專利名稱：一種紅樹林真菌的胞外多糖制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紅樹林真菌發(fā)酵液中胞外多糖及其制備方法，以及該多糖在抗氧化活性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微皮傘屬分類地位為擔子菌門，傘菌目、口蘑科。該屬多種真菌為經(jīng)濟真菌。早在60年代就從該屬真菌中分離到抗生素小皮傘菌素。微皮傘(Marasmiellus sp.)2003-GXK-04#從廣西紅樹林中篩選出。紅樹林是分布在熱帶和亞熱帶海岸潮間帶的生物群落，具有豐富生物多樣性和物種多樣性，其中紅樹林區(qū)真菌是生長在紅樹植物組織中一類重要的生物群落。由于紅樹林真菌存在的特殊的海洋生態(tài)環(huán)境，其代謝產(chǎn)物具有其獨有的特性。雖然我國紅樹林真菌資源豐富、種類繁多，約有1.5×106種，但目前對于紅樹林真菌的應(yīng)用研究較少。因而研究紅樹林真菌次級代謝產(chǎn)物多糖，開發(fā)紅樹林真菌的用途具有重要經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化活性的紅樹林真菌胞外多糖和制備方法，以及該多糖在抗氧化活性方面的應(yīng)用。
本發(fā)明所制備的紅樹林真菌次級代謝產(chǎn)物多糖，是利用從采自廣西紅樹林中篩選出的紅樹林真菌微皮傘(Marasmiellus sp.)2003-GXK-04#，在玉米粉培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，取發(fā)酵液為原料，經(jīng)乙醇沉、三氯乙酸法除蛋白、透析、洗滌干燥的提取步驟而得到的提取物，為淺黃色的多糖。所述的紅樹林真菌微皮傘屬(Marasmiellus)2003-GXK-04#已保藏中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為CCTCC M 205144，保存日期2005年12月19日，該菌種簡稱為GXK-04#。
所述的紅樹林真菌胞外多糖的制備方法，采用下述的具體提取步驟(1)以含30-80％人工海水的玉米粉培養(yǎng)基對紅樹林真菌微皮傘2003-GXK-04#CCTCCNOM205144進行發(fā)酵，將發(fā)酵后的菌絲體過濾，離心留上清液，用氫氧化鈉將pH調(diào)至7-8，真空濃縮至原來體積四分之一，加熱至80-95℃，離心去掉沉淀；(2)加入3倍乙醇，攪拌后4℃靜置24h，4000r/mim離心得底部沉淀；(3)沉淀溶于去離子水，加入10％的三氯乙酸，攪拌后放置20min，離心得上清液，加NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，繼續(xù)醇沉；(4)上述產(chǎn)物溶于蒸餾水透析2天，醇沉，依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再真空干燥，即得淺黃色多糖。
所述的人工海水可采用以下配方
NaCl 23.476g，MgCl24.981g，Na2SO43.917g，CaCl21.102g，KCl 0.664g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，按上述配方加水至總重量為1000g即為人工海水(該人工海水的組成是按Lymam與Fleming的配方，1940)經(jīng)上制得的紅樹林真菌胞外多糖進行體外清除自由基及小鼠體內(nèi)抗氧化試驗，證明該多糖具有抗氧化活性，可作為抗氧化劑的應(yīng)用。
具體試驗過程和結(jié)果如下1.體外清除自由基抗氧化實驗(1)采用結(jié)晶紫作顯色劑分光光度法測定多糖對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基的清除作用；(2)采用鄰苯三酚法自氧化法測定多糖對超氧陰離子的清除作用；(3)胞外多糖對小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化作用的測定2.小鼠體內(nèi)抗氧化試驗(1)試驗動物雌雄性小鼠各半，體重18～20g。由廣東醫(yī)學實驗動物中心提供。
(2)小鼠分組及給藥接種后24h分成4組，每組12只。對照組給等量生理鹽水；多糖組按60mg/kg·b·w、120mg/kg·b·w、180mg/kg·b·w的藥物量溶于0.5％羧甲基纖維素鈉與生理鹽水混勻；每組均設(shè)平行組，采用灌胃方式給藥，嚴格消毒，一日一次。連續(xù)10天。末次給藥后24h后脫頸致死，稱體重。取心、肝、脾稱各臟器重量，以等滲生理鹽水制備10％組織勻漿，并測定心、肝和脾臟中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力及丙二醛(MDA)的水平。
(3)實驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理自由采食、自由飲水，自然光照，定期更換墊料。
(4)數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計軟件SPSS11.0進行統(tǒng)計分析，Bonferroni或TambaneT 2檢驗。
3.結(jié)果(1)GXK-04#真菌胞外多糖有顯著的抗氧化活性。對超氧陰離子自由基、羥自由基均有清除作用，其IC50分別為0.267mg/ml和0.075mg/ml，并對脂質(zhì)過氧化由保護作用，其IC50為0.503mg/ml(表1)。
(2)小鼠體內(nèi)抗氧化試驗結(jié)果表明與對照組相比，GXK-04#真菌胞外多糖的劑量為120mg/kg·b·w和180mg/kg·b·w時，能顯著提高各器官內(nèi)SOD和GSH-PX的活力(P＜0.01)，降級肝臟和血清MDA水平(P＜0.01)，見表2。與對照組相比，當劑量為120mg/kg·b·w時，多糖對小鼠心、肝臟及脾臟中SOD活力分別提高了40％、145％和124％；對GSH-PX活力分別提高了14.7％、40.7％和52.3％。對三種器臟中MDA含量分別降低了39.1％、38.2％和31.9。因此GXK-04#真菌胞外多糖具有顯著的抗氧化作用。
表1GXK-04#真菌胞外多糖體外抗氧化活性

表2GXK-04#真菌胞外多糖對心、肝和脾臟SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影響

*P＜0.01(vs對照組)具體實施方式
紅樹林真菌胞外多糖制備方法如下步驟一、以含50％人工海水的玉米粉培養(yǎng)基對GXK-04#真菌進行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉2％，蛋白胨0.15％，葡萄糖2.5％，人工海水50％，pH6.7，搖瓶發(fā)酵，裝量100ml/500ml三角瓶，接種量5％，溫度25-30℃，培養(yǎng)時間6-7天，搖床轉(zhuǎn)速為140rpm。取發(fā)酵后的發(fā)酵液為原料，離心得上清液；步驟二、用氫氧化鈉將上清液pH調(diào)至7.5，濃縮至四分之一。90℃加熱3h，離心留上清液，加入3倍乙醇，攪拌后4℃靜置24h，4000r/mim離心得底部沉淀；步驟三、沉淀溶于去離子水，加入10％的三氯乙酸，攪拌后放置20min，離心得上清液，加NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，繼續(xù)醇沉；步驟五、上述產(chǎn)物溶于蒸餾水透析2天，醇沉，依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再真空干燥，即得淺黃色多糖。
所述的人工海水采用Lymam與Fleming在1940年所公開的下述人工海水配方NaCl 23.476g，MgCl24.981g，Na2SO43.917g，CaCl21.102g，KCl 0.664g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，按上述配方加水至總重量為1000g即為人工海水。
權(quán)利要求
1.一種紅樹林真菌的胞外多糖，其特征在于該多糖是以玉米粉培養(yǎng)基對紅樹林真菌微皮傘屬2003-GXK-04#CCTCC NOM205144進行發(fā)酵，取發(fā)酵液為原料，經(jīng)乙醇沉、三氯乙酸法除蛋白、透析、洗滌干燥的提取步驟而得到的提取物，為淺黃色的多糖。
2.權(quán)利要求1所述的紅樹林真菌的胞外多糖的制備方法，其特征在于采用下述提取步驟(1)以含30-80％人工海水的玉米粉培養(yǎng)基對紅樹林真菌微皮傘2003-GXK-04#CCTCCNOM205144進行發(fā)酵，將發(fā)酵后的菌絲體過濾，離心留上清液，用氫氧化鈉將pH調(diào)至7-8，真空濃縮至原來體積四分之一，加熱至80-95℃，離心去掉沉淀；(2)加入3倍乙醇，攪拌后4℃靜置24h，4000r/mim離心得底部沉淀；(3)沉淀溶于去離子水，加入10％的三氯乙酸，攪拌后放置20min，離心得上清液，加NaOH調(diào)節(jié)pH至中性，繼續(xù)醇沉；(4)上述產(chǎn)物溶于蒸餾水透析2天，醇沉，依次以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，再真空干燥，即得淺黃色多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紅樹林真菌的胞外多糖的制備方法，其特征在于所述的人工海水的配方為NaCl 23.476g，MgCl24.981g，Na2SO43.917g，CaCl21.102g，KCl 0.664g，NaHCO30.192g，KBr 0.096g，H3BO30.026g，SrCl20.024g，NaF 0.003g，按上述配方加水至總重量為1000g即為人工海水。
4.權(quán)利要求1所述的紅樹林真菌的胞外多糖的用途，其特征在于作為抗氧化劑的應(yīng)用。
全文摘要
一種紅樹林真菌的胞外多糖制備方法及其用途，多糖該是以玉米粉培養(yǎng)基對紅樹林真菌微皮傘(Marasmiellus sp.)2003－GXK－04# CCTCC NOM205144進行發(fā)酵，取發(fā)酵液為原料，經(jīng)乙醇沉、三氯乙酸法除蛋白、透析、洗滌干燥的提取步驟而得到的提取物，為淺黃色的多糖。制得的紅樹林真菌胞外多糖進行體外清除自由基及小鼠體內(nèi)抗氧化試驗，證明該多糖具有抗氧化活性，可作為抗氧化劑的應(yīng)用。
文檔編號C12R1/645GK1876823SQ20061003501
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月17日
發(fā)明者孫翠慈, 王友紹, 楊志浩 申請人:中國科學院南海海洋研究所