3不同接種量對DMF降解效率的影響圖4初始pH對DMF降解效率的影響圖5不同裝液量對DMF降解效率的影響圖6菌株DMF3對DMF降解的液相色譜圖
五具體實施例方式1實驗室生物降解實驗 1.1接種量對DMF降解效率的影響菌株DMF3在LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基配方g/L 酵母膏5. 00，蛋白胨10. 00，NaCl 10. 00, pH 7.0)中培養(yǎng)至對數(shù)后期，按0.5、1、2、5、10、15%的接種量分別接入無機鹽培養(yǎng) 基(DMF 400mg/L, NaCl 1. 00g/L, K2HPO4 2. 50g/L, KH2PO4 1. 00g/L, pH 7.0。下文同)中， 30°C、160r/min搖床培養(yǎng)，每隔12小時測定一次DMF的含量，結(jié)果如圖3所示。接種量的大 小對DMF的降解效率有直接的關(guān)系，在小于2%的接種量下，接種量越大，DMF的降解效率就 越高；當接種量大于2%時，再增大接種量對DMF降解影響不大。1. 2初始pH對DMF降解效率的影響菌株DMF3在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)后期，按2%接種至不同pH的無機鹽培養(yǎng)基 中，30°C、160r/min搖床培養(yǎng)，72h后測定其中DMF的含量，結(jié)果如圖4所示。在pH5. 0 9. 0的條件下，菌株DMF3對DMF的降解率差距較大；當pH為7. 0，降解率幾乎為100%。當 pH為5. 0時，DMF幾乎不被降解；當pH在堿性條件下隨著pH的升高DMF的降解率快速下 降。
1. 3裝液量對解DMF降解效率的影響在5個250mL的三角瓶中分別裝入50、70、100、120、150mL無機鹽培養(yǎng)基。菌株 DMF3在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)后期，按2%的接種量接種到上述各培養(yǎng)基中，30°C、160r/ min搖床培養(yǎng)，48小時后測定DMF的降解率，結(jié)果如圖5。48小時的測定結(jié)果表明裝有50、 70、100、120、150mL培養(yǎng)液的三角瓶中DMF的降解率分別為86%、80%、70%、66%和63%， 菌株DMF3降解DMF的過程是個好氧過程，大通氣量有助于DMF的降解。2生產(chǎn)實施例 將本發(fā)明的DMF降解菌DMF3的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能，接種于 試管斜面上備用。試管種接種于含200ml的LB培養(yǎng)基1000ml搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至 對數(shù)期，準備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為葡萄糖0. 8 %， (NH4)2SO4 1%, K2HPO4 0. 2%, MgSO4 0. 05%, NaCl 0. 01%, CaCO3 0. 3%，酵母膏 0. 02%， pH值7. 2-7. 5。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種 按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空 氣通入量為1 0.8。將到達對數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐 所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4. 5噸。投料后的生產(chǎn)罐 1. lkg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無菌空氣保持無菌狀 態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30-35°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為 1 0.8-1.0，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個工藝流程培養(yǎng)時間為48-60小時。發(fā)酵結(jié)束后 菌體數(shù)量達到10億個/ml以上。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭 吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
權(quán)利要求
一種二甲基甲酰胺降解菌，其特征在于，該微生物是革蘭氏染色陰性的變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)的菌株DMF3，于2010年5月21日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC NO.3854，菌體為不規(guī)則桿狀，大小約0.5～1.0μm×1.5～5.0μm，無菌柄，無鞘，不產(chǎn)生芽孢，需氧，進行嚴格的呼吸性代謝，氧化酶陽性，接觸酶陽性，能以二甲基甲酰胺為唯一碳源、氮源進行生長，并將其徹底礦化釋放出氨氮。
2.一種用權(quán)利要求1所述的二甲基甲酰胺降解菌生產(chǎn)的降解菌劑，是通過以下方法生 產(chǎn)而成1)將試管種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種 子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖 0.8%, (NH4)2S04 1%, K2HP04 0. 2%, MgS040 . 05%, NaCl 0. 01%, CaC03 0. 3%，酵母膏 0. 02%，pH 值 7. 2-7. 5 ；3)將種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0.6-1.2，攪拌速度為 180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35°C，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量 達到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型 或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
全文摘要
本發(fā)明提供一種二甲基甲酰胺(DMF)降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌菌株DMF3，經(jīng)鑒定為變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)。主要生物學(xué)特性為G-，菌體為不規(guī)則桿狀，大小約0.5～1.0μm×1.5～5.0μm，無菌柄，無鞘，不產(chǎn)生芽孢，需氧，進行嚴格的呼吸性代謝，能以DMF為唯一碳源、氮源進行生長，將其徹底礦化并釋放出氨氮。在30℃、pH 7.0條件下該菌株可以在3天內(nèi)，使廢水中一定濃度的DMF殘留量降低95％以上，解決了化工生產(chǎn)廢水中DMF難處理的問題，可使DMF廢水COD達標排放。
文檔編號C12R1/38GK101935626SQ20101019926
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者楊帥, 蔡天明, 陳立偉, 顧海莎 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)