專利名稱：微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫纖維素酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫纖維素酶主要應(yīng)用于飼料行業(yè)、食品加工、中草藥提取、造紙與紡織、原油開采、印染與洗滌、以及其它纖維素酶應(yīng)用行業(yè)?？梢蕴岣咴系睦寐省⑥D(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。
背景技術(shù)：
纖維素酶是指能降解纖維素生成纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的一組酶的總稱，是一種復(fù)合的誘導(dǎo)酶，包括多種水解酶(張啟先，微生物學(xué)報，1974)。纖維素酶作為生物制劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飼料、食品加工，中草藥提取，原油開采，造紙及紡織、印染等行業(yè)中，但目前使用的纖維素酶主要為中溫纖維素酶。雖然國內(nèi)外對纖維素酶的研究有40多年，但主要是研究中溫纖維素酶；有關(guān)低溫纖維素酶的研究是起步階段，主要是菌種選育和產(chǎn)酶條件優(yōu)化、生長特性和酶學(xué)性質(zhì)，以及相關(guān)基因的克隆等基礎(chǔ)研究(王玢等，山東教育學(xué)院學(xué)報和海洋科學(xué)，2003；曾胤新等，高技術(shù)通訊，2005；游銀偉，微生物學(xué)報，2005)；低溫纖維素酶產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用還未見報道。低溫纖維素酶與高溫、中溫纖維素酶相比具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢，因為低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢；經(jīng)過溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會影響產(chǎn)品的品質(zhì)(孫謐等，海洋水產(chǎn)研究，2002)，這將有助于低溫纖維素酶的推廣和使用。低溫纖維素酶的應(yīng)用將對傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化工、能源和環(huán)保等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠的影響，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫纖維素酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加于反芻動物纖維質(zhì)粗飼料、農(nóng)產(chǎn)品深加工和中草藥提取等領(lǐng)域中，在8～25℃處理0.5～2小時，可以提高原料的轉(zhuǎn)化率10.2％～18.5％，降低了生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量?？梢詮母旧蠑[脫中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。低溫纖維素酶將為人類擺脫生存和發(fā)展中所面臨的諸如饑餓、資源、能源危機以及環(huán)境污染等困境提供現(xiàn)實的機遇。低溫纖維素酶具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法，該方法主要是微生物經(jīng)過低溫馴化后，在10～16℃液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫纖維素酶粗酶液活性可以達到180U/ml，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。當(dāng)該酶活性為1000U/ml或1000U/g，0.01‰～0.5‰的量應(yīng)用于反芻動物纖維質(zhì)粗飼料、農(nóng)產(chǎn)品深加工和中草藥提取等領(lǐng)域中，在8～25℃處理0.5～2小時，可以提高原料的轉(zhuǎn)化率10.2％～18.5％。該酶制劑應(yīng)用操作簡單、方便、快捷、成本低?？梢詮母旧媳苊庵袦?、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法具體包括以下步驟(1)將產(chǎn)生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的纖維素酶產(chǎn)生菌在10～16℃逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。纖維素酶產(chǎn)生菌(例如，CGMCC菌種編號3.316或3.3005或3.3010或3.2942或3.3744或3.4033等)，菌株先活化、再經(jīng)過逐級低溫馴化后發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶時按本發(fā)明產(chǎn)酶條件進行培養(yǎng)，低溫馴化后的菌株在4℃環(huán)境中可保存2個月，用10～25％甘油制成的菌懸液、在零下80℃條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②菌種低溫馴化培養(yǎng)基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③液體種子培養(yǎng)基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
④產(chǎn)酶培養(yǎng)基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產(chǎn)生纖維素酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的纖維素酶產(chǎn)生菌在10～12℃培養(yǎng)48～72h而后按5％的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發(fā)酵液體積3～5％的接種量接入10L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10～12℃培養(yǎng)120～144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶結(jié)束。
(6)將(5)的發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫纖維素酶制劑。
實施例二(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②菌種低溫馴化培養(yǎng)基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③液體種子培養(yǎng)基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
④產(chǎn)酶培養(yǎng)基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產(chǎn)生纖維素酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的纖維素酶產(chǎn)生菌在12～14℃培養(yǎng)48～72h而后按5％的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發(fā)酵液體積5～7％的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在12～14℃培養(yǎng)96～120h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶結(jié)束。
(6)將(5)的發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫纖維素酶制劑。
實施例三(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基馬鈴薯200.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②菌種低溫馴化培養(yǎng)基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③液體種子培養(yǎng)基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween800.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl20.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
④產(chǎn)酶培養(yǎng)基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween800.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產(chǎn)生纖維素酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環(huán)境中生長良好；
(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的纖維素酶產(chǎn)生菌在14～16℃培養(yǎng)48～72h而后按5％的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)制備的二級種子按發(fā)酵液體積7～9％的接種量接入100L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在14～16℃培養(yǎng)72～96h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶結(jié)束。
(6)將(5)的發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液。
(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的低溫纖維素酶制劑。
實施例四按實施例一、二和三方法生產(chǎn)的低溫纖維素酶，平均酶活性為800U/ml，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同活性、純度和劑型的酶制劑。將活性為1000U/ml或1000U/g的低溫纖維素酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加于反芻動物纖維質(zhì)粗飼料、農(nóng)產(chǎn)品深加工和中草藥提取等領(lǐng)域中，在8～25℃處理0.5～2小時，可以提高原料的利用率、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。低溫纖維素酶應(yīng)用部分實驗結(jié)果見下表。

實驗結(jié)果表明低溫纖維素酶應(yīng)用于反芻動物纖維質(zhì)粗飼料、農(nóng)產(chǎn)品深加工和中草藥提取等領(lǐng)域中，可以提高原料的利用率、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量；同時也說明低溫酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可大大縮短處理過程的時間并省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢；該酶制劑應(yīng)用操作簡單、方便、快捷、成本低可以從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法，其包括以下步驟(1)將產(chǎn)生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低，25℃→22℃→20℃→18℃→16℃→14℃→12℃→10℃，使其在低溫環(huán)境中生長良好；(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的纖維素酶產(chǎn)生菌在10～16℃逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體；收集到的液體即為粗酶液。(5)根據(jù)不同需要和使用對象不同，還可以將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在步驟(5)之后進一步包括將步驟(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中菌種低溫馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基分別為(1)菌種低溫馴化培養(yǎng)基馬鈴薯50.0～100.0g，新華濾紙粉5.0～8.0g，麩皮2.0～6.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。(2)液體種子培養(yǎng)基水稻秸稈粉3.0～5.0g，蛋白胨0.5～1.0g，Tween80 0.1～0.3g，(NH4)2SO40.8～1.2g，KH2PO41.2～1.8g，尿素0.2～0.4g，MgSO40.2～0.3g，CaCl30.1～0.2g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·H2O 1.6mg，CoCl21.8mg，自來水1.0L，pH值自然，121℃高壓蒸氣滅菌30min。(3)產(chǎn)酶培養(yǎng)基水稻秸稈粉7.0～12.0g，麩皮1.0～5.0g，Tween80 0.1～0.4g，(NH4)2SO41.0～1.5g，KH2PO41.4～2.0g，尿素0.2～0.6g，MgSO40.1～0.4g，CaCl20.2～0.3g，ZnSO4·7H2O 2.4mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl23.6mg，自來水1.0L，pH值6.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶的方法是將產(chǎn)生纖維素酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環(huán)境中生長良好；將低溫馴化后的纖維素酶產(chǎn)生菌在10～ 16℃逐級擴大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在10～16℃培養(yǎng)72～144h時，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫纖維素酶結(jié)束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N1/00GK1807610SQ20061000201
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月23日
發(fā)明者遲乃玉, 張慶芳 申請人:遲乃玉, 張慶芳