專利名稱：：一種提高羊草愈傷組織分化率的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種提高羊草愈傷組織分化率的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：羊草隸屬于單子葉植物綱、禾本科、禾亞科、早熟禾系、大麥族、野麥亞族、賴草屬植物，是歐亞大陸草原區(qū)東部的重要草原建群種之一。作為一種重要的牧草資源，羊草具有產(chǎn)量高、抗逆性強、動物適口性好、營養(yǎng)豐富等諸多優(yōu)點；同時，羊草還對不同生態(tài)環(huán)境具有較強的適應性，對改善我國北方草原生態(tài)環(huán)境和治理鹽漬化土地具有重大意義。多年來，人們主要通過傳統(tǒng)育種技術(shù)馴化和改良羊草群體，選育優(yōu)良品種，而傳統(tǒng)育種技術(shù)卻具有工作量大、周期長、目的性差等局限性。近些年，隨著植物基因工程的迅速發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育和改良植物品種已逐漸成為一種便捷、實用的重要途徑(魏琪，胡國富，李鳳蘭，胡寶忠。羊草種子愈傷組織的誘導及植株再生。東北農(nóng)業(yè)大學學報，36(1)41-44)。在羊草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立中，愈傷組織再生植株是一個關(guān)鍵因素。衡量羊草植株再生能力的指標主要有愈傷組織分化率(％)＝(分化愈傷數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100；不定芽分化率(％)＝(分化芽數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100。而通常羊草愈傷組織的分化率很低，已有文獻報道羊草愈傷組織分化率為16％-24％(曲同寶，王丕武，關(guān)淑艷，劉玲芝。羊草組織培養(yǎng)及再生系統(tǒng)的建立。草業(yè)學報，13(5)91-94；魏琪，胡國富，李鳳蘭，胡寶忠。羊草種子愈傷組織的誘導及植株再生。東北農(nóng)業(yè)大學學報，36(1)41-44)，而不定芽分化率僅有26.67％(魏琪，胡國富，李鳳蘭，胡寶忠。羊草種子愈傷組織的誘導及植株再生。東北農(nóng)業(yè)大學學報，36(1)41-44)。可見分化率低成為制約遺傳轉(zhuǎn)化率的瓶頸，因此提高愈傷組織的分化率至關(guān)重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高羊草愈傷組織分化率的方法及其專用培養(yǎng)基，以解決羊草組織培養(yǎng)過程中分化率過低的問題。本發(fā)明所提供的提高羊草愈傷組織分化率的培養(yǎng)基是添加0.3-2.5mg/L6-BA和0.3-2.5mg/LKT，并用30-90g/L麥芽糖替代蔗糖的N6固體培養(yǎng)基。所述6-BA的濃度優(yōu)選為1.5mg/L，所述KT的濃度優(yōu)選為1.5mg/L。本發(fā)明所提供的提高羊草愈傷組織分化率的方法，是將愈傷組織置于預分化培養(yǎng)基中進行預分化培養(yǎng)20-30天，然后接種在上述提高羊草愈傷組織分化率的培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，直到分化出芽；所述預分化培養(yǎng)基是添加0.05-1mg/L2，4-D的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基可為N6培養(yǎng)基KNO32800mg/L，(NH4)2SO4463mg/L，KH2PO4400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O165mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg/L，MnSO4·H2O4.4mg/L，ZnSO4·7H2O1.5mg/L，H3BO31.6mg/L，KI0.8mg/L，維生素B11mg/L，維生素B60.5mg/L，葉酸0.5mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。所述預分化培養(yǎng)基分為預分化培養(yǎng)基I和預分化培養(yǎng)基II；所述預分化培養(yǎng)基I為添加0.07-1mg/L2，4-D的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述預分化培養(yǎng)基II為添加0.05-1mg/L2，4-D的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在使用時，預分化培養(yǎng)基I和預分化培養(yǎng)基II分階段使用。所述預分化培養(yǎng)基I中2，4-D的濃度優(yōu)選為0.5mg/L；所述預分化培養(yǎng)基II中2，4-D的濃度優(yōu)選為0.3mg/L。所述預分化培養(yǎng)為先將愈傷組織置于所述預分化培養(yǎng)基I中培養(yǎng)10-15天，再在所述預分化培養(yǎng)基II培養(yǎng)10-15天。實驗證明，本發(fā)明方法處理的愈傷組織分化率可達到51.70％，不定芽分化率可達到112.11％，是已有文獻報道的最高分化率的2倍和4倍左右。本發(fā)明方法簡單易行，無需復雜操作，即可有效提高羊草愈傷組織的分化率，有助于提高羊草的遺傳轉(zhuǎn)化率，具有重要的實際意義。具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、高羊草愈傷組織培養(yǎng)分化及其效果1、羊草種子的處理挑選飽滿當年生羊草種子，去掉種皮，在超凈工作臺內(nèi)用75％的酒精浸泡45秒，然后用無菌水沖洗干凈，再用2％次氯酸鈉浸泡消毒10分鐘，其間不斷搖晃，保證消毒徹底，再用無菌水沖洗干凈。2、愈傷組織的誘導將600顆無菌種子，接種在添加2.0mg/L2，4-D，7.5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，pH5.8的N6培養(yǎng)基上，25℃恒溫暗培養(yǎng)，作為實驗組。N6培養(yǎng)基KNO32800mg/L，(NH4)2SO4463mg/L，KH2PO4400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O165mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg/L，MnSO4·H2O4.4mg/L，ZnSO4·7H2O1.5mg/L，H3BO31.6mg/L，KI0.8mg/L，維生素B11mg/L，維生素B60.5mg/L，葉酸1mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。3、愈傷組織的繼代步驟2中實驗組誘導愈傷組織的600顆無菌種子中，130顆無菌種子形成愈傷組織，將其中108個緊密型愈傷組織轉(zhuǎn)到含有1mg/L2，4-D的N6固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，每3-4周繼代1次，進行3-4次繼代。4、愈傷組織的分化將步驟3實驗組得到的3-4次繼代的愈傷組織，分為三組，實驗組1、實驗組2、實驗組3，分別先后置于預分化培養(yǎng)基I(2，4-D濃度為0.07、0.5或1mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和預分化培養(yǎng)基II(0.05、0.3或1mg/L的N6培養(yǎng)基)中分別預分化兩周，在26℃光照強度為1600lx(勒克斯)的條件下培養(yǎng)28天，從而獲得較多的胚性愈傷組織，然后接種在分化培養(yǎng)基上。分化培養(yǎng)基是pH5.8，添加1.5mg/L6-BA和1.5mg/LKT，并用60g/L麥芽糖代替蔗糖的N6固體(添加瓊脂7.5g/L)培養(yǎng)基。實驗組1、實驗組2、實驗組3所用培養(yǎng)基的具體組分和其含量如表1所示。計算愈傷組織分化率(分化的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))和不定芽分化率(分化出的芽數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))結(jié)果如表1所示，表明實驗組1、實驗組2、實驗組3的愈傷組織分化率和不定芽分化率比對照分別提高73.38％和178.70％、115.42％和320.36％、68.83％和239.97％；另外實驗組1、實驗組2、實驗組3是已有文獻報道(曲同寶，王丕武，關(guān)淑艷，劉玲芝。羊草組織培養(yǎng)及再生系統(tǒng)的建立。草業(yè)學報，13(5)91-94；魏琪，胡國富，李風蘭，胡寶忠。羊草種子愈傷組織的誘導及植株再生。東北農(nóng)業(yè)大學學報，36(1)41-44)的最高分化率的2倍和4倍左右。表1羊草愈傷組織在不同培養(yǎng)基上的分化頻率和平均再生芽數(shù)<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="877">組別預分化培養(yǎng)基成分(mg/L)2，4-D分化培養(yǎng)基成分(mg/L)愈傷組織分化率(分化的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))不定芽分化率(分化山的芽數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))III6-BAKT麥芽糖實驗組1實驗組2實驗組3對照組0.070.51--0.050.31--1.51.51.5--1.51.51.5--606060--41.61％51.70％40.52％24％74.33％112.11％90.67％26.67％</table></tables>將實驗組1、實驗組2、實驗組3得到的不定芽移到N6生根培養(yǎng)基7-12天后全部分化出根，繼續(xù)在N6培養(yǎng)壯苗，結(jié)果表明所有分化苗全部成活。權(quán)利要求1.一種提高羊草愈傷組織分化率的培養(yǎng)基，是添加0.3-2.5mg/L6-BA和0.3-2.5mg/LKT，并用30-90g/L麥芽糖替代蔗糖的N6固體培養(yǎng)基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述6-BA的濃度為1.5mg/L，所述KT的濃度為1.5mg/L，所述麥芽糖濃度為60g/L。3.一種提高羊草愈傷組織分化率的方法，是將愈傷組織置于預分化培養(yǎng)基中進行預分化培養(yǎng)20-30天，然后接種在權(quán)利要求1或2所述分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，直到分化出芽；所述預分化培養(yǎng)基是添加0.05-1mg/L2，4-D的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基KNO32800mg/L，(NH4)2SO4463mg/L，KH2PO4400mg/L，MgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O165mg/L，Na2-EDTA37.3mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mg/L，MnSO4·H2O4.4mg/L，ZnSO4·7H2O1.5mg/L，H3BO31.6mg/L，KI0.8mg/L，維生素B11mg/L，維生素B60.5mg/L，葉酸1mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述預分化培養(yǎng)基分為預分化培養(yǎng)基I和預分化培養(yǎng)基II；所述預分化培養(yǎng)基I為添加0.07-1mg/L2，｀4-D的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；所述預分化培養(yǎng)基II為添加0.05-1mg/L2，4-D的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述預分化培養(yǎng)基I中2，4-D的濃度為0.5mg/L；所述預分化培養(yǎng)基II中2，4-D的濃度為0.3mg/L。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述預分化培養(yǎng)為先將愈傷組織置于所述預分化培養(yǎng)基I中培養(yǎng)10-15天，再在所述預分化培養(yǎng)基II培養(yǎng)10-15天。全文摘要本發(fā)明公開了一種提高羊草愈傷組織分化率的方法及其專用培養(yǎng)基。提高羊草愈傷組織分化率的培養(yǎng)基是添加0.3－2.5mg/L6－BA和0.3－2.5mg/LKT，并用30－90g/L麥芽糖替代蔗糖的N6固體培養(yǎng)基。提高羊草愈傷組織分化率的方法，是將愈傷組織置于預分化培養(yǎng)基中進行預分化培養(yǎng)20－30天，然后接種在該提高羊草愈傷組織分化率的培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，直到分化出芽；所述預分化培養(yǎng)基是添加0.05－1mg/L2，4－D的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明的特點是方法簡單易行，無需復雜操作，即可有效提高羊草愈傷組織的分化率，有助于提高羊草的遺傳轉(zhuǎn)化率，具有重要的實際意義。文檔編號C12N5/04GK1843098SQ20061007840公開日2006年10月11日申請日期2006年5月24日優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日發(fā)明者劉公社,李曉峰,蘇蔓,齊冬梅申請人:中國科學院植物研究所