專利名稱：利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，屬微生物發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵是幾乎所有活細(xì)胞所必需的營養(yǎng)元素，在許多生物學(xué)過程中起著重要作用。Fe3+Fe2+的相互轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生氧化還原電勢，是某些關(guān)鍵代謝酶類活性所必需的金屬元素。雖然鐵是地殼中含量第二位的金屬元素，但是大部分不能直接被生物利用。在中性pH下，環(huán)境中可供生物體利用的水化鐵離子Fe3+的濃度不超過10-18molL[J.Biological Chem.270，4526723-26726，1995]。鐵載體(siderophore)是微生物為適應(yīng)低鐵條件下的生理代謝，而產(chǎn)生的一類低分子量(＜1KDa)鐵離子螯合劑[Annu.Rev.Microbiol.48743-772，1994]。它們對鐵離子(Fe3+)具有特異性的高親和力，能從低鐵環(huán)境中攝取鐵，轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，供微生物生理代謝所需。
鐵載體在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、造紙印染工業(yè)、化肥工業(yè)等方面都有著廣泛的用途。在農(nóng)業(yè)方面，鐵載體能富集鐵元素，提高土壤難溶鐵的溶解性和可利用率，從而促進(jìn)植物生長，鐵載體還能通過螯合鐵，降低局部的游離鐵的濃度，從而抑制植物病原菌的繁殖。在醫(yī)學(xué)上，鐵載體被廣泛用于治療鐵離子沉積引起的血色病，治療β-地中海貧血癥等。在印染工業(yè)的退漿、煮練、漂白等工序中，鐵載體通過螯合水中鈣、鎂、鐵等金屬離子，消除織物黃斑現(xiàn)象，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
鐵載體應(yīng)用中存在的主要問題是目前應(yīng)用的鐵載體大多數(shù)是化學(xué)合成的鐵載體，其生物相容性差，由于難于降解，大量使用后易造成環(huán)境污染。用生物技術(shù)合成鐵載體能夠很好地克服這些缺陷，生物鐵載體主要有三種化學(xué)類型兒茶酚鹽型、氧肟酸鹽型和多羥基羧酸鹽類，此外還有一些不常見的結(jié)構(gòu)。鐵載體可與Fe3+結(jié)合形成六齒型結(jié)構(gòu)。在細(xì)菌中兒茶酚鹽型和氧肟酸鹽型兩種鐵載體都有，而大多數(shù)真菌只有氧肟酸鹽型鐵載體。
目前國內(nèi)外有許多微生物合成鐵載體的報道[Annu.Rev.Microbiol.48743-772，1994； Infect.Immun.593997-4000，1991；Clin.Microbio.Rev.Vol.12，No.3，394-404，1999；微生物學(xué)報，2000年1期]，但是利用微生物進(jìn)行鐵載體的大量合成仍存在一定困難。這是由于微生物的大量生長需要足夠的鐵，而鐵載體的合成卻需要低鐵條件的誘導(dǎo)，鐵對鐵載體合成的反饋抑制限制著生物鐵載體的大量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，該方法可大量合成高效鐵載體。
本發(fā)明所述的利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，由下述步驟組成(1)菌種選擇選用黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275，黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC 10864，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 20611，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 1067之一；(2)孢子懸液的制備將上述黑曲霉接種于麩皮汁固體培養(yǎng)基斜面上，于25℃-30℃溫箱培養(yǎng)4-5天，待長出大量孢子后，用生理鹽水洗下孢子并收集，將孢子濾液用生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)孢子濃度為107-108個/mL，置于無菌試管中，4℃保存?zhèn)溆?；其中所述麩皮汁固體培養(yǎng)基配制方法是麩皮汁加2％瓊脂，121℃滅菌20min，備用；麩皮汁配制方法是稱取100g麩皮加蒸餾水，煮沸半小時，紗布過濾，用蒸餾水稀釋至1L；(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)將上述黑曲霉孢子懸液以體積百分比為1％-2％的接種量，接種于麩皮汁液體培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃-30℃，170-200rpm振蕩培養(yǎng)，6-8天后，用四層紗布過濾培養(yǎng)物，收集發(fā)酵液，棄去菌體，所獲得的發(fā)酵液含高活性的鐵載體；其中所述麩皮汁液體培養(yǎng)基配制方法是麩皮汁用自來水稀釋5倍，121℃滅菌20min，備用；所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基配制方法是馬鈴薯去皮，稱取200g，切成小塊，加入蒸餾水，煮沸半小時，紗布過濾，濾液中加入20g葡萄糖，用蒸餾水稀釋至1L，121℃滅菌20min，備用；(4)發(fā)酵液粗提將上述發(fā)酵液用截流分子量為1KDa的超濾膜進(jìn)行超濾，然后超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干后得到的干粉即為粗提的鐵載體粗品；鐵載體粗品非常穩(wěn)定，可長期保存；(5)鐵載體精制將上述鐵載體干粉粗品用其體積量5-7倍的水稀釋后，加入飽和醋酸鉛溶液進(jìn)行沉淀，至不再產(chǎn)生沉淀為止；然后過濾收集沉淀，再用飽和醋酸鉛溶液洗滌沉淀；過濾收集沉淀，用超純水懸浮沉淀；通入現(xiàn)制備的硫化氫，硫化氫與溶液中的鉛形成硫化鉛沉淀，過濾除去硫化鉛沉淀，得除去鉛的濾液；濾液用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，同時除去濾液中溶解的硫化氫；之后，濃縮液上CM-Sepharose fast flow陽離子交換層析柱，收集含活性組分的透過峰；活性組分再濃縮后上DEAE-Sepharose fastflow陰離子交換層析柱，用鹽洗脫，收集活性組分分離峰；活性組分經(jīng)真空冷凍干燥濃縮后，獲得精制的鐵載體干粉樣品。
上述利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法中步驟(2)或(3)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選是28℃。
上述利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法中步驟(3)所述振蕩條件優(yōu)選是180-190rpm。
上述利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法中步驟(3)所述培養(yǎng)時間優(yōu)選是7-8天。
鐵載體活力測定和計算方法CAS(chrome azurol sulfonate assay)[Methods Enzymol.235329-344]因它的普遍適用性、高靈敏性以及方便性而得到廣泛應(yīng)用。CAS分析法是一種高靈敏度的化學(xué)方法，這種方法不依賴于鐵載體的結(jié)構(gòu)而是基于鐵載體對Fe3+的親和性。
取上含鐵載體的溶液1.5mL加入1.5mL CAS檢測液混勻，室溫靜置1小時以上，用723分光光度計測定630nm波長下的光吸收OD630，以水作為陰性對照。鐵載體表達(dá)量計算公式如下 其中Ar為630nm下以水作空白對照測得的光吸收值，As為樣品測得的光吸收值。
當(dāng)環(huán)境中鐵(不溶性的Fe3+)的濃度達(dá)到10-20μmol/L時，微生物分泌鐵載體的能力幾乎被完全抑制，因此篩選對鐵有一定耐受性的鐵載體產(chǎn)生微生物是大量生產(chǎn)鐵載體的關(guān)鍵。本發(fā)明在大量菌種篩選工作的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)黑曲霉(Aspergillus niger)，特別是黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 10864，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 20611，黑曲霉(Aspergillus niger) CGMCC 1067是良好的鐵載體高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)生的鐵載體活性明顯超過其他鐵載體產(chǎn)生菌，而且鐵載體的合成幾乎不受鐵的反饋抑制。鐵載體分泌試驗證實，所述菌株鐵載體的分泌受環(huán)境中鐵濃度的影響小，在鐵濃度達(dá)到500μmol/L時，仍然能進(jìn)行鐵載體的大量合成和分泌。這表明所述菌鐵載體的合成機(jī)制不同于其它菌株，它不是低鐵誘導(dǎo)表達(dá)的，很可能是組成型表達(dá)，低鐵僅僅刺激了菌體鐵載體合成量的增加。所述菌株對培養(yǎng)條件要求粗放，因此可用天然原料進(jìn)行大規(guī)模生物培養(yǎng)制備鐵載體。
有機(jī)溶劑萃取實驗結(jié)果表明，黑曲霉產(chǎn)生的鐵載體極性很強(qiáng)，不溶于極性低的溶劑，如三氯甲烷和苯甲醇，可以部分溶解于甲醇和丙酮。是一類不同于兒茶酚鹽和氧肟酸鹽類的新型鐵載體。它極易溶于水，其水溶液的pH值約為3.5-4.5，分子量小于1KDa。黑曲霉鐵載體具有極強(qiáng)的鐵螯合能力，而且能將不溶性的Fe3+轉(zhuǎn)化成可溶性的Fe2+，利于生物的吸收和利用。黑曲霉鐵載體還具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，鐵載體在水溶液100℃煮沸30分鐘，CAS法檢測鐵載體活性不降低。該方法生物合成的鐵載體在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、印染等方面有著潛在的應(yīng)用價值。
本發(fā)明所述利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法的優(yōu)點是提供的黑曲霉菌株生長旺盛，抗污染能力強(qiáng)，并可產(chǎn)生大量孢子，有利于接種和培養(yǎng)。
培養(yǎng)方法簡單，培養(yǎng)基原料廉價、易于制備。采用液體培養(yǎng)技術(shù)，利于放大和實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
合成的鐵載體活性高，性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用價值。
具體實施例方式
實施例1將黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275接種于麩皮汁固體培養(yǎng)基斜面上，于28℃溫箱培養(yǎng)5天，待長出大量孢子后，用適量生理鹽水洗下孢子并收集，將孢子濾液用適量的生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)孢子濃度為107-108個/mL，置于無菌試管中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 其中所述麩皮汁固體培養(yǎng)基配制方法是麩皮汁加2％瓊脂，121℃滅菌20min，備用；麩皮汁配制方法是稱取100g麩皮加蒸餾水，煮沸半小時，紗布過濾，用蒸餾水稀釋至1L；菌株接種于含麩皮汁液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量為2％(v/v)，28℃，170rpm振蕩培養(yǎng)6天，鐵載體活性可達(dá)95-100％，收集培養(yǎng)液。
其中所述麩皮汁液體培養(yǎng)基的配制方法是麩皮汁用自來水稀釋5倍，121℃滅菌20min，備用；發(fā)酵液過濾，棄去菌體。用截流分子量1KDa的超濾膜超濾，收集濾出液。真空冷凍干燥，干粉粗品用水適量稀釋后，先加入飽和醋酸鉛溶液進(jìn)行沉淀，至不再產(chǎn)生沉淀為止，過濾得沉淀，用飽和醋酸鉛溶液洗滌并收集沉淀。用適量超純水懸浮沉淀，通入現(xiàn)制備的硫化氫，硫化氫與溶液中的鉛形成硫化鉛沉淀，過濾除去硫化鉛沉淀，得除去鉛的濾液。濾液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行適當(dāng)濃縮，同時可以除去濾液中溶解的硫化氫。濃縮液上CM-Sepharose fast flow陽離子交換層析柱，收集含活性組分的透過峰；活性組分再濃縮后上DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析柱，用鹽洗脫，收集活性組分分離峰；活性組分經(jīng)真空冷凍干燥濃縮后，獲得精制的鐵載體干粉樣品。
實施例2將黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 10864接種于麩皮汁固體培養(yǎng)基斜面上，于28℃溫箱培養(yǎng)5天，待長出大量孢子后用用適量生理鹽水洗下孢子并收集，將孢子濾液用適量的生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)孢子濃度為107-108個/mL，置于無菌試管中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 菌株接種于含馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液的三角瓶中，接種量為1％(v/v)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)7天，鐵載體活性90-95％，收集培養(yǎng)液。
發(fā)酵液過濾，棄去菌體。用截流分子量1KDa的超濾膜超濾，收集濾出液。將超濾液真空冷凍干燥，凍干后鐵載體粗品干粉可長期儲存。
實施例3將黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 1067接種于麩皮汁固體培養(yǎng)基斜面上，于28℃溫箱培養(yǎng)4天，待長出大量孢子后，用生理鹽水洗下孢子并收集，將孢子濾液用生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)孢子濃度為107-108個/mL，置于無菌試管中，4℃保存?zhèn)溆?；其中所述麩皮汁固體培養(yǎng)基配制方法是麩皮汁加2％瓊脂，121℃滅菌20min，備用；麩皮汁配制方法是稱取100g麩皮加蒸餾水，煮沸半小時，紗布過濾，用蒸餾水稀釋至1L；將上述黑曲霉孢子懸液以體積百分比為2％的接種量，接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)，8天后，用四層紗布過濾培養(yǎng)物，收集發(fā)酵液，棄去菌體，所獲得的發(fā)酵液含高活性的鐵載體；其中所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基配制方法是馬鈴薯去皮，稱取200g，切成小塊，加入蒸餾水，煮沸半小時，紗布過濾，濾液中加入20g葡萄糖，用蒸餾水稀釋至1L，121℃滅菌20min，備用；將上述發(fā)酵液濾用截流分子量為1KDa的超濾膜進(jìn)行超濾，然后超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干后得到的干粉即為粗提的鐵載體粗品；鐵載體粗品非常穩(wěn)定，可長期保存；將上述鐵載體干粉粗品用其重量5倍的水稀釋后，加入飽和醋酸鉛溶液進(jìn)行沉淀，至不再產(chǎn)生沉淀為止；然后過濾收集沉淀，并用飽和醋酸鉛溶液洗滌沉淀；用超純水懸浮沉淀，通入現(xiàn)制備的硫化氫，硫化氫與溶液中的鉛形成硫化鉛沉淀，過濾除去硫化鉛沉淀，得除去鉛的濾液；濾液用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，同時除去濾液中溶解的硫化氫。濃縮液上CM-Sepharose fast flow陽離子交換層析柱，收集含活性組分的透過峰；活性組分再濃縮后上DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析柱，用鹽洗脫，收集活性組分分離峰；活性組分經(jīng)真空冷凍干燥濃縮后，獲得精制的鐵載體干粉樣品。
權(quán)利要求
1.一種利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，由下述步驟組成(1)菌種選擇選用黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 6275，黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC 10864，黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC 20611，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC 1067之一；(2)孢子懸液的制備將上述黑曲霉接種于麩皮汁固體培養(yǎng)基斜面上，于25℃-30℃溫箱培養(yǎng)4-5天，待長出大量孢子后，用生理鹽水洗下孢子并收集，將孢子濾液用生理鹽水稀釋，調(diào)節(jié)孢子濃度為107-108個/mL，置于無菌試管中，4℃保存?zhèn)溆?；其中所述麩皮汁固體培養(yǎng)基配制方法是麩皮汁加2％瓊脂，121℃滅菌20min，備用；麩皮汁配制方法是稱取100g麩皮加蒸餾水，煮沸半小時，紗布過濾，用蒸餾水稀釋至1L；(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)將上述黑曲霉孢子懸液以體積百分比為1％-2％的接種量，接種于麩皮汁液體培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃-30℃，170-200rpm振蕩培養(yǎng)，6-8天后，用四層紗布過濾培養(yǎng)物，收集發(fā)酵液，棄去菌體，所獲得的發(fā)酵液含高活性的鐵載體；其中所述麩皮汁液體培養(yǎng)基配制方法是麩皮汁用自來水稀釋5倍，121℃滅菌20min，備用；所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基配制方法是馬鈴薯去皮，稱取200g，切成小塊，加入蒸餾水，煮沸半小時，紗布過濾，濾液中加入20g葡萄糖，用蒸餾水稀釋至1L，121℃滅菌20min，備用；(4)發(fā)酵液粗提將上述發(fā)酵液濾用截流分子量為1KDa的超濾膜進(jìn)行超濾，然后超濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干后得到的干粉即為粗提的鐵載體粗品；鐵載體粗品非常穩(wěn)定，可長期保存；(5)鐵載體精制將上述鐵載體干粉粗品用其體積量5-7倍的水稀釋后，加入飽和醋酸鉛溶液進(jìn)行沉淀，至不再產(chǎn)生沉淀為止；然后過濾收集沉淀，并用飽和醋酸鉛溶液洗滌沉淀；用超純水懸浮沉淀，通入現(xiàn)制備的硫化氫，硫化氫與溶液中的鉛形成硫化鉛沉淀，過濾除去硫化鉛沉淀，得除去鉛的濾液；濾液用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，同時除去濾液中溶解的硫化氫；之后，濃縮液上CM-Sepharose fast flow陽離子交換層析柱，收集含活性組分的透過峰；活性組分再濃縮后上DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析柱，用鹽洗脫，收集活性組分分離峰；活性組分經(jīng)真空冷凍干燥濃縮后，獲得精制的鐵載體干粉樣品。
2.如權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，其特征是步驟(2)或(3)所述培養(yǎng)溫度是28℃。
3.如權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，其特征是步驟(3)所述振蕩條件是180-190rpm。
4.如權(quán)利要求1所述的利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，其特征是步驟(3)所述培養(yǎng)時間是7-8天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用黑曲霉制備高效生物鐵載體的方法，由(1)菌種選擇，(2)孢子懸液的制備，(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)，(4)發(fā)酵液粗提，(5)鐵載體精制等步驟組成。本發(fā)明所述方法簡單，培養(yǎng)基原料廉價、易于制備，并且采用液體培養(yǎng)技術(shù)，利于放大和實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，合成的鐵載體活性高，性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用價值。
文檔編號C12R1/685GK1970731SQ200610070568
公開日2007年5月30日 申請日期2006年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月4日
發(fā)明者盧雪梅, 孫紅啟, 張為燦, 趙越, 高培基 申請人:山東大學(xué)