專利名稱：在低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達(dá)的標(biāo)簽、基因片段及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達(dá)的標(biāo)簽、基因片段及其克隆方法。
背景技術(shù)：
植物對滲透脅迫的反應(yīng)是一個(gè)多基因控制的復(fù)雜過程。不同植物對滲透脅迫的反應(yīng)也不盡相同，具有豐富的多樣性。但是，對滲透脅迫的細(xì)胞水平的反應(yīng)則似乎在整個(gè)生物界都是保守的(Yancey等，1982)。已有相當(dāng)多的例子表明，從高等植物中獲得的一些基因，往往是間接利用了從動物、低等植物、甚至是酵母、細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的該類同源基因才分離出來的。實(shí)際上，這些同源基因也經(jīng)常被直接應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物遺傳改良中。
同樣的道理，鹽藻(Dunaliella viridis)就是一個(gè)具有這樣特性的真核單細(xì)胞綠藻(Cowan等，1992)。它的抗環(huán)境脅迫的能力異乎尋常，尤其是滲透脅迫，可以在從接近淡水(NaCl＜50mM)直到飽和鹽水(NaCl＞5M)的環(huán)境中生長。因此，鹽藻因其極強(qiáng)的耐受滲透脅迫和其它極端環(huán)境的能力被作為研究耐逆機(jī)制及其發(fā)掘抗逆基因的模式生物而倍受關(guān)注(Hans J.Bohnert等.2001)。
基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)技術(shù)(Velculescu，V.E.等，1995)是近年興起并應(yīng)用于細(xì)胞生殖、發(fā)育、分化、癌變等生命過程有關(guān)基因的差異表達(dá)以及相關(guān)基因的分子克隆的有效的方法之一(Desai S.等.2000)。
為了更好地從分子水平上對鹽藻進(jìn)行耐鹽機(jī)制的研究和發(fā)掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因資源，本領(lǐng)域迫切需要利用當(dāng)前的分子生物學(xué)技術(shù)(如基因表達(dá)系列分析技術(shù)、基因芯片及生物信息學(xué)等)開發(fā)在鹽脅迫過程中受到誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)的基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供低鹽和高鹽滲透脅迫相關(guān)的基因片段。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達(dá)的標(biāo)簽，其特征在于它包含4個(gè)在低鹽環(huán)境下高表達(dá)的標(biāo)簽和4個(gè)在高鹽條件下高表達(dá)的標(biāo)簽，該8個(gè)標(biāo)簽對應(yīng)的序列為序列表中的SEQ ID No1-8。
上述的低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達(dá)的標(biāo)簽克隆出的基因片斷，其特征在于上述的8個(gè)標(biāo)簽對應(yīng)的基因片斷的堿基序列為序列表中的SEQ ID No9-16。
上述的基因片斷，其特征在于SEQ ID NO9～12所代表的基因片段在低鹽滲透脅迫環(huán)境下呈現(xiàn)高水平表達(dá)，高鹽滲透環(huán)境下低水平表達(dá)，SEQ ID NO13～16所代表的基因片段在高鹽滲透脅迫條件下呈現(xiàn)高水平表達(dá)，低鹽滲透條件下低水平表達(dá)。
上述的基因片段的克隆方法，其特征在于，該方法的具體步驟為a.取在分別含有0.5M NaCl和3M Nacl的DM培養(yǎng)基中穩(wěn)定培養(yǎng)的鹽藻細(xì)胞提取總RNA，利用基因表達(dá)系列分析建立SAGE文庫，通過測序和生物信學(xué)分析分別得到受低鹽誘導(dǎo)表達(dá)和受高鹽誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)簽；b.根據(jù)步驟a所得的標(biāo)簽各設(shè)計(jì)一個(gè)引物，以cDNA文庫為模板，再配合文庫中載體上的引物M13(-20)Forward Primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的產(chǎn)物并克隆進(jìn)T-Easy載體，再使用通用引物M13Reverse Primer進(jìn)行測序，從而得到對應(yīng)標(biāo)簽的基因片段。
本發(fā)明使用SAGE技術(shù)由極端模式生物鹽藻(Dunaliella viridis)中得到8個(gè)與鹽脅迫相關(guān)的基因標(biāo)簽，通過PCR獲得對應(yīng)標(biāo)簽的基因片段，經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證這8個(gè)分別在低滲和高滲脅迫條件下表達(dá)水平呈現(xiàn)極大差異的基因片段SEQ ID NO9～16，確實(shí)與鹽脅迫相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究鹽藻耐鹽分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。


圖1是鹽藻在0.5M NaCl和3.0M NaCl脅迫環(huán)境下的總RNA。其中泳道1為0.5MNaCl，泳道2為3.0M NaCl。
圖2是處于0.5M NaCl和3M NaCl環(huán)境下鹽藻細(xì)胞內(nèi)4個(gè)與低鹽脅迫相關(guān)的基因表達(dá)情況。泳道1，3，5，7分別是4個(gè)受低鹽誘導(dǎo)基因在低鹽環(huán)境下的RT-PCR，泳道2，4，6，8分別是4個(gè)受低鹽誘導(dǎo)基因在高鹽環(huán)境下的RT-PCR。
圖3是處于0.5M NaCl和3M NaCl環(huán)境下鹽藻細(xì)胞4個(gè)與高鹽脅迫相關(guān)的基因表達(dá)情況。泳道1，3，5，7分別是4個(gè)受高鹽誘導(dǎo)基因在低鹽環(huán)境下的RT-PCR，泳道2，4，6，8分別是4個(gè)受高鹽誘導(dǎo)基因在高鹽環(huán)境下的RT-PCR。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從鹽藻(Dunaliella viridis)中，利用基因表達(dá)系列分析方法結(jié)合生物信息學(xué)方法從極端耐鹽的模式生物鹽藻中克隆到8個(gè)與鹽脅迫相關(guān)的基因標(biāo)簽。根據(jù)這8個(gè)標(biāo)簽克隆到對應(yīng)的基因片斷，通過RT-PCR對這8個(gè)基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件和Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)或植物分子生物學(xué)一實(shí)驗(yàn)手冊(Plant Molecular Biology-ALaboratory Manual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一1.與鹽脅迫相關(guān)的基因標(biāo)簽的分離為了分離鹽藻中與鹽脅迫相關(guān)的基因標(biāo)簽，在含有0.5mol/LNaCl和3mol/LNaCl的DM培養(yǎng)基(Sun Y.等，2005)中穩(wěn)定培養(yǎng)的鹽藻培養(yǎng)至107細(xì)胞/ml，5,000g，4℃離心10分鐘收集細(xì)胞，提取總RNA(Trizol kit，Invitrogen)，總RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分析和定量。以總RNA為模板，利用基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)建立SAGE文庫，采用通用引物M13Reverse Primer，雙脫氧法(DYEnamic ET-Terminator Cycle Sequencing)，DNA序列分析儀(MegaBACE 4500)對文庫進(jìn)行測序。所得到序列經(jīng)軟件SAGE2000v45等分析，分別得到4個(gè)在低鹽環(huán)境下高表達(dá)和4個(gè)在高鹽條件下高表達(dá)的標(biāo)簽。
2.與鹽脅迫相關(guān)的基因片斷的分離根據(jù)8個(gè)標(biāo)簽各設(shè)計(jì)一個(gè)引物，L SEQ ID NO1CATGCATCAAATGCACATACAL SEQ ID NO2AGTTTCACGCAGGAACCCATGL SEQ ID NO3AGCAGGCCTGTGGCTACATGL SEQ ID NO4GTTGTTTGTGCCTGCATCATH SEQ ID NO5CATGCTTAGGCGACCATTAGCH SEQ ID NO6CTGTTGATCTGCCTCAGCATGH SEQ ID NO7TTCTCACA GAAGAAGGCATGH SEQ ID NO8CATGAAATGTACAAGAGTAGA
以cDNA文庫(λ噬菌體文庫)為模板，再配合文庫中載體上的通用引物M13(-20)Forward Primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的產(chǎn)物并克隆進(jìn)T-Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨卞青霉素的LB平板，37℃，培養(yǎng)14小時(shí)，挑取單克隆，液體培養(yǎng)14小時(shí)，37℃，250rpm，減法抽提質(zhì)粒，酚抽提純化，再使用通用引物M13 Reverse Primer雙脫氧法(DYEnamicET-Terminator Cycle Sequencing)，DNA序列分析儀(MegaBACE 4500)進(jìn)行測序。
實(shí)施例二RT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)分別以0.5M NaCl和3.0M NaCl脅迫環(huán)境下總RNA為模板，Oligo(dT)16作引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)上述8個(gè)基因片段的序列分別設(shè)計(jì)一對引物 以稀釋至1/20的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分析，證明了SEQ ID NO9～12所代表的4個(gè)基因在低鹽滲透環(huán)境下高水平表達(dá)，而SEQID NO13～16所代表的4個(gè)基因在高鹽滲透脅迫條件下高水平表達(dá)，這個(gè)結(jié)果與SAGE文庫結(jié)果顯示的一致。
實(shí)施例三tBLASTx比對基因片段分離出的4個(gè)在低鹽滲透脅迫環(huán)境下呈高表達(dá)的鹽藻基因片段，除了SEQ IDNO10編碼了一個(gè)已知的葉綠素a/b結(jié)合蛋白(chlorophyll a/b binding protein)，SEQ IDNO12與水稻中有同源基因，但功能目前未知，其余2個(gè)基因在Genbank中無同源序列發(fā)現(xiàn)，可能是新的基因。
分離出的4個(gè)在高鹽滲透脅迫條件下呈現(xiàn)高水平表的的鹽藻基因片段，除了SEQID NO13編碼了一種新型的類胡蘿卜素結(jié)合蛋白(novel carotenoid-binding protein)，SEQ ID NO14與萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(putativePi-transporter homologue B1)同源，其余2個(gè)基因在Genbank中無同源序列發(fā)現(xiàn)，可能是新的基因(表1)。
表1在低滲和高滲條件下呈現(xiàn)大差異的8個(gè)標(biāo)簽所對應(yīng)的基因

序列表<110>上海大學(xué)<120>在低鹽和高鹽滲透脅迫下鹽藻差異表達(dá)的標(biāo)簽、基因片段及其克隆方法<160>16<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature
<223>引物<400>1catgcatcaa atgcacatac a21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2agtttcacgc aggaacccat g21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3agcaggcctg tggctacatg 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4gttgtttgtg cctgcatcat g21<210>5
<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5catgcttagg cgaccattag c21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ctgttgatct gcctcagcat g21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7ttctcacacg aagaaggcat g21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>8catgaaatgt acaagaagtag a 21<210>9<211>742<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>9ggagatctac taccctggag gaacccccga ggacactggc ctggagtctg agcaaatcgt gagcagcatt ttcaacaacactgctgcccc tgagccgggc tccaggaagc tgctggccgt gaaccgcaac ctttacgaca gcagtggccc tggtgcgtacggcagcacga ctgactttgg cacttttgag tccgctgtct cggactcagg cttccagtca tcatcagaca caggtgatgatggggcagcc cagggtctga gggctggcct gctgtcaggt gtggcagctg ttttcctgtc tttctttttc ctgtctgggatcagtctgtg agcagtgaat tgttcttgat ggttgatatg agcttgagag cggtccttgg cgttagccat tcatgatgacctggacggag cgacctctta attcattctc aaagctgcat ttaatttggt ttatgcctgg atttcattta ttacttccgtggaactctgg acctactaat gtcccataat tgtcttgatt gtaccattga tgctgctgaa aagttgcatt cattaattaataaatgctac cattgatgtt acaaagttcg catttataca ttttaactga ttgttttgag cttaattgct gaccaggtgcttcattgttg cggcaataat tcattattct ttatttatat taatttcctg ggctttcttt cactggcttg gtttttattgatgtatgtgc atttgatgca tg 742<210>10<211>812<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>10cctgagctac tgggcaaggc cggcatcatc cccgagtcca ctggcctgac ctggtttgag gcaggtggcc tggacagctctaagagtctg atcgctgtgc ccttcaccag cgacatcccc ttccagtact ggaccgacaa gtacacccta ctgttcaccatgcacgctgc catgggattt gcggagttca ggcgctggca ggagtacaag gagcctggat ccgtccaaaa gcagtggttcctcggcctgg agagctttac accctcctct ggtgcccagc ctgcttaccc cggaggcggc ttcttcaact ttgcaggctttggaaaggag ggagaggaga agatgttcga acttaagacc aaggagatca ggaacggccg gctggcaatg
ctagccttcc tgggcttcat ggttcaggct gaagcaaccc acaaaggtcc cgtgcagaat ctgatggacc atgtcagcaaccccctttct gacaacatac ttgccaggtt tgggggcaac taagcttgtg cagcggaata agagcatttg atcttttaacgggactagga aagcttgtat aggcagaaga tgtgagaaag gaaatatatg tacatattcg atgcactaac taccaggagtgtttgccgtg ctggtttgga gtttacttta tatatgtgtg tgtttcgtgc cccagctgca cgtggtggtt tgatgtctgttttagtgagt ctttgtgagg agtataactg ccctttcatc gccatctgtc agagcagatg ctgggtatgg ttcactatatccatgggttc ctgcgtgaaa ct 812<210>11<211>998<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>11gcagcgctat caggattccc ctgatcaggt gtagtgtctg cctcagcctg gtattttggg gaagaaaacg gaatgggtggttcctgatca ggtgcaatgc tttctgtctg cctctgcctg ggattttgtg gaagaaagcg ggatgggaat gtcaaagcaagttgaaatga ctcgtgtggc ctagtgtcca tgcgtgaata tgcgagaaga tctttggtca tgcgtctgtc agtccggttggaagttctgg tcgtaaaaat gggcactccc ttctctgcga tgctggcatg catgaagaaa gaaaactttt gcacgggggtgttgtggctt gctggctgtg gatcgcctgc tgtaatgcat cctgaaggct tacctgcatt gttgctgagt tgaacagttagttctgttag ctaatgtgtt tgctgtgttt gtttgttctg agtgtggctg cattattgag gtgtttgctc cttttggacctggctgcatt catgagtgca tgttcctcgg ttgttggtgg agaattttgt ccgaggaata agacctccga gtacctggctaaacaggcgc tcacgaaaat actggtgtct ctcggctcag gaggctgcct tcccatcaag tgtggtgtag gcttggaaaaacagaactat gctgatcctg aattggtgtt gtggatgata ggggagagta caacgctgtt gcgagcgaga gatctcaaaggtctttcttt tcgtgctact tcttttggtt ctctctacgt acaatcacag ccagcaggag aagcgagcct ttggtcggcaggtagttgtg ctggcacgct tgggcgcata tagtgttgaa gagagttctt gagtctgtgt actcacttgt ggatgcgcagaaatgttgat ttgtgggcct tagcaagcaa caccttggac gtcatttttt tgttcgattg atttttgctg gtgtcttgacacacacagac ttggtccccg tcttctcatg cttccta 998<210>12<211>581<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)
<400>12ggcagtctgc ctggggactt cggatgggat ccgctgcacc ttgcagacac caatgatcag gacaggctga acaacgcgatgagcatgtcc tggctgtcat atgctgaggt catgcactgc cggtgggcca tgcttggcgc agcaggcgcc attgcgcctgagctactggg caaggctggc atcatccccg agtccactgg cctgacctgg tttgaggcag gcggcctgga cagctctaagagtctgattg ctgtgccctt caccagcgac atccccttcc agtactggac cgacaagtac accctgctgt tcaccatgcacgctgccatg ggattcgcag agttcaggcg ctggcaggag tacaaggagc ctggatccgt ccaaaagcag tggttctttgggctggagaa actgacaccc agcagtgaac agcctcaata tccaggcggt ggcttcttca actttgcagg tctgggcaccaaagatgaga aggccatgtt tgacctgaag acaaaggaga tcaggaacgg ccggctggct atgttggcct tcctgggcttcatgatgcag gcacaaacaa c581<210>13<211>400<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>13gagcgcgcgc cgtagggtga atagtggatc aaagaattcg gacgagcaaa actctcacac tctcaacacg agaacaccaagcacgatgca aatgatgctg aagcagaccc cgcaggtgct cggcattcgc cagcagagcc gtctgcagcaggtgaagccg tgcgcccgcc tgcagcgcac agtggtgcgc gccgagggcg gtggcgaggg ccccaagaagctggaggaca tccctcctgc agagcgcaag ttctctgacc agcagtggga tgatgccatc aagtctgcct cccaatccagtgcccccaag gcccccagcc aacccaagcc tgtgtccctg ggcgaagctt tcgcgttcag cggccccctg cctgagaaggctaatggtcg cctaagcatg 400<210>14<211>718<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>14atgttgccaa cggtgtgggc cctcttgccg gtatctggga cacctacaac acctaccagt ctggcagtgg caaggcgtctcagccccgct ggattctggt catcggtgct gctggcattg tgttcggcct ggccatgtac ggctaccgta tcattgcgaccctgggtgtg gacttggtgg tcatgacccc cagccgcg gttacgcggtgg agctggcggg tgctgccatc attgccctagcctccactta cggtctgccc gtctccacca cacaagtcat caccggcggt gaaatagggg tgggcatgtg cgagacctgg
aagatgacgg gcgtgaactg gctcctgttc atccgcacct tctggggctg ggtgggtgcc ctggtgaccg gcgccatcctctcggctctc ttcttctcca tcggtgtgta tggccccagc cgcaccgacc tggactacgt gacacactac cagagggccatgaagattga tatcgatgag tcaatggcgg ccctgctgga ccaatgcatg gagcttcaaa cagctggcgg gggcggatgtgactacagtg acaacagctg ctcttgcaag caagccacac cctacaccat gggtgacctc aagggcctga aggctcaggctgatgggctg ttcaacttcg aggagaatgg ccagattaac gagtacaaca tgatgtacat gctgaggcag atcaacag718<210>15<211>985<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>15cctagcaaga aatgtgtgca cttgtggggt gcaagccgcc cccctcccct aagttttgat tttttacgcg ctgccgtgcgcggatacatg tgccccctgg ttcacctggg agatactgcg actgagagta aggccgcagc aataagcagg ccctccagccctgcctgcca tcttgtgtgg gtgctggatg ccaagagact atcatgcagc cacatgaatg gcaaaaaccg cacgaggcgcaattggttgt taggggagta gcttactgag tgtcaatttg atgggagcac acttgaatag gcatgtgctt tgttgagcgatttgaggatt gctgagattc tttgtgatcg ggccacagca ctggtgtgtt tgcacgaggg atgaaatttc agcagcagttgtgctgcatg catttgagca actgcatgtg tactgtgtgg acaatcaaaa tattcaccga agcctgtaga aggtgctgtttgtggagcag gatggtagta ggaaaagtcg tgtacaggag atcaatcaac atgcccttga ggccctggtg caatgtgtgcaacttaagcg catgtgttgg tgcacgtcag cctgtccagc aattgtacat tgatgttcgc caaaataaag ggtctgaaccatgtgcccag tgcctgcccg gttccgcaag gcctttgatt catgtttcag acttgggcag aaggaaagag gtcttgccttttctgagcac tgctcaagac gtcaggagaa actgttttgg ctgccaattg gttcagcagc acatgattcc tatttccattccttatcatg atctgtgctc gtgtccaaaa gagttctcct tttttccctt ccaggtagcc aacaactgcc cataggaggtgaggaaacag tgggcatttt cagttctgtg ttttgttggt tttagttgtg tggccctttt tatgcgtgtg cctggacaaggctccatgcc ttcttcgtgt gaga 985<210>16<211>447<212>DNA<213>鹽藻(Dunaliella viridis)<400>16tcttcgatgg ggacttctct cagtacgaga atgtgtctga gcagaccatg ccttgagctt ggcatctgtt ccttcggctg
tcttattatt tagtctccaa ttctttctgc tacatgtatt tttggctgcc tgagtggtca atcttgctag tgaaaattct tatttgatctgcttttccat gattagaatc atgcagggat ctgtctgagc agttttgtca gctttgattc aggtttcatt attacgcctaagaccgcctg cttagtgcac tgtatggatg tattgtttag ttattgctcg gatcctcgtg caaagaggga atatgtgatgtcttcttttt gtgcacaagc gaggaactca atttgatttc agtcttgaac tgtgatgtcc ttgaccaaga atgttgattgtcctttgcgt aatccgtcta ctcttgtaca tttcatg 44權(quán)利要求
1.鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3，其特征在于該基因具有SEQ NO 1所示的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的編碼蛋白，其特征在于該基因具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.以DCA3(+)-2、DCA3(-)-2為引物，采用PCR方法從鹽藻的BAC文庫中篩選出一個(gè)不同于已知碳酸酐酶的鹽藻基因組BAC克隆，該BAC克隆的大小為60kb；b.將上述BAC克隆隨機(jī)打斷為2～4kb的小片段，裝入測序載體，構(gòu)建了該BAC克隆的鳥槍文庫；c.大通量提取鳥槍文庫的質(zhì)粒DNA，在MegaBACE 4500上進(jìn)行序列的測定；每個(gè)鳥槍質(zhì)粒利用M13正反向引物，進(jìn)行雙向測序；d.在RedHat Linux平臺的并聯(lián)計(jì)算機(jī)群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所測序列，構(gòu)建亞克隆并測序以填補(bǔ)出現(xiàn)在序列之中的缺口，最終得到鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的全長序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鹽藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于所述的篩選BAC克隆的PCR方法的程序?yàn)?4℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，30 cycles；72℃ 10min；引物序列DCA3(+)-2 ACG GTT GTT GGT GAT GGC AGDCA3(-)-2 TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA。
全文摘要
本發(fā)明涉及在低鹽和高鹽滲透脅迫下杜氏鹽藻(Dunlaliella virids)差異表達(dá)基因片段及其分離方法。本發(fā)明使用SAGE技術(shù)由極端模式生物鹽藻(Dunaliellaviridis)中得到8個(gè)與鹽脅迫相關(guān)的基因標(biāo)簽，通過PCR獲得對應(yīng)標(biāo)簽的基因片段，經(jīng)RT－PCR驗(yàn)證這8個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因片段SEQ ID NO9～16，確實(shí)與鹽脅迫相關(guān)基因。其中，SEQ ID NO9～12所代表的4個(gè)基因在低鹽滲透環(huán)境下高水平表達(dá)，在高鹽滲透環(huán)境呈低水平表達(dá)；而SEQ ID NO13～16所代表的4個(gè)基因在高鹽滲透脅迫條件下高水平表達(dá)，低鹽滲透脅迫條件下呈低水平表達(dá)。為進(jìn)一步研究鹽藻耐鹽分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/10GK1920042SQ200610029210
公開日2007年2月28日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者宋任濤, 許政暟, 張雨 申請人:上海大學(xué)