專利名稱：：檢測(cè)黑素瘤的方法和試劑的制作方法檢測(cè)黑素瘤的方法和試刑發(fā)明背景皮膚的惡性黑素瘤是一種發(fā)病率逐漸增加的常見(jiàn)的、迅速發(fā)展的癌癥。它是一種嚴(yán)重的健康問(wèn)題，預(yù)計(jì)2004年美國(guó)將有超過(guò)55,100個(gè)新病例，死亡率將是大約14.5%CancerFactsandFigures2003。AmericanCancerSociety,2003。黑素瘤的發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，超過(guò)任何其它惡性腫瘤'DeBraudetal.(2003)。盡管早期局部黑素瘤的預(yù)后是有利的，即，5年總體存活率高于90%,但局部淋巴結(jié)累及使總體存活率降低到10-46%。Balchetal.(2001),因此，局部淋巴結(jié)(LN)狀況成為黑素瘤患者存活率的最重要預(yù)后因素。崗哨淋巴結(jié)(SLN)技術(shù)的引入(Morton(1992))與單獨(dú)的H&E染色相比，增加了黑素瘤微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的靈敏度。Yuetal.(1999);和Messinaetal.(1999)。然而，即使通過(guò)rac得到增強(qiáng)，組織分析仍然受到光學(xué)顯微鏡識(shí)別胂瘤細(xì)胞的能力的限制。最近提出了逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析，用于更靈敏檢測(cè)LN中的黑素細(xì)胞。當(dāng)采用充分表征的黑素細(xì)胞特異性標(biāo)志物如璐氨酸酶和MART-1時(shí)，很多研究證明了這些基因轉(zhuǎn)錄物存在于通過(guò)常規(guī)組織學(xué)和IHC發(fā)現(xiàn)是陰性的LNs中。Shiversetal.(1998);和Kuoetal.(2003)。但是，這些基因?qū)δ[瘤細(xì)胞不是特異性的，不能用于區(qū)分良性和惡性組織。實(shí)際上，它們?cè)诹夹择拇嬖谙聦?dǎo)致了假陽(yáng)性結(jié)果，Takeuchietal,(2004);Starzetal.(2003);和Giitzmeretal.(2002)?？紤]到良性痣在黑素瘤SLN中并非少見(jiàn)，目前的RT-PCR分析對(duì)于黑素瘤微轉(zhuǎn)移的診斷并不是臨床有用的.最近的一項(xiàng)研究提出了多標(biāo)志物組，包括用于RT-PCR分析的癌癥特異性標(biāo)志物，以增加分析的特異性.Hoonetal.(2004)。新的黑素瘤特異性標(biāo)志物的鑒定仍然是黑素瘤研究的關(guān)鍵問(wèn)題之一.已經(jīng)證明了某些蛋白與黑素瘤及其轉(zhuǎn)移相關(guān)。已經(jīng)將這些蛋白或其活性用于IHC中，以鑒定轉(zhuǎn)移，這些蛋白包括L1CAM(Thiesetal.(2002);Fogeletal.(2003));和S-100(Diegoetal.(2003))。已經(jīng)提出了增加檢測(cè)轉(zhuǎn)移性黑素瘤的靈敏度的核酸測(cè)試。美國(guó)專利公開(kāi)Nos.2002/0110820和2003/0232356。研究采用的標(biāo)志物包括MAGE3、輅氨酸酶、MART曙1，MITF-M或IL-1、Rl、內(nèi)皮縮血管肽-2、肝配蛋白-A5、IGF結(jié)合蛋白7、HLA-A0202重鏈、激活蛋白A(PA亞基)、TNFRH、SPC4、CNTFRa或gplOO(HMB45)基因，Bosticketal.(1999);Hoonetal.(2001);Palmierietal.(2001);Wrightsonetal.(2001);Gutzmeretal.(2002);Davidsetal.(2003);Starzetal.(2003);Rimboldietal.(2003);Cooketal(2003);Reintgenetal.(2004);美國(guó)專利公開(kāi)Nos.2002/0098535;2003/0049701;美國(guó)專利Nos.5,512,437;5，512，444;5，612，201;5,759,783;5,844,075;6，025，474;6,057,105;6,235,525;6,291,430;6,338,947;6,369,211;6，426，217;6,475,727;6，500，919;6，527，560;6,599,699;WO96/29430。確定后，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物不足以在黑素瘤診斷中進(jìn)行確定的使用，Riccionietal.(2002);Gutzmeretal.(2002);Davidsetal.(2003);Goydosetal.(2003);和Prichardetal.(2003),也發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)志物中的許多表明了其它腫瘤，如ME20M(GP100)表明透明細(xì)胞肉瘤、膽管癌和胃癌。Hiragaetal.(1997);Okadaetal.(2001);Okamietal.(2001);Antonescuetal.(2002);Segaletal.(2003)。MAGE3也表明許多腫瘤，包括乳腺、肝細(xì)胞、腎、神經(jīng)、肺和食道腫瘤，Yamanakaetal.(1999);Ookaetal.(2000);Suzukietal.(2000);Cheungetal.(2001);和Weiseretal.(2001)。一些黑素瘤抗原編碼基因也在肺癌中表達(dá).Yoshimatsuetal.(1998)。證明了這些標(biāo)志物是靈敏但非特異性的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谄渌┌Y和良性黑素細(xì)胞中也表現(xiàn)出陽(yáng)性表達(dá)。此外，酪氨酸酶也在正常淋巴結(jié)中存在的施旺細(xì)胞中表達(dá).特異性的缺乏使得需要開(kāi)發(fā)新的或額外標(biāo)志物的分析。H&E組織學(xué)和IHC仍然是"鑒定SLNs中的黑素瘤和痣細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)"。Starzetal.(2003)。手術(shù)中的檢測(cè)問(wèn)題使得該需要更急迫。淋巴結(jié)累及在很多實(shí)體瘤中是最強(qiáng)的預(yù)后因素，而且淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)是病理學(xué)家和外科醫(yī)生最為關(guān)注的，目前的淋巴結(jié)評(píng)估涉及H&E染色組織切片的顯微鏡檢查，并有三個(gè)主要局限性(a)容易遺漏小的細(xì)胞灶；(b)不能快速獲得結(jié)果，意味著SLN程序的任何陽(yáng)性結(jié)果需要第二次外科手術(shù)來(lái)切除腋窩淋巴結(jié)和(c)只研究了一個(gè)或兩個(gè)組織切片，因此每個(gè)淋巴結(jié)的大部分沒(méi)有被檢驗(yàn)。連續(xù)切片有助于克服取樣誤差問(wèn)題，而IHC可有助于鑒定小的細(xì)胞灶.但是，這些方法的組合對(duì)于常規(guī)分析來(lái)說(shuō)過(guò)于昂責(zé)和費(fèi)時(shí).局部淋巴結(jié)解剖的手術(shù)確定可以基于手術(shù)中的淋巴結(jié)冷凍切片分析；但是，這些方法的靈敏度相對(duì)較差，是標(biāo)準(zhǔn)H&E病理學(xué)的50-70°/。，導(dǎo)致另一次手術(shù)的可能性很大.因此，病理學(xué)家常規(guī)不進(jìn)行黑素瘤患者的手術(shù)中冷凍切片分析或接觸印跡細(xì)胞學(xué)分析。黑素瘤的手術(shù)中分析的靈敏度和特異性的改進(jìn)將對(duì)腫瘤學(xué)具有顯著益處.已經(jīng)將高密度微陣列用于同時(shí)監(jiān)測(cè)生物樣品中數(shù)千種基因的表達(dá)。研究導(dǎo)致鑒定了在良性和惡性病變中差異表達(dá)的基因，以及可能具有預(yù)后價(jià)值的基因'Luoetal.(2001);和Wangetal.(2004)。用含有8，150種cDNAs的探針的微陣列實(shí)現(xiàn)了惡性黑素瘤的基因表達(dá)謙分析。Bittneretal.(2000).這些研究者鑒定了一些可能與發(fā)展迅速的腫瘤行為相關(guān)的基因.在最近的研究中，比較了一些黑素瘤和正常黑色細(xì)胞系的基因表達(dá)諳，導(dǎo)致鑒定了在黑素瘤中差異表達(dá)的基因和受到調(diào)節(jié)的途徑。Takeuchietal.(2004).發(fā)明概述本發(fā)明提供了廣泛的一組臨床上相關(guān)的組織樣品的基因表達(dá)詳分析.在含有22,000個(gè)探針組的AffymetrixHul33A微陣列上對(duì)來(lái)自45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、18個(gè)良性皮趺痣和7個(gè)正常皮膚組織的總RNA進(jìn)行了雜交。鑒定了與良性組織相比，在惡性黑素瘤中差異表達(dá)的基因.差異表達(dá)的基因的途徑分析發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)組織發(fā)育相關(guān)的基因的超量表達(dá)，以及淀粉樣蛋白加工信號(hào)傳遞途徑的激活。用一步定量RT-PCR分析檢驗(yàn)一組臨床上相關(guān)的樣品中兩種黑素瘤特異性基因，即PLAB和L1CAM的組合，所述樣品包括原發(fā)性惡性黑素瘤、良性痣、黑素瘤LN轉(zhuǎn)移和無(wú)黑素瘤的淋巴結(jié)樣品.本發(fā)明提供了通過(guò)以下步稞鑒定黑素瘤的方法獲得組織樣品；分析和測(cè)量樣品中編碼相應(yīng)于前列腺分化因子(PLAB，MIC1)(SEQIDNO:1)和Ll細(xì)胞粘附分子(L1CAM)(SEQIDNO:2);或PLAB、L1CAM和3型神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)酪氨酸激蘇受體(NTRK3)(SEQIDNO:3)的mRNA的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)以下步聚鑒定黑素瘸的方法獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中編碼由引物/探針20組SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18識(shí)別的mRNA的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明也提供了通過(guò)以下步驟區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中編碼PLAB和L1CAM;或PLAB、L1CAM和NTRK3的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明也提供了通過(guò)以下步驟區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中由引物/探針組SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)以下步驟確定患者治療方案的方法從患者獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中編碼PLAB和L1CAM;或PLAB、L1CAM和NTRK3的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)以下步驟確定患者治療方案的方法從患者獲得組織樣品；并且分析和測(cè)量樣品中由引物/探針組SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4畫(huà)6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤.本發(fā)明進(jìn)一步提供了其它標(biāo)志物和對(duì)照基因，其表達(dá)輔助要求保護(hù)的方法.這些額外的基因包括受到上調(diào)的SEQIDNOs:29-467和受到下調(diào)的SEQIDNOs:468-978.一級(jí)標(biāo)志物可以是PLAB,并且本文定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:1,PLAB也由Paralkaretal.(1998)描述，并且由編號(hào)AF003934表示.PLAB也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:4-9識(shí)別的mRNA的基因。二級(jí)標(biāo)志物可以是L1CAM，并且本文定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:2。LICAM也由Haspeletal(2003)和美國(guó)專利No.6，107，476描述，并且由編號(hào)NM一000425表示。LICAM也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:10-15識(shí)別的mRNA的基因.本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于進(jìn)行分析以確定細(xì)胞中樣品黑素瘤存在的試劑盒，其中包含核酸擴(kuò)增和檢測(cè)試刑.本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于擴(kuò)增和檢測(cè)本發(fā)明的方法獲得的PCR產(chǎn)物的引物/探針組，這些組包括以下序列SEQIDNO:4(PLAB正向引物)ggcagaatcttcgtccgca5(PLAB反向引物)ggacagtggtccccgttg6(PLAB探針)cccagetggagttgcacttgcggcc7(PLAB上引物)gaacacegacctcgtccc8(PLAB下引物)ggcggcccgagagata9(PLAB探針)cgccagaagtgcggctgggatttSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQSEQIDNO:IDNO:IDNO:IDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNO101112131415161718192021222324LICAM正向)gctgggactgggaacagaactLICAM反向)ggagcagagatggcaaagaaaLICAM探針)"ccccaccatctgctgtUCAM上)ccacagatgacatcagcctcaaLICAM下)ggtcacacccagctcttccttLICAM探針)tggcaagcccgaagtgcagttccttNTRK3引物)gccccggcaccctttaNTRK3引物)aaccctgccagtggtggatNTRK3探針)cagatgggtgttttcTyr上)actcagcccagcatcattcttcTyr下)atggetgttgtactcctccaatcTyr探針)cttctcctcttggcagattgtctgtagcttPBGD上)ccacacacagcctactttccaaPBGD下)tacccacgcgaatcactctcaPBGD探針)aacggcaatgcggctgcaacggcggaatt本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)本發(fā)明方法利用的PCR方法獲得的擴(kuò)增子.這些擴(kuò)增子包括以下序列SEQIDNO:25(PLAB擴(kuò)增子)cggccacctgcacctgcgtatctctcgggccgccSEQIDNO:26(L1CAM擴(kuò)增子)gggatggtgtccacttcaaacccaaggaagagctgggtgtgaccSEQIDNO:27(酪氨酸蘇擴(kuò)增子)atSEQIDNO:28(PBGD擴(kuò)增子)ccacacacagcctactttccaagcggagccatgtctggtaacggcaatgcggctgcaacggcggaagaaaacagcccaaagatgagagtgattcgcgtgggta。本文描述的其它基因包括受到上調(diào)的標(biāo)志物(SEQIDNOs:29-467)、受到下調(diào)的標(biāo)志物(SEQIDNOs:468-978)、PBGD(SEQIDNO:979)、MARTI(SEQIDNO:980)、ME20M(GP100;SEQIDNO:981)和MAGE-3(SEQIDNO:982)以及用于檢測(cè)其表達(dá)的多種引物和探針(SEQIDNOs:983-1011)。附困簡(jiǎn)述圖l.數(shù)據(jù)分析的流程圖.困1對(duì)所有樣品中具有至少2次"存在"信號(hào)的15,795種基因的等級(jí)簇集(hierarchicalclustering).每一列是樣品，每一行是基因，紅色是上調(diào)，綠色是下調(diào).紫色黑素瘤樣品；黃色良性痣；藍(lán)色正常皮膚.圖3.選定的基因的微陣列表達(dá)(A)和實(shí)時(shí)RT-PCR證實(shí)數(shù)據(jù)(B)。從左側(cè)開(kāi)始的前14種樣品是黑素瘸組織樣品(紅色)；隨后的7種是良性痣樣品(黃色)，最后5種是正常皮膚(藍(lán)色).對(duì)于微陣列曲線，x軸表示強(qiáng)度值；對(duì)于PCR曲線，x軸是2"T,其中ACt是Ct(靶基因)-CtPBGD.困4.淀粉樣蛋白加工途徑.獲自IngenuityTM途徑分析軟件應(yīng)用。在黑素瘤中上調(diào)的基因是紅色，在黑素瘤中下調(diào)的基因是綠色。每個(gè)23基因符號(hào)后面是黑素瘤和良性/正常樣品之間的表達(dá)水平改變倍數(shù)。圖5.PLAB和L1CAM(A)以及常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物gp100、酪氨酸酶(SEQIDNO:999)和MARTI(B)的一步定量RT-PCR分析。對(duì)于每個(gè)曲線，x軸代表新標(biāo)志物或常規(guī)標(biāo)志物的評(píng)分。標(biāo)出了每個(gè)樣品分類的中值評(píng)分.在每個(gè)曲線上標(biāo)出了基于正常(綠色)和良性(紅色)樣品的兩個(gè)截止水平。詳述本發(fā)明提供了定性和定量鑒定黑素瘤；區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞；診斷具有不明確的病理特征的黑素細(xì)胞病變；以及確定黑素瘤患者治療方案的方法.這些方法進(jìn)一步提供了對(duì)患者預(yù)后、患者監(jiān)測(cè)和藥物開(kāi)發(fā)的輔助，這些方法依賴于分析和測(cè)量編碼本文提供的mRNAs的多種標(biāo)志物基因的表達(dá)水平，其中超過(guò)預(yù)定截止水平的基因表達(dá)表明測(cè)定的樣品中存在惡性黑素細(xì)胞。皮膚的黑素瘤是一種發(fā)病率逐漸增加的常見(jiàn)的、迅速發(fā)展的癌癥。對(duì)黑素瘤特異性的受到下調(diào)的基因的鑒定可以提供用于LN分期分析和進(jìn)一步指示黑素瘤腫瘤發(fā)生的分子標(biāo)志物。在含有22,000個(gè)探針組的AffymetrixHul33A微陣列上對(duì)來(lái)自45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、l8個(gè)良性皮膚痣和7個(gè)正常皮膚組織的總RNA進(jìn)行了雜交。等級(jí)簇集發(fā)現(xiàn)了來(lái)自良性和正常標(biāo)本的黑素瘤樣品的明顯分離。鑒定了與惡性黑素瘤相關(guān)的新基因。用一步定量RT-PCR分析在原發(fā)性惡性黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品和惡性黑素瘤LN轉(zhuǎn)移和無(wú)黑素瘤的淋巴結(jié)上檢測(cè)了兩種黑素瘤特異性基因，即PLAB和L1CAM的差異基因表達(dá)。將這些標(biāo)志物的性能與常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物如酪氨酸酶、gplOO和MARTI進(jìn)行比較，結(jié)果證明在RT-PCR分析中用PLAB和LICAM的組合區(qū)分含有良性或惡性黑素細(xì)胞的臨床上相關(guān)的組織樣品的能力。高密度cDNA和寡核苷酸微陣列使得能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)千種基因的表達(dá).微陣列技術(shù)提供了mRNA豐度的定量測(cè)量，并且被接受為基于基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物的工具。在癌癥研究?jī)?nèi)容中，微陣列分析鑒定了在良性和惡性病變、不同癌癥類型中差異表達(dá)，或具有預(yù)后意義的基因。Luoetal.(2001);Suetal.(2001);Henshalletal.(2003);和Wangetal.(2004)。惡性黑素瘤的笫一次基因表達(dá)謙分析采用了含有8，150種cDNAs的探針的微陣列，并且^定了可能與迅速發(fā)展的腫瘤行為相關(guān)的基因.Bittneretal.(2000).由于在它們的研究中分析的樣品不包括含有正常或良性黑素細(xì)胞的組織，沒(méi)有鑒定惡性黑素瘤中差異表達(dá)的基因.與正常皮膚相反，良性痣中的黑素細(xì)胞含量與黑素瘤中的含量接近.在另一種研究中，將來(lái)源于黑素瘤或良性痣組織的兩種合并的樣品與cDNA陣列雜交，并且發(fā)現(xiàn)了優(yōu)先在來(lái)源于黑素瘤或痣的樣品中表達(dá)的基因.Seykoraetal.(2003).其它研究者采用了扣除雜交或在黑素瘤細(xì)胞系上產(chǎn)生的SAGE文庫(kù)的分析，用于監(jiān)測(cè)黑素瘤中的基因表達(dá)，Hipfeletal.(2000);和Weeraratna(2004)。最近，對(duì)一些黑素瘤和黑素細(xì)胞系的基因表達(dá)詳?shù)谋容^導(dǎo)致鑒定了在黑素瘤中差異表達(dá)的基因和受調(diào)節(jié)的途徑。Hoeketal.(2004).盡管這些研究提供了黑素瘤遣傳學(xué)的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，但還沒(méi)有明確區(qū)分黑素瘤和良性組織的標(biāo)志物。目前使用的一些標(biāo)志物，如駱氨酸酶和Mart-l，不能區(qū)分良性和惡性組織'Takeuchietal.(2004),因此，這些標(biāo)志物在諸如手術(shù)中基于淋巴結(jié)的疾病分期中的作用有限.從惡性黑素瘤和良性黑素細(xì)胞病變獲得足夠RNA樣品的困難、組織異質(zhì)性和黑色素在純化的DNA中的存在仍然是這些研究的主要挑戰(zhàn)'在此處所示的研究中，在含有22,000個(gè)探針組的AffymetrixHul33A微陣列上對(duì)從45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、18個(gè)良性皮膚痣和7個(gè)正常皮膚組織分離的總RNA進(jìn)行了雜交。開(kāi)發(fā)了改進(jìn)的RNA提取方法，以制備增加微陣列雜交信號(hào)的不含黑色素的RNA樣品。等級(jí)簇集發(fā)現(xiàn)黑素瘤樣品與良性和正常標(biāo)本的顯著分離，微陣列(SAM)法的顯著性分析、t檢驗(yàn)和百分比分析鑒定出了黑素瘤樣品中的439種受到上調(diào)的(SEQIDNOs:29-467)和511種受到下調(diào)的(SEQIDNOs:468-978)基因。除了充分表征的基因，如me20m(gp100)、黑皮質(zhì)素受體1和L1CAM，鑒定了很多以前認(rèn)為與黑素瘤無(wú)關(guān)的新基因，包括NTKR3和PLAB。差異表達(dá)的基因的途徑分析發(fā)現(xiàn)基因的超量表達(dá)與神經(jīng)組織發(fā)育和功能、淀粉樣蛋白加工和整聯(lián)蛋白信號(hào)傳遞途徑的激活相關(guān)。進(jìn)行了RT-PCR分析，證實(shí)了選定的基因的差異表達(dá)。這里提供的方法具有檢測(cè)黑素瘤轉(zhuǎn)移的足夠的特異性和靈敏度。目前方法的比較表明H&E和IHC的傳統(tǒng)方法是臨床上可接受的，而在本發(fā)明之前，PCR方法是不能接受的.表l顯示了在此處要求保護(hù)的本發(fā)明之前，目前方法的缺陷和優(yōu)點(diǎn).表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在本發(fā)明中，基于與H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，特異性優(yōu)選是至少95°/。，更優(yōu)選地，特異性是至少97%，最優(yōu)選地，特異性是至少99%.優(yōu)選地，基于與H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，靈敏度是至少80%，更優(yōu)選地，靈敏度是至少85%,最優(yōu)選地，靈敏度是至少90%。優(yōu)選地，基于與H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，特異性和靈敏度是至少97%，基于與H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，特異性和靈敏度是至少85。/。。優(yōu)選地，預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中至少2倍超量表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)選方法利用了從組織樣品提取核酸的快速技術(shù)和擴(kuò)增和檢測(cè)表明轉(zhuǎn)移的核酸片段的方法.核酸片段定性和定量測(cè)量了標(biāo)志物基因編碼的mRNA.組織樣品包括淋巴結(jié)，即局部和崗哨淋巴結(jié)、皮膚病變和其它活檢材料。本發(fā)明提供的方法使得能夠進(jìn)行微轉(zhuǎn)移的手術(shù)中檢測(cè)，使得醫(yī)生能夠確定是否切除額外的淋巴結(jié)并且立即采用合適的治療方案。如表2中所示，如果發(fā)現(xiàn)LN是黑素瘤陽(yáng)性的，則切除局部淋巴結(jié)，并且可以建議干擾素治療.可以進(jìn)行一周的標(biāo)準(zhǔn)活檢方法，陽(yáng)性結(jié)果需要額外的手術(shù)來(lái)除去LNs，并且伴隨干擾素治療的延遲。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>重要的是對(duì)用于進(jìn)行分析的組織進(jìn)行足夠的取樣。這包括適當(dāng)?shù)那谐图庸そM織樣品，以及提取RNA。一旦獲得，重要的是適當(dāng)?shù)丶庸そM織樣品，以便檢測(cè)存在的任何癌細(xì)胞，在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在手術(shù)中和手術(shù)外也關(guān)注淋巴結(jié)取樣。由于淋巴結(jié)中癌細(xì)胞的分布是非均勻的，優(yōu)選地是對(duì)淋巴結(jié)的多個(gè)切片進(jìn)行取樣。應(yīng)該對(duì)每個(gè)鑒定的SLN進(jìn)行病理評(píng)估。通常在福爾馬林中固定SLN材科，檢驗(yàn)福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織樣品。加工SLN的具有相同代表性的部分，用于分子分析(新組織)和組織學(xué)(固定的組織)。通用的LN取樣程序描述于Cochranetal,(2001);和Cochranetal.(2004)。實(shí)現(xiàn)基于分子的檢測(cè)和通過(guò)病理學(xué)檢驗(yàn)相同淋巴結(jié)樣品的一種方法是沿最長(zhǎng)直徑解剖淋巴結(jié)。然后將每一半分成至少4個(gè)完整面的切片，至少一個(gè)外和內(nèi)切片作為固定材料用于病理學(xué)，至少一個(gè)外和內(nèi)切片用于分子檢測(cè)。由于轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移的分布在淋巴結(jié)或其它組織中是不均勻的，應(yīng)該獲得足夠大的樣品，以便不遣漏轉(zhuǎn)移。本方法中的該取樣問(wèn)題的一種方法是對(duì)大的組織樣品進(jìn)行勻漿，隨后稀釋用于隨后的分子檢測(cè)的充分混合的勻漿樣在LN組織樣品的情況下，優(yōu)選的是在細(xì)胞破壞之前除去任何脂肪組織?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行手工細(xì)胞和組織破壞，如美國(guó)專利4，715，545中描述的一次性組織研磨器或可商購(gòu)的勻漿器如具有一次性探頭的OmniGLH115(OmniInternational,Warrenton，VA)。勻漿時(shí)間是1-2分鐘內(nèi)，更優(yōu)選是30-45秒，然后可以加工樣品，以純化RNA，然后分析和測(cè)量標(biāo)志物表達(dá)水平。合適的RNA純化方法包括柱子，如(例如RNeasymini柱，QIAshredder,QIAGENInc.，Valencia,CA或合適的替代物).多種技術(shù)可以用于從組織樣品提取核酸。典型的可商購(gòu)核酸提取試劑盒用至少15分鐘來(lái)提取核酸.在本發(fā)明的優(yōu)選手術(shù)中方法中，在少于8分鐘，優(yōu)選少于6分鐘的時(shí)間內(nèi)提取核酸.完整RNA的成功分離通常包括4步有效破壞細(xì)胞或組織，核蛋白復(fù)合體的變性、內(nèi)源性核糖核酸酶(RNase)的滅活和污染DNA和蛋白的去除。異硤氛酸胍(GITC)和p-巰基乙醇(p-me)滅活第一步的優(yōu)選試劑。當(dāng)與諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)的表面活性劑聯(lián)合使用時(shí)，實(shí)現(xiàn)了核蛋白復(fù)合體的破壞，使得RNA能夠釋放到溶液中，并且經(jīng)過(guò)分離而不含蛋白.在含有GITC的裂解緩沖液中對(duì)組織進(jìn)行勻漿，乙醇的加入建立了使RNA結(jié)合二氣化硅膜的合適條件。離心可以使沉淀的蛋白和細(xì)胞DNA的裂解液澄清，優(yōu)選是通過(guò)柱子進(jìn)行的。RNA純化優(yōu)選在含有二氧化硅或其它材料的旋轉(zhuǎn)柱上進(jìn)行的。按照上文所述通過(guò)旋轉(zhuǎn)柱沉淀RNA,離心時(shí)間優(yōu)選不超過(guò)30秒。典型地，用等體積的70%乙醇稀釋樣品，在加樣到柱子前徹底混合。洗滌后，通過(guò)離心干燥柱子，在無(wú)RNase的水中洗脫RNA，通過(guò)離心收集。該快速方案的總時(shí)間是少于8分鐘，優(yōu)選少于6分鐘。概言之，快速RNA提取方法包括以下步寐獲得組織樣品:將組織勻漿，產(chǎn)生勻漿物；使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA,該快速提取方法中涉及的試劑可以是制造商提供的那些，或可以是例如裂解/結(jié)合緩沖液(優(yōu)選4.5MGITC，lOOmMNaP04)，洗滌緩沖液I(優(yōu)選溶于5MGITC，20mMTris-HCl中的37%乙醇)，洗滌緩沖液II(優(yōu)選溶于20mMNaCl，2mMTris-HCl中的80%乙醇)，和用于洗脫的無(wú)核酸酶的無(wú)菌雙蒸水。在一種方法中，在上文描述的分離核酸的過(guò)程之前，將組織樣品稱重，放在8或14ml的聚丙烯培養(yǎng)試管中，并且在干水上預(yù)先冷卻。然后在不解凍的條件下將冷凍的組織樣品分成大約50mg或更少的片。所有緩沖液是QIAGEN在RNeasymini試劑盒中提供的那些?；诒?，將一定體積的勻漿(裂解)緩沖液加入組織。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*將多于550mg的組織分成相等的部分，加工為各個(gè)樣品。計(jì)算超過(guò)100mg的組織的裂解援沖液體積的一種替代方法是每50mg組織加入lml;對(duì)于少于100mg的組織，采用2ml。然后例如通過(guò)電源設(shè)置為6級(jí)的OmniGLH115，適配器A1000和一次性探頭對(duì)組織樣品勻漿。然后將勻漿物與等體積的70%乙醇混合，然后例如通過(guò)在設(shè)置為10速(最大)的VWRModelG560上渦旋大約10秒或通過(guò)抽吸4-5次而徹底混合'然后根據(jù)表4的體積將勻漿物/乙醇混合物加入安裝在真空集合管上的RNeasymini柱，使得加栽一致量的原始組織(大約5mg/柱)，從而對(duì)于每個(gè)組織樣品產(chǎn)生相似的RNA產(chǎn)率。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>然后給柱子施加真空，以除去液體。停止真空，進(jìn)行兩次700ml的洗滌，第一次用RWI緩沖液，笫二次用RPE緩沖液，每次都通過(guò)過(guò)濾除去。每種情況下的真空都是在8CMM200mBar。然后將柱子置于1.5ml的收集管中，在Eppendorf5415D離心機(jī)中以13,200rpm離心30秒到干燥.將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的收集管中。將50^1無(wú)RNase的水直接加入膜，在Eppendorf5415D離心機(jī)中以13,200rpm將柱子離心30秒，以洗脫RNA,用AgilentBioanalyzer確定RNA的質(zhì)量，將RNA在-70TC儲(chǔ)存。黑色素可以不利地影響逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)的效率，因此，當(dāng)懷疑樣品含有顯著量的黑色素(如在原發(fā)性黑素瘤或良性皮膚痣的樣品的情況下)時(shí)，進(jìn)行黑色素去除程序，當(dāng)在SLN上進(jìn)行分析時(shí)，不用太注意該程序，因?yàn)楹谒丶?xì)胞含量低。如果必要，除去黑色素，以便增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄和/或核酸擴(kuò)增.典型地，在上文提供的過(guò)濾步驟中除去黑色素。在具有高黑色素濃度的組織的情況下，應(yīng)該采用較少的組織，即每個(gè)QiagenRNeasymini柱大約5mg。如果采用另一個(gè)在樣品中產(chǎn)生殘留黑色素的方法，則除去步碟包括使用采用了聚合物珠系統(tǒng)，如Bio-GelP-60(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)的基質(zhì),所述方法描述于Satyamoorthyetal.(2002)?；旧希摲椒òㄖ苽銪io-Gel材料在10mM醋酸鈉(pH4.2)中的50%(w/v)混合物.將大約300il混合物置于微量離心管中，在1000rpm離心1分鐘。棄去上清液，將珠子罝于微柱或相似的容器中。然后使勻漿物通過(guò)裝有珠子的容器(在第一次在容器中溫育它們之后)。收集上清液.用額外的10mM醋酸鈉的100pl等分物進(jìn)一步洗滌珠子，如果對(duì)于充足的分析體積是必要的，可以用于捕獲額外體積的不含黑色素的樣品.暗黑色素在保留在容器中的珠子上是明顯可見(jiàn)的。如Wangetal.(2001)的描述，也可以用其它基于二氣化硅的過(guò)濾器除去黑色素。本發(fā)明的手術(shù)中方法的一個(gè)重要方面是快速標(biāo)志物檢測(cè)。前提是可以在手術(shù)中分析可接受的時(shí)間段(即不超過(guò)大約35分鐘)中進(jìn)行所述方法，可以使用任何可靠、靈敏和特異的方法.在測(cè)量mRNA水平以確定基因表達(dá)的情況下，可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行分析，并且包括諸如PCR、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和其它的方法.涉及的快速分子診斷是最優(yōu)選的定量PCR方法，包括QRT-PCR。可以通過(guò)本領(lǐng)域/^知的任何方法進(jìn)行檢測(cè)，包括微陣列、基因芯片和熒光，典型的PCR包括多個(gè)擴(kuò)增步驟，或選擇性擴(kuò)增靶核酸種類的循環(huán).典型的PCR包括三個(gè)步驟變性步驟，其中把核酸被變性；退火步驟，其中一組PCR引物(正向和反向引物)與互補(bǔ)DNA鏈退火；和延伸步驟，其中耐熱DNA聚合酶使引物延伸.通過(guò)重復(fù)該步驟多次，擴(kuò)增DNA片段，以產(chǎn)生相應(yīng)于靶DNA序列的擴(kuò)增子。典型的PCR包括20或更多個(gè)變性、退火和延伸的循環(huán).通常，可以同時(shí)進(jìn)行退火和延伸步猓，在此情況下循環(huán)僅僅包括兩個(gè)步驟。在本發(fā)明的采用RT-PCR的優(yōu)選方法中，在適于手術(shù)中診斷的時(shí)間中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，這些步驟中每一個(gè)步壤的長(zhǎng)度可以是在秒的范圍，而不是分鐘的范圍.具體地，由于某些新的熱循環(huán)儀能夠產(chǎn)生每秒至少約5TC的熱斜率，采用30分鐘或更少時(shí)間的RT-PCR擴(kuò)增。更優(yōu)選地，在少于25分鐘的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增?？紤]到這一因素，對(duì)PCR的每一步驟提供的以下時(shí)間不包括斜率時(shí)間，變性步驟可以進(jìn)行10秒或更少的時(shí)間，實(shí)際上，一些熱循環(huán)儀設(shè)置為"o秒"，這可以是變性步驟的最優(yōu)持續(xù)時(shí)間。也就是說(shuō)，它足夠熱循環(huán)儀到達(dá)變性溫度。退火和延伸步驟最優(yōu)選是均少于io秒，當(dāng)在相同溫度下進(jìn)行時(shí)，組合的退火/延伸步驟可以是少于io秒。一些同質(zhì)探針檢測(cè)方法可能需要獨(dú)立的延伸步驟，使快速分析性能最高。為了使總擴(kuò)增時(shí)間和非特異性副反應(yīng)形成最少，退火溫度典型地高于50t:。更優(yōu)選地，退火溫度高于55TC。RT-PCR需要單獨(dú)合并的反應(yīng)，而沒(méi)有試驗(yàn)干預(yù)，這是因?yàn)閹讉€(gè)原因(1)實(shí)驗(yàn)誤差的風(fēng)險(xiǎn)減少；(2)靶或產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)減少；和(3)分析速度增加。反應(yīng)可以有一種或兩種聚合醉。在兩種聚合酶的情況下，這些聚合酶中的一種典型地是基于RNA的DNA聚合物(逆轉(zhuǎn)錄酶)，并且一種是耐熱的基于DNA的DNA聚合酶。為了使分析性能最高，優(yōu)選對(duì)這些酶的功能采用"熱啟動(dòng)"形式。美國(guó)專利5,411,876和5，985，619提供了不同"熱啟動(dòng)"方法的實(shí)例。優(yōu)選方法包括采用一種或多種熱激活方法，該方法掩蔽了有效DNA聚合所需的一種或多種成分。美國(guó)專利5，550，044和5,413,924描述了制備用于所述方法的試劑的方法。美國(guó)專利6，403，341描述了掩蔽方法，涉及PCR試劑成分之一的化學(xué)改變。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNA和DNA依賴性聚合酶均存在于單一酶中.有效擴(kuò)增所需的其它成分包括三磷酸核苷，二價(jià)鹽和緩沖液成分.在某些情況下，非特異性核酸和酶穩(wěn)定劑可能是有益的.在優(yōu)選的RT-PCR中，某些逆轉(zhuǎn)錄酶和PCR成分的量是非典型的，以便利用某些熱循環(huán)儀的更快的斜率時(shí)間.具體地，引物濃度非常向。逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的典型基因特異性引物濃度是小于約20nM。為了使快速逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)以1-2分鐘的數(shù)量級(jí)進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄酶引物濃縮升高到大于20nM，優(yōu)選至少約50nM，典型約100nM。標(biāo)準(zhǔn)PCR引物濃縮是100nM-300nM?？梢詫⒏邼饪s用于標(biāo)準(zhǔn)PCR中，以補(bǔ)償Tm變化。但是，為了此處的目的，例如，提到的引物濃度是不需要Tm補(bǔ)償?shù)臐舛取？梢詰{經(jīng)驗(yàn)確定成比例更高的引物濃度，并且如果Tm補(bǔ)償是必須或需要時(shí)，采用該更高的引物濃度。為了實(shí)現(xiàn)快速PCR，PCR引物濃度典型地是大于250nM，優(yōu)選大于約300nM，32典型地約500nM.商用的診斷劑也優(yōu)選采用一種或多種內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照，其證實(shí)了陰性結(jié)果時(shí)特定擴(kuò)增反應(yīng)的運(yùn)行，在RT-PCR中必須控制的假陰性結(jié)果包括RNA量不足、RNA的降解、RT的抑制和/或PCR和實(shí)驗(yàn)者誤差。在測(cè)量蛋白水平以確定基因表達(dá)的情況下，任何本領(lǐng)域公知的方法都是合適的，前提是它導(dǎo)致足夠的特異性和靈敏度。例如，可以通過(guò)結(jié)合于蛋白的特異性抗體或抗體片段和測(cè)量抗體結(jié)合的蛋白量而測(cè)量蛋白水平，可以用放射性、熒光或其它可檢測(cè)試劑標(biāo)記抗體，以促進(jìn)檢測(cè)，檢測(cè)方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和免疫印跡^支術(shù)。本發(fā)明提供了足以鑒定組織樣品中的惡性黑素細(xì)胞的特異性和靈敏度。該方法通過(guò)測(cè)量標(biāo)志物編碼的mRNA而確定特定標(biāo)志物基因的表達(dá)。相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，本發(fā)明優(yōu)選的標(biāo)志物在具有惡性黑素細(xì)胞的組織中表現(xiàn)出至少2倍的超量表達(dá)。這里示出的結(jié)果表明，一級(jí)標(biāo)志物不足以提供臨床上相關(guān)的信息，但當(dāng)與一種或多種二級(jí)標(biāo)志物組合時(shí)，獲得的信息可以與臨床醫(yī)生目前依賴的H&E和IHC的"金標(biāo)準(zhǔn)"相比.三級(jí)標(biāo)志物和對(duì)照基因可以增強(qiáng)一級(jí)和二級(jí)標(biāo)志物，以進(jìn)一步增加特異性和/或靈敏度。如以下實(shí)施例所述，通過(guò)圖1描述的方案鑒定了標(biāo)志物。因此，本發(fā)明提供了通過(guò)圖1的方法和此處提供的實(shí)施例鑒定黑素瘤特異性標(biāo)志物的方法，一級(jí)標(biāo)志物可以是PLAB，并且在此處定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:1.PLAB也由Paralkaretal.(D98)描述，并且由編號(hào)AF003934表示。PLAB與前列腺癌(Liuetal(2003);Karanetal.(2003);和Nakamuraetal.(2003);美國(guó)專利Nos.5,994,102;6,107,476;6，465，181;6，500，638;6,521,227;美國(guó)專利公開(kāi)Nos.2002/0048784;2003/0013097;和2003/0059431)和結(jié)直腸癌(Brownetal.(2003);Buckhaultsetal.(2001);和美國(guó)專利公開(kāi)No.2002/0160382)的發(fā)病相關(guān)。二級(jí)標(biāo)志物可以是LICAM，并且本文定義為編碼任何變體、等位基因等的基因，包括SEQIDNO:2,LICAM也由Haspeletal(2003)和美國(guó)專利Nos.5,872,225和5,969,124描述,并且由由編號(hào)NM一000425表示。本發(fā)明進(jìn)一步提供了屬于一些功能分類的三級(jí)標(biāo)志物。因此，可以采用這些功能分類中的額外標(biāo)志物。如實(shí)施例中更詳細(xì)的描述，黑素瘤特異性的受到上調(diào)的基因?qū)儆谏窠?jīng)組織發(fā)育和細(xì)胞周期控制的功能分類，黑素瘤特異性的受到下調(diào)的基因?qū)儆诮M織發(fā)育和細(xì)胞分化的功能分類，三級(jí)標(biāo)志物包括SEQIDNOs:3、29-978和999。多種三級(jí)標(biāo)志物描述于表5，并且所有三級(jí)標(biāo)志物概括于表15。NTRK3描述于Strausbergetal.(2002);Marchettietal.(2003);Hisaokaetal.(2002);McGregoretal.(1999);Rydenetal.(1996);美國(guó)專利Nos.5，348，856;5,844,092;5，910，574;以及美國(guó)專利公開(kāi)Nos.2002/0155480和2003/014283，并且由編號(hào)BC013693或S76476.1表示。NTRK3也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:16-18識(shí)別的mRNA的基因。酪氨酸酶描述于Mandelcom-Monsonetal.(2003)和美國(guó)專利No.6，153，388，并且由編號(hào)NM_000372表示.輅氨酸酶也定義為編碼由引物/探針組SEQIDNOs:19-21識(shí)別的mRNA的基因.<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>MAP2K2Chenetal.(2004)NM030662MAP2K4Wooetal.(2004)NM003010MAP3K11ZhangeUl.(2004a)NM002419MAPK8Fujiietal.(2004)NM—13卯49MYLKOuryetal.(2004)NM053032NRASReifenbergeretal.(2004)NM002524PAK1Sellsetal,(l卯7)HSU24I52PAK2Kirchhoffeta1.(2004)NM002577PAK3Kitanoetal.(2003)NM002578PAK4-Baracetal.(2004)NM005884PAK6Chingeta.(2003)NM020168PAK7Jaffereta1.(2002)1NM020341PTK2Golubovskayaetal.(2004)NM005607PXNSaitoetal.(2004)NM002859RAC1Pontowetal.(2004)NM198829RAF1Akulaetal.(2004)NM002880RAP1ANomuraetal.(2004)雨002884RAP2BEvellinetal.(2002)NM002886SHCIY咖onietal.(2004)NM183001S0S1Buchsetal.(2004)NM005633SRCEncinasetal.(2004)NM198291TLN1Tr咖uthetal.(2004)NM006289VASPTokuoetal,(2004)NM003370VCLIzardetal.(2004)NM003373WASPIPLuthietal.(2003)NM003387ZYXIietal.(2004)NM003461三級(jí)標(biāo)志物能夠替代和/或補(bǔ)充一級(jí)或二級(jí)標(biāo)志物，前提是得到的分析具有足夠的靈敏度和特異性。任何給定的基于擴(kuò)增的分子診斷的靈敏度很大程度，但不是完全依賴于引物組的身份.引物組是成對(duì)的正向和反向寡核苷酸引物，它們退火于靶DNA序列，以便允許靶序列的擴(kuò)增，從而產(chǎn)生靶序列特異性擴(kuò)增子。引物必須能夠擴(kuò)增目的疾病狀態(tài)的標(biāo)志物。在本發(fā)明的情況下，這些標(biāo)志物針對(duì)黑素瘤，反應(yīng)也必須包括檢測(cè)特異性信號(hào)的一些工具，這優(yōu)選是通過(guò)采用檢測(cè)來(lái)源于目的靶序列的聚合的DNA序列區(qū)域的試劑而實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)選的檢測(cè)試劑在與特異性的目的核酸序列結(jié)合時(shí)產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)差異.通常，這些方法包括在與目的序列結(jié)合時(shí)產(chǎn)生增加的熒光的核酸探針。典型地，通過(guò)分析每個(gè)PCR引物組的擴(kuò)增子產(chǎn)生的相對(duì)速率而監(jiān)測(cè)本發(fā)明方法的反應(yīng)進(jìn)程。37本發(fā)明進(jìn)一步包括引物/探針組及其在要求保護(hù)的方法中的用途，這些序列是4(PLAB正向引物)ggcagaatc"cgtccgca5(PLAB反向引物)ggacagtggtccccgttg6(PLAB探針)cccagctggagttgcacttgcggcc7(PLAB上引物)gaacaccgacctcgtccc8(PLAB下引物)ggcggcccgagagata9(PLAB探針)cgccagaagtgcggctgggattt10(L1CAM正向)gctgggactgggaacagaact11(L1CAM反向)ggagcagagatggcaaagaaa12(LICAM探針)ttccccaccatctgctgt13(LICAM上)ccacagatgacatcagcctcaa14(L1CAM下)ggtcacacccagctcttcctt15(L1CAM探針)tggcaagcccgaagtgcagttcctt16(NTRK3引物)gccccggcacccttta17(NTRK3引物)aaccctgccagtggtggat18(NTRK3探針)cagatgggtgttttc19(Tyr上)actcagcccagcatcattcttc20(Tyr下)atggctgttgtactcctccaatc21(Tyr探針)cttctcctcttggcagattgtctgtagctt22(PBGD上)ccacacacagcctactttccaa23(PBGD下)tacccacgcgaatcactctca24(PBGD探針)aacggcaatgcggctgcaacggcggaatt可以通過(guò)多種檢測(cè)試劑和方法實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增子產(chǎn)生的監(jiān)測(cè)，包括但不限于，熒光引物和熒光探針，以及結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料。也可以采用分子信標(biāo)、Scorpions和其它檢測(cè)方案.監(jiān)測(cè)PCR的常規(guī)方法采用熒光水解探針?lè)治?。該方法利用某些耐熱DNA聚合酶(如Taq或TflDNA聚合酶)的5，核酸酶活性，在PCR過(guò)程中裂解寡聚探針'本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)本發(fā)明方法利用的PCR方法獲得的擴(kuò)增子.這些擴(kuò)增子包括以下序列SEQIDNO:25(PLAB擴(kuò)增子)SE(JIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOcggccacctgcacctgcgtatctctcgggccgccSEQIDNO:26(L1CAM擴(kuò)增子)gggatggtgtccacttcaaacccaaggaagagctgggtgtgaccSEQIDNO:27(輅氨酸酶擴(kuò)增子)atSEQIDNO:28(PBGD擴(kuò)增子)ccacacacagcctactttccaagcggagccatgtctggtaacggcaatgcggctgcaacggcggaagaaaacagcccaaagatgagagtgattcgcgtgggta。選擇寡聚物，在延伸條件下與擴(kuò)增的靶序列退火.探針典型地在其5'末端具有熒光報(bào)道分子，在3，末端具有報(bào)道分子的熒光猝滅劑。只要寡聚物是完整的，來(lái)自報(bào)道分子的熒光信號(hào)被猝滅，但是，當(dāng)在延伸過(guò)程中消化寡聚物時(shí)，熒光報(bào)道分子不再臨近于猝滅劑.給定擴(kuò)增子的游離熒光報(bào)道分子的相對(duì)聚集可以與對(duì)照樣品的相同擴(kuò)增子的聚集和/或?qū)φ栈蚶纾幌抻赑-肌動(dòng)蛋白或PBGD的聚集相比較，以確定RNA群體中給定RNA的給定cDNA產(chǎn)物的相對(duì)豐度。焚光水解探針?lè)治龅漠a(chǎn)物和試劑容易商購(gòu)，例如，購(gòu)自AppliedBiosystems。合適的檢測(cè)試劑通常稱作"Scorpions"，并且描述于美國(guó)專利6,326,145和5，525，494。這些試劑包括一種或多種包含具尾的引物和整合的信號(hào)傳遞系統(tǒng)的分子.引物具有模板結(jié)合區(qū)和包含接頭和靶結(jié)合區(qū)的尾。尾中的靶結(jié)合區(qū)與引物的延伸產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交。這種靶特異性雜交亊件與信號(hào)系統(tǒng)連接，其中雜交導(dǎo)致可檢測(cè)的改變。在PCR中，靶結(jié)合區(qū)和尾區(qū)有利地安排，使得尾區(qū)保持單鏈，即，未復(fù)制.因此，尾區(qū)在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是不可擴(kuò)增的.接頭包含阻斷部分，其防止引物模板上的聚合酶介導(dǎo)的鏈延伸。最優(yōu)選的檢測(cè)試劑是TaqMan⑧探針(RocheDiagnostics,Branchburg，NJ)，它們描述于美國(guó)專利5,210,015;5,487,972和5，804，375?；旧希@些探針包括通過(guò)分離探針上的熒光-猝滅劑組合而進(jìn)行核酸檢測(cè)，所述分離是通過(guò)用于PCR中的聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性。任何合適的熒光團(tuán)都可以用于任何標(biāo)志物或?qū)φ?。?9述焚光團(tuán)包括，但不限于，TexasRed、CalRed、Fam、Cy3和Cy5.在一種實(shí)施方案中，以下熒光團(tuán)對(duì)應(yīng)于指出的標(biāo)志物PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶CI;PBGD:Cy5.容易獲得用于在PCR和QRT-PCR中控制和監(jiān)測(cè)擴(kuò)增子聚集的設(shè)備和軟件，包括購(gòu)自CepheidofSunnyvale,California的SmartCycler熱循環(huán)儀和購(gòu)自AppliedBiosystems的ABIPrism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)，在基因表達(dá)分析的情況下，優(yōu)選采用在目的組織中組成型表達(dá)的基因。由于以下幾種原因，通常將PBGD用作內(nèi)部對(duì)照它不含人類的已知假基因，它在人組織中組成型表達(dá)，并且它以相對(duì)低水平表達(dá)，因此較不容易導(dǎo)致目的靶序列擴(kuò)增的抑制。采用PBGD作為對(duì)照，使假陰性結(jié)果的所有可能來(lái)源產(chǎn)生的報(bào)道誤差最少或消除誤差。在上述QRT-PCR的方法的商品化中，某些用于檢測(cè)特定核酸的試劑盒特別有用。在一種實(shí)施方案中，試劑盒包括擴(kuò)增和檢測(cè)標(biāo)志物的試劑。任選地，試劑盒包括樣品制備試劑和/或物品(如試管)，以從淋巴結(jié)組織提取核酸。該試劑盒也可以包括使樣品污染的風(fēng)險(xiǎn)最小的物品(如用于淋巴結(jié)切開(kāi)和制備的一次解剖刀和表面)。在優(yōu)選的試劑盒中，包括了上述單管QRT-PCR方法的必要試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶引物、相應(yīng)的PCR引物組(優(yōu)選針對(duì)標(biāo)志物和對(duì)照)、耐熱DNA聚合酶，如Taq聚合酶，和合適的檢測(cè)試劑，例如，但不限于scorpion探針、用于熒光水解探針?lè)治龅奶结?、分子信?biāo)探針、雙鏈DNA的特異性單染料引物或熒光染料，如溴化乙錠。引物的量?jī)?yōu)選產(chǎn)生上述高濃度。耐熱DNA聚合酶通常和商業(yè)上獲自多個(gè)制造商。試劑盒中的額外材料可以包括合適的反應(yīng)試管或管形瓶、屏障組分，典型地是蠟珠，任選包括鎂；逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)混合物(典型是10x)，包括必要的緩沖液和試劑，如dNTPs;不含核酸酶或不含RNA酶的水；RNA酶抑制劑；對(duì)照核酸、任何額外的緩沖液、化合物、輔因子、離子組分、蛋白和酶、聚合物等，它們可以用于QRT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄酶和/或PCR階段。任選地，試刑盒包括核酸提取試劑和材料。試劑盒中也優(yōu)選包括說(shuō)明書(shū)。提供了以下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明，但不是限制要求保護(hù)的發(fā)明，在此全文引入提到的所有參考文獻(xiàn)作為參考。實(shí)施例1組織制備從GenomicsCollaborative,Inc.(Cambridge,MA)，Asterand(Detroit,MI)，Clinomics(Pittsfield，MA)和Proteogenex(LosAngeles,CA)，Ardais(Lexington,MA)以及Impath(Westborough，MA)獲得新鮮冷凍的惡性黑素瘤、良性皮膚痣、正常皮膚、黑素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移物和無(wú)黑素瘤的淋巴結(jié)樣品，所有組織的出售者宣稱用于研究中的組織標(biāo)本是根據(jù)nstitutionalReviewBoard批準(zhǔn)的相應(yīng)醫(yī)院的方案和生物倫理學(xué)原則而采集的。也收集了患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和病理學(xué)信息。評(píng)定了每個(gè)樣品的組織病理學(xué)特征，以證實(shí)診斷，并且估計(jì)樣品保存和腫瘤含量。選擇用于微陣列分析的黑素瘤和良性痣原代組織的黑素細(xì)胞含量超過(guò)50%,沒(méi)有混合的組織學(xué).從惡性黑素瘤患者采集黑素瘤陽(yáng)性淋巴結(jié)；通過(guò)H&E和IHC(S100和HMB45)的組合證實(shí)黑素瘤的診斷，采用S100和HMB45的抗體，通過(guò)H&E和IHC證實(shí)了來(lái)自于臨床病史沒(méi)有黑素瘤，并且目前沒(méi)有黑素瘤的患者的不含黑素瘤的淋巴結(jié)。將來(lái)自總共70個(gè)原代組織樣品的RNA用于基因表達(dá)謙分析和黑素瘤特異性基因鑒定.樣品包括45個(gè)原發(fā)性惡性黑素瘤、18個(gè)良性皮膚痣和7個(gè)正常皮膚組織.研究中包括的大多數(shù)原發(fā)性黑素瘤代表疾病的早期階段，厚度小于4mm,這與標(biāo)準(zhǔn)黑素瘤患者群體一致。Aitkenetal.(2004)。表6中示出了患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和病理學(xué)特征，并且概括于表7。此外，將T7個(gè)惡性黑素瘤LN轉(zhuǎn)移和18個(gè)無(wú)黑素瘤的LN組織樣品用于一步定量PCR分析。黑素瘤陽(yáng)性淋巴結(jié)包括腋窩淋巴結(jié)、頸淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)，其中的轉(zhuǎn)移灶是來(lái)自上皮樣和紡錘狀細(xì)胞原發(fā)性黑素瘤。在18個(gè)無(wú)黑素瘤的LN中，10個(gè)是從其它癌癥患者采集的，但病理學(xué)家沒(méi)有從這些淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，并且8個(gè)LN來(lái)自非惡性病變。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實(shí)施例2從惡性黑素瘤和良性皮膚痣樣品分離RNA采用QiagenRNeasyTMMini試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)，用改進(jìn)的方案使RNA樣品中的殘留黑色素最少，對(duì)于含有黑素細(xì)胞的組織，釆用了來(lái)自各個(gè)患者的四份重復(fù)的組織樣品，其重量是大約5mg，分開(kāi)使用和處理各個(gè)樣品，用機(jī)械勻漿器(UltraTurrexT8，IKA-Werke，Staufen，Germany)在含有100-巰基乙醇(SigmaChemicalCo"St.Louis,MO)的1.0mlRLT緩沖液(QIAGEN)中對(duì)組織樣品進(jìn)行勻漿。勻漿后，將樣品加入QIAGENRneasyTM柱，然后離心.棄去流通液后，加入700mlRW1緩沖液；使柱子在室溫下保持5分鐘，然后離心.將該步稞重復(fù)3次。然后采用標(biāo)準(zhǔn)QIAGENRneasyTM方案。為了從硅膠膜上除去RNA，進(jìn)行兩步洗脫.合并來(lái)自相同個(gè)體患者組織的總RNA，用于進(jìn)一步分析，將標(biāo)準(zhǔn)Trizol程序用于從不含顯著比例的黑素細(xì)胞的組織分離RNA。在Trizol試劑(lnvitrogen，Carlsbad,CA)中對(duì)組織進(jìn)行勻漿。離心后，收集最上層的液相，在-20TC下用異丙醇沉淀總RNA。用75。/o的乙醇洗滌RNA沉淀，溶解在水中，在-801C下儲(chǔ)存直到使用，用Agilent2100BioanalyzerRNA6000Nano分析(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)檢驗(yàn)RNA量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制造商的程序制備標(biāo)記的cRNA，與高密度寡核苷酸陣列Hul33A基因芯片(Affymetrix，SantaClara,CA)雜交，所述陣列總共含有22,000個(gè)探針組。用Affymetrix程序和掃描儀掃描陣列。對(duì)于隨后的分析，認(rèn)為每個(gè)探針都是分離的基因。采用Affymetrix基因芯片分析軟件MAS5.0計(jì)算每個(gè)基因的表達(dá)值。所有芯片滿足三個(gè)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)"存在"信號(hào)高于35%，，當(dāng)標(biāo)度為600的靶強(qiáng)度時(shí)，尺度因子小于12，背景水平小于150。選擇低于"存在"信號(hào)截止值的通常百分比，因?yàn)楹茈y從皮膚細(xì)胞分離RNA(Hipfeletal,(1998))，使得總體基因表達(dá)水平較低.實(shí)施例3數(shù)據(jù)分析過(guò)濾基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以便在2個(gè)或更多樣品中僅僅包括稱作"存在"的基因.該過(guò)濾器被用于除去在樣品中的表達(dá)不改變的基因。在陣列上存在的22，000種基因中，15/795種通過(guò)該過(guò)濾器，并且用于等級(jí)簇集。在簇集之前，用每個(gè)基因表達(dá)信號(hào)除以數(shù)據(jù)組中所有樣品中的中值表達(dá)。該標(biāo)準(zhǔn)化步猓使基因表達(dá)強(qiáng)度的效果最小，并且將簇集分析中具有相似表達(dá)模式的基因分組在一起。采用GeneSpring6.1，在基因和樣品上都進(jìn)行了采用Pearson關(guān)聯(lián)的平均連鎖等級(jí)簇集。為了鑒定差異表達(dá)的基因，我們分別比較了黑素瘤樣品與良性痣和正常皮膚樣品。第一次分析由45個(gè)黑素瘤和7個(gè)正常皮膚樣品組成；第二次分析由45個(gè)黑素瘤和18個(gè)痣樣品組成。在圖1所示的以下程序中分別分析了這兩個(gè)數(shù)據(jù)組，在基因選擇中采用微陣列的顯著性分析(SAM;Tusheretal.(2001))和斯氏T檢驗(yàn).SAM的參數(shù)設(shè)置為厶=2.5，倍數(shù)改變=2.0，具有1，000次交換.FDR是1%。沒(méi)有遺漏的數(shù)據(jù)，采用了缺省隨機(jī)數(shù)。進(jìn)行了隨后的百分比分析。對(duì)于受到上調(diào)的基因，將黑素瘤樣品中的30%與正常樣品或痣樣品的最大值進(jìn)行比較.也進(jìn)行了具有Bonferroni校正的斯氏T檢驗(yàn)，其截止p<0.05，以確保選定的基因在兩組樣品之間具有顯著的差異表達(dá)。作為最終步驟，我們鑒定了黑素瘤/良性和黑素瘤/正?；蛄斜碇g共同的基因，得到圖1所示的在黑素瘤中受到上調(diào)的基因的單一列表，其中439種共同基因相應(yīng)于表15中描述的SEQIDNOs:2S>-467，其結(jié)果示于表8.表8PSID黑素瘤中的中值表達(dá)改變倍數(shù)(癌與良性)改變倍數(shù)(癌與皮膚)200078sat395423200601at92542了200612sat23962200644at72406200660at1465934200707at3153251200736sat73053200737at24232200783sat102822200825sat37463200827at159322200837at581725200838at19225817200839aat283537200859xat9637200910at778024200950at84197200954at31322200966xat2738823200967at615424200968sat55872746<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>220864sat841633220948sat1179423220973sat49743220974xat2S4022220980sat359832221059sat2438.53221483sat簡(jiǎn)33221484at383433221538sat39713221558sat23563221577jcat48972838221641sat119924221688sat374024221710xat72822221732at931221759at1261421221797at43027221799at16013221815at329317144221882satH4456221902at249144221卯9at2432217221962sat113226222116sat420824222153at44538222155sat1264310222175sat2415'36222196at22436222J99sat215223222206sat383412222212sat371534222231sat272432222234sat754412222240sat133133222294sat2193.3532811at41942340560at162944783sat850314646665at7835455093at30324453825at10096147487100at737670我們選擇了與良性標(biāo)本相比，在黑素瘤中具有至少10倍過(guò)量表達(dá)的一'卜部分基因.完整的陣列數(shù)據(jù)組提交于NCBI/GenbankGEO數(shù)據(jù)庫(kù)(系列條目未決)。等級(jí)簇集發(fā)現(xiàn)了四個(gè)不同的簇(圖2)。兩個(gè)簇由大多數(shù)黑素瘤樣55品(45個(gè)中的43個(gè))組成；第三個(gè)簇包括大多數(shù)良性痣樣品(18個(gè)中的15個(gè))，笫四個(gè)包括所有7個(gè)正常皮膚標(biāo)本.黑素瘤樣品自身形成兩個(gè)簇，笫一個(gè)簇中有35個(gè)樣品，另一個(gè)簇中有IO個(gè)樣品.形成小簇的樣品僅僅代表上皮樣黑素瘤，可觀察到含有較少的黑色素，并且證明具有更高的FRAME和MIA基因表達(dá)(p<0.05),極少數(shù)的HI和IV期腫瘤都分組到了小簇中。大簇表現(xiàn)出NTRK3和巢蛋白(NES)的較高表達(dá)(p<0.05).所有黑素瘤和良性痣樣品都表現(xiàn)出已知黑素細(xì)胞標(biāo)志物如酪氨酸酶和MART-1的相同高的表達(dá)，證明在這些樣品中存在相似的黑素細(xì)胞含量.我們的數(shù)據(jù)表明，黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品具有不同的基因表達(dá)詳，并且可以在分子量基礎(chǔ)上分離.在黑素瘤中高表達(dá)的選定基因及其相關(guān)的功能分類概括于表9。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>實(shí)施例4筌定在黑素瘤中差異表達(dá)的基因?qū)⒖偣?0個(gè)基因表達(dá)謙用于分析。黑素瘤、良性和正常樣品組的"存在信號(hào)"的中值百分比分別是43.8%、46.9%和41.7%,60個(gè)微陣列(86%)具有最小值3倍范圍內(nèi)的尺度因子。具有超過(guò)3的尺度因子的10個(gè)芯片相等分布在樣品類目，即黑素瘤、良性和正常之間.非監(jiān)督的等級(jí)簇集結(jié)果揭示了黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品的不同分離(圖2).我們觀察了4個(gè)簇，包括兩個(gè)主要由黑素瘤樣品(45個(gè)中的43個(gè))組成的簇，含有所有7個(gè)正常皮膚、3個(gè)良性痣和2個(gè)黑素瘤標(biāo)本的第三個(gè)簇，和包括18個(gè)良性痣樣品中的14個(gè)樣品的第四個(gè)簇。樣品的來(lái)源不影響簇集。根據(jù)樣品類型(黑素瘤、良性或正常)將來(lái)自不同來(lái)源的標(biāo)本簇集在一起。為了進(jìn)一步測(cè)試簇集模式的穩(wěn)定性，我們?cè)诖胤治鲋霸诨蜻^(guò)濾上采用替代的截止值。具體地，我們保留了在黑素瘤、良性痣和皮膚樣品的每一個(gè)樣品中具有至少10%"存在"信號(hào)的基因。采用該截止值，我們獲得了15,306種基因，并且重復(fù)了等級(jí)簇集?；颊邩悠飞系拇啬Ｊ脚c來(lái)自2個(gè)"存在"信號(hào)的15，795種基因的模式相同，證實(shí)了簇集穩(wěn)定性，與黑素瘤樣品簇集在一起的單個(gè)痣樣品是不存在原位黑素瘤的不典型痣(中度)。與正常皮膚簇集在一起的所有三種痣樣品是混合痣樣品，其中之一的黑素細(xì)胞含量低于其它痣樣品。黑素瘤樣品自身形成了兩個(gè)簇，大簇中具有34個(gè)樣品，小簇中具9個(gè)樣品.形成小簇的樣品僅僅代表上皮樣黑素瘤，并且可以觀察到含有較少的黑色素。我們的研究中用到的很少數(shù)的ni和iv期肺瘤，都分組在小簇中。大簇包括混合組織學(xué)標(biāo)本的上皮樣、紡錘狀細(xì)胞和黑素瘤，具有更顯著的黑色素存在.大簇僅僅包含i期和n期標(biāo)本。發(fā)現(xiàn)不同的基因簇與黑素瘤相關(guān)。這可以通過(guò)黑素瘤樣品中上調(diào)(圖2，A，B,C)和下調(diào)的(圖2，E)基因表征。同時(shí)，黑素瘤和良性痣樣品表現(xiàn)了已知黑素細(xì)胞標(biāo)志物如MART-1的高表達(dá)(圖3，D)，證實(shí)了這些樣品中黑素細(xì)胞的類似含量，以及黑素細(xì)胞特異性標(biāo)志物不能區(qū)分它們.我們的數(shù)據(jù)表明，黑素瘤、良性痣和正常皮膚樣品具有不同的基因表達(dá)詳，并且可以基于它們的分子進(jìn)行分離。為了鑒定在惡性黑素瘤中受到上調(diào)的基因，我們采用了SAM與具有Bonferroni校正的t檢驗(yàn)和百分比分析的組合(圖1)。用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)和百分比分析分別解決多個(gè)檢驗(yàn)問(wèn)題和腫瘤樣品的異質(zhì)性。作為這些分析的結(jié)果，選擇了439種基因，在表15中概括為SEQIDNOs:29-467。在黑素瘤中受到上調(diào)的439種基因中，我們選擇了少數(shù)的33種基因，其在黑素瘤樣品中比在良性樣品種具有10倍的超量表達(dá)。這些包括很多與惡性黑素瘤具有已知關(guān)聯(lián)的基因，如NTRK3(Xuetal.(2003))，L1CAM(Fogdetal.(2003);和Thiesetal.(2002))，me20m(Ademaetal.(1994)，以及新基因表10種列出了在黑素瘤中具有超過(guò)10倍的超量表達(dá)的基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>樣品，所述樣品是從相同組織分離的，用于微陣列研究.將每種基因的表達(dá)值歸一化到管家對(duì)照基因PBGD.L1CAM、NTRK3、PLAB和gplOO的RT-PCR和微陣列結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)分別是0.79、0.86、0.87和0.88。該結(jié)果表明，RT-PCR結(jié)果與微陣列數(shù)據(jù)高度一致。實(shí)施例5差異表達(dá)的基因的途徑分析用IngemiityTM途徑分析軟件(Ingenuity,MountainView,CA)進(jìn)行黑素瘤中差異表達(dá)的基因的功能分析.選擇了具有小于0.05的p-值的功能類目或規(guī)范途徑.用隨機(jī)選擇的基因測(cè)試規(guī)范途徑鑒定的特異性。為了進(jìn)一步觀察區(qū)分黑素瘤與良性和正常組織的可能機(jī)制，我們用Ingenuity途徑分析軟件鑒定與黑素瘤相關(guān)的規(guī)范途徑。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白加工中的很多基因在黑素瘤樣品中受到上調(diào)，為了證實(shí)我們的觀察結(jié)果的特異性，我們從AffymetrixHul33A微陣列選擇了3個(gè)隨機(jī)的基因列表，對(duì)它們進(jìn)行Ingenuity途徑分析。這些列表都沒(méi)有產(chǎn)生與淀粉樣蛋白加工或任何其它規(guī)范途徑的顯著關(guān)聯(lián)。為了證實(shí)黑素瘤中這一規(guī)范途徑的激活，檢索了途徑中所有基因的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。計(jì)算了黑素瘤和良性/正常組織之間差異表達(dá)的改變倍數(shù)和p-值。在淀粉樣蛋白加工途徑中包括的34種基因中(Esleretal.U001);和Giancottietal.(1999))，25種表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，對(duì)于其中的19個(gè)(56%)，差異表達(dá)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p-值〈0.05;圖4)。作為額外的對(duì)照，我們隨機(jī)選擇了具有相似基因數(shù)目的兩個(gè)代謝途徑。在丙氨酸合成途徑的63種基因中，其中的8個(gè)(13%)表現(xiàn)出顯著上調(diào)，其p-值小于0.05。在組氨酸合成途徑中的47種基因中，用相同標(biāo)準(zhǔn)僅僅發(fā)現(xiàn)了2種基因(4%).我們的數(shù)據(jù)第一次強(qiáng)烈表明淀粉樣蛋白加工途徑的激活參與惡性黑素瘤。實(shí)施例6微陣列結(jié)果的RT-PCR證實(shí)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(Invitrogen，Carlsbad,CA)，用DNA酶I處理10微克來(lái)自每個(gè)樣品的總RNA，并且采用SuperscriptH逆轉(zhuǎn)錄病毒，用寡聚(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.以前測(cè)試了對(duì)照基因PBGD，并且報(bào)道為管家基因，Vandesompeleetal.(2003),用PrimerExpress軟件(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)設(shè)計(jì)me20m(gpl00)、LICAM、NTRK3和對(duì)照基因PBGD的引物和MGB-探針。PLAB(MIC1)基因探針是基于FAM-TAMRA的，引物序列不足以設(shè)計(jì)基于MGB的探針。引物/探針序列如下所示表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>PBGD正向CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA986PBGD反向CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA987PBGD探針(6-FAM)CCTGAGGCACCTGGAAGOAGGCTGCAOTOT(TAMRA)988為了達(dá)到高于90%的最佳擴(kuò)增效率，檢驗(yàn)了所有引物和探針，標(biāo)準(zhǔn)曲線包括靶基因PCR產(chǎn)物的6個(gè)10倍稀釋，拷貝數(shù)是10-106.在含有50ng模板cDNA、2xTaqManuniversalPCR主混合物(12.5pi)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)、500nM正向和反向引物和250nM探針的20Ml反應(yīng)混合物中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，在ABIPRISM7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)條件是50TC下2分鐘的AmpEraseUNG激活，951C下10分鐘的聚合酶激活和50個(gè)循環(huán)的95TC下15秒和退火溫度(60"C)下60秒.在每次分析中，對(duì)于目的基因和對(duì)照基因，包括了標(biāo)準(zhǔn)曲線和非模板對(duì)照以及雙份的模板cDNA。每個(gè)靶基因的相對(duì)量表示為ACt，其等于靶基因的Ct減去對(duì)照基因的Ct.為了證實(shí)通過(guò)微陣列分析鑒定的黑素瘤特異性基因，選擇了四種基因(L1CAM，NTRK3，PLAB和gp100)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)RT-PCR驗(yàn)證(圖4).將每種基因的表達(dá)值歸一化到管家基因?qū)φ誔BGD。L1CAM、NTRK3、PLAB和gp100的RT-PCR和微陣列結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)分別是0.79、0.86、0.87和0,88,表明RT-PCR結(jié)果與微陣列數(shù)據(jù)高度一致.實(shí)施例7采用RNA特異性引物進(jìn)行的一步qRTPCR分析和截止值建立采用來(lái)自原發(fā)性黑素瘤、良性痣、正常皮膚、黑素瘤LN轉(zhuǎn)移灶和無(wú)黑素瘤的淋巴結(jié)的RNA，用一步RT-PCR進(jìn)行選定基因的表達(dá)評(píng)估。P-肌動(dòng)蛋白用作管家基因，控制反應(yīng)中RNA的輸入量和質(zhì)量。不采用DNA酶處理。相反，設(shè)計(jì)引物或探針，使它們跨內(nèi)含子，以便不在基因組DNA上報(bào)道.將8ng總RNA用于RT-PCR。用包含在TaqManOneStepPCRMasterMixReagents試劑盒(Applied62Biosystems,FosterCity,CA)中的40XMultiscribe和RNA酶抑制劑混合物逆轉(zhuǎn)錄總RNA.然后用不含UNG的2x主混合物處理cDNA，用10pl的反應(yīng)體積，以384孔區(qū)塊形式在ABI7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)上進(jìn)行RNA擴(kuò)增。引物和探針濃度分別是4iliM和2.5f^M.將反應(yīng)混合物在481C下溫育30分鐘，以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行AmpUtaq激活步驟，該步驟包括95TC下IO分鐘，最后40個(gè)周期的95TC下15秒變性和60t:下1分鐘退火和延伸.在每個(gè)板上建立從8pg到80ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)R2值大于0.99時(shí)，接受循環(huán)閣值(Ct)。用于反應(yīng)中的序列如下，每個(gè)序列都是從5，到3，方向記栽的。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>PLAB反向COCAGGTGCAGGTGGC歸PLAB探針GATACTCACGCCAGAAGTGCGGCT1011對(duì)于每個(gè)樣品，計(jì)算了ACt-Ct(靶基因)-Ctp-肌動(dòng)蛋白。厶Ct被廣泛用于臨床RT-PCR測(cè)定，并且選作直接方法，Croninetal.(2004)。在黑素瘤和非黑素瘤樣品，包括原發(fā)和LN樣品之間的ACt上進(jìn)行T檢驗(yàn).我們?nèi)缓笥肁Ct構(gòu)建每個(gè)患者的兩個(gè)評(píng)分。一個(gè)評(píng)分來(lái)自兩種黑素瘤特異性基因PLAB和LICAM的組合；另一評(píng)分來(lái)自3種常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物，即酪氨酸酶、gpl00和MARTI的組合。評(píng)分定義為測(cè)試的基因的ACt值的加權(quán)和，相應(yīng)的t統(tǒng)計(jì)值作為權(quán)重。對(duì)兩個(gè)評(píng)分進(jìn)行歸一化以具有相同的平均值，以便以相同的尺度對(duì)它們進(jìn)行比較。我們通過(guò)RT-PCR檢驗(yàn)了多種臨床組織樣品中的兩種在黑素瘤中高度超量表達(dá)基因，即，PLAB和L1CAM，所述組織樣品包括惡性黑素瘤細(xì)胞(原發(fā)性黑素瘤和黑素瘤LN轉(zhuǎn)移灶)、良性黑素細(xì)胞(良性皮趺痣)和正常樣品(正常皮膚和無(wú)黑素瘤的LN)。主要組織與用于微陣列研究的組織相同，只是所有的LN標(biāo)本都來(lái)自于獨(dú)立的患者。也在相同樣品上檢測(cè)了常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物，如酪氨酸酶、gpl00和MARTI作為對(duì)照，因?yàn)樗鼈兪悄壳暗呐R床研究中最常用于黑素瘤分子分析的標(biāo)志物。Rimboldietal.(2003);Abrahamsenetal.(2005);和Kammulaetal.(2004)。PLAB和LICAM的計(jì)算的評(píng)分示于圖4A，酪氨酸酶、gpl00和MARTI的計(jì)算的評(píng)分示于圖4B結(jié)果證明了惡性黑素瘤樣品(原發(fā)性和LN轉(zhuǎn)移灶)和良性痣以及正常LN之間PLAB和LICAM的表達(dá)的顯著差異。相反，三種常規(guī)標(biāo)志物表現(xiàn)出良性和惡性樣品中的相似表達(dá)水平。為了進(jìn)一步證明基因標(biāo)志物區(qū)分良性和惡性組織的能力，我們檢驗(yàn)了兩個(gè)截止值；笫一個(gè)確立為原代正常樣品中的最高值，第二個(gè)為良性痣樣品中的最高得分。對(duì)于每一個(gè)截止值，我們?cè)u(píng)估了LN樣品中靈敏度。采用在正常樣品上確定的截止值，新的標(biāo)志物和常規(guī)標(biāo)志物分別產(chǎn)生卯％和83%的靈敏度，采用在良性樣品上確定的截止值，新的和常規(guī)標(biāo)志物的靈敏度是88%和42%。結(jié)果表明，新的標(biāo)志物可能具有更好的區(qū)分含有良性和惡性黑素細(xì)胞的組織的能力.實(shí)施例8多路分析材料和方法每個(gè)反應(yīng)的終體積是25pl，含有以下成分:正向引物400nM反向引物500nMPLAB探針50nM酪氨酸醉探針300nML1CAM探針200nMPBGD探針200nMTth5UAbTP6-251貼甘油10%Tns-HCl，*T—、ifj.,mmN汰C14mMEDTA0.004mMTween-200.22%NP-400.02%DTT0.04mM氫氣化鉀20.5mMN-二羥乙基甘氨酸50mM醋酸鐘115mM牛白蛋白海條糖0.15MdNTP各0.2mMMgCl20.5mMMnS043.5mM引物各300nM探針各200nM引物和探針序列示于表13。表13SEQIDNO序列5'-3'功能43_gaacaccgacctcgtcccPLAB上引物44gpcggcccgagagataPLAB下引物45Fani"Cgccagaagtgcggctgggat-BHQI-ttPLAB探針55actcagcccagcatcattcttcTyr上引物56atggctgttgtactcctccaatcTyr下引物57Q570-cttctcctcttggcagattgtctgtagcBHQ2-ttTyr探針49ccacagatgacatcagcctcaaLICAM上引物50ggtcacacccagctcttccttLICAM下引物51CalRed-tggcaagcccgaagtgcagttcc-BHQ2-ttLICAM探針58ccacacdcagcctacfttccaaPBGD上引物59tacccacgcgaatcactctcaPBGD下引物60Q670-aacggcaatgcggctgcaacggcggaa-BHQ2-ttPBGD探針用PLAB在Fam通道中，酪氨酸酶在Cy3通道中，L1CAM在TexasRed通道中，和PBGD在Cy5通道中進(jìn)行反應(yīng)。采用的循環(huán)方案如下所述，并且用30分鐘完成。951Cx15秒65TCx420秒40個(gè)以下循環(huán)95X:5秒621C15秒-熒光讀數(shù)采用的閾值在Fam通道中是30，在Cy3通道中是20，在TexasRed通道中是20，在Cy5通道中是20。在Cy3和Texasred通道中采用的閾值可以降低。獲得的結(jié)果概括于表H。表14最佳標(biāo)志物組合標(biāo)志物%靈敏度(95%CI)%特異性(95%CI)L1CAM+PLAB82(73'89)96(87-100)酷氨酸酶+ME20M(GP100)63(52-72)100(94-100)LICAM+PLAB+璐氨酸酶87(79-93)96(87-100)Ct截止值L1CAM2766PLAB29駱氨酸酶23ME20M(GP100)23.5注這些數(shù)據(jù)僅僅是對(duì)H&E病理的基準(zhǔn).4個(gè)反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)的擴(kuò)增效率都很高，反應(yīng)在5個(gè)對(duì)數(shù)范圍內(nèi)也是線性的(通過(guò)R2值判斷，其在所有病例中都>0.99)。因此，這些數(shù)據(jù)證明了起作用的4路、快速測(cè)定.這些數(shù)據(jù)表明，PLAB是一級(jí)標(biāo)志物，并且由LACAM實(shí)現(xiàn)的補(bǔ)充進(jìn)一步增加了靈敏度.如果需要，加入酪氨酸酶作為第三標(biāo)志物，進(jìn)一步補(bǔ)充了L1CAM和PLAB，并且增加了靈敏度。如果需要，實(shí)驗(yàn)中可以去掉酪氨酸酶，而不影響其余標(biāo)志物的性能。討論我們進(jìn)行了原發(fā)性黑素瘤、良性痣和正常皮膚組織標(biāo)本的基因表達(dá)諳分析，以便找到可能用于LN分子分期分析的黑素瘤特異性基因標(biāo)志物。鑒定了在惡性黑素瘤樣品中高度和差異表達(dá)的新基因.在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中引入良性痣對(duì)于我們的研究是關(guān)鍵的。與正常皮膚相比，良性痣中的黑素細(xì)胞含量與黑素瘤中的黑素細(xì)胞含量接近。除通過(guò)組織學(xué)評(píng)估外，這是通過(guò)黑素瘤和痣組織標(biāo)本中諸如酪氨酸酶和MART的常規(guī)黑素瘤標(biāo)志物的相同高的表達(dá)水平而證實(shí)的。相似的細(xì)胞組成使我們能夠監(jiān)測(cè)與黑素瘤惡性轉(zhuǎn)化特異性相關(guān)(而不僅僅與黑素細(xì)胞系分化相關(guān))的基因表達(dá)。作為結(jié)果，我們鑒定了在黑素瘤中特異性超量表達(dá)的新基因.新的高度超量表達(dá)的黑素瘤基因之一，即前列腺分化因子(PLAB，MIC1)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-P超家族的成員，并且已知與其它惡性腫瘸相關(guān)。Baeetal.(2003);和Welshetal.(2003)。PLAB減少了細(xì)胞粘附(Yamauchietal.(2003))，表明了它在黑素瘤進(jìn)展中的可能作用.在黑素瘤中超量表達(dá)的基因的途徑分析表明了許多這樣的基因與神經(jīng)組織功能和發(fā)育相關(guān)，表明黑素細(xì)胞的去分化和過(guò)程的激活與對(duì)黑素瘤發(fā)育和進(jìn)展可能是重要的多能前體細(xì)胞相關(guān)。此外，規(guī)范途徑的分析表明，神經(jīng)組織相關(guān)的淀粉樣蛋白加工在黑素瘤中受到顯著調(diào)節(jié)。以前沒(méi)有將淀粉樣蛋白加工(APP)途徑自身與黑素瘤發(fā)育和進(jìn)展進(jìn)行關(guān)聯(lián)，APP途徑中的許多基因，如P-和Y-分泌酶家族(BACE2，PSEN2)的成員也參與Notch途徑，并且在Notch和APP中都起到裂解整合膜蛋白的作用.Esleretal.(2001)。Notch阻抑了分化，并且?guī)椭S持神經(jīng)峰干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)(Gangemietal.(2004)),Notch在黑素瘤中的參與，特別是y-分泌酶的作用是很多研究的焦點(diǎn).Hoeketal.(2004);Baldietal.(2003);和Wilsonetal.(2000)。我們比較了我們的結(jié)果和Haqqetal(2005)最近的研究，在他們的工作中，用含有20,862個(gè)探針的cDNA陣列對(duì)良性痣、原發(fā)性黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤標(biāo)本進(jìn)行語(yǔ)分析。樣品組包括轉(zhuǎn)移性和原發(fā)性黑素瘤以及良性痣.在它們的研究中發(fā)現(xiàn)了區(qū)分良性痣和原發(fā)性惡性黑素瘤組織的相似簇集結(jié)果。在兩個(gè)研究中報(bào)道的可以區(qū)分黑素瘤和良性痣的共同基因包括驅(qū)動(dòng)蛋白樣5(KNSL5)、前列腺分化因子(PLAB)、CITED1、骨橋蛋白(SPP1)、組織蛋白酶B(CSTB)、鈣粘著蛋白3(CDH3)、早老蛋白2(PSEN2).我們的一步RT-PCR分析證明，新的黑素瘤特異性基因PLAB和L1CAM不僅在原發(fā)性黑素瘤組織中表達(dá)，也在黑素瘤LN轉(zhuǎn)移灶中表達(dá).此外，區(qū)分惡性黑素瘤和良性痣的能力使得它們是比常規(guī)用于對(duì)黑素瘤診斷進(jìn)行分子測(cè)試的常規(guī)標(biāo)志物更好的候選物。在臨床研究中進(jìn)一步驗(yàn)證后，這些基因可以開(kāi)發(fā)為用于分子分期分析的特異性標(biāo)志物，以便在崗哨淋巴結(jié)(SLN)活檢程序中檢測(cè)黑素瘤微轉(zhuǎn)移，所述基因的另一可能應(yīng)用是診斷具有不確定的病理學(xué)特征的黑素細(xì)胞病變。盡管為了清楚理解的目的通過(guò)說(shuō)明和舉例以一定詳細(xì)程度描述了上文的發(fā)明，但這些描述和舉例不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明的范圍。表15序列說(shuō)明、名稱和序列編號(hào):<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>138203557Sat剛一000281PCBD肝細(xì)胞核因子lcc的6-丙胡酰四氫嚷吟合酶二聚化輔因子139203570atNM005576LOXU賴氨酰氧化酶樣1140203590一atNM—006141DNCLI2動(dòng)力蛋白，細(xì)胞質(zhì)，輕中間多肽2141203643atNM006494ERFEts阻遏因子142203663satNM0042.55C0X5A細(xì)胞色素c氧化酶亞基Va143203668at剛006715MAN2C1甘露糖苷蘇，a,2C類，成員1144203693satNM001949E2F3E2F轉(zhuǎn)錄因子3145203695satNM004403DFNA5耳聾，常染色體顯性5146203723at細(xì)002221ITPKB肌醇1，4，5-三磷酸3-激酶B147203729atNM001425EMP3上皮膜蛋白3148203730丄atBF196931ZFP95與小鼠中的Zfp95同源的鋅指蛋白149203731satNM014569ZFP95150203775atNM014251SLC25A13溶質(zhì)栽體家族25,成員13151203827atNM017983FU10055假定蛋白FLJ10O55152203878s8tNM005940MMP"基質(zhì)金屬蛋白酶"153204014atNM001394DUSP4雙特異性褲酸酶4154204015satBC002671DDSP4155204033atNM004237TRIP13甲狀腺素受體相互作用蛋白13156204092satNM003600STK15絲氨酸蘇氨酸激酶15157204099一atNM_003078SMARCD3SWISNF相關(guān)的，基質(zhì)相關(guān)的，染色質(zhì)的肌動(dòng)蛋白依賴性調(diào)節(jié)刑，亞家族d，成員3158204170satNM001827CKS2CDC28蛋白激酶2159204197satNM004350圓X3runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3160204198satAA54簡(jiǎn)圓X3161204202atNM017604,1023KIAA1023蛋白162204228atNM006347USA-CYP親環(huán)蛋白163204244satNM006716ASKS期激酶的激活刑164204247satNM004935CDK5細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5165204252atM68520cdc2相關(guān)蛋白激醉166204262satNM000447PSEN2早老蛋白2轉(zhuǎn)錄變體1167204423—atNM_013255MKLN1muskellin1，含有kelch基序的細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)168204436atNM025201PP1628假定蛋白PP1628169204458atAU10209DKFZp564A01221702044673atNM000345SNCA突觸核蛋白，a轉(zhuǎn)錄變體NACP140171204584一atAI653981UCAM丄l細(xì)胞粘附分子，MASA轉(zhuǎn)錄變體172204585sat剛000425L1CAM173204647at剛004838HOMER-3同聚體，神經(jīng)元立即早期基因，3174204654satNM003220TFAP2A轉(zhuǎn)錄因子AP-2a175204709sat剛004866KNSL5驅(qū)動(dòng)蛋白樣5176204778x8tAW102783H0XB7同源盒B7177204779satNM004502H0XB7178204857atNM003550MAD1L1MAD1樣1179204932atBF433902TNF受體超家族，成員lb180204973atNM000化6GJB1間隙連接蛋白，Pl,32kD181204995—atAL567411細(xì)胞詢期蛋白依賴性激酵5,調(diào)節(jié)亞基1(p35)182205051satNM000222KITv-kitHardy-Zuckerman4貓科動(dòng)物72肉瘸病毒癌基因同源物<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>320213496atAW592663KIAA0455基因產(chǎn)物321213573atAA861608核周蛋白(輸入蛋白)B1322213587satAI884明7核糖體蛋白L26323213638atAW054711染色體6p24上的PAC257A7324213670xatAI768378KIAA0618基因產(chǎn)物325213720_s_atAI831675SWISNF相關(guān)的，基質(zhì)相關(guān)的，染色質(zhì)的肌動(dòng)e蛋白依賴性調(diào)節(jié)劑，亞家族a,成員4326213746satAW051856細(xì)絲蛋白A，ai，一"/213836s8tAW052034KiAAlOOl蛋白328213895atBF445047上皮膜蛋白蛋白1329213960atT87225克隆=IMAGE:22392330214023xatAL533B38微管蛋白，e多肽331214068atAF070610克隆24505332214104atAI703188.G蛋白偶聯(lián)的受體333214201xatAA742237HLA-B相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物-2334214581xatBE568134死亡受體6335214614atAI738662同源盒HB9336214632atM295257神經(jīng)氈蛋白2337214656xatBE790157M蛋白IB338214687xatAK026577FLJ22924fis339214708atBG484314肌養(yǎng)蛋白結(jié)合蛋白，ei340214710salBE407516細(xì)胞周期蛋白Bl341214714atAK022360FLJ12298fis342214717atAL137534DKFZp434H1419343214752xatA1625550細(xì)絲蛋白A，a344214778_at'A即簡(jiǎn)1MEGF8345214841atAF070524克隆24453346214893丄atAI421964超極化激活的環(huán)狀核苷酸門(mén)控的鉀通道2347214696atAL109671EUROIMAGE29222348215025atS76476trkC(可變剪接的)349215115xatAI6額5ets變體基因6(TEL癌基因)350215126—atAL109716EUROIMAGE208948351215155at細(xì)78'HEXA異常P-氨基己糖苷酶a鏈352215311atAL109696EUROIMAGE21920353215812satU4"63SLC6A10肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白354215836satAK026188FLJ22535fis355216194一s一atAD001527來(lái)自含有CAPNS和P0L2RI的染色體19-粘粒(24590的DNA356216973satS49765同源盒B7357217033一x一atS76475trkC神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)格氨酸激酶，受體，3型358217104atAL109714.EUROIMAGE327506359217226satM95929PH0X1成對(duì)的間皮同源盒l(wèi)360217297satAF143684MY09b非常規(guī)的肌球蛋白Ixb361217377_x_atAF041811ETV6-NTRK3融合體ETS相關(guān)的蛋白生長(zhǎng)因子受體私氨酸激酶融合蛋白362217419xatAK021586FLJ11524fis363217624atM464753ESTs364217799xatNM003344UBE2H遍在蛋白綴合酶E2H365217827satNM016630ACP33酸寇蛋白33366217867xatNM01210SBACE2P習(xí)位點(diǎn)APP裂解酶276<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>593204718at剛004445EPHB6EphB6594204719一atNM一007鄉(xiāng)ABCA8ATP結(jié)合盒，亞家族A成員8595204734atNM002275KRT15角蛋白15596204749atNM004538NAP1L3核小體組裝蛋白l-樣3597204753satA舊簡(jiǎn)2肝白血病因子598204754atAI810712肝白血病因子599204755xatM95585HLF白血病因子600204765—atNM一006435ARHGEF5Rbo鳥(niǎo)氨酸核苷酸交換因子5601204773atMM004512IU1RA白介素U受體，a602204773atNM—004512IL11RA603204855一atNM_002639SERPINB5絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白醉抑制劑，進(jìn)化枝B,成員5604204872atNM007005BCE-1BCE-1蛋白605204937satNM016325ZNF274鋅指蛋白274606204942—s_atNM_000695ALDH3B2搭脫氫酵3家族成員B2607204952一at剛一014400C4.4AGPI錨定的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白同源物608204971atNM005213CSTA半錄酸蛋白酶抑制劑A(stefinA)609204975atNM001424EMP2上皮膜蛋白2610204990satNM000213ITGB4整聯(lián)蛋白，04611205014atNM005130HBP17肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子結(jié)合6122050198atNM004624VIPR1血管活性腸肽受體1613205081atNM001311CRIP1富含半胱氨酸的蛋白1(腸)614205109一s一atNM一015320ARHGEF4Rho鳥(niǎo)氨酸核苷酸交換因子(GEF)4615205128xatNM000962PTGS1前列腺素內(nèi)過(guò)氣化物合酶l616205185atNM—006846SP,絲氨酸蛋白酶抑制劑，Kazalt，5617205200at剛003278TNA四連蛋白618205206at剛000216KAL1Kallmann綜合征1序列619205236xatNM003102S0D3超氧化物歧化蘇3，細(xì)胞外620205251atNM022817PER2period同源物2轉(zhuǎn)錄變體1621205259_at既000901NR3C2核受體亞家族3，C組，成員2622205286atU85658轉(zhuǎn)錄因子ERF-l623205349atNM002068GNA15鳥(niǎo)氨酸核苷酸結(jié)合蛋白，ccl5624205363一atNM_003986BB0X1丁酰甜菜堿(Y)，2-氧化戊二酸二加氧酶1625205382satNM001928DF補(bǔ)體的D成分(肥胖菌素)626205384一atNM一005031FXYD1含有FXYD結(jié)構(gòu)域的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)物l'變體a627205403atNM004633IUR2白介素l受體，H型628205404atNM005525HSD"B1羥基甾體類脫氫酵l629205407一atNM一021"1RECK具有kazal基序的謙導(dǎo)回復(fù)突變的富含半胱氨酸的蛋白630205440satNM000909NPY1R神經(jīng)肽Y受體Yl631205455atNM002447MST1R巨噬細(xì)胞刺激l受體632205464—atNM000336S固1BNa通道，非電壓門(mén)控的1，e633205470satNM006353KLK"激肽釋放酵1163420S4卯XatBF060667連接蛋白間隙接合蛋白，P3，31kD635205498atNM000163GHR生長(zhǎng)激素受體636205559satNM006200PCSK5原蛋白轉(zhuǎn)4匕酶subtilisinkexin5型82<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>參考文獻(xiàn)WO96/294302003/02323562002/01603822002/01554802002/01108202002/00985352003/00594312003/00497012002/00487842003/0142832003/00130976,500,9194,715,5455,210,0155,348,8565,411,8765,413,9245,487,9725,512,4375,512,4445,525,4945,550,0445,612,2015,759,7835,804,3755,844,0755,844,0925,872,2255,910,5745,969,1245,985,6195,994,1026,025,4746,057,1056,107,4766,153,3886,235,5256,291,4306,326,1456,338,9476,369,2116,403,3416,426,2176,465,1816,475,7276,500,6386,521,2276,527,5606,599,699Abrahamscnetal.(2004)Quantificationofme咖mamRNAmarkersinsentinelnodes:pre-clinicalevaluationofasingle-stepreal-timereversetranscriptase-polymerasechainreactionassayJMolecDiag6:253-259Abrahamsenetal.(2005)Pathologicassessmentofmelanomasentinelnodes:aroleformolecularanalysisusingquantitativereal-timereversetr咖cription-PCRforMARTIandtyrosinasemessengerRNAClinCancerRes11:1425-1433Ademaetal.(1994)Molecularcharacterizationofthemelanocytelineagespecificantigengpl00JBiolChem69:20126-20133Ahmedetal.(2004)Cdc42-dependentnucleartranslocationofnon-receptortyrosinekinase,ACKbiochem.Biophys,Res,Commun.314:571-579Aitkenetal,(2004)Populationscreeningformelanoma:currentevidenceandacommunitybasedrandomizedtrial,to"TextbookofMelanoma"Ed.byJFThompson,DLMortonandBBRKroon.MartinandDunitzAkulaetal.(2004)Rafpromoteshumanheipesvirus-8(HHV-8/KSHV)infectionOncogene23:5227-5241Alexaetal.(2004)ContributionofdistinctstructuralelementstoactivationofcalpainbyCa2+ionsJ.Biol.Che審.279:20118-20126Altznaueretal,(2004)Calpain-1regulatesBaxandsubsequentSraac-dependentcaspase-3activationin加utrophilapoptosisJ.Biol.Chem.27^:5947-5957Antonescuetal,(2002)Moleculardiagnosisofclearcellsarcoma:detectionofEWS-ATF1andMITF-Mtranscriptsandl^istopathologicalandultrastructuralanalysisof12casesJ.Mol.Diag.4:44-52Arozarenaetal.(2004)ActivationofH-RasintheendoplasmicreticulumbytheRasGRFfamilyguaninenucleotideexchangefactorsMol.Cell.Biol.24:1516-1530Baeetal.(2003)GeneexpressionpatternsaspotentialmolecularbiomarkersformalignanttransformationinhumankcratinocytestreatedwithMNNG,arsenicorametalmi血eToxicolSci74:32-42Balchetal.(2001)FinalversionoftheAmericanJointCommitteeoncancerstagingsystemforcutaneousmelanomaJClinOncol19:3635-3648Baldietal.(2003)Identificationofgenesdown-regulatedduringmelanomaprogression:acDNAarraystudyExpDermatol12:213-218Baracetal.(2004)Directinteractionofp21-activatedkinase4withPDZ"RhoGEF,aGprotein-linkedRhoguani'neexchangefactorJ.Biol.Chem.279:6182-6189臺(tái)endottietal.(2004)Activatedp38MAPKisanovelcomponentoftheintracellularinclusionsfoundinhumanamyotrophiclateralsclerosisandmutantSODltransgenicmiceJ.Neuropatbol.Exp.Neurol.63:113-119Bittneretal.(2000)MolecularclassificationofcutaneousmalignantmelanomabygeneexpressionprofilingNature406:536-540Bosticketal.(1999)Prognosticsignificanceofoccultmetastasesdetectedbysentinellymphadencctomyandreversetranscriptase-polymerasechainreactioninearly-stagemelanomapatientsJ.Clin.Oncol.17:3238-324^Brownetal.(2003)MIC'lSerumLevelandGenotype:Ass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5的方法，其中通過(guò)蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白。37.筌定黑素瘤的方法，包括以下步驟a.獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中編碼由選自SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18的引物/探針組識(shí)別的mRNA的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤。38.權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼酪氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平。39.權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括測(cè)重樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平.40.權(quán)利要求39的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979),41.權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平。42.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié)。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié)。44.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述樣品獲自活檢，45.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行。46.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述黑素瘤是微轉(zhuǎn)移。47.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移。48.權(quán)利要求47的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。49.權(quán)利要求47的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%.50.權(quán)利要求47的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%。51.權(quán)利要求47的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%.52.權(quán)利要求47的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。53.權(quán)利要求47的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%.54.權(quán)利要求47的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。55.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá)。56.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量.57.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中通過(guò)從樣品提取的RNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá).58.權(quán)利要求57的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè)，59.權(quán)利要求57的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。60.權(quán)利要求59的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3.61.權(quán)利要求60的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5,62.權(quán)利要求57的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT陽(yáng)PCR)。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑。64.權(quán)利要求57的方法，其中通過(guò)以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。65.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素.66.權(quán)利要求65的方法，其中通過(guò)以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過(guò)粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。68.權(quán)利要求66的方法，其中所述基質(zhì)包括二氣化硅。69.權(quán)利要求64的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。70.權(quán)利要求64的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的。71.權(quán)利要求37、38、39、40或41的方法，其中通過(guò)測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá)。72.權(quán)利要求71的方法，其中通過(guò)蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白，73.區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法，包括以下步驟a.獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中編碼PLAB(SEQIDNO:1)和L1CAM(SEQH)NO:2);或PLAB、LICAM和NTRK3(SEQIDNO:3)的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在惡性黑素瘤。74.權(quán)利要求73的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼輅氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平。75.權(quán)利要求73的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979)。77.權(quán)利要求73的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平。78.權(quán)利要求73、74、75、76或T7的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié)。79.權(quán)利要求"的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié).80.權(quán)利要求73、"、75、76或77的方法，其中所述樣品獲自活檢，81.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行。82.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述黑素瘤是微轉(zhuǎn)移。83.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移。84.權(quán)利要求83的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。85.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%。86.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%。87.權(quán)利要求83的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。88.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。89.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%.卯.90.權(quán)利要求83的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。91.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá).92，權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。93.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中通過(guò)從樣品提取的RNA的聚合醉鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá).94.權(quán)利要求93的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè).95.權(quán)利要求93的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。96.權(quán)利要求95的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3,97.權(quán)利要求96的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。98.權(quán)利要求93的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR).99.權(quán)利要求93的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑.100.權(quán)利要求93的方法，其中通過(guò)以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。101.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素，102.權(quán)利要求101的方法，其中通過(guò)以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過(guò)粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。103.權(quán)利要求102的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。104.權(quán)利要求102的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅。105.權(quán)利要求100的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。106.權(quán)利要求100的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的。107.權(quán)利要求73、74、75、76或77的方法，其中通過(guò)測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá).108.權(quán)利要求107的方法，其中通過(guò)蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白。109.區(qū)分惡性黑素細(xì)胞和良性黑素細(xì)胞的方法，包括以下步驟a,獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中選自SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4陽(yáng)6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18的引物/探針組識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在惡性黑素細(xì)胞。110.權(quán)利要求109的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼賂氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平，111.權(quán)利要求109的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平.112.權(quán)利要求110的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979)。113.權(quán)利要求109的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平.114.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié)。115.權(quán)利要求114的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié)。116.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述樣品獲自活檢，117.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行。118.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述黑素瘤是微轉(zhuǎn)移。119.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移。120.權(quán)利要求119的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。121.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%,122.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%。123.權(quán)利要求119的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。124.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%.125.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%。126.權(quán)利要求119的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。127.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá).128.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。129.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中通過(guò)從樣品提取的RNA的聚合醉鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá)，130.權(quán)利要求129的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè).131.權(quán)利要求129的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。132.權(quán)利要求131的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3,133.權(quán)利要求132的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。134.權(quán)利要求128的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR).135.權(quán)利要求134的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑。136.權(quán)利要求129的方法，其中通過(guò)以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA,137.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素。138.權(quán)利要求136的方法，其中通過(guò)以下步稞減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過(guò)粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。139.權(quán)利要求136的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。140.權(quán)利要求136的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅。141.權(quán)利要求136的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。142.權(quán)利要求136的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的.143.權(quán)利要求109、110、111、112或113的方法，其中通過(guò)測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá).144.權(quán)利要求143的方法，其中通過(guò)蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白，145.確定患者治療方案的方法，包括以下步驟a.從患者獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中編碼PLAB(SEQIDNO:1)和L1CAM(SEQIDNO:2);或PLAB、L1CAM和NTRK3(SEQIDNO:3)的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤。146.權(quán)利要求145的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼璐氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平。147.權(quán)利要求145的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平，148.權(quán)利要求147的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979)。149.權(quán)利要求145的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平。150.權(quán)利要求l45、146、l47、148或149的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié)。151.權(quán)利要求1S0的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié)。152.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中所述樣品獲自活檢。153.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行.154.權(quán)利要求l45、146、147、148或149的方法，其中所述黑素瘤是微轉(zhuǎn)移.155.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移.156.權(quán)利要求I55的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。157.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%。158.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%,159.權(quán)利要求155的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。160.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%,161.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%。162.權(quán)利要求155的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。163.權(quán)利要求l45、146、H7、148或149的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá)。164.權(quán)利要求l45、l46、147、148或149的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。165.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，其中通過(guò)從樣品提取的RNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá).166.權(quán)利要求165的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè)。167.權(quán)利要求165的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán)。168.權(quán)利要求167的方法，其中熒光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3。169.權(quán)利要求168的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。170.權(quán)利要求152的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。171.權(quán)利要求no的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑.172.權(quán)利要求165的方法，其中通過(guò)以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。173.權(quán)利要求145、146、147、148或149的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素.174.權(quán)利要求173的方法，其中通過(guò)以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過(guò)粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。175.權(quán)利要求174的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠。176.權(quán)利要求174的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅.177.權(quán)利要求的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的.178.權(quán)利要求172的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的。179.權(quán)利要求"5、"6、U7、148或149的方法，其中通過(guò)測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá).180.權(quán)利要求的方法，其中通過(guò)蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白。181.確定患者治療方案的方法，包括以下步驟a.從患者獲得組織樣品；和b.測(cè)量樣品中由選自SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15;或SEQIDNOs:4-6或SEQIDNOs:7-9和SEQIDNOs:10-12或SEQIDNOs:13-15和SEQIDNOs:16-18的引物/探針組識(shí)別的基因的表達(dá)水平，其中高于預(yù)定截止水平的基因表達(dá)水平表明樣品中存在黑素瘤。182.權(quán)利要求181的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量編碼酪氨酸酶的基因(SEQIDNO:999)的表達(dá)水平，183.權(quán)利要求181的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量樣品中組成型表達(dá)的基因的表達(dá)水平.184.權(quán)利要求181的方法，其中所述基因編碼PBGD(SEQIDNOs:979).185.權(quán)利要求184的方法，進(jìn)一步包括測(cè)童至少一種編碼相應(yīng)于選自SEQIDNOs:29-978的psid的mRNA的基因的表達(dá)水平。186.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述樣品獲自淋巴結(jié).187.權(quán)利要求1S6的方法，其中所述淋巴結(jié)是崗哨淋巴結(jié)。188.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述樣品獲自活檢。189.權(quán)利要求1M、1M、l83、184或l85的方法，其中所述方法是在手術(shù)中進(jìn)行。190，權(quán)利要求1M、l82、l83、或185的方法，其中所述黑191.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中特異性和靈敏度足夠檢測(cè)黑素瘤的轉(zhuǎn)移。192.權(quán)利要求191的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少95%。193.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%.194.權(quán)利要求1M的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少99%.195.權(quán)利要求191的方法，其中基于蘇木精和伊紅(H&E)和免疫組織化學(xué)(IHC)陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少80%。196.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%.197.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少90%。198.權(quán)利要求191的方法，其中基于H&E和IHC陰性淋巴結(jié)的比較，所述特異性是至少97%，并且基于H&E和IHC陽(yáng)性淋巴結(jié)的比較，所述靈敏度是至少85%。199.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述預(yù)定截止水平是相對(duì)于良性黑素細(xì)胞或正常組織，在具有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的組織中是至少兩倍超量表達(dá)。200.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中所述基因表達(dá)是在微陣列上或基因芯片上測(cè)量。201.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中通過(guò)從樣品提取的RNA的聚合醉鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，從而確定基因表達(dá)。202.權(quán)利要求201的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包含SEQIDNOs:25-28中的至少一個(gè).203.權(quán)利要求201的方法，其中所述PCR產(chǎn)物包括熒光團(tuán).204.權(quán)利要求203的方法，其中突光團(tuán)選自Fam、TexasRed、CalRed、Cl、Cy5和Cy3.205.權(quán)利要求204的方法，其中當(dāng)可應(yīng)用時(shí)，熒光團(tuán)相應(yīng)于PLAB:Fam;L1CAM:TexasRed或CalRed;酪氨酸酶Cl;PBGD:Cy5。206.權(quán)利要求201的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。207.權(quán)利要求206的方法，其中所述RT-PCR進(jìn)一步包括一種或多種內(nèi)部對(duì)照試劑。208.權(quán)利要求201的方法，其中通過(guò)以下步驟從樣品提取RNA:a.將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物；b.使勻漿物與含有或附著了RNA結(jié)合材料的基質(zhì)接觸；c.使RNA與RNA結(jié)合材料結(jié)合；d.在足夠除去任何污染物、干擾物和未結(jié)合的RNA的條件下洗滌基質(zhì)；以及e.從基質(zhì)洗脫未結(jié)合的RNA。209.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，進(jìn)一步包括減少樣品中的黑色素。210.權(quán)利要求209的方法，其中通過(guò)以下步驟減少黑色素濃度將樣品勻漿，產(chǎn)生勻漿物，使勻漿物通過(guò)粘附、結(jié)合或附著了黑色素的基質(zhì)。211.權(quán)利要求210的方法，其中所述基質(zhì)包括聚合物珠.212.權(quán)利要求210的方法，其中所述基質(zhì)包括二氧化硅。213.權(quán)利要求208的方法，其中所述RNA是在少于約8分鐘的時(shí)間中提取的。214.權(quán)利要求208的方法，其中所述RNA是在少于約6分鐘的時(shí)間中提取的，215.權(quán)利要求181、182、183、184或185的方法，其中通過(guò)測(cè)量基因編碼的蛋白而測(cè)量基因表達(dá)。216.權(quán)利要求215的方法，其中通過(guò)蛋白的特異性抗體檢測(cè)蛋白。217.包含至少一種選自SEQIDNOs:4-6，SEQIDNOs:7-9，SEQIDNO:46-48，SEQIDNOs:13-15，SEQIDNOs:16-18，SEQIDNOs:19-21和SEQIDNOs:22-24的引物/探針組的組合物。218.包含至少一種選自SEQIDNOs:25-28的擴(kuò)增子的組合物。219.進(jìn)行分析以確定組織樣品中黑素瘤的存在的試劑盒，包含核酸擴(kuò)增和檢測(cè)試劑。220.權(quán)利要求219的試劑盒，其中所述試劑包括引物，該引物具有用于檢測(cè)編碼選自SEQIDNOs:1-3的mRNA的至少一種基因的表達(dá)的序列。221.權(quán)利要求219的試劑盒，包含RT-PCR試劑。全文摘要通過(guò)確定特定基因的差異表達(dá)是否表示黑素瘤超過(guò)截止值而進(jìn)行鑒定惡性黑素細(xì)胞的分析。該分析可以在手術(shù)中在淋巴結(jié)組織上進(jìn)行。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101258249SQ200580027824公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2005年6月24日優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日發(fā)明者A·馬祖姆德,D·塔蘭托夫,Y·王申請(qǐng)人:維里德克斯有限責(zé)任公司