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新型體外生物人工肝的生物反應(yīng)器的制備方法

文檔序號:590036閱讀:220來源:國知局
專利名稱:新型體外生物人工肝的生物反應(yīng)器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種生物人工肝,特別涉及生物人工肝中生物反應(yīng)器的制備方法。
背景技術(shù)
人工肝的肝支持技術(shù)包括機械人工肝和生物人工肝。機械人工肝利用血液透析、濾過、吸附等機械原理清除血液中的毒性成份,以替代肝的部分解毒功能。但肝臟除了解毒功能外,還有合成蛋白及其他生物活性物質(zhì),以及調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝的作用等,而這些功能機械人工肝是無法做到的。生物人工肝利用具有部分或全部肝細(xì)胞活性的生物活性細(xì)胞制備成生物反應(yīng)器,當(dāng)血液或其部分成份(如血漿)通過體外循環(huán)裝置流經(jīng)該生物反應(yīng)器時,生物活性細(xì)胞一方面對血液中的毒性物質(zhì)進(jìn)行吸收、轉(zhuǎn)化,另一方面合成多種生物活性物質(zhì)并釋放進(jìn)入血液中,以達(dá)到清除血液中的毒性成份的作用。以機械人工肝和生物人工肝聯(lián)合而成的新型組合型(或稱混合型、雜合型)生物人工肝,可以較全面地支持肝臟功能,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。因而成為人工肝治療的主流方法。
生物人工肝中的核心部分是生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器一般由生物活性細(xì)胞和提供生物活性細(xì)胞生長及代謝微環(huán)境的支持系統(tǒng)構(gòu)成。
目前生物反應(yīng)器所使用的生物活性細(xì)胞有兩大類,一類是正常肝細(xì)胞,一般通過部分或全部正常肝臟通過膠原酶消化分離得到,一般取自豬、狗、狒狒等動物,少部分來自因外傷切除的部分人肝組織、因故不能移植的供體肝臟等;一類是變異的肝臟細(xì)胞,包括低度惡性的肝癌細(xì)胞株、永生化肝細(xì)胞株,這些細(xì)胞株具有部分或全部的肝細(xì)胞功能,同時又可在體外環(huán)境下培養(yǎng)擴增,目前國內(nèi)外已有多株該類細(xì)胞,但其保留的肝臟功能均較弱,且不全面。支持系統(tǒng)種類較多,但大多因過于復(fù)雜而未能普及,目前最為常用的且已應(yīng)用于臨床的是利用中空纖維濾器。
中空纖維濾器由數(shù)百上千根中空纖維集束在一柱狀容器中,中空部分在容器兩端均合并為共同開口,而容器外腔亦在兩端近端口處各有一開口,中空纖維壁分布有大量大小均勻的微孔,中小分子物質(zhì)可以自由通過微孔進(jìn)行物質(zhì)交換。
在本發(fā)明之前,臨床及實驗中常使用的生物反應(yīng)器制備過程是首先制備生物活性細(xì)胞,或采用肝臟分離,或采用細(xì)胞株體外擴增至最終需要量(一般需在109-1010數(shù)量級);然后將制備成功的細(xì)胞直接或與明膠混合后加入至中空纖維濾器外腔中,使細(xì)胞固定在外腔中,生物反應(yīng)器即制備成功。
但是,由于這種生物反應(yīng)器中的生物反應(yīng)細(xì)胞種類均限于同種或異種的肝細(xì)胞或變異肝細(xì)胞,上述來源細(xì)胞均存在難以克服的限制,如同種肝組織細(xì)胞(即人肝細(xì)胞)來源極其缺乏;異種肝細(xì)胞(如豬、狗、狒狒等)具有很強的免疫原性,會產(chǎn)生強烈排斥反應(yīng),且分泌的生物活性成分在人體內(nèi)活性低,而且可能存在動物源性感染;肝癌細(xì)胞及永生化肝細(xì)胞因均存在致瘤性,生物安全性難以充分保證,且所獲得的細(xì)胞株生物活性較低,難以令人滿意。
上世紀(jì)末干細(xì)胞研究的興起,為生物人工肝中的生物活性細(xì)胞來源提供了新的途徑。干細(xì)胞是一類具有無限增殖能力及多向分化能力的細(xì)胞,其一方面可以在特定條件下無限制快速增殖,在一定條件下又可分化為功能細(xì)胞如肝細(xì)胞。該性能已被國內(nèi)外多個實驗室包括本實驗室所證實。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用干細(xì)胞通過擴增、誘導(dǎo)構(gòu)建生物人工肝細(xì)胞中生物反應(yīng)器的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是新型體外生物人工肝的生物反應(yīng)器的制備方法,其步驟是(1)取干細(xì)胞,在培養(yǎng)瓶中以擴增型培養(yǎng)液培養(yǎng)擴增至1×107數(shù)量級;(2)將擴增后的干細(xì)胞消化、離心濃集后加入擴增型培養(yǎng)液中混懸均勻;(3)將混懸均勻后的干細(xì)胞加入中空纖維濾器中,并加入擴增型培養(yǎng)液,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),使干細(xì)胞繼續(xù)擴增;(4)擴增一定時間后,更換培養(yǎng)液為誘導(dǎo)型培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng);(5)以誘導(dǎo)型培養(yǎng)液培養(yǎng)一定時間后的干細(xì)胞成為具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。
本發(fā)明的優(yōu)點在于
1.利用干細(xì)胞可以無限擴增的特點,使其在僅需少量種子細(xì)胞的前提下,經(jīng)過適當(dāng)?shù)臄U增和誘導(dǎo),可以得到足夠量的具有肝細(xì)胞功能的生物活性細(xì)胞。種子細(xì)胞可以通過穿刺獲得,或利用儲存在細(xì)胞庫中的細(xì)胞,獲取方便,避免了常規(guī)采用肝臟細(xì)胞時每次均需切取動物肝臟、消化、培養(yǎng)等復(fù)雜程序;2.利用中空纖維濾器在有限空間具有極大表面積的特性,將一定量的干細(xì)胞接種于中空纖維濾器內(nèi),使其在中空纖維表面生長擴增,可以達(dá)到足夠多的細(xì)胞量,以滿足生物人工肝對細(xì)胞量的需要,也避免了使用平面培養(yǎng)方法需要大量培養(yǎng)瓶或大面積專用平板的要求,同時也節(jié)約了成本;3.利用中空纖維濾器可以直接連接于血液透析、血液濾過、血漿置換、分子吸附再循環(huán)系統(tǒng)(MARS)等的特點,制成的生物反應(yīng)器可直接串聯(lián)于上述治療的體外循環(huán)通路中,成為組合型生物人工肝,使用方便;4.種子細(xì)胞利用同種細(xì)胞(即人干細(xì)胞)甚至可以是患者本人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,免疫源性極低或完全免疫相容,排斥反應(yīng)小,細(xì)胞保持活性時間長,保證治療持續(xù)進(jìn)行,有利于提高治療效果。
具體實施例方式
1.獲取種子細(xì)胞可根據(jù)具體條件和要求采用(1)復(fù)蘇細(xì)胞庫中干細(xì)胞;或者(2)通過穿刺患者本人、親屬、志愿捐贈者等獲取少量(5-10mL)骨髓,經(jīng)梯度離心分離獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;或者(3)通過從廢棄的胎盤血或臍帶血中分離獲取臍血干細(xì)胞。
2.初步培養(yǎng)擴增將獲取的干細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,加入專用擴增型培養(yǎng)液,使其擴增至基本長滿瓶底時,予以消化后傳代、分瓶、繼續(xù)培養(yǎng),直至細(xì)胞總量達(dá)到1×107數(shù)量級。
3.中空纖維濾器以纖維連接蛋白溶液預(yù)處理,以利于細(xì)胞附著生長;將上述多瓶細(xì)胞全部消化,離心濃集后加入專用擴增型培養(yǎng)液中,混勻后加入中空纖維濾器。
4.繼續(xù)將中空纖維濾器放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),并間斷更換上述培養(yǎng)液,使細(xì)胞進(jìn)一步擴增6-8個細(xì)胞周期,此過程約需2周左右。
5.更換培養(yǎng)液為專用誘導(dǎo)型培養(yǎng)液,促使細(xì)胞向肝細(xì)胞方向分化,此過程早期細(xì)胞即干細(xì)胞自身在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中仍存在擴增能力,從而仍會繼續(xù)擴增3-4個細(xì)胞周期;約3-4周后,細(xì)胞即可大部分轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞,具有肝細(xì)胞的合成和代謝功能;該中空纖維濾器即已成功制備為生物反應(yīng)器。
本發(fā)明請求保護(hù)的范圍并不僅僅局限于本具體實施方式
的描述。
權(quán)利要求
1.新型體外生物人工肝的生物反應(yīng)器的制備方法,其步驟是(1)取干細(xì)胞,在培養(yǎng)瓶中以擴增型培養(yǎng)液培養(yǎng)擴增至1×107數(shù)量級;(2)將擴增后的干細(xì)胞消化、離心濃集后加入擴增型培養(yǎng)液中混懸均勻;(3)將混懸均勻后的干細(xì)胞加入中空纖維濾器中,并加入擴增型培養(yǎng)液,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),使干細(xì)胞繼續(xù)擴增;(4)擴增一定時間后,更換培養(yǎng)液為誘導(dǎo)型培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng);(5)以誘導(dǎo)型培養(yǎng)液培養(yǎng)一定時間后的干細(xì)胞成為具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型體外生物人工肝的生物反應(yīng)器的制備方法,其特征在于步驟(4)中擴增時間為6~8個細(xì)胞周期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型體外生物人工肝的生物反應(yīng)器的制備方法,其特征在于步驟(5)中干細(xì)胞在誘導(dǎo)型培養(yǎng)液中培養(yǎng)時間為3~4周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型體外生物人工肝的生物反應(yīng)器的制備方法,其特征在于步驟(3)中將混懸均勻后的干細(xì)胞加入中空纖維濾器的外腔或內(nèi)腔后繼續(xù)擴增培養(yǎng)并誘導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物人工肝中生物反應(yīng)器制備方法。本發(fā)明采用將干細(xì)胞培養(yǎng)擴增至1×10
文檔編號C12N5/08GK1850967SQ200610038920
公開日2006年10月25日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者丁義濤, 朱章華, 潘一明 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院
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