專利名稱：：參與植物纖維發(fā)育的多核苷酸和多肽和使用它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：和背景本發(fā)明涉及參與植物纖維發(fā)育的多核苷酸和多肽和使用它們的方法。本發(fā)明涉及一種新的計算方法，其利用比較基因組學(xué)來鑒別在纖維發(fā)育中起作用的基因。棉花和棉花副產(chǎn)物提供了用于生產(chǎn)大量基于消費者的產(chǎn)品的原料，所述產(chǎn)品除了紡織品以外，包括棉花糧食、家畜飼料、肥料和紙。僅僅在美國，基于棉花的產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售、消費和貿(mào)易每年產(chǎn)生1000億美元的盈余，從而使棉花成為最增值的農(nóng)作物。據(jù)估計，人類使用棉花作為纖維，在中美洲可以追溯到7000年前，在印度可以追溯到5000年前。即使在最近50年來，有合成纖維的增長，但棉花仍然占世界紡織品纖維的約50％[AgrowReports，GlobalSeedmarketsDS208，October2000]。盡管棉花作為農(nóng)作物的價值的90％存在于纖維(皮棉)，但產(chǎn)量和纖維質(zhì)量已經(jīng)下降，尤其是在最近十年來[Meredith(2000)，Proc.WorldCottonResearchConferenceII，Athens，Greecepp.97-101]。該下降已經(jīng)歸因于棉花品種的遺傳多樣性的普遍侵蝕，和該農(nóng)作物對環(huán)境條件的增加的易損性[Bowman等，CropSci.36577-581(1996)；Meredith，同上]。存在許多棉花植物品種，從它們可以得到具有一系列特征的棉花纖維，并將其用于多種應(yīng)用?？梢愿鶕?jù)許多性質(zhì)來表征棉花纖維，其中有些被認(rèn)為是生產(chǎn)日益高質(zhì)量的產(chǎn)品和最佳地開發(fā)現(xiàn)代紡織技術(shù)的紡織工業(yè)中非常需要的。商業(yè)上需要的性質(zhì)包括長度、長度均勻性、細(xì)度、成熟度比率、減少的棉籽絨生產(chǎn)、馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀、束纖維強度和單纖維強度。已經(jīng)將許多努力用于改良棉花纖維的特征，主要集中在纖維長度和纖維細(xì)度上。具體地，對特定長度的棉花纖維存在大量需求。改良棉花纖維的特征或產(chǎn)量的方法，可以分成下面的三類1.通過雜交育種改良品種到目前為止，該方法已經(jīng)被最廣泛地利用。現(xiàn)在，棉花植物的幾乎所有栽培品種都是通過該方法育種的。但是，使用傳統(tǒng)育種來提高棉花纖維產(chǎn)量相對較慢且效率低，且可以達(dá)到的變異性程度有限。2.利用植物激素處理植物激素，例如生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯，已經(jīng)廣泛地用于大田作物或園藝產(chǎn)品。已知植物激素(尤其是赤霉素、生長素和油菜素內(nèi)酯)對棉花植物的纖維特征的影響[例如美國專利號5880110通過用油菜素類固醇處理生產(chǎn)具有改良的纖維特征的棉花纖維]。但是，尚未記載可測量的作用，從而使得這些激素的大規(guī)模實踐應(yīng)用非常不可能。3.通過基因工程改良品種基因工程改造的棉花在主要生產(chǎn)國的廣泛接受和它是非食物農(nóng)作物的事實，使它成為有吸引力的用于改良纖維產(chǎn)量和/或質(zhì)量的基因工程改造的候選品。近年來，植物基因工程改造已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，結(jié)果，已經(jīng)報道了商業(yè)上重要的農(nóng)作物植物的幾個成功的品種改良的例子(例如，棉花、大豆、玉米、低芥酸芥子、番茄)。例如，已經(jīng)開發(fā)了通過向棉花植物中導(dǎo)入編碼BT毒素(即由蘇云金芽胞桿菌(Baillusthuringensis)生成的殺蟲蛋白毒素)的基因來提高抗蟲性的方法，并將其付諸實際應(yīng)用。另外，通過導(dǎo)入編碼5-烯醇-丙酮酸-莽草酸3-磷酸合成酶的基因，已經(jīng)基因工程改造了具有提高的除草劑(草甘膦)抗性的棉花植物。植物基因工程改造的有效性和成功結(jié)合棉花是通過重組技術(shù)進(jìn)行基因操縱的優(yōu)良候選物的事實，已經(jīng)引導(dǎo)研究人員假設(shè)，如果可以鑒別出與改良的棉花纖維性質(zhì)有關(guān)的基因，則可以使用重組技術(shù)上調(diào)所述基因，從而提高棉花纖維的特征或產(chǎn)量。相反地，如果可以鑒別出與棉花纖維性質(zhì)的降低有關(guān)的基因，則可以使用基因沉默方法下調(diào)所述基因。為此目的，必須在基因水平闡明纖維延長和形成的機理，且必須鑒別出與這些機理密切相關(guān)的基因。棉花纖維由已經(jīng)從種皮的表皮細(xì)胞分化的單個細(xì)胞形成，它的發(fā)育經(jīng)過4個階段，即起始、延長、次生細(xì)胞壁增厚和成熟階段。更具體地，開花后，立即在胚珠的表皮細(xì)胞中開始棉花纖維的延長，此后棉花纖維迅速延長約21天。然后終止纖維延長，形成次生細(xì)胞壁，且生長成熟，以變成成熟的棉花纖維。已經(jīng)分離了幾個與棉花纖維的延長和形成有關(guān)的候選基因。例如，通過差示篩選方法和差示展示方法，已經(jīng)從棉花植物鑒別出在棉花纖維延長階段特異性表達(dá)的5個基因[美國專利號5,880,100和美國專利申請系列號08/580,545、08/867,484和09/262,653]。WO0245485描述了通過調(diào)節(jié)蔗糖合酶(對細(xì)胞壁合成重要的一種糖)在這樣的植物中的活性和/或表達(dá)，調(diào)節(jié)纖維-生產(chǎn)性植物(例如棉花)中的纖維質(zhì)量的方法和工具。美國專利號6,472,588和WO0117333提供了通過用編碼蔗糖磷酸合酶的DNA轉(zhuǎn)化，提高由棉花植物生產(chǎn)的棉花纖維的質(zhì)量的方法。纖維質(zhì)量包括強度、長度、纖維成熟度比率、不成熟纖維含量、纖維均勻性和馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀。WO9508914公開了一種纖維生產(chǎn)性植物，其在它的基因組中包含異源基因構(gòu)建體。該基因構(gòu)建體包含纖維-特異性的啟動子和編碼植物過氧化物酶(例如棉花過氧化物酶)的編碼序列。WO9626639提供了這樣的方法，其中使用子房特異性的啟動子序列來在棉花胚珠組織中表達(dá)植物生長修飾激素。該方法允許修飾棉花植物的棉鈴組(bollset)的特征，并提供改變纖維質(zhì)量特征(例如纖維尺寸和強度)的機理。美國專利號5,981,834、美國專利號5,597,718、美國專利號5,620,882、美國專利號5,521,708和美國專利號5,495,070都公開了基因工程改造纖維-生產(chǎn)性植物的方法，和用于鑒別棉花中的纖維基因的cDNA克隆的鑒別。cDNA克隆可以用于從纖維生產(chǎn)性植物開發(fā)對應(yīng)的基因組克隆，以使得能夠使用這些基因來基因工程改造棉花和其它植物。以有義或反義方向使用來自這些分離的基因的編碼序列，以改變轉(zhuǎn)基因纖維生產(chǎn)性植物的纖維特征。美國專利申請2002049999和2003074697都公開了具有改良的棉花纖維特征的棉屬(Gossypium)的棉花植物。該棉花植物具有一個表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有編碼選自endoxyloglucan轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的酶的基因，從而該基因在棉花纖維細(xì)胞中表達(dá)，以改良棉花纖維特征。WO01/40250提供了通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)來改良棉花纖維質(zhì)量的方法。WO96/40924提供了新DNA構(gòu)建體，其可以用作分子探針，或者可選擇地插入植物宿主，以在棉花纖維發(fā)育的各個階段，提供目標(biāo)DNA序列的轉(zhuǎn)錄的修飾。該DNA構(gòu)建體包含與在棉花纖維中表達(dá)的基因有關(guān)的棉花纖維轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)。還提供了一種新棉花，其具有天然顏色的棉花纖維。通過在棉花纖維細(xì)胞中導(dǎo)入和表達(dá)色素基因構(gòu)建體，實現(xiàn)該顏色。EP0834566提供了一種基因，其控制棉花植物的纖維形成機理，且其可以用于工業(yè)上有用的改良。但是，除了蔗糖合酶以外，迄今為止沒有證明任何特定基因的表達(dá)在棉花纖維形成或增強的纖維特征中起關(guān)鍵作用。因而，仍然需要鑒別與棉花植物的纖維特征有關(guān)的其它基因，且需要更徹底地搜索質(zhì)量-相關(guān)的基因。在將本發(fā)明變?yōu)閷嵺`的同時，發(fā)明人設(shè)計和采用了新的計算方法，其利用比較基因組學(xué)來鑒別在纖維發(fā)育中起關(guān)鍵作用的基因。如本文所證實的，這樣的基因的表達(dá)與纖維長度相關(guān)，且它們的超表達(dá)足以修飾番茄種子纖維，棉花纖維的最終模型。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的多核苷酸可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花植物，其特征在于所需長度的纖維。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了分離的多核苷酸，其包含編碼具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列的多肽的核酸序列，其中該多肽能調(diào)節(jié)棉花纖維發(fā)育。根據(jù)下述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的其它特征，核酸序列選自SEQIDNO.1、2、4、5、7、9、10、16、17、20、21、22、24、25、27和13。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，多肽如SEQIDNO.26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96所述。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，氨基酸序列如SEQIDNO.26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96所述。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，棉花纖維發(fā)育包含纖維形成。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，棉花纖維發(fā)育包含纖維延長。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的多核苷酸，其包含與SEQIDNO85或91具有至少80％同一性的核酸序列，其中該核酸序列能調(diào)節(jié)至少一個可操作地與其連接的多核苷酸序列在胚珠內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，胚珠內(nèi)皮細(xì)胞是植物纖維或毛狀體的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了寡核苷酸，其能與分離的多核苷酸特異性地雜交。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包含分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，核酸構(gòu)建體還包含至少一個可操作地連接到分離的多核苷酸上的順式-作用調(diào)節(jié)元件。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，多核苷酸序列選自SEQIDNO1、2、4、5、7、9、10、16、17、20、21、22、24、25、27和13。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，順式-作用調(diào)節(jié)元件如SEQIDNO74、75、85或91或其功能等同物所述。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包含核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了包含核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了提高纖維生產(chǎn)性植物的纖維質(zhì)量和/或產(chǎn)量的方法，該方法包含，調(diào)節(jié)至少一種編碼多肽的多核苷酸在纖維生產(chǎn)性植物中的表達(dá)水平或活性，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列，從而提高纖維生產(chǎn)性植物的質(zhì)量和/或產(chǎn)量。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，纖維生產(chǎn)性植物的質(zhì)量包含至少一個選自下述的參數(shù)纖維長度、纖維強度、每單位長度的纖維重量、成熟度比率、均勻性和馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，調(diào)節(jié)至少一種多核苷酸的表達(dá)或活性是上調(diào)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，通過向棉花中導(dǎo)入核酸構(gòu)建體，實現(xiàn)上調(diào)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，調(diào)節(jié)至少一種多核苷酸的表達(dá)或活性是下調(diào)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，通過基因沉默，實現(xiàn)下調(diào)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，通過向棉花中導(dǎo)入寡核苷酸，實現(xiàn)基因沉默。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，纖維生產(chǎn)性植物選自棉花、絲綿樹(木棉花，吉貝(Ceibapentandra))、沙漠柳樹、石炭酸灌木(creosotebush)、winterfat、輕木(balsa)、苧麻、洋麻、大麻、洛神葵、黃麻、sisalabaca和亞麻。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了增加植物的生物量的方法，該方法包含，調(diào)節(jié)至少一種編碼多肽的多核苷酸在植物中的表達(dá)水平或活性，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列，從而增加該植物的生物量。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，該植物是單子葉植物。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，該植物是雙子葉植物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因的方法，該方法包含(a)提供源自棉花纖維的表達(dá)的核酸序列；(b)提供源自胚珠組織的表達(dá)的核酸序列；(c)計算地裝配(a)和(b)的表達(dá)的核酸序列，以產(chǎn)生簇；和(d)鑒別簇中包含(a)和(b)的表達(dá)的核酸序列的簇，從而鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，該方法還包含，在(d)之后，鑒別在棉花纖維中有差異地表達(dá)的基因。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的其它特征，有差異地表達(dá)包含(a)特異性的表達(dá)；和/或(b)表達(dá)隨纖維發(fā)育的變化。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了生產(chǎn)昆蟲抗性植物的方法，其包含調(diào)節(jié)至少一種編碼多肽的多核苷酸在植物的毛狀體中的表達(dá)水平或活性，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列，從而生產(chǎn)昆蟲抗性植物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了生產(chǎn)棉花纖維的方法，該方法包含(a)產(chǎn)生表達(dá)至少一種多肽的轉(zhuǎn)基因棉花植物，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列；和(b)收獲轉(zhuǎn)基因棉花植物的纖維，從而生產(chǎn)棉花纖維。本發(fā)明通過提供參與棉花纖維發(fā)育的基因和使用它們的方法，成功地解決了現(xiàn)在已知的構(gòu)型的缺點。除非另有定義，在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或等同的方法和材料可以用于實踐或測試本發(fā)明，但下面描述了合適的方法和材料。在沖突的情況下，以專利說明書、包括定義為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實施例僅僅用于解釋，而無意進(jìn)行限制。附圖簡述僅僅作為實例，參考附圖，描述了本發(fā)明?，F(xiàn)在，具體地參考附圖，應(yīng)當(dāng)強調(diào)，顯示的細(xì)節(jié)是作為實例，且僅僅用于本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的說明性討論，描述它們的原因是，提供被認(rèn)為是最有用的、且最容易地理解的本發(fā)明的原理和概念方面的描述的那些內(nèi)容。在這點上，不嘗試超過基本上理解本發(fā)明所需的詳細(xì)程度來顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，其中說明書和附圖使本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白如何在實踐中實現(xiàn)本發(fā)明的幾種形式。在附圖中圖1是描述實現(xiàn)鑒別可以用于提高棉花纖維產(chǎn)量和質(zhì)量的基因的本發(fā)明的生物信息學(xué)方法的圖解。圖2a-d是顯示纖維特異性的基因(CT_11圖2b)、延長相關(guān)基因(CT_1，圖2c)和起始相關(guān)基因(CT_22，圖2d)的表達(dá)模式的條線圖。圖3是描述CT_76在棉花品種(陸地棉(G.hirsutum)Tamcot、Coker和Acala變種，和海島棉(G.barbadense)PimaS5變種)植物中的表達(dá)的圖，如通過RT-PCR所測得的。圖4是pPi二元質(zhì)粒的示意圖。圖5a-l是超表達(dá)本發(fā)明的基因的野生型和轉(zhuǎn)基因鼠耳芥(arabidopsis)植物的照片。圖5a顯示了野生型植物的2周齡瓣狀體(rosette)；圖5b顯示了CT11超表達(dá)的鼠耳芥植物的2周齡瓣狀體；圖5c顯示了CT11的2周齡根；圖5d顯示了3周齡野生型鼠耳芥；圖5e顯示了3周齡CT_20；圖5f顯示了3周齡CT_22；圖5g顯示了野生型和CT_9的30天齡瓣狀體；圖5h顯示了野生型和CT_9的30天花序；圖5i顯示了CT9的2周齡根；圖5j顯示了野生型和CT_40的30天齡瓣狀體；圖5k顯示了野生型和CT81超表達(dá)的植物的5周齡瓣狀體；圖5l顯示了野生型和CT81超表達(dá)的鼠耳芥植物的葉子；圖6a-e是描繪超表達(dá)CT_20的野生型和轉(zhuǎn)基因番茄植物的照片。圖6a顯示了野生型植物的葉子；圖6b顯示了CT_20轉(zhuǎn)基因番茄的葉子；圖6c顯示了野生型和CT_20超表達(dá)的番茄植物的種子纖維；圖6d顯示了野生型番茄種子的切片；圖6e顯示了CT_20超表達(dá)的番茄種子的切片；圖6f是野生型和CT_82的種子纖維。圖7a-b是描繪在CT_2啟動子的表達(dá)下超表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)基因番茄植物的照片。圖7a是在CT2啟動子下超表達(dá)GUS的成熟綠色階段的剪斷的轉(zhuǎn)基因番茄果實(x5放大倍數(shù))。圖7b類似于圖7a，顯示了x25放大倍數(shù)；圖8a-b是描繪野生型和轉(zhuǎn)基因番茄果實或番茄種子的各種放大倍數(shù)的照片。圖8a是單個的覆蓋有種子纖維的野生型番茄種子，x10放大倍數(shù)；圖8b顯示了在35S下超表達(dá)蘋果青霉素的番茄種子(x10放大倍數(shù))。優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明涉及多肽和編碼它們的多核苷酸，其參與植物纖維發(fā)育，且可以用于提高纖維生產(chǎn)性植物的纖維質(zhì)量和/或產(chǎn)量/生物量。參考附圖和伴隨的描述，可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的應(yīng)用不限于在下面描述中所示或?qū)嵤├纠募?xì)節(jié)。本發(fā)明能有其它實施方案，或能以各種方式實踐或?qū)崿F(xiàn)。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，本文中采用的措辭和術(shù)語是用于描述目的的，而不應(yīng)當(dāng)視作限制。棉花和棉花副產(chǎn)物提供了用于生產(chǎn)大量基于消費者的產(chǎn)品的原料，除了紡織品以外，棉花被用于生產(chǎn)糧食、家畜飼料、肥料和紙。僅僅在美國，基于棉花的產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售、消費和貿(mào)易每年產(chǎn)生1000億美元的盈余，從而使棉花成為最增值的農(nóng)作物。在過去的十年中，棉花纖維生產(chǎn)急劇下降，從而促使棉花種植者和研究人員尋找可以用于提高纖維產(chǎn)量和質(zhì)量的方法。增加不同環(huán)境條件下的纖維質(zhì)量和/或產(chǎn)量，會增加棉花農(nóng)作物生產(chǎn)的收益性，并提供新范圍的用于加工業(yè)的材料性質(zhì)。在將本發(fā)明變?yōu)閷嵺`時，發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計了新的計算方法，其利用比較基因組學(xué)來鑒別在纖維發(fā)育中起作用的基因。使用該方法鑒別出的基因可以成功地用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所需性質(zhì)的纖維。因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因的方法。如本文所使用的，術(shù)語“棉花”指野生型、栽培品種(例如，雜種)或轉(zhuǎn)基因棉花(棉屬)植物。如本文所使用的，短語“纖維發(fā)育”指棉花種子纖維的發(fā)育。如本文所使用的，當(dāng)在棉花纖維的上下文中使用時，術(shù)語“發(fā)育”指纖維的起始和/或其延長，以及纖維次生細(xì)胞壁增厚和成熟。如下實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法(a)提供源自棉花纖維的表達(dá)的核酸序列；(b)提供源自胚珠組織(即從種子植物的子房發(fā)育的組織。實例包括但不限于心皮、種皮、胚、胚乳)的表達(dá)的核酸序列；(c)計算地裝配(a)和(b)的表達(dá)的核酸序列，以產(chǎn)生簇；和(d)鑒別所述簇中包含(a)和(b)的表達(dá)的核酸序列的簇，從而鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因。根據(jù)本發(fā)明的該方面，用作鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因的潛在來源的表達(dá)的核酸序列，優(yōu)選地是從組織或細(xì)胞系制劑得到的表達(dá)的信使RNA[即已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)、cDNA克隆、毗連群、信使mRNA前體等]的文庫，其可以包括基因組和/或cDNA序列?？梢詮默F(xiàn)有的可公開得到的數(shù)據(jù)庫(見下面的實施例部分的實施例1，或私有的數(shù)據(jù)庫)，檢索根據(jù)本發(fā)明的該方面的表達(dá)的核酸序列?；蛘?，可以從序列文庫(例如，cDNA文庫、EST文庫、mRNA文庫和其它文庫)，產(chǎn)生本發(fā)明使用的表達(dá)的核酸序列。cDNA文庫是表達(dá)的序列信息的合適來源。在這樣的情況下，一般地通過組織或細(xì)胞樣品制備、RNA分離、cDNA文庫構(gòu)建和測序，產(chǎn)生序列數(shù)據(jù)庫。應(yīng)當(dāng)明白，可以從分離自完整植物、特定組織或細(xì)胞群體的RNA，構(gòu)建這樣的cDNA文庫。一旦從棉花纖維和胚珠組織得到表達(dá)的序列數(shù)據(jù)，就可以使序列成簇，以形成毗連群。見下面的實施例部分的實施例1。然后裝配這樣的毗連群，以鑒別存在于同一簇中的(棉花纖維和胚珠組織的)同源序列，認(rèn)為這樣的毗連群參與棉花纖維發(fā)育?？缮虡I(yè)上得到許多能形成表達(dá)的序列的簇的常用的計算機軟件片段閱讀裝配器。這些包包括但不限于，TIGR裝配器[SuttonG.等(1995)GenomeScienceandTechnology19-19]、GAP[BonfieldJK.等(1995)NucleicAcidsRes.234992-4999]、CAP2[HuangX.等(1996)Genomics3321-31]、TheGenomeConstructionManager[LaurenceCB.等(1994)Genomics23192-201]、BioImageSequenceAssemblyManager、SeqMan[SwindellSR.和PlastererJN.(1997)MethodsMoLBiol.7075-89]、LEADS和GenCarta(CompugenLtd.以色列)。一旦鑒別出參與棉花纖維發(fā)育的基因，就可以如下面的實施例部分的實施例2所述，分析它們的表達(dá)模式，從而鑒別在棉花纖維中(即特異性表達(dá))或在棉花纖維發(fā)育過程中(即在棉花纖維發(fā)育過程中表達(dá)的變化)有差別地表達(dá)的基因。鑒別有差別地表達(dá)的基因的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。使用上述的方法，發(fā)明人能成功地鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因。如下面的實施例部分所述，根據(jù)它們與已知蛋白和酶的序列同源性，使用本發(fā)明的教導(dǎo)鑒別出的基因可以分成6個功能類(下面的表3)。2個基因歸入細(xì)胞命運定型類與已知參與鼠耳芥的毛狀體發(fā)育的MYB轉(zhuǎn)錄因子和GL3同源。2個基因的表達(dá)模式和鼠耳芥和番茄T1植物兩者中的CT20轉(zhuǎn)基因的表型，支持它們主要在起始階段的參與。2個其它的基因(下面的表3)是來自MYB和MADSBOX家族的轉(zhuǎn)錄因子。許多研究證實了這2個轉(zhuǎn)錄因子家族作為在不同發(fā)育過程(其中有毛狀體和纖維形態(tài)發(fā)生)中起關(guān)鍵作用的同源異型基因的功能(Suo.J.等2003，F(xiàn)errarioS等2004)。它們在纖維發(fā)育的早期階段的作用，也得到它們的RNA表達(dá)模式的支持，所述表達(dá)模式在開花那天之前和過程中誘導(dǎo)。一個基因?qū)儆诘矸酆驼崽谴x途徑。近期的工作證實，屬于該途徑的另一個基因(SUS)，是纖維起始和發(fā)育的限制因子。另一個基因(下面的表3)歸入脂質(zhì)運輸，其RNA表達(dá)在早期的纖維延長階段高度誘導(dǎo)，這與脂質(zhì)是纖維形成的關(guān)鍵組分的事實相符合。幾個基因(下面的表3)分類成參與脫水、脫落酸刺激的鹽度反應(yīng)的基因和參與電子轉(zhuǎn)移的基因。從它們中，通過要在延長階段誘導(dǎo)的RNA表達(dá)模式，選擇3個基因。考慮到上述內(nèi)容以及將基因表達(dá)與纖維長度相關(guān)聯(lián)的實驗結(jié)果，暗示著本發(fā)明的基因可以用于產(chǎn)生具有商業(yè)上需要的纖維質(zhì)量的纖維生產(chǎn)性植物。因而，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的方法鑒別的多核苷酸和它們編碼的多肽以及在本文中鑒別的多肽的功能等同物(即，能調(diào)節(jié)棉花纖維發(fā)育的多肽，如根據(jù)下面的實施例部分所述的測定所測得的)和它們的編碼序列。這樣的功能等同物可以與SEQIDNO106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、95或96具有至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約75％、至少約75％、至少約75％、至少約75％、約100％同源性。編碼功能等同物的多核苷酸可以與SEQIDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或27具有至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約75％、至少約75％、至少約75％、至少約75％、約100％的同一性。使用任意的同源性對比軟件，包括，例如，國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation)(NCBI)的BlastP軟件，例如通過使用默認(rèn)參數(shù)，可以確定同源性(例如，百分比同源性)。使用任意的同源性對比軟件，包括，例如，國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BlastN軟件，例如通過使用默認(rèn)參數(shù)，可以確定同一性(例如，百分比同源性)。如本文所使用的，短語“分離的多核苷酸”指分離的且以RNA序列、互補的多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合的多核苷酸序列(例如，上述的組合)的形式提供的單鏈的或雙鏈的核酸序列。如本文所使用的，短語“互補的多核苷酸序列”指這樣的序列，它由使用逆轉(zhuǎn)錄酶或任何其它依賴于RNA的DNA聚合酶來逆轉(zhuǎn)錄信使RNA產(chǎn)生。隨后，可以使用依賴于DNA的DNA聚合酶，體內(nèi)或體外擴增這樣的序列。如本文所使用的，短語“基因組多核苷酸序列”指從染色體衍生(分離)的序列，因而它代表著染色體的鄰接部分。如本文所使用的，短語“復(fù)合的多核苷酸序列”指這樣的序列，它是至少部分地互補的，且至少部分地基因組的。復(fù)合的序列可以包括編碼本發(fā)明的多肽所需的一些外顯子序列，以及插入其中的一些內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以是任意的來源的，包括其它基因的，且一般地包括保守的剪接信號序列。這樣的內(nèi)含子序列還可以包括順式作用表達(dá)調(diào)節(jié)元件。根據(jù)本發(fā)明的該方面的一個優(yōu)選實施方案，核酸序列如SEQIDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、19、21、22、23、24、25或26所述。根據(jù)本發(fā)明的該方面的另一個優(yōu)選實施方案，分離的多核苷酸如SEQIDNO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或27所述。根據(jù)本發(fā)明的該方面的另一個優(yōu)選實施方案，多肽如SEQIDNO106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、95或96所述。根據(jù)本發(fā)明的該方面的另一個優(yōu)選實施方案，氨基酸序列如SEQIDNO106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、95或96所述。使用雜交測定，在中等至嚴(yán)格的雜交條件下，在有寡核苷酸探針或引物存在下，通過溫育上述的分離的多核苷酸，也可以定量本發(fā)明的該方面的分離的多核苷酸。中等至嚴(yán)格的雜交條件的特征在于雜交溶液，例如含有10％硫酸葡聚糖、1MNaCl、1％SDS和5×106cpm32P標(biāo)記的探針，在65℃，使用0.2×SSC和0.1％SDS的最終洗滌溶液，在65℃最終洗滌，然而如下實現(xiàn)中等雜交使用含有10％硫酸葡聚糖、1MNaCl、1％SDS和5×106cpm32P標(biāo)記的探針的雜交溶液，在65℃，使用1×SSC和0.1％SDS的最終洗滌溶液，和在50℃最終洗滌。因而，本發(fā)明包括上文所述的核酸序列；其片段，可與其雜交的序列，與其同源的序列，編碼類似的具有不同密碼子選擇的多肽的序列，特征在于突變的改變的序列，所述突變例如，缺失、插入或置換一個或多個核苷酸，無論是天然發(fā)生的還是人工誘導(dǎo)的，無論是隨機地還是以靶定的方式。由于本發(fā)明的多核苷酸序列編碼以前未鑒別的多肽，所以本發(fā)明也包括由上文所述的分離的多核苷酸和其各自核酸片段編碼的新多肽或其部分。因而，本發(fā)明也包括由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的多肽。這些新多肽的氨基酸序列如SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96所述。本發(fā)明也包括這些多肽的同源物，這樣的同源物可以與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96具有至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或更進(jìn)一步約100％的同源性。本發(fā)明也包括上述多肽和具有突變的多肽的片段，所述突變例如，缺失、插入或置換一個或多個氨基酸，無論是天然發(fā)生的還是人工誘導(dǎo)的，無論是隨機地還是以靶定的方式。在棉花纖維的至少一個結(jié)構(gòu)參數(shù)例如纖維長度或纖維細(xì)度或纖維生長速率上，可以直接確定本發(fā)明的多核苷酸和它們的產(chǎn)物調(diào)節(jié)棉花纖維發(fā)育的能力(下文進(jìn)一步描述)。但是，通過例如用于棉花纖維發(fā)育的植物模型系統(tǒng)，也可以間接確定棉花纖維發(fā)育。例如，已經(jīng)充分確立，毛狀體細(xì)胞和根毛與棉花纖維細(xì)胞共有共同的特征，且同樣可以用作棉花纖維發(fā)育的模型系統(tǒng)[綜述見Wagner.GJ.等(2004)]，如在下面的實施例部分的實施例12中詳細(xì)證實的。通過分析表達(dá)特征，發(fā)明人能確定本發(fā)明的生物分子序列(即多核苷酸和多肽)在纖維起始和/或延長中的參與。通過確立基因表達(dá)和纖維長度之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步證實了這些結(jié)果(見實施例7)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的生物分子序列(例如，多核苷酸、多肽、啟動子、寡核苷酸、抗體，在本文中也稱作試劑)可以用于提高纖維生產(chǎn)性植物的纖維質(zhì)量和/或產(chǎn)量。因而，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了提高纖維生產(chǎn)性植物的纖維質(zhì)量和/或產(chǎn)量的方法。如下實現(xiàn)本發(fā)明的該方面的方法調(diào)節(jié)至少一種本發(fā)明的多核苷酸或多肽(上文所述的)在纖維生產(chǎn)性植物中的表達(dá)水平或活性，從而提高纖維生產(chǎn)性植物的質(zhì)量和/或產(chǎn)量。如本文所使用的，短語“纖維生產(chǎn)性植物”指共有下述共同特征的植物具有伸長的形狀和厚細(xì)胞壁(一般地稱作次生壁)中豐富的纖維素。這樣的壁可以是或不是木質(zhì)化的，且這樣的細(xì)胞的原生質(zhì)體可以在成熟時是或不是有生活力的。這樣的纖維具有許多工業(yè)用途，例如木材和加工好的木材產(chǎn)品、紙、紡織品、麻袋布和拳擊材料、繩索、刷子和掃帚、填料和填充劑(stuffing)、填縫材料、其它材料的加強和纖維素衍生物的生產(chǎn)。根據(jù)本發(fā)明的該方面的一個優(yōu)選實施方案，纖維生產(chǎn)性植物是棉花。術(shù)語“纖維”通常包括厚壁傳導(dǎo)細(xì)胞例如導(dǎo)管和管胞，和許多單個的纖維細(xì)胞的纖絲聚集體。因此，術(shù)語“纖維”指(a)木質(zhì)部的厚壁傳導(dǎo)和非-傳導(dǎo)細(xì)胞；(b)木質(zhì)部外起源的纖維，包括來自韌皮部、樹皮、基本組織和表皮的那些；和(c)來自莖、葉子、根、種子和花或花序的纖維(例如在刷子和掃帚的生產(chǎn)中使用的蜀黍(Sorghumvulgare)的那些)。纖維生產(chǎn)性植物的實例包括但不限于，農(nóng)作物，例如棉花、絲綿樹(木棉花，吉貝)、沙漠柳樹、石炭酸灌木、winterfat、輕木、洋麻、洛神葵、黃麻、sisalabaca、亞麻、玉米、甘蔗、大麻、苧麻、木棉花、椰子殼纖維(coir)、竹子、鐵蘭和龍舌蘭屬(Agave)物種(例如波羅麻)。如本文所使用的，短語“纖維質(zhì)量”指農(nóng)業(yè)上需要的或纖維工業(yè)中需要的至少一個纖維參數(shù)(下文進(jìn)一步描述)。這樣的參數(shù)的實例包括但不限于，纖維長度、纖維強度、纖維適合度、每單位長度的纖維重量、成熟度比率和均勻性(下文進(jìn)一步描述)。一般地根據(jù)纖維長度、強度和細(xì)度測量棉花纖維(皮棉)質(zhì)量。因此，當(dāng)纖維更長、更強和更細(xì)時，認(rèn)為皮棉質(zhì)量更高。如本文所使用的，短語“纖維產(chǎn)量”指從纖維生產(chǎn)性植物生產(chǎn)的纖維的量。如本文所使用的，術(shù)語“提高”指，與天然植物(即未用本發(fā)明的生物分子序列修飾)相比，纖維質(zhì)量/產(chǎn)量變化至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％。如本文所使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”指上調(diào)、下調(diào)或其組合。例如，當(dāng)需要增加纖維纖度時，可以如下實現(xiàn)本發(fā)明上調(diào)至少一種本發(fā)明的參與纖維起始的多核苷酸(例如，SEQIDNO4、10、9、12、16和25)?；蛘撸?dāng)需要短纖維時，例如，在玉米中，則如下實現(xiàn)本發(fā)明下調(diào)至少一種本發(fā)明的參與纖維延長的多核苷酸(例如，SEQIDNO.1、2、3、5、6、7、17、18、19、20、21、22、23、24和27)?；蛘撸梢匀缦聦崿F(xiàn)本發(fā)明上調(diào)至少一種本發(fā)明的多核苷酸(例如參與纖維延長)的表達(dá)和下調(diào)至少一種本發(fā)明的多核苷酸(例如參與纖維延長)。以此方式，可以得到具有提高的每種短長度的纖維產(chǎn)量的纖維生產(chǎn)性植物。依靠調(diào)節(jié)至少一種本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)水平，可以在基因組水平(例如，借助于啟動子、增強子或其它調(diào)節(jié)元件，來激活轉(zhuǎn)錄)、轉(zhuǎn)錄物水平或蛋白水平實現(xiàn)本發(fā)明。下面是能上調(diào)本發(fā)明的生物分子序列(即核酸或蛋白序列)的表達(dá)水平和/或活性的試劑的不完全列表。能上調(diào)目標(biāo)多核苷酸的表達(dá)的試劑可以是外源多核苷酸序列，其設(shè)計或構(gòu)建成用于表達(dá)其至少功能部分(例如，提高纖維產(chǎn)量/質(zhì)量、增加生物量等)。因此，外源多核苷酸序列可以是編碼多肽分子的DNA或RNA序列，其能提高纖維產(chǎn)量或量?；蛘撸庠炊嗪塑账峥梢允琼樖阶饔谜{(diào)節(jié)區(qū)(例如，SEQIDNO74、75、85、88或91)，其可以被導(dǎo)入植物中來增加參與纖維發(fā)育的任何多核苷酸的表達(dá)(例如，蔗糖磷酸合酶，如美國專利號6,472,588所述)。為了在植物細(xì)胞中表達(dá)外源多核苷酸，優(yōu)選地將本發(fā)明的多核苷酸序列連接進(jìn)適合于植物細(xì)胞表達(dá)的核酸構(gòu)建體中。這樣的核酸構(gòu)建體包括順式作用調(diào)節(jié)區(qū)，例如用于指導(dǎo)多核苷酸序列在細(xì)胞中以組成型的或誘導(dǎo)型的方式轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。啟動子可以與轉(zhuǎn)化的植物/細(xì)胞同源或異源?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的該方面使用的優(yōu)選啟動子序列是內(nèi)皮細(xì)胞啟動子。例如，本發(fā)明的每種多核苷酸序列的啟動子序列可以優(yōu)選地用于本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中。根據(jù)本發(fā)明的該方面的一個優(yōu)選實施方案，啟動子與SEQIDNO.85或91是至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％同一性的，其能調(diào)節(jié)至少一個可操作地與其連接的多核苷酸序列在胚珠內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)(即能對與其連接的編碼序列產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用)。從下面的實施例部分可以清楚地看出，這樣的啟動子序列能調(diào)節(jié)與其可操作地連接的編碼核酸序列(例如，GUS)的表達(dá)。棉花纖維-增強的啟動子的其它實例包括棉花纖維-表達(dá)的基因E6(John等，PlantMol.Biol.，30297-306(1996)和John等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9312768-12773(1996)e)、H6(John等，PlantPhysiol.，108669-676，(1995))、FbL2A(Rinehart等，PlantPhysiol.，1121331-1341(1996)和John等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9312768-12773(1996))、rac(Delmer等，Mol.Gen.Genet，24843-51(1995))；CelA(Pear等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，9312637-12642(1996))；CAP(Kawai等，PlantCellPhysiol.391380-1383(1998))；ACP(Song等，Biochim.Biophys.Acta1351305-312(1997)；和LTP(Ma等，Biochim.Biophys.Acta1344111-114(1997))的啟動子。美國專利號5,495,070公開了其它棉花纖維特異性的啟動子?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的該方面使用的其它啟動子是能確保僅在特定器官(例如葉子、根、塊莖、種子、莖、花)或特定細(xì)胞類型(例如薄壁組織、表皮、毛狀體或維管細(xì)胞)中表達(dá)的那些。在EvogeneLtd的WO2004/111183中，公開了優(yōu)選的用于增強毛狀體細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子。優(yōu)選的增強維管組織中的表達(dá)的啟動子包括CAD2啟動子(Samaj等，Planta，204437-443(1998))、Pt4C11啟動子(Hu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955407-5412(1998))、C4H啟動子(Meyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，956619-6623(1998))、PtX3H6和PtX14A9啟動子(Loopstra等，PlantMol.Biol.，27277-291(1995))、RolC啟動子(Graham，PlantMol.Biol.，33729-735(1997))、Hvhsp17啟動子(Raho等，J.Expt.Bot，471587-1594(1996))和COMT啟動子(Capellades等，PlantMol.Biol.，31307-322(1996))。優(yōu)選的增強莖組織中的表達(dá)的啟動子包括pith啟動子(Datta，Theor.Appl.Genet.，9720-30(1998)和Ohta等，Mol.Gen.Genet.，225369-378(1991))和陰離子過氧化物酶啟動子(Klotz等，PlantMol.Biol.，36509-520(1998))。優(yōu)選的增強韌皮部、樹皮和木栓而不是木質(zhì)部或髓中的表達(dá)的啟動子包括Psam-1啟動子(Mijnsbrugge等，PlantandCellPhysiol.，371108-1115(1996))。優(yōu)選的增強種子中的表達(dá)的啟動子包括phas啟動子(Geest等，PlantMol.Biol.32579-588(1996))；GluB-1啟動子(Takaiwa等，PlantMol.Biol.301207-1221(1996))；γ-玉米醇溶蛋白啟動子(Torrent等PlantMol.Biol.34139-149(1997))和油質(zhì)蛋白啟動子(Sarmiento等，ThePlantJournal11783-796(1997))。在EvogeneLtd的WO2004/081173中，公開了可以介導(dǎo)組成型的、誘導(dǎo)型的、組織-特異性的或發(fā)育階段-特異性的表達(dá)的其它啟動子序列。也可以使用截短的或合成的啟動子，包括賦予組織-增強的表達(dá)的特定核苷酸區(qū)，如通過賦予木質(zhì)部-增強的表達(dá)的大啟動子內(nèi)的調(diào)節(jié)元件的鑒別所例證的(Seguin等，PlantMol.Biol.，35281-291(1997)；Torres-Schumann等，ThePlantJournal，9283-296(1996)；和Leyva等，ThePlantCell，4263-271(1992))。核酸構(gòu)建體可以是，例如，質(zhì)粒、桿粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體，更優(yōu)選地，是二元載體。短語“二元載體”指一種表達(dá)載體，其攜帶修飾的來自Ti質(zhì)粒的T-區(qū)，其能在大腸桿菌(E.coli)和土壤桿菌(Agrobacterium)細(xì)胞中繁殖，且通常包含2個邊界區(qū)之間的植物轉(zhuǎn)化的報告基因。適用于本發(fā)明的二元載體包括pBI2113、pBI121、pGA482、pGAH、pBIG、pBI101(Clonetech)、pPI(見下面的實施例部分的實施例5)或其修飾。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，細(xì)菌、植物)或植物。如本文所使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化的”可互換地使用，指向其中已經(jīng)轉(zhuǎn)移了克隆的遺傳材料的細(xì)胞或植物。在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化中，本發(fā)明的核酸分子整合進(jìn)植物基因組，且同樣它代表著穩(wěn)定的且可遺傳的性狀。在瞬時轉(zhuǎn)化中，核酸分子由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表達(dá)，但是未整合進(jìn)基因組中，且同樣代表著瞬時性狀。存在多種將外來基因?qū)雴巫尤~和雙子葉植物的方法(Potrykus，I.(1991).AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol42，205-225；Shimamoto，K.等(1989).Fertiletransgenicriceplantsregeneratedfromtransformedprotoplasts.Nature(1989)338，274-276)。外源DNA向植物基因組DNA中的穩(wěn)定整合的基本方法包括2個主要方法(i)土壤桿菌-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。見Klee，H.J.等(1987).AnnuRevPlantPhysiol38，467-486；Klee，H.J.和Rogers，S.G.(1989).CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants，Vol.6，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes，pp.2-25，J.Schell和L.K.Vasil，編，AcademicPublishers，SanDiego，Cal.；和Gatenby，A.A.(1989).RegulationandExpressionofPlantGenesinMicroorganisms，pp.93-112，PlantBiotechnology，S.Kung和C.J.Arntzen，編，ButterworthPublishers，Boston，Mass。(ii)直接DNA攝入。見，例如Paszkowski，J.等(1989).CellCultureandSomaticCellGeneticsofPlants，Vol.6，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes，pp.52-68，J.Schell和L.K.Vasil，編，AcademicPublishers，SanDiego，Cal.；和Toriyama，K.等(1988).Bio/Technol6，1072-1074(methodsfordirectuptakeofDNAintoprotoplasts)。也見Zhang等(1988).PlantCellRep7，379-384；和Fromm，M.E.等(1986).Stabletransformationofmaizeaftergenetransferbyelectroporation.Nature319，791-793(DNAuptakeinducedbybriefelectricshockofPlantCells).也見Klein等(1988).Bio/Technology6，559-563；McCabe，D.E.等(1988).Stabletransformationofsoybean(Glycinemax)byparticleacceleration.Bio/Technology6，923-926；和Sanford，J.C.(1990).Biolisticplanttransformation.PhysiolPlant79，206-209(DNAinjectionintoPlantCellsortissuesbyparticlebombardment).也見Neuhaus，J.M.等(1987).TheorApplGenet75，30-36；和Neuhaus，J.M.和Spangenberg，G.C.(1990).PhysiolPlant79，213-217(使用微量移液管系統(tǒng))。見美國專利號5,464,765(glassfibersorsiliconcarbidewhiskertransformationofcellcultures，embryosorcallustissue)。也見DeWet，J.M.J.等(1985).“Exogenousgenetransferinmaize(Zeamays)usingDNA-treatedpollen，”ExperimentalManipulationofOvuleTissue，G.P.Chapman等，編，Longman，NewYork-London，pp.197-209；和Ohta，Y.(1986).High-EfficiencyGeneticTransformationofMaizebyaMixtureofPollenandExogenousDNA.ProcNatlAcadSciUSA83，715-719(directincubationofDNAwithgerminatingpollen)。土壤桿菌-介導(dǎo)的系統(tǒng)包括使用質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體含有整合進(jìn)植物基因組DNA中的定義的DNA片段。接種植物組織的方法依賴于植物物種和土壤桿菌送遞系統(tǒng)而異。廣泛使用的方法是葉-盤(leaf-disc)方法，其可以用能提供用于完整-植物分化的起始的良好來源的任意組織外植體進(jìn)行(Horsch，R.B.等(1988).“Leafdisctransformation.”PlantMolecularBiologyManualA5，1-9，KluwerAcademicPublishers，Dordrecht)。一種補充方法采用與真空滲入相結(jié)合的土壤桿菌送遞系統(tǒng)。土壤桿菌系統(tǒng)特別適用于建立轉(zhuǎn)基因的雙子葉植物。存在各種指導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞中的方法。在電穿孔中，簡單地將原生質(zhì)體暴露于強電場中，從而打開小孔以允許DNA進(jìn)入。在顯微注射中，使用微量移液管，將DNA直接機械地注射進(jìn)細(xì)胞中。在微粒轟擊中，將DNA吸附到微粒(例如硫酸鎂晶體或鎢顆粒)上，且將微粒物理地加速進(jìn)細(xì)胞或植物組織中。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后，發(fā)生植物繁殖。植物繁殖的最普通方法是通過種子。但是，通過種子繁殖進(jìn)行再生的缺點是，雜合性導(dǎo)致的農(nóng)作物缺少一致性，這是因為種子由植物根據(jù)孟德爾規(guī)則控制的遺傳變異生成。換言之，每粒種子都是遺傳上不同的，且各自具有它自身的特定性狀地生長。因此，優(yōu)選地實現(xiàn)再生，從而使再生的植物具有與親本轉(zhuǎn)基因植物一致的性狀和特征。優(yōu)選的再生轉(zhuǎn)化的植物的方法是通過微繁殖(micropropagation)，它會提供轉(zhuǎn)化植物的快速的、一致的繁殖。微繁殖是由從選擇的親本植物或栽培品種切離的單個組織樣品生長第二代植物的方法。該方法允許大量繁殖具有優(yōu)選的組織且表達(dá)融合蛋白的植物。新產(chǎn)生的植物在遺傳上與原始植物一致，且具有原始植物的所有特征。微繁殖允許在短時間段內(nèi)大量生產(chǎn)高質(zhì)量的植物材料，并使選擇的栽培品種快速增殖，同時保持原始的轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)化的植物的特征。該植物克隆的方法的優(yōu)點包括植物增殖的速度和生成的植物的質(zhì)量和均勻性。微繁殖是一種多階段的方法，其需要改變階段之間的培養(yǎng)基或生長條件。微繁殖方法包含4個基本階段階段1，初期組織培養(yǎng)；階段2，組織培養(yǎng)物增殖；階段3，分化和植物形成；和階段4，溫室培養(yǎng)和固化。在階段1的過程中，確立組織培養(yǎng)物，并證明沒有污染物。在階段2的過程中，增殖最初的組織培養(yǎng)物，直到生成足夠數(shù)目的組織樣品，以滿足生產(chǎn)目標(biāo)。在階段3的過程中，將新生長的組織樣品分開，并使其生長成單個的小植株。在階段4，將轉(zhuǎn)化的小植株轉(zhuǎn)移到溫室進(jìn)行固化，在這里逐漸增強植物對光線的耐受性，以便它們可以在自然環(huán)境中繼續(xù)生長。盡管穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化目前是優(yōu)選的，但本發(fā)明也設(shè)想例如葉細(xì)胞、分生細(xì)胞或整株植物的瞬時轉(zhuǎn)化。通過上述的直接DNA轉(zhuǎn)移方法的任一種，或通過使用修飾的植物病毒進(jìn)行病毒感染，可以實現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)化。已經(jīng)表明對植物宿主的轉(zhuǎn)化有用的病毒包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)和桿狀病毒(BV)。使用植物病毒轉(zhuǎn)化植物記載在，例如美國專利號4,855,237(菜豆金黃花葉病毒，BGMV)；EPA67,553(TMV)；日本公開的申請?zhí)?3-14693(TMV)；EPA194,809(BV)；EPA278,667(BV)；和Gluzman，Y.等(1988).CommunicationsinMolecularBiologyViralVectors，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，pp.172-189。在WO87/06261中，描述了假病毒顆粒在許多宿主(包括植物)中表達(dá)外來DNA中的用途。通過上面的以及下面的文獻(xiàn)，證實了用于在植物中導(dǎo)入和表達(dá)非病毒的外源核酸序列的植物RNA病毒的構(gòu)建Dawson，W.O.等(1989).Atobaccomosaicvirus-hybridexpressesandlosesanaddedgene.Virology172，285-292；French，R.等(1986)Science231，1294-1297；和Takamatsu，N.等(1990).ProductionofenkephalinintobaccoprotoplastsusingtobaccomosaicvirusRNAvector.FEBSLett269，73-76。如果轉(zhuǎn)化病毒是DNA病毒，則本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對病毒本身進(jìn)行合適的修飾。或者，可以首先將病毒克隆進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒，以便用外來DNA容易地構(gòu)建需要的病毒載體。然后，可以從質(zhì)粒切離病毒。如果病毒是DNA病毒，則可以將細(xì)菌的復(fù)制起點附著到病毒DNA上，然后由細(xì)菌復(fù)制它。DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯會生成外殼蛋白，其使病毒DNA殼體化。如果病毒是RNA病毒，則通常將病毒克隆成cDNA，并插入質(zhì)粒。然后，使用該質(zhì)粒來制備所有的植物基因構(gòu)建體。然后，從質(zhì)粒的病毒序列轉(zhuǎn)錄RNA病毒，隨后翻譯病毒基因以生成外殼蛋白，其使病毒RNA殼體化。在上面的文獻(xiàn)以及美國專利號5,316,931中，證實了用于在植物中導(dǎo)入和表達(dá)非病毒的外源核酸序列的植物RNA病毒的構(gòu)建，例如包含在本發(fā)明的構(gòu)建體中的那些。在一個實施方案中，提供了用于插入的植物病毒核酸，其包含從病毒核酸缺失天然的外殼蛋白編碼序列、非天然的(外來的)植物病毒外殼蛋白編碼序列和非天然的啟動子，優(yōu)選地非天然的外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，且能在植物宿主中表達(dá)，包裝重組的植物病毒核酸，并確保重組的植物病毒核酸對宿主的全身感染。或者，通過，在其中插入非天然的核酸序列，可以使天然的外殼蛋白編碼序列成為不可轉(zhuǎn)錄的，從而生成非天然的蛋白。重組的植物病毒核酸構(gòu)建體可以含有一個或多個額外的非天然的亞基因組啟動子。每個非天然的亞基因組啟動子都能在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)臨近的基因或核酸序列，且不能彼此重組和與天然的亞基因組啟動子重組。此外，重組的植物病毒核酸構(gòu)建體可以含有一個或多個順式作用調(diào)節(jié)元件，例如增強子，其結(jié)合反式作用調(diào)節(jié)劑，并調(diào)節(jié)位于其下游的編碼序列的轉(zhuǎn)錄。如果包含超過一個核酸序列，則可以將非天然的核酸序列插入得鄰近天然的植物病毒亞基因組啟動子或天然的和非天然的植物病毒亞基因組啟動子。在亞基因組啟動子的控制下，在宿主植物中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)非天然的核酸序列，以生成所需的產(chǎn)物。在第二個實施方案中，如在第一個實施方案中一樣提供重組的植物病毒核酸構(gòu)建體，只是除了將天然的外殼蛋白編碼序列放置得鄰近非天然的外殼蛋白亞基因組啟動子之一，而不是鄰近非天然的外殼蛋白編碼序列。在第三個實施方案中，提供了重組的植物病毒核酸構(gòu)建體，其包含放置得鄰近它的亞基因組啟動子的天然的外殼蛋白基因，和一個或多個插入病毒核酸構(gòu)建體的非天然的亞基因組啟動子。插入的非天然的亞基因組啟動子能在植物宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)臨近基因，且不能彼此重組和與天然的亞基因組啟動子重組?？梢詫⒎翘烊坏暮怂嵝蛄胁迦氲绵徑翘烊坏膩喕蚪M植物病毒啟動子，以便在亞基因組啟動子的控制下，在宿主植物中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)所述序列，以生成所需的產(chǎn)物。在第四個實施方案中，如在第三個實施方案中一樣提供重組的植物病毒核酸構(gòu)建體，只是除了用非天然的外殼蛋白編碼序列替代天然的外殼蛋白編碼序列。由如上所述的重組的植物病毒核酸構(gòu)建體編碼的表達(dá)的外殼蛋白使病毒載體殼體化，以生成重組的植物病毒。重組的植物病毒核酸構(gòu)建體或重組的植物病毒用于感染合適的宿主植物。重組的植物病毒核酸構(gòu)建體能在宿主中復(fù)制，在宿主中全身傳播，和在宿主中轉(zhuǎn)錄或表達(dá)一個或多個外來基因(分離的核酸)，以生成所需的蛋白。除了上面的以外，也可以將本發(fā)明的核酸分子導(dǎo)入葉綠體基因組，從而使得能進(jìn)行葉綠體表達(dá)。已知將外源核酸序列導(dǎo)入葉綠體基因組中的技術(shù)。該技術(shù)包含下述步驟。首先，化學(xué)地處理植物細(xì)胞，以將每個細(xì)胞的葉綠體數(shù)減少到約1個。然后，將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，優(yōu)選地通過顆粒轟擊，其目的是將至少一個外源核酸分子導(dǎo)入葉綠體中。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員選擇能通過同源重組整合進(jìn)葉綠體基因組中的外源核酸，這可以通過葉綠體固有的酶容易地實現(xiàn)。為此目的，除了目標(biāo)基因以外，外源核酸包含至少一個源自葉綠體基因組的核酸序列。另外，外源核酸包含選擇標(biāo)記，其通過相繼的選擇步驟，用于允許技術(shù)人員確定經(jīng)過這樣的選擇后的葉綠體基因組的所有或基本上所有拷貝都包含外源核酸。與該技術(shù)有關(guān)的其它細(xì)節(jié)見本文引作參考的美國專利號4,945,050和5,693,507。這樣，多肽可以由葉綠體的蛋白表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，并整合進(jìn)葉綠體內(nèi)膜中。在基因組和/或轉(zhuǎn)錄物水平，使用許多干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的分子(例如，反義、siRNA)，或在蛋白水平，使用例如抗體、免疫技術(shù)等，可以實現(xiàn)目標(biāo)基因的下調(diào)。例如，能下調(diào)目標(biāo)多肽的活性的試劑是能特異性地結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體或抗體片段。優(yōu)選地，抗體特異性地結(jié)合目標(biāo)多肽的至少一個表位。如本文所使用的，術(shù)語“表位”指抗體的互補位結(jié)合的抗原上的任意抗原決定簇。通過在植物中有效的基于RNA的沉默策略，可以實現(xiàn)RNA水平的下調(diào)。見例如，Kusaba(2004)RNAinterferenceincropplants.Curr.Opin.Biotechnol.15(2)139-43；Matzke(2001)RNAbasedsilencingstrategiesinplant.Curr.Opin.Genet.11221-7。例如，能下調(diào)目標(biāo)多核苷酸的試劑是RNA干擾(RNAi)過程中的小干擾RNA(siRNA)分子?？梢砸詭追N方式向植物送遞dsRNA(綜述見WaterhouseP，HelliwellC.2003，ExploringplantgenomesbyRNA-inducedgenesilencing.NatureGenet429-38)用dsRNA或含有內(nèi)含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)-表達(dá)載體的微粒轟擊；用攜帶表達(dá)ihpRNA轉(zhuǎn)基因的T-DNA的土壤桿菌株滲入植物組織；病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)，其中靶序列整合進(jìn)用于感染植物，或用于從土壤桿菌-導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的病毒序列中，和通過用ihpRNA表達(dá)轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。關(guān)于它們的作用的持久性和它們可以應(yīng)用的植物的范圍，各種RNAi技術(shù)各自具有優(yōu)點和缺點，例如轟擊可以應(yīng)用于任何植物，但是僅僅產(chǎn)生瞬時作用?；蛘?，用ihpRNA-表達(dá)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化提供穩(wěn)定的且可遺傳的基因沉默，但是需要有效的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)。已經(jīng)表明，ihpRNA轉(zhuǎn)基因?qū)Ω鞣N植物物種中的廣范圍的靶基因是非常有效的(綜述見WaterhouseP，HelliwellC.2003.ExploringplantgenomesbyRNA-inducedgenesilencing.NatureGenet429-38；WesleyS，HelliwellC，SmithN，等2001.Constructdesignforefficient，effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplant.PlantJ21581-590)，從而表明RNAi機制可能在所有植物物種中是保守的。這得到非維管苔蘚小立碗蘚(Physcomitrellapatens)中的RNAi的近期報道的支持(BezanillaM，PanA，QuatranoR.2003.RNAinterferenceinthemossPhyscomitrellapatens.PlantPhysiol133470-474)。纖維特異性的啟動子(例如，對于SEQIDNO85、91)的反義基因構(gòu)建體可以用于抑制和減少纖維細(xì)胞中一個或多個纖維基因的表達(dá)。反義構(gòu)建體的使用記載在美國專利號5,495,070和Smith，等Nature334724-726，1988；Bird，等Bio/Technology9635-639，1991；VanderKrol，等Gene7245-50，1988。應(yīng)當(dāng)理解，通過使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，使每種上述的基因修飾植物與野生型、雜種或轉(zhuǎn)基因植物雜交，也可以產(chǎn)生具有根據(jù)本發(fā)明的所需性狀的纖維生產(chǎn)性植物。一旦產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，就收獲纖維(例如通過機械摘棉和/或手工剝離)，并測定纖維產(chǎn)量和質(zhì)量。下面描述了定量棉花纖維的方法。纖維長度-使用儀器，例如纖維長度照影機和HVI(高體積儀器)系統(tǒng)，測量纖維的長度。HVI儀器按照“平均值”和“上半平均值”(UHM)長度計算長度。平均值是所有纖維的平均長度，而UHM是更長一半的纖維分布的平均長度。纖維強度-如所述的，通常將纖維強度定義為破壞一束纖維或單根纖維所需的力。在HVI測試中，將破壞力轉(zhuǎn)化成“每特單位的克力”。這是破壞大小為1特單位的一束纖維所需的力。在HVI測試中，以每特單位的克(克/特)給出強度。可以將纖維分成低強度(例如，19-22克/特)、平均強度(例如，23-25克/特)、高強度(例如，26-28克/特)和非常高強度(例如，29-36克/特)。馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀-從多孔氣流試驗，得到纖維的馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀讀數(shù)。如下進(jìn)行該試驗。將稱重的棉花樣品壓至給定的體積，并使控制的氣流穿過樣品。將對氣流的阻力讀作馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀單位。馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀讀數(shù)反映成熟度和細(xì)度的組合。由于給定品種的棉花中的纖維的纖維直徑相當(dāng)一致，所以馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀指數(shù)更適合指示成熟度變化，而不是細(xì)度變化。2.6-2.9的馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試讀數(shù)是低值，而3.0-3.4低于平均值，3.5-4.9是平均值，且5.0和以上是高值。對于大多數(shù)紡織用途，使用3.5-4.9的馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試。通常不希望比它高的任何值。但是應(yīng)當(dāng)理解，不同的用途需要不同的纖維性質(zhì)。因而，應(yīng)當(dāng)理解，在一個應(yīng)用中是缺點的纖維性質(zhì)可能在另一個應(yīng)用中會是優(yōu)點。如下面的實施例部分所解釋的，本發(fā)明的生物分子序列能增加毛狀體/葉毛(leafhair)數(shù)目和長度，以及種子纖維。同樣，本發(fā)明的生物分子序列可以用于產(chǎn)生具有增加的毛狀體數(shù)目/長度的轉(zhuǎn)基因植物，其能更好地攔住食草動物，引導(dǎo)傳粉者的途徑，或通過增強的光反射，影響光合作用、葉溫或水喪失。另外，這樣的轉(zhuǎn)基因植物可以用于在毛狀體中區(qū)室化地生產(chǎn)重組蛋白和化學(xué)制品，如EvogeneLtd的WO2004/111183所詳細(xì)描述的。有趣地且意外地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多核苷酸序列能增加植物的生物量。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的多肽增加植物產(chǎn)量/生物量/活力的能力，是它們促進(jìn)植物細(xì)胞大小或體積的增加的能力所固有的(如本文所述)因而，本發(fā)明也設(shè)想增加植物(松柏類植物、苔蘚、藻類、單子葉植物或雙子葉植物以及在www.nationmaster.com/encyclopedia/Plantae中列出的其它植物)的生物量/活力/產(chǎn)量的方法。如上所述，通過調(diào)節(jié)至少一種本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)和/或活性，可以實現(xiàn)該方法。如本文所使用的，短語“植物生物量”指植物在生長季節(jié)生成的組織的量，其也會決定或影響植物產(chǎn)量或每單位生長區(qū)的產(chǎn)量。如本文所使用的，短語“植物活力”指植物在給定的時間生成的組織的量。因此，增加活力也會決定或影響植物產(chǎn)量或每單位生長時間或生長區(qū)的產(chǎn)量。如本文所使用的，短語“植物產(chǎn)量”指作為植物生產(chǎn)的產(chǎn)物生成和收獲的組織的量。因此，增加產(chǎn)量會影響人們在特定生長區(qū)和/或生長時間可以從植物得到的經(jīng)濟利益。因而，本發(fā)明對于促進(jìn)商業(yè)上需要的農(nóng)作物的產(chǎn)量(例如，營養(yǎng)器官例如楊木或生殖器官的生物量，例如種子的數(shù)目或種子生物量)，具有高農(nóng)業(yè)價值。如本文所使用的，術(shù)語“約”指±10％。閱讀下面的非限制性的實施例后，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會明白本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和新特征。另外，從下面的實施例中，可以找到上面描述的和下面的權(quán)利要求部分要求保護(hù)的本發(fā)明的各種實施方案和方面的每一個的實驗支持。實施例現(xiàn)在，參考下面的實施例，其與上面的描述一起，以非限制性的方式解釋本發(fā)明。一般地，本文中使用的命名和在本發(fā)明中使用的實驗室操作包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中充分解釋了這樣的技術(shù)。見，例如，“MolecularCloningAlaboratoryManual”Sambrook等，(1989)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”VolumesI-IIIAusubel，R.M.，編(1994)；Ausubel等，“CurrentProtocolsinMolecularBiology”，JohnWileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“APracticalGuidetoMolecularCloning”，JohnWiley&Sons，NewYork(1988)；Watson等，“RecombinantDNA”，ScientificAmericanBooks，NewYork；Birren等(編)“GenomeAnalysisALaboratoryManualSeries”，Vols.1-4，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998)；美國專利號4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；“CellBiologyALaboratoryHandbook”，VolumesI-IIICellis，J.E.，編(1994)；“CurrentProtocolsinImmunology”VolumesI-IIIColiganJ.E.，編(1994)；Stites等(編)，“BasicandClinicalImmunology”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編)，“SelectedMethodsinCellularImmunology”，W.H.FreemanandCo.，NewYork(1980)；可利用的免疫測定廣泛地記載在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，見，例如，美國專利號3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“OligonucleotideSynthesis”Gait，M.J.，編(1984)；“NucleicAcidHybridization”Hames，B.D.和HigginsS.J.，編(1985)；“TranscriptionandTranslation”Hames，B.D.和HigginsS.J.，編(1984)；“AnimalCellCulture”Freshney，R.L，編(1986)；“ImmobilizedCellsandEnzymes”IRLPress，(1986)；“APracticalGuidetoMolecularCloning”Perbal，B.，(1984)和“MethodsinEnzymology”Vol.1-317，AcademicPress；“PCRProtocolsAGuideToMethodsandApplications”，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)；Marshak等，“StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual”CSHLPress(1996)；它們都引作參考，如同在本文中充分描述一樣。貫穿本文件中，提供了其它一般文獻(xiàn)。認(rèn)為其中的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且為閱讀者的方便而提供。其中包含的所有信息都在本文中引作參考。實施例1參與纖維形成的棉花基因的計算機(insilico)鑒別實驗方法表達(dá)的序列的種間對比-在數(shù)據(jù)采掘階段，使用2種主要工具。從包括Compugen′sGeneCarta平臺(CompugenLtd.以色列)的ORACLE數(shù)據(jù)庫，查詢大量基因概況。將該數(shù)據(jù)載入MicrosoftExcel電子制表軟件，用于進(jìn)一步的手工精制。使用該數(shù)據(jù)，可以實現(xiàn)跨物種基因組對比，其目的在于定義來自其它植物物種的器官，對于所述器官可利用可公開得到的EST文庫作為模型和信息的新來源，以定義在纖維形成中具有關(guān)鍵作用的新基因(圖1)。該對比分析主要使用棉花、鼠耳芥和番茄數(shù)據(jù)庫。EST序列的成簇和種間成簇-棉花基因組數(shù)據(jù)庫包括少于50,000個EST(Genbankrelease#135)，其主要源自2個物種樹棉(Gossypiumarboreum)(約35,000EST)和陸地棉(約9,000EST，下面的表1)。在2個可替代的方法中，使用LEADSTM軟件平臺(CompugenLtd，以色列)，使這些EST成簇并裝配。在第一個方案中，使來自2個物種的EST成簇并裝配到一起(從而模仿進(jìn)化過程，因為樹棉是陸地棉的祖先)。該方法揭示了6478個簇，其中3243個新簇(在公開數(shù)據(jù)庫中，沒有mRNA)被定義為高質(zhì)量簇(下面的表1)。在第二個方法中，使來自每個物種的EST成簇并分別裝配。2個方法之間的對比表明，使用第一個方法增加棉花簇的有價值的信息，而在分析中沒有顯著偏倚。番茄基因組數(shù)據(jù)庫含有126,156個EST，其源自約30個充分確定的文庫，所述EST通過成簇和裝配方法揭示了14034簇，其中有一大組12787個新的高質(zhì)量簇(表1)。鼠耳芥的基因組數(shù)據(jù)包括99417個EST(ftp//ftp.ncbi.nih.gov/genbank/)、8573個全長cDNA(Rikken和genbankmRNAsftp//ftp.ncbi.nih.gov/genbank/)和整個DNA序列。使用LEADS軟件，揭示了23,148簇和6777singeltones(單個的EST，沒有其它EST與其成簇)，它們都得到了EST序列的支持，與公開的聚生體(consortium)相反(TAIR，www.arabidopsis.org/)。尋找來自共有與棉花纖維的生物過程類似的其它植物和器官的EST文庫。預(yù)期這樣的EST用作模型和新信息來源，用于鑒別參與纖維發(fā)育的基因。為此，產(chǎn)生了一列被懷疑參與纖維形成的已知基因。這些基因源自鼠耳芥，且在各個研究中表明在毛狀體形成中具有關(guān)鍵作用(即，GL2、CPC、bHLH、TTG1、GL1，綜述見LarkinJ.C.等2003，SchellmannS.等2002)。廣泛的對比基因組分析揭示，與棉花纖維基因和鼠耳芥毛狀體基因具有高度同源性的番茄基因，在葉毛狀體和特定的花發(fā)育文庫中具有顯著的EST含量。其它分析對比了這3個物種(棉花、鼠耳芥和番茄)的基因組數(shù)據(jù)(集中在上述的番茄文庫)，以作為目前的數(shù)據(jù)庫搜索的關(guān)鍵參數(shù)(圖1)。表1棉花、番茄和鼠耳芥的基因組數(shù)據(jù)庫*源自不同物種的簇棉花樹棉和陸地棉，番茄(L.esculentum)、L.hirsutum和L.pennellii在纖維發(fā)育中起作用的棉花基因的計算機鑒別為了發(fā)現(xiàn)番茄基因組數(shù)據(jù)是否可以用作研究棉花纖維發(fā)育的基因組數(shù)據(jù)的相關(guān)來源，進(jìn)行了廣泛的基因組對比，以鑒別與決定鼠耳芥毛狀體發(fā)育的關(guān)鍵基因(例如，GL2、CPC、bHLH、TTG1、GL1)具有高度同源性的番茄和棉花基因。在棉花和番茄中鑒別出了同源基因。因為幾乎所有棉花EST都由棉花纖維生成，所以不可能計算機預(yù)測那些基因的表達(dá)特征。但是，用于生產(chǎn)番茄EST數(shù)據(jù)庫的廣泛組織來源使得能夠鑒別其中表達(dá)毛狀體特異性的基因的組織。在番茄中，揭示毛狀體和胚珠EST在代表毛狀體特異性的基因的簇中富集。有趣地，發(fā)現(xiàn)棉花纖維由胚珠外殼細(xì)胞生成。由于番茄種子覆蓋著毛樣組織，與棉花種子類似，所以推測那些毛在發(fā)育上與毛狀體和棉花纖維形成有關(guān)。在番茄中，發(fā)現(xiàn)約1100個簇包括至少一個來自毛狀體文庫的EST。其中，約1000個序列包括也源自番茄花文庫(其中存在胚珠組織)的序列。對比該組基因和棉花數(shù)據(jù)，揭示了約2300個棉花基因與番茄毛狀體基因具有高度同源性。使用這2組基因以及其它生物信息學(xué)信息[跨物種同源性，GeneOnthology(GO)]采掘數(shù)據(jù)庫揭示，預(yù)測80個棉花簇在纖維形成中起關(guān)鍵作用?；谙率鰳?biāo)準(zhǔn)，選擇那些基因具有至少2個EST的棉花簇；與具有高于1e-5的e-分?jǐn)?shù)的番茄簇的同源性；與具有至少一個來自毛狀體文庫的EST或一個來自含胚珠的組織的EST的番茄簇的同源性；認(rèn)為下面的標(biāo)準(zhǔn)是有利的，盡管不是必需的簇中大量的EST；轉(zhuǎn)錄因子/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白；與細(xì)胞膨脹、膨壓、細(xì)胞壁合成有關(guān)的基因注釋。進(jìn)一步分析新基因以及已知參與纖維形成的對照棉花基因在棉花植物中的RNA表達(dá)特征。實施例2根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)鑒別的基因的mRNA表達(dá)分析為了研究如上面實施例1所述鑒別的候選基因的RNA表達(dá)特征，通過實時PCR(RT-qPCR)實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄。實驗方法定量實時PCR分析(qRTPCR)-為了證實表達(dá)特異性和性狀-關(guān)聯(lián)的水平，進(jìn)行定量(實時)PCR后的逆轉(zhuǎn)錄(RTqPCR)。在纖維發(fā)育的不同階段(從開花當(dāng)天直到開花后第20天)，提取總RNA。為了研究表達(dá)的特異性，收集來自棉花植物的其它組織的RNA，并分析對照表達(dá)(即嫩葉、嫩莖、成熟莖、嫩根、萼片、花瓣和雄蕊)。為此目的，使用根據(jù)www.eeob.iastate.edu/faculty/WendelJ/ultramicrorna.html的熱硼酸鹽RNA提取規(guī)程，從棉花組織提取RNA。使用300USuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)、225ng隨機脫氧核苷酸六聚體(Invitrogen)、500μMdNTPs混合物(Takara，日本)、0.2體積×5RT緩沖液(Invitrogen)、0.01MDTT、60URNA酶抑制劑(Promega)，DEPC處理的重蒸餾水加至37.5μl，使用1.5μg總RNA實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄。在42℃溫育逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物50分鐘，然后在70℃溫育15分鐘。在TrisEDTA，pH＝8中以1∶20稀釋cDNA。將5mL稀釋的cDNA用于qRT-PCR。使用x1SYBRGREENPCR主混合物(AppliedBiosystems)、正向和反向引物各0.3μM，在cDNA(5μL)上進(jìn)行定量RT-PCR。在下述條件下，使用ABI7000實時PCR機50℃進(jìn)行2分鐘，95℃進(jìn)行10分鐘，40次的95℃進(jìn)行15秒和60℃進(jìn)行1分鐘，然后在95℃進(jìn)行15秒，60℃進(jìn)行60秒，和70次的60℃進(jìn)行10秒，在每個循環(huán)中有+0.5℃增加。對于每個基因，以5個稀度(稀度-1∶60、1∶200、1∶600、1∶2000、1∶10000)，從來自所有樣品的RT庫制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖[ct(循環(huán)閾值)vs.log(濃度)]應(yīng)當(dāng)具有R＞＝0.98，其效率范圍為100％+/-5％。使用擴增反應(yīng)的效率(E)和對應(yīng)的C.T.(樣品超過閾值時的循環(huán))，計算在qPCR中測量的表達(dá)水平(Qty)Qty＝E-C.T.。檢查得到的解離曲線是否不存在不需要的額外PCR產(chǎn)物或引物-二聚體。重復(fù)反應(yīng)至少2次。計算方法基于下述事實，即GOI(目標(biāo)基因)和持家基因的反應(yīng)效率類似。為了標(biāo)準(zhǔn)化不同組織之間的表達(dá)水平，設(shè)計了特異性的引物，其用于與下述持家基因特異性雜交肌動蛋白(GenBank登記號D88414SEQIDNO28，正向和反向引物分別如SEQIDNO68和69所述)、GAPDH(GenBank登記號COTCWPPR，部分序列，SEQIDNO29，正向和反向引物分別如SEQIDNO97和98所述)和RPL19(GenBank登記號AI729179，SEQIDNO30，正向和反向引物分別如SEQIDNO99和100所述)。使用該方法，可能鑒別在纖維延長過程中表現(xiàn)出升高的表達(dá)的基因，以及表現(xiàn)出獨特的棉花纖維特異性的基因。將在開花過程中表現(xiàn)出升高的表達(dá)、且在纖維延長過程中降低的基因，視作參與纖維分化和起始的良好候選物。應(yīng)當(dāng)注意，上述定量方法不能提供絕對表達(dá)水平，但是提供了用于評價隨著纖維發(fā)育的相對基因表達(dá)的良好參數(shù)，因為檢測到不同基因達(dá)到的最大表達(dá)水平的差異高達(dá)超過1000倍(下面的表2)。結(jié)果評價了88個棉花基因在不同棉花(陸地棉Acala變種)組織中的表達(dá)特征。根據(jù)基因表達(dá)結(jié)果，預(yù)測23個基因提高纖維產(chǎn)量和質(zhì)量。表2顯示了所有候選基因的表達(dá)特征。表2使用實時PCR，在嫩或成熟的棉花(陸地棉Acala變種)植物的組織上，進(jìn)行定量PCR后的逆轉(zhuǎn)錄。顯示了所有檢查的組織中每個基因的mRNA的相對量，dpa-開花后的天數(shù)，胚珠和纖維組織(10dpa以前)或僅纖維組織(10dpa以后)。根據(jù)它們的RNA特征分析，使用2個主要標(biāo)準(zhǔn)來選擇棉花基因作為可能參與纖維發(fā)育的候選物。表現(xiàn)出高度的纖維表達(dá)特異性的基因和表現(xiàn)出隨著纖維發(fā)育而變化的表達(dá)水平的基因(下面的表3)。23個基因滿足這些選擇標(biāo)準(zhǔn)CT-1(SEQIDNO.1和106)、CT_2(SEQIDNO.2和107)、CT_3(SEQIDNO.3和108)、CT_4(SEQIDNO.4和109)CT_6(SEQIDNO.5和110)、CT_7(SEQIDNO.6和111)、CT_9(SEQIDNO.7和112)、CT_1(SEQIDNO.8和113)、CT_20(SEQIDNO.9和114)、CT_22(10和115)、CT_26(SEQIDNO.11和116)、CT_27(SEQIDNO.12和117)、CT_40(SEQIDNO.16和118)、CT_49(SEQIDNO.17和119)、CT_70(SEQIDNO.18和120)、CT_71(SEQIDNO.19和121)、CT_74(SEQIDNO.20和122)、CT_75(SEQIDNO.21和123)、CT_76(SEQIDNO.22和124)、CT_77(SEQIDNO.23和125)、CT_81(SEQIDNO.24和126)、CT_82(SEQIDNO.25和95)、CT_84(SEQIDNO.27和96)和CT_88(SEQIDNO.13和26)。主要選擇CT-4、22、20、27、40、82(分別是SEQIDNO4、10、9、12、16和25)作為可能在纖維起始中起作用的候選基因(表3)，而CT27(SEQIDNO12)也用作對照，它是GL3的同源基因(在圖2d中，顯示了CT22，SEQIDNO10)。根據(jù)它們的表達(dá)模式(表3，在圖2C中，顯示了CT1)，預(yù)測CT-1、2、3、6、7、9、49、70、71、74、75、76、77、81、84(分別是SEQIDNO.1、2、3、5、6、7、17、18、19、20、21、22、23、24和27，見圖2a，c)會參與纖維延長和質(zhì)量(強度和細(xì)度(finesse))。與來自鼠耳芥的Glabrous1(GenBank登記號AB006078)同源的CT11、40、74和CT26(分別是SEQIDNO.8、16、20和11，見圖2a，b)是纖維特異性的基因，其在纖維發(fā)育的所有階段都表現(xiàn)出均勻的且纖維-特異性的表達(dá)(表3，在圖2B中，將CT11顯示為實例)。在上面的表2中，顯示了所有選擇的基因的表達(dá)特征。表3使用組成型35SCaMV啟動子(SEQIDNO.31)，在轉(zhuǎn)基因的鼠耳芥和番茄中超表達(dá)選擇的基因。進(jìn)一步評價轉(zhuǎn)基因植物的表皮修飾、毛狀體密度和長度和種子纖維產(chǎn)量(如下文進(jìn)一步描述的)。實施例3使用可公開得到的微陣列分析基因表達(dá)通過統(tǒng)計學(xué)分析來自鼠耳芥的微陣列數(shù)據(jù)，檢索關(guān)于選擇的基因(上面的實施例2)的表達(dá)的其它信息?；旧希瑢⑹蠖娴男潞蜻x基因的最佳同源物與鼠耳芥的不同組織的一組77個微陣列實驗相對比(AtGenExpress數(shù)據(jù)庫，AFGN主要研究人員是Prof.Dr.LutzNover，BotanischesInstitut，MolekulareZellbiologie，F(xiàn)BBiologieundInformatikderJ.W.GoetheUniversittFrankfurt；BiozentrumN2003OG，Marie-Curie-Strasse9，60439FrankfurtamMain，www.arabidopsis.org/info/expression/ATGenExpress.jsp)。選擇在伸長的細(xì)胞或花序分生組織中高度表達(dá)的多核苷酸序列，以用于進(jìn)一步分析。下面的表4列出了表現(xiàn)出最高基因表達(dá)水平的組織。表4實施例4確立候選基因的表達(dá)和纖維長度之間的關(guān)聯(lián)為了定義選擇的基因的RNA表達(dá)水平和纖維長度之間的關(guān)聯(lián)，分析了來自4個不同的棉花系的纖維。選擇的這些纖維表現(xiàn)出非常好的纖維質(zhì)量和高皮棉指數(shù)(Pima類型，源自其它棉花物種，即海島棉)和與來自各種陸地棉系的不同的質(zhì)量水平和皮棉指數(shù)好質(zhì)量和高皮棉指數(shù)(Acala類型)、中等皮棉指數(shù)(Coker類型)和差質(zhì)量和短皮棉指數(shù)(Tamcot類型)。實驗方法RNA提取-在5、10、15和20DPA，對代表著不同纖維特征的纖維發(fā)育階段取樣，并如實施例2所述提取RNA。纖維評價-使用纖維長度照影機，測量上述系的纖維長度。使用纖維長度照影機系統(tǒng)來根據(jù)“上半平均值”長度計算長度。上半平均值(UHM)是更長一半的纖維分布的平均長度。在給定的百分比點，纖維長度照影機以跨長測量長度(www.cottoninc.com/ClassificationofCotton/？Pg＝4#Length.)。結(jié)果在2004年夏天期間，在以色列的Rehovot生長4個不同的棉花系，并測量它們的纖維長度。纖維UHM值總結(jié)在下面的表5中表5測試了5個基因的基因表達(dá)和纖維長度之間的關(guān)聯(lián)(在圖3中，顯示了CT_76)。結(jié)果總結(jié)在下面的表6中表6使用實時PCR，在棉花(陸地棉Tamcot、Coker和Acala變種，和海島棉PimaS5變種)植物的0、5、10和15DPA的組織上進(jìn)行定量PCR后的逆轉(zhuǎn)錄。在所有檢查的組織中，顯示了與每個基因的mRNA相對量和關(guān)于T0的相對表達(dá)。實施例5將選擇的基因克隆進(jìn)在組成型調(diào)節(jié)下的二元載體和重組表達(dá)它ORF分析-使用GeneRunner軟件3.05版(HastingSoftware，Incwww.generunner.com/)，分析本發(fā)明的基因序列的ORF。使用Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，將每個基因的ORF與Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比。通過與最高同源性的ORF對比，確定ATG起始密碼子的位置。表明本文所述的所有序列都具有預(yù)測的全長ORF，且包括預(yù)測的ATG起始密碼子?？寺∵M(jìn)pPI表達(dá)載體-為了克隆本發(fā)明的基因，根據(jù)www.eeob.iastate.edu/faculty/WendelJ/rnaextraction.html，使用熱硼酸鹽從棉花組織提取RNA，從各個發(fā)育階段的纖維生產(chǎn)性細(xì)胞提取總RNA。按照生產(chǎn)商提供的規(guī)程，使用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)酶(Roche)和T16NNDNA引物，從mRNA生產(chǎn)互補的DNA(cDNA)分子。按照生產(chǎn)商提供的規(guī)程，使用PFU校正DNA聚合酶(Promegawww.promega.com/pnotes/68/7381_07/738l_07.html)，通過PCR，對上述序列中的19個基因進(jìn)行cDNA擴增，即CT克隆編號1、2、3、6、7、9、11、20、22、27、40、71、74、75、76、81、82、84和88。將每個基因的引物設(shè)計成跨完整ORF。將其它限制性內(nèi)切核酸酶位點添加到每個引物的5′端，以促進(jìn)CT向二元載體(pPI)中的進(jìn)一步克隆。下面的表7列出了用于克隆每個基因的引物表7使用PCR純化試劑盒(Qiagen，德國)純化得到的PCR平端產(chǎn)物，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶(Roche)消化，并克隆進(jìn)pPI二元載體(圖4)，同時替換現(xiàn)有的GUS報告基因。pPI是pBI101.3(Clontech，登記號U12640)的修改版。通過將源自pGL3基本質(zhì)粒載體(Promega，AccNoU47295，其中合成的多腺苷酸化信號序列位于堿基對4658-4811之間)的合成的多腺苷酸化信號序列插入pBI101.3的HindIII限制位點(同時重構(gòu)在多腺苷酸化插入片段下游的HindIII位點)，來構(gòu)建pPI，以避免上游Nos-啟動子的連讀效應(yīng)的可能性。為了用pPI二元載體中的每一個CT基因替代GUS基因，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶痯PI[5′限制酶是SmaI或XbaI，且3′限制酶是SacI或EcoRV(Roche-使用生產(chǎn)商提供的規(guī)程)]。使用PCR純化試劑盒(Qiagen，德國)，純化開口的二元載體。按照生產(chǎn)商提供的規(guī)程，使用T4DNA連接酶(Roche)，在10μL連接反應(yīng)體積中，連接5-75ng每個CT基因的PCR產(chǎn)物和100ng開口的pPI質(zhì)粒載體。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中。在細(xì)菌中的重組表達(dá)-使用MicroPulser電穿孔儀(Biorad)、0.2cm杯(Biorad)和EC-2電穿孔程序(Biorad)，通過電穿孔，用1μl連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化60μL大腸桿菌株DH5-α感受態(tài)細(xì)胞(約109細(xì)胞/mL)。在37℃，在0.8mLLB液體培養(yǎng)基中使大腸桿菌細(xì)胞生長1小時，并將0.2mL細(xì)胞懸浮液鋪平板到補加了抗生素卡那霉素50mg/L(Sigma)的LB-瓊脂平板上。然后，在37℃溫育平板16小時。使細(xì)菌菌落生長，并使用設(shè)計成跨二元載體中的插入序列的引物，通過PCR擴增證實表達(dá)。用于pPI二元載體中的插入片段的DNA擴增的引物是5′-GGTGGCTCCTACAAATGCCATC-3′(正向，SEQIDNO.70)和5′-AAGTTGGGTAACGCCAGGGT-3′(反向，SEQIDNO.71)。在1.5％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并通過與DNA梯(MBIFermentas)對比，來估計產(chǎn)物大小。使用與以前用于PCR擴增相同的引物(見上面的表7)，對具有預(yù)測大小的PCR產(chǎn)物測序。使用基于每個基因插入片段的序列而設(shè)計的其它引物，完成全長ORF插入片段的測序。對插入的序列測序，以證實以正確的方向?qū)肓丝寺?，并排除在PCR擴增過程中包含序列錯誤的可能性。使用ABI377測序儀(AmershamBiosciencesInc)，確定DNA序列。將組成型花椰菜花葉病毒35S啟動子克隆進(jìn)攜帶CT基因的19個pPI二元構(gòu)建體中的每一個中。通過用限制性內(nèi)切核酸酶HindIII和BamHI(Roche)消化pBI121載體，來克隆源自pBI121載體(Clontech，登記號AF485783)的花椰菜花葉病毒35S啟動子序列，并連接進(jìn)用相同酶消化的二元構(gòu)建體中(SEQIDNO.31)。實施例6攜帶目標(biāo)基因的二元質(zhì)粒的土壤桿菌轉(zhuǎn)化和在鼠耳芥和番茄植物中的表達(dá)通過根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefacience)轉(zhuǎn)化，將19個二元構(gòu)建體(其包含在每個CT基因上游的35S啟動子)中的每一個轉(zhuǎn)化進(jìn)鼠耳芥或番茄植物。使用MicroPulser電穿孔儀(Biorad)、0.2cm杯(Biorad)和EC-2電穿孔程序(Biorad)，通過電穿孔，用20ng二元質(zhì)粒轉(zhuǎn)化60μL根癌土壤桿菌GV301或LB4404感受態(tài)細(xì)胞(約109細(xì)胞/mL)。在28℃，在0.8mLLB液體生長基中生長土壤桿菌細(xì)胞3小時，并將0.2mL細(xì)胞懸浮液鋪平板在補加了抗生素慶大霉素50mg/L(對于土壤桿菌株GV301)或鏈霉素300mg/L(對于土壤桿菌株LB4404)和卡那霉素50mg/L(Sigma)的LB-瓊脂平板上。然后，在28℃溫育平板48小時。生長土壤桿菌菌落，并使用設(shè)計成跨二元載體中的插入序列的引物，在土壤桿菌細(xì)胞上進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增使用的引物是5′-GGTGGCTCCTACAAATGCCATC-3′(正向，SEQIDNO.70)和5′-AAGTTGGGTAACGCCAGGGT-3′(反向，SEQIDNO.71)。在1.5％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，并通過與DNA梯(MBIFermentas)對比，來確定產(chǎn)物大小。使用用于PCR擴增的引物，對具有預(yù)測大小的PCR產(chǎn)物測序。對插入的序列測序，以證實將正確的克隆導(dǎo)入了土壤桿菌細(xì)胞中。使用ABI377測序儀(AmershamBiosciencesInc.)，進(jìn)行DNA測序。植物轉(zhuǎn)化和栽培用推定的棉花基因轉(zhuǎn)化鼠耳芥植物-使用Clough和Bent以及Desfeux等所述的FloralDip方法，經(jīng)微小改進(jìn)，轉(zhuǎn)化鼠耳芥Columbia植物(T0植物)。簡而言之，將T0植物播種在裝滿濕的基于泥炭的生長混合物的250ml罐中。該罐覆蓋著鋁箔和塑料穹頂，在4℃保持3-4天，然后打開蓋子，在18-24℃，在16/8小時光照/黑暗循環(huán)下，在生長室中溫育。在開花前6天，T0植物準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化。在補加了卡那霉素(50mg/L)和慶大霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)攜帶二元構(gòu)建體的土壤桿菌的單個菌落。在劇烈搖動下，在28℃溫育培養(yǎng)物48小時，然后在4,000rpm離心5分鐘。將包含土壤桿菌細(xì)胞的沉淀重新懸浮在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，后者含有半強度(2.15g/L)Murashig-Skoog(Duchefa)；0.044μM芐氨基嘌呤(Sigma)；112μg/LB5Gambourg維生素(Sigma)；5％蔗糖；和0.2ml/LSilwetL-77(OSISpecialists，CT)，溶于重蒸餾水中，pH5.7。通過將每株植物顛倒到土壤桿菌懸浮液中，從而使地上植物組織浸沒3-5秒，來實現(xiàn)T0植物的轉(zhuǎn)化。將每株接種的T0植物立即置于塑料盤中，然后覆蓋清潔的塑料穹頂，以維持濕度，并在黑暗中，在室溫保持18小時，以促進(jìn)感染和轉(zhuǎn)化。然后，將轉(zhuǎn)化的(即轉(zhuǎn)基因的)植物打開蓋子，并轉(zhuǎn)移到溫室，以進(jìn)行恢復(fù)和成熟。使轉(zhuǎn)基因的T0植物在溫室中生長3-5周，直到長角果是褐色且干燥。從植物收獲種子，并保持在室溫，直到播種。為了產(chǎn)生攜帶基因的T1轉(zhuǎn)基因植物，通過在70％乙醇中浸泡1分鐘，然后在5％次氯酸鈉和0.05％triton中浸泡5分鐘，將從轉(zhuǎn)基因的T0植物收集的種子表面滅菌。在無菌的蒸餾水中徹底洗滌表面滅菌的種子，然后置于培養(yǎng)平板上，后者含有半強度Murashig-Skoog(Duchefa)；2％蔗糖；0.8％植物瓊脂；50mM卡那霉素；和200mMcarbenicylin(Duchefa)。將培養(yǎng)平板在4℃溫育48小時，然后轉(zhuǎn)移到25℃生長室，用于另外溫育一周。將有生活力的T1鼠耳芥植物轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)平板，用于另外溫育一周。溫育后，從培養(yǎng)平板取出T1植物，并種植在裝在250ml罐中的生長混合物中。使轉(zhuǎn)基因植物在溫室中生長至成熟。用推定的棉花基因轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄植物-根據(jù)Curtis等1995和Meissner等2000，實現(xiàn)番茄(番茄MicroTom變種)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的栽培。實施例7鼠耳芥轉(zhuǎn)化的植物的生長和表型表征如上所述生長T1鼠耳芥植物，并表征表型。轉(zhuǎn)基因植物的PCR分析-將鼠耳芥T2種子直接播種在裝在250ml罐中的生長混合物中。通過PCR，篩選陽性的轉(zhuǎn)基因植物的兩周齡葉子中的卡那霉素抗性。用于卡那霉素的PCR擴增的引物是5′-CTATTCGGCTATGACTGGGC-3′(正向，SEQIDNO.72)和5′-ATGTCCTGATAGCGGTCCGC-3′(反向，SEQIDNO.73)。根性能-為了使根性能可視化，通過在70％乙醇中浸泡1分鐘，然后在5％次氯酸鈉和0.05％triton中浸泡5分鐘，將T2種子表面滅菌。在無菌的蒸餾水中徹底洗滌表面滅菌的種子，然后置于培養(yǎng)平板上，后者含有半強度Murashig-Skoog(Duchefa)；2％蔗糖；0.8％植物瓊脂；50mM卡那霉素；和200mMcarbenicylin(Duchefa)。將培養(yǎng)平板在4℃溫育48小時，然后轉(zhuǎn)移到25℃生長室，直到達(dá)到用于表型表征的正確大小。結(jié)果表8-攜帶推定的棉花基因的鼠耳芥T2植物的分析實施例8MicroTom轉(zhuǎn)化的植物的生長和表型表征實驗方法轉(zhuǎn)基因的番茄植物-如上面的實施例6所述轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化后，在裝在1000ml罐中的混合物中，生長T1MicroTom番茄植物。結(jié)果表9-攜帶推定的棉花基因的Micro-Tom番茄T1和T2植物和種子的分析討論(實施例1-8)參與棉花纖維發(fā)育的基因的計算機鑒別-對于棉花纖維起始和延長的遺傳控制知之甚少。由于棉花纖維和鼠耳芥毛狀體都從單個表皮細(xì)胞發(fā)育而成，所以假定它們共有類似的遺傳調(diào)節(jié)(綜述見WagnerG.J.等2004)。在鼠耳芥中，大量研究已經(jīng)揭示了關(guān)于調(diào)節(jié)毛狀體起始和延長的遺傳機制的廣泛信息。通過表明鼠耳芥和煙草植物中的棉花纖維特異性的啟動子賦予毛狀體特異性的表達(dá)，幾項研究證實了毛狀體和纖維之間的相似性(Kim和Triplett，2001；Hsu等1999；Liu等2000，Wang等2004)。研究纖維發(fā)育的大多數(shù)研究使用鼠耳芥毛狀體作為模型系統(tǒng)來以小規(guī)模方式鑒別棉花基因(Kim和Triplett，2001；Wang等2004)。在該研究中，發(fā)明人已經(jīng)使用番茄毛狀體和花EST文庫作為模型系統(tǒng)來研究棉花纖維發(fā)育。分析番茄同源簇和已知的鼠耳芥毛狀體基因的EST文庫特征，表明番茄毛狀體和花EST文庫明顯有助于該組簇。在分析通過它們作為棉花纖維基因的RNA表達(dá)模式選擇的新棉花簇的EST文庫特征時，證實了該結(jié)果。9和10簇分別含有源自花和毛狀體文庫的EST。而且，番茄毛狀體簇組(毛狀體EST/總EST＞0.1)包含來自番茄基因的大部分，其表現(xiàn)出與棉花的高度同源性(約50％)，即使它們在總?cè)后w中的百分比僅僅是約5％?？梢灾赋觯瑑蓚€器官共有共同的發(fā)育過程。即使對番茄果實和毛狀體發(fā)育的遺傳控制進(jìn)行了大量研究，但不能找到使用這些器官作為基因組數(shù)據(jù)的來源以研究棉花纖維發(fā)育的出版物。將所有23個棉花基因與分別從紅花菜豆(ScarletRunnerbean)發(fā)育中的種子的胚和胚柄分離的獨特的EST數(shù)據(jù)進(jìn)行對比(www.mcdb.ucla.edu/Research/Goldberg/ests/intro-index.htm)。所有序列，除了一個以外，都與源自胚柄(它是母體組織)的序列共有高度同源性。該結(jié)果支持了計算機結(jié)果，并鑒別出這些棉花簇在纖維發(fā)育中的作用，其也源自母系細(xì)胞。通過分析RNA表達(dá)特征，鑒別在纖維發(fā)育中起作用的棉花基因-在開花時或之前的基因表達(dá)代表著分化/起始階段。主要在5至20DPA的非常快的生長速率代表著主要在hirsutum栽培品種中的延長階段。在約20DPA的峰值纖維膨脹時間段略之前和過程中，在它們的最高水平表達(dá)的基因(例如CT1、2、3)代表著一種模式。在所有纖維發(fā)育中具有相同表達(dá)水平的CT40、11或70，顯示了基因表達(dá)的另一種模式。同樣地，編碼肌動蛋白、endoxyloglucan轉(zhuǎn)移酶或Suc合酶的已知基因，在整個纖維發(fā)育中也表現(xiàn)出不變的RNA水平(Shimizu等，1997)。由于起始主要發(fā)生在開花之前到1DPA，所以表明在該時間中具有表達(dá)峰值的基因可以在纖維起始中起作用。CT4、20、22和11具有指示它們參與該階段的表達(dá)模式。當(dāng)前的棉花EST數(shù)據(jù)庫的一個限制是，缺少從起始階段的花提取的EST(存在從1DPA子房得到的一個文庫，但是質(zhì)量差)，大多數(shù)EST僅在以后6至10DPA得到。該EST組成可以解釋為什么大多數(shù)選擇的基因具有指示它們與延伸階段的關(guān)聯(lián)的表達(dá)模式。選擇的基因在纖維發(fā)育中的作用，可能的機理-根據(jù)它們與已知蛋白和酶的序列同源性，可以將23個纖維相關(guān)簇分成6個功能類(上面的表3)。根據(jù)GO聚生體(www.geneontology.org/)，進(jìn)行分類。最大組包含與任何已知蛋白沒有同源性的獨特序列。根據(jù)已知與纖維發(fā)育有關(guān)的類，對其它簇分類。將2個基因(上面的表3)歸入細(xì)胞命運定型類屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子的新基因和GL3的棉花同源基因，已知其參與鼠耳芥的毛狀體發(fā)育。鼠耳芥和番茄T1植物中的兩種基因的表達(dá)模式和CT20轉(zhuǎn)基因的表型，支持它們主要在起始階段的參與。積累的證據(jù)將棉花MYB基因與纖維發(fā)育相關(guān)聯(lián)(Suo.J.等2003，Cerdoni.M.L等2003，LoguericoL.L.等1999)。以相同途徑起作用的許多基因的超表達(dá)，與起始階段階段有關(guān)，可以進(jìn)一步誘導(dǎo)起始。Kirik等(2004)表明，通過超表達(dá)2或3個來自起始階段的基因，它們會增加毛狀體和根毛的數(shù)目。與起始階段有關(guān)的基因，可以用于棉花種子上的纖維起始的均勻性，啟動更多的種子表皮細(xì)胞形成纖維。那些基因在植物分生組織例如莖和葉子中的超表達(dá)，可以用作免受昆蟲(如已經(jīng)在低芥酸芥子中證實的，www.westerngrains.com/news/nr_050413.html)和非生物的應(yīng)激的保護(hù)。但是，沒有實質(zhì)的證據(jù)能證實任何MYB基因在纖維發(fā)育中的直接參與。2個其它基因(上面的表3)是來自MYB和MADSBOX家族的轉(zhuǎn)錄因子。許多研究證實了這2個轉(zhuǎn)錄因子家族作為在不同的發(fā)育過程(其中有毛狀體和纖維形態(tài)發(fā)生)中具有關(guān)鍵作用的同源異型基因的功能(Suo.J.等2003，F(xiàn)errarioS等2004)。它們在纖維發(fā)育早期中的作用，也得到了它們的RNA表達(dá)模式的支持，后者在開花那天之前和過程中誘導(dǎo)。一個基因(CT_2，上面的表3)歸入淀粉和蔗糖代謝途徑。近期的工作證實，屬于該途徑的另一個基因(SUS)是纖維起始和發(fā)育的限制因子。將CT_40、75歸入脂質(zhì)運輸，它的RNA表達(dá)在早期纖維延長階段高度誘導(dǎo)，這與脂質(zhì)是纖維形成的關(guān)鍵組分的事實相符合。幾個基因(上面的表3，CT_4、70、71)歸入?yún)⑴c脫水、脫落酸刺激的鹽度反應(yīng)的基因，和參與電子轉(zhuǎn)移的基因。在它們中，通過RNA表達(dá)模式選擇3個要在延長階段誘導(dǎo)的基因(CT7、9和49)。幾項研究將改變質(zhì)子和鉀泵機理視作纖維的快速生長速率的關(guān)鍵因子(SmartL.B，等1998)。組合與纖維延長有關(guān)的幾個基因(例如與淀粉和蔗糖代謝有關(guān)的基因，其會增強細(xì)胞壁形成)和脂質(zhì)運輸基因或與脫水有關(guān)的基因(其可能影響細(xì)胞內(nèi)的壓力)的超表達(dá)，可以導(dǎo)致比超表達(dá)的單個細(xì)胞更長的纖維。實施例9克隆和分析在本發(fā)明的基因的上游的啟動子序列棉花的纖維組織和其它組織中的有差別的基因表達(dá)，是復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)的結(jié)果。預(yù)測在23個選擇的基因上游的基因組區(qū)域具有啟動子活性，其以獨特的定量和定性方式將基因表達(dá)指向纖維細(xì)胞。指向纖維細(xì)胞的精確的基因表達(dá)，對于具有增強的纖維性能的棉花植物的發(fā)育是至關(guān)重要的，而不會負(fù)面地影響其它植物組織。實驗方法啟動子序列的克隆-如下所述，從棉花(陸地棉Acala變種)的基因組DNA，克隆在CT2和CT6的上游的基因組序列。使用DNA提取試劑盒(Dneasy植物小試劑盒，Qiagen，德國)，從4周齡栽培的棉花植物(陸地棉Acala變種)的植物葉組織提取總基因組DNA。按照一般規(guī)程(www.pmci.unimelb.edu.au/corefacilities/manual/mb390.asp)，利用下面改進(jìn)，在基因組DNA上進(jìn)行反向PCR(IPCR)、DNA消化、自身連接和PCR反應(yīng)。為了避免IPCR中的錯誤，首先鑒別有關(guān)的cDNA的5′序列的基因組序列(即包括內(nèi)含子)，以生成基因組島(GI)。使用基于cDNA簇序列設(shè)計的直接寡核苷酸引物，PCR-擴增所需的來自基因組DNA的區(qū)域(對于CT_2和CT_6，各GI序列如CT_2和CT_6的SEQIDNO.74和75所述。引物如SEQIDNO.14-15(CT_2)和101-102CT_6所述)。使用普通的PCR規(guī)程，在DNA熱循環(huán)儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。例如92℃/3分鐘→31×[94℃/30秒→56℃/30秒→72℃/3分鐘]→72℃/10分鐘)。使用PCR純化試劑盒(Qiagen)純化PCR產(chǎn)物，并使用ABI377測序儀(AmershamBiosciencesInc)對擴增的PCR產(chǎn)物測序。在有些情況下，當(dāng)IPCR導(dǎo)致較差的擴增時，使用不同的技術(shù)[UP-PCR(Dominguez和Lopez-Larrea.1994)]。為了擴增已知簇序列的未知上游區(qū)域，使用UP-PCR技術(shù)。通常，該方法包含4種寡核苷酸引物2種序列特異性的引物(SPs，外部的和內(nèi)部的)(下面列出)，二者都具有相同的方向，其3′端朝向未知的、但是需要的基因的5′區(qū)域，和2種萬能的步移(walking)引物(WP285′-TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT(SEQIDNO.76和sWP5′-TTTTTGTTTGTTGTGGG，SEQIDNO.77)。使用下面的反應(yīng)混合物，進(jìn)行反應(yīng)樣品混合物(SM)-棉花物種的基因組DNA(30-40ng)，WP28引物(20pmol)，并用重蒸餾水加至10μl終體積。聚合酶混合物(PM)-dNTPs(Roche，瑞士，各10nmol)、ExpandLongTemplateEnzymemix(Roche，瑞士，1U)、補加了酶的10x緩沖液，并用重蒸餾水加至8μl終體積。將SM置于熱循環(huán)儀(Biometra，美國)，在那里進(jìn)行擴增程序在90℃進(jìn)行1分鐘，保持在80℃(暫停)，直到加入PM，在15℃進(jìn)行30秒，在25℃進(jìn)行10分鐘，在68℃進(jìn)行3分鐘，保持在90℃，直到加入外部SP(2μl10μM濃度)。該過程后面是外部PCR反應(yīng)在92℃進(jìn)行30秒，在94℃進(jìn)行10秒，在65.5℃進(jìn)行30秒，在68℃進(jìn)行3分鐘，30個循環(huán)后，在68℃最后延伸10分鐘。使用5000-25000倍稀釋的外部PCR產(chǎn)物作為模板，且使用特異性的內(nèi)部sWP和SP(各30pmol)引物，1UExTaq(Takara)，以50μl反應(yīng)體積，進(jìn)行PCR擴增。使內(nèi)部PCR反應(yīng)進(jìn)行擴增程序在92℃進(jìn)行2分鐘，然后在94℃進(jìn)行30秒，在58℃進(jìn)行30秒，且在72℃進(jìn)行3分鐘，30個循環(huán)后，在72℃最后延伸10分鐘。純化(PCR純化試劑盒，Qiagen，德國)IPCR/Up-PCR產(chǎn)物，并測序(ABI377測序儀，AmershamBiosciencesInc)。CT_2的引物如下(UP-PCR)外部引物sWP28-5′-TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT-3′(SEQIDNO.78)SP(外部)-5′-CTGGGGTTACTTGCTAATGG-3′(SEQIDNO79)內(nèi)部(嵌套)引物sWP-5′-TTTTTGTTTGTTGTGGG-3′(SEQIDNO80)SP(內(nèi)部)-5′-GCTCCGGGCTTTGGTTAACG-3′(SEQIDNO81)在SEQIDNO14中，提供了由上面的方法產(chǎn)生的CT_2的內(nèi)部基因組序列。CT_6的引物如下(UP-PCR)外部引物sWP28-5′-TTTTTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGGTGT-3′(SEQIDNO.78SP(外部)-5′-GGCTTTGGGATGTTTGAGGTGG-3′(SEQIDNO.82)內(nèi)部(嵌套)引物sWP-5′-TTTTTGTTTGTTGTGGG-3′(SEQIDNO83)SP(內(nèi)部)-5′-GGTGGTGGGCTCTTGCAACAG-3′(SEQIDNO84)在SEQIDNO85中，提供了由上面的方法產(chǎn)生的CT_2的內(nèi)部基因組序列。為了克隆推定的啟動子和5′UTR，使用一組新引物(見下面)進(jìn)行PCR擴增，對所述引物延伸8-12bp，其包括在5′端上的一個限制位點(HindIII、SalI、XbaI、BamHI或SmaI)。對于每個啟動子，選擇在啟動子序列中不存在的限制位點。而且，如此設(shè)計引物序列中的限制位點，以便以正確的方向，在GUS報告基因的上游將得到的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)二元載體pPI。通過將源自pGL3基本質(zhì)粒載體(Promega，AccNoU47295；bp4658-4811)的合成的多腺苷酸化信號序列插入二元載體pBI1001.3(Clontech，登記號U12640)的HindIII限制位點，來構(gòu)建質(zhì)粒pPI。下面是啟動子和5′UTR(P+U)擴增和克隆進(jìn)pPI使用的引物，和擴增和克隆的序列。以粗體字母顯示每個引物內(nèi)的限制位點CT_2P+U正向(HindIII)5′-ATTCAAGCTTTTTTTGTTTGTTGTGGGGG-3′(SEQIDNO86)P+U反向(BamHI)5′-TTGGATCCTTGGGCATTGAGCTTCTGTAC-3′(SEQIDNO87)CT_2的P+U序列如SEQIDNO88所述。CT6P+U正向(HindIII)5′-TTAAAGCTTTGGGCTCTTGCAACAGAGGC-3′(SEQIDNO89)P+U反向(BamHI)5′-AAGGATCCGACGACGACAACAACAACAAC-3′(SEQIDNO90)CT_6的P+U序列如SEQIDNO91所述。將基因組DNA或IPCR/UP-PCR產(chǎn)物用作使用新設(shè)計的寡核苷酸引物的PCR-擴增的DNA模板。純化(PCR純化試劑盒，Qiagen，德國)PCR產(chǎn)物，并以存在于引物中的限制位點(Roche，瑞士)進(jìn)行消化。重新純化消化的PCR產(chǎn)物，并克隆進(jìn)用相同限制酶消化的二元載體pPI。使用T4DNA連接酶(Roche，瑞士)，連接PCR產(chǎn)物和開口的質(zhì)粒載體。實施例10用攜帶棉花纖維啟動子的二元載體轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌細(xì)胞使用在GUS報告基因上游的pPi二元載體，其包括CT2或CT6啟動子，來轉(zhuǎn)化土壤桿菌細(xì)胞。通過電穿孔，將二元載體導(dǎo)入根癌土壤桿菌GV301或LB4404感受態(tài)細(xì)胞(約109細(xì)胞/mL)。使用MicroPulser電穿孔儀(Biorad)，0.2cm杯(Biorad)和EC-2電穿孔程序(Biorad)，進(jìn)行電穿孔。在28℃，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)處理的細(xì)胞3小時，然后鋪平板到補加了慶大霉素(50mg/L；對于土壤桿菌株GV301)或鏈霉素(300mg/L；對于土壤桿菌株LB4404)和卡那霉素(50mg/L)的LB瓊脂上，在28℃持續(xù)48小時。使用SEQIDNO70-71所述的引物，其設(shè)計成跨pPI質(zhì)粒中的插入序列，通過PCR，分析在選擇培養(yǎng)基上形成的土壤桿菌菌落。分離得到的PCR產(chǎn)物，并如上面實施例4所述測序，以證實將正確的序列正確地導(dǎo)入土壤桿菌細(xì)胞中。實施例11在番茄葉子和番茄果實中表達(dá)棉花纖維特異性的啟動子進(jìn)行GUS染色，以解釋毛狀體和番茄果實中的特異性表達(dá)。實驗方法用推定的棉花啟動子轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄植物-如上所述。用推定的棉花啟動子轉(zhuǎn)化鼠耳芥植物-如上所述。鼠耳芥的Gus染色-如以前所述(JeffersonRA.等1987，Meissner等2000)，進(jìn)行鼠耳芥植物的Gus染色。番茄葉子的Gus染色-如以前所述(JeffersonRA.等1987，Meissner等2000)，進(jìn)行番茄植物的Gus染色。如下進(jìn)行組織固定。將番茄葉子浸沒在90％冰冷的丙酮中，然后在冰上溫育15-20分鐘，隨后去除丙酮。此后，在黑暗中，用工作溶液[100mM磷酸鈉(Sigma，美國)緩沖液pH＝7、鐵氰化物(Sigma，美國)5mM、亞鐵氰化物(Sigma，美國)5mM、EDTA(BioLab)pH＝81mM、TritonX-100(Sigma，美國)1％]沖洗組織2次，15-20分鐘。然后，去除沖洗溶液，替換為X-gluc染色溶液[工作溶液+溶解在N，N-二甲基甲酰胺(BioLab)中的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(X-GlcA，Duchefa)0.75mg/ml、二硫蘇糖醇(BioLab)100mM]，并在37℃，在黑暗中溫育過夜(用鋁箔包裝管)。通過將植物組織浸沒在70％乙醇中，并在50℃加熱約120分鐘，實現(xiàn)變色(distain)。重復(fù)變色步驟，直到植物組織變成透明的，除了染成藍(lán)色的區(qū)域以外。在室溫，將變色的植物保藏在70％乙醇(BioLab)。番茄果實的GAS染色-如以前所述(JeffersonRA.等1987，Meissner等2000)，實現(xiàn)番茄果實的Gus染色。簡而言之，在黑暗中，將薄番茄果實切片浸沒于染色溶液[100mM磷酸鈉(Sigma，美國)緩沖液pH＝8、鐵氰化物(Sigma，美國)5mM、亞鐵氰化物(Sigma，美國)5mM、EDTA(BioLab)pH＝815mM、甲醇(BioLab)20％、溶解在N，N-二甲基甲酰胺(BioLab)中的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(X-GlcA，Duchefa)0.75mg/ml](用鋁箔包裝管)，且在37℃溫育過夜。通過將植物組織浸沒在70％乙醇中，并在50℃加熱約20分鐘，實現(xiàn)變色。重復(fù)變色步驟，直到果實切片變成透明的，除了染成藍(lán)色的區(qū)域以外。在室溫，將變色的果實保藏在70％乙醇(BioLab)。結(jié)果在T1番茄植物的種子上，進(jìn)行GUS染色。在遺傳轉(zhuǎn)化的番茄植物中的啟動子CT2和CT6的調(diào)節(jié)下，表達(dá)GUS(圖7a-b)。下面的表10總結(jié)了番茄T1代的結(jié)果。表10數(shù)字代表著平均級別，0-未表達(dá)，5-高表達(dá)實施例12作為棉花纖維的模型系統(tǒng)的番茄種子纖維棉花的基因修飾是冗長且耗時的。因此，為了發(fā)現(xiàn)能提高棉花纖維產(chǎn)量和質(zhì)量的基因，需要其它植物中的棉花纖維發(fā)育的模型系統(tǒng)。毛狀體細(xì)胞和根毛共有與棉花纖維細(xì)胞共同的特征，且被廣泛地接受為棉花纖維發(fā)育的模型系統(tǒng)[綜述見Wagner.GJ.等2004，和Wang等2004]。但是，由于毛狀體細(xì)胞的小尺寸、遠(yuǎn)可接近性和缺少尺寸的均勻性，測量生長速率、長度和厚度以及其它結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化并非一項容易的工作。為了克服這些限制，分析番茄種子纖維用作棉花纖維發(fā)育的模型組織的可能性。為此目的，如上所述，在源自CT2的棉花纖維特異性的啟動子元件的調(diào)節(jié)下，超表達(dá)GUS報告基因。如上所述，實現(xiàn)二元構(gòu)建體的番茄轉(zhuǎn)化、植物再生和GUS染色。番茄種子纖維(圖8a)是母體表皮細(xì)胞，覆蓋著種子的胚珠表面。在解剖學(xué)方面，番茄種子纖維比毛狀體細(xì)胞或根毛更接近棉花纖維。生產(chǎn)4種獨立的轉(zhuǎn)基因番茄果實，其超表達(dá)在棉花特異性的啟動子CT_2下的GUS基因。只在發(fā)育種子纖維的種子殼上，觀察到成熟-綠色階段(果實是實際大小，即將進(jìn)行成熟過程)的果實的GUS染色(圖7a和b)。生產(chǎn)5種獨立的轉(zhuǎn)基因番茄果實，其超表達(dá)35S-蘋果青霉素(AF043284)，測量種子纖維長度，并與野生型對比。轉(zhuǎn)基因植物的種子纖維明顯比野生型長(圖8a-b)。表11應(yīng)當(dāng)指出，為了清楚而在獨立的實施方案上下文中描述的本發(fā)明的某些特征，也可以在單個實施方案中組合地提供。相反地，為了簡潔而在單個實施方案上下文中描述的本發(fā)明的各種特征，也可以分開地或以任何合適的子組合提供。盡管已經(jīng)結(jié)合特定實施方案描述了本發(fā)明，但顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會明白許多替代方案、改進(jìn)和變化。因此，意在包括落入所附權(quán)利要求書的精神和廣闊范圍內(nèi)的所有這樣的替代方案、改進(jìn)和變化。在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請和GenBank登記號，都在本文中整體引入說明書作為參考，其程度與特別地和個別地指明將每篇單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埢騁enBank登記號在本文中引作參考相同。另外，任何文獻(xiàn)在本申請中的引用或標(biāo)識都不應(yīng)理解為承認(rèn)這樣的文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。在本申請中通過作者姓名引用的文獻(xiàn)(在該文件中引用了其它文獻(xiàn))CedroniM.L，CronnR.C，AdamsK.L，WilkinsT.A，andWendelJ.F.2003.EvolutionandexpressionofMYBgenesindiploidandpolyploidcotton.PlantMol.Biol.51，313-25.CloughS.J，andBentA.F(1998).FloraldipasimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.16，735-43.CurtisI.S，DaveyM.R，andPowerJ.B.1995.Leafdisktransformation.MethodsMol.Biol.44，59-70.DesfeuxC，CloughS.J，andBentA.F(2000).FemalereproductivetissuesaretheprimarytargetofAgrobacterium-mediatedtransformationbytheArabidopsisfloral-dipmethod.PlantPhysiol.123，895-904.DominguezO，andLopez-Larrea.C.1994.GenewalkingbyunpredictablyprimedPCR.NucleicAcidsResearch.223247-3248.HsuC.Y，CreechR.G，JenkinsJ.N，andMaD.P.1999.AnalysisofpromoteractivityofcottonlipidtransferproteingeneLPT6intransgenictobaccoplants.PlantSci143，63-70.KimH.J，andTriplettB.A.2001.Cottonfibergrowthinplantaandinvitro.Modelsforplantcellelongationandcellwallbiogenesis.PlantPhysiol.2001Dec；127(4)1361-6.LarkinJ.C，BrownM.L，andSchiefelbeinJ.2003.Howdocellsknowwh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oHisAspProSerThrProSerThrProSerHisThrProProHis100105110GlyThrProProSerSerGlyGlyGlySerProProSerTyrGlyGly115120125GlySerProProSerTyrGlyGlyGlySerProProSerTyrGlyGly130135140GlySerProProSerTyrGlyGlyGlySerProProSerTyrGlyGly145150155160GlySerProProThrThrProIleAspProGlyThrProSerIlePro165170175SerProProPhePheProAlaProThrProProIleGlyGlyThrCys180185190AspPheTrpArgSerHisProThrLeuIleTrpGlyLeuLeuGlyTrp195200205TrpGlyThrValGlyAsnAlaPheGlyValThrAsnAlaProGlyLeu210215220GlyThrSerMetSerLeuProGlnAlaLeuSerAsnThrArgThrAsp225230235240GlyLeuGlyAlaLeuTyrArgGluGlyThrAlaSerPheLeuAsnSer245250255MetValAsnAsnArgPheProPheSerThrLysGlnValArgGluThr260265270PheValAlaAlaLeuGlySerAsnSerAlaAlaAlaAlaGlnAlaArg275280285LeuPheLysLeuAlaAsnGluGlyHisLeuLysProArgThr290295300<210>123<211>196<212>PRT<213>陸地棉(Gossypiumhirsutum)<400>123MetMetLysArgGlyPheIleValLeuAlaLeuThrValValPheAla151015AlaThrValValThrAlaAlaAspGluSerGlyLeuAlaAsnGluCys202530SerLysAspPheGlnSerValMetThrCysLeuSerPheAlaGlnGly354045LysAlaAlaSerProSerLysGluCysCysAsnSerValAlaGlyIle505560LysGluAsnLysProLysCysLeuCysTyrIleLeuGlnGlnThrGln65707580ThrSerGlyAlaGlnAsnLeuLysSerLeuGlyValGlnGluAspLys859095LeuPheGlnLeuProSerAlaCysGlnLeuLysAsnAlaSerValSer100105110AspCysProLysLeuLeuGlyLeuSerProSerSerProAspAlaAla115120125IlePheThrAsnSerSerSerLysAlaThrThrProSerThrSerThr130135140ThrThrAlaThrProSerSerAlaAlaAspLysThrAspSerLysSer145150155160SerGlyIleLysLeuGlyProHisPheValGlySerThrAlaAlaLeu165170175LeuValAlaThrAlaAlaValPhePheLeuValPheProAlaGlyPhe180185190AlaSerIleVal195<210>124<211>629<212>PRT<213>陸地棉(Gossypiumhirsutum)<400>124MetProValValAspPheAlaCysValPheLeuValSerValValMet151015PheAsnLeuArgValSerThrGluProValGluAspLysGlnAlaLeu202530LeuAlaPheIleSerGlyIleArgHisAlaAspArgValLysTrpAsn354045SerSerThrSerAlaCysAspTrpPheGlyValGlnCysAspAlaAsn505560ArgSerPheValTyrThrLeuArgValProGlyTrpGlyProTyrGly65707580ValArgPheArgProLysGlnIleGlyArgLeuAsnArgLeuArgVal859095LeuSerLeuArgAlaAsnArgLeuSerGlyGluIleProAlaAspPhe100105110TyrAsnLeuThrGlnLeuArgSerLeuTyrLeuGlnGlyAsnGluPhe115120125ThrGlyProPheProProSerValThrArgLeuThrArgLeuThrArg130135140LeuAspLeuSerSerAsnAsnPheThrGlyProIleProLeuGlyVal145150155160AsnAsnLeuThrGlnLeuThrLysLeuPheLeuGlnAsnAsnLysPhe165170175SerGlySerLeuProSerIleAspSerAspGlyLeuAsnAspPheAsn180185190ValSerAsnAsnAsnLeuLysGlySerIleProAspSerLeuSerLys195200205PheProGluSerSerPheAlaGlyAsnIleGlyLeuCysGlyGlyPro210215220LeuArgProCysAsnProPheProProSerProSerProThrGluPro225230235240IleProProLysThrSerGlyGlnSerSerLysSerLeuProThrGly245250255AlaIleIleAlaIleAlaValGlySerAlaIleValAlaLeuLeuLeu260265270LeuLeuPheLeuIleIleCysPheArgLysTrpLysArgLysSerPro275280285ArgArgGlnLysAlaIleProSerThrThrHisAlaLeuProValGlu290295300GluAlaGlyThrSerSerSerLysAspAspIleThrGlyGlySerThr305310315320GluIleGluArgMetMetAsnAsnLysLeuMetPhePheLysGlyGly325330335ValTyrSerPheAspLeuGluAspLeuMetArgAlaSerAlaGluMet340345350LeuGlyLysGlySerThrGlyThrSerTyrArgValValLeuAlaVal355360365GlyThrThrValAlaValLysArgLeuLysAspValAlaValSerLys370375380ArgGluPheValMetLysMetGlyMetLeuGlyLysIleMetHisGlu385390395400AsnValValProLeuArgAlaPheTyrTyrSerAspGluGluLysLeu405410415LeuValTyrAspTyrMetHisGlyGlySerLeuPheAlaLeuLeuHis420425430GlySerArgSerSerAlaArgThrProLeuGluTrpAspProArgMet435440445LysIleAlaLeuGlyValAlaArgGlyLeuAlaHisLeuHisSerSer450455460GlnAsnMetValHisGlyAsnIleLysSerSerAsnIleLeuLeuArg465470475480ProAspHisGluAlaCysIleSerGluPheGlyLeuAsnSerLeuPhe485490495AsnThrAsnThrProProSerArgIleAlaGlyTyrGlnAlaProGlu500505510ValIleGlnThrHisLysValThrValLysSerAspValTyrSerPhe515520525GlyValLeuLeuLeuGluLeuLeuThrGlyArgAlaProIleGlnPro530535540SerIleThrGluGluGlyPheAspLeuProArgTrpValGlnSerVal545550555560ValArgGluGluTrpAlaAlaGluValPheAspAlaGluLeuMetAla565570575TyrHisAspIleGluGluGluMetValGlnAlaLeuGlnMetAlaMet580585590ValCysValSerThrValProAspGlnArgProValMetSerGluVal595600605ValArgMetIleGlyAspMetIleAspArgGlyGlyThrAsnAspGly610615620ThrAlaAlaAlaIle625<210>125<211>545<212>PRT<213>陸地棉(Gossypiumhirsutum)<400>125MetAlaGluMetSerThrLeuCysThrPheLeuPheSerLeuLeuLeu151015PheAlaSerHisProLeuIleLeuProThrAlaAlaAspGlyArgTrp202530GlnLeuLeuGlnLysSerIleGlyIleSerSerMetHisMetGlnLeu354045LeuLysAsnAspArgValValMetTyrAspArgThrAspPheGlyPro505560SerThrLeuProLeuAlaSerGlyLysCysHisAsnAspProThrAsn65707580ThrAlaValGlnValAspCysThrAlaHisSerValGluTyrAspVal859095LeuSerAsnLysPheArgAlaLeuThrValGlnSerAsnValTrpCys100105110SerSerGlyGlyValMetProAspGlyLysLeuValGlnThrGlyGly115120125PheSerGluGlyGluLeuArgValArgValPheSerProCysGluSer130135140CysAspTrpHisGluThrProAsnGlyLeuAlaAlaLysArgTrpTyr145150155160AlaThrAsnHisValLeuProAspGlyArgGlnIleValValGlyGly165170175ArgGluGlnPheAsnTyrGluPheValProLysAsnIleAlaAlaAsp180185190ThrPheLysLeuHisPheLeuSerGluThrAsnGluArgGlyValGlu195200205AsnAsnLeuTyrProPheValPheLeuAsnValAspGlyAsnLeuPhe210215220IlePheAlaAsnAsnArgAlaIleLeuLeuAspTyrValAsnAsnLys225230235240ValValLysThrTyrProLysIleProGlyGlyGluProArgSerTyr245250255ProSerThrGlySerAlaValLeuLeuProLeuLysAsnLeuThrAla260265270AlaThrIleGlnAlaGluValLeuValCysGlyGlyAlaProLysGly275280285SerPheValGlnAlaLeuGlnGlyLysPheValLysAlaLeuAsnThr290295300CysAlaArgIleSerIleThrAspProLysProLysTrpValLeuGlu305310315320ThrMetProLeuAlaArgValMetGlyAspMetValLeuLeuProAsn325330335GlyLysValLeuValIleAsnGlyAlaArgSerGlySerAlaGlyTrp340345350AspLeuGlyArgAspProValLeuAsnProValLeuTyrMetProAsp355360365AsnGluIleGluSerArgPheLysIleLeuAsnProThrLysIlePro370375380ArgMetTyrHisSerThrAlaValLeuLeuArgAspGlyArgValLeu385390395400ValGlyGlySerAsnProHisAlaTyrTyrAsnPheThrGlyValLeu405410415TyrProThrGluLeuSerLeuGluAlaPheTyrProGlyTyrLeuAsp420425430AlaLysPheAsnAsnLeuArgProThrIleValAlaProLysSerMet435440445SerGlyIleArgTyrAsnLysLysLeuLysIleLysValValIleThr450455460GlyGluValThrLeuAsnLeuLeuSerValThrMetValSerProAla465470475480PheAsnThrHisSerPheSerMetAsnGlnArgLeuLeuValLeuGly485490495AsnAspLysValMetAlaSerGlyLysSerThrTyrGluIleGluVal500505510MetThrProGlySerGlyAsnLeuAlaProAlaGlyPheTyrLeuLeu515520525PheValValHisGlnAspIleProSerGlnGlyIleTrpValHisLeu530535540Lys545<210>126<211>508<212>PRT<213>陸地棉(Gossypiumhirsutum)<400>126MetGlnIleLeuProPheArgGlyGlyAlaLeuValCysPheIleAla151015SerLeuLeuPheValAlaSerPheCysAsnAlaAspAlaLysThrVal202530GluValValGlyAlaGlyGluCysAlaAspCysAlaGluAsnAsnLeu354045GluIleSerGlnAlaPheSerGlyLeuArgValSerIleAspCysLys505560ProGluAsnGlyLysAsnPheLysThrArgGlySerGlyGluLeuAsp65707580LysGlnGlyAsnPheLysValPheValProGluAspLeuValGluAsn859095GlyGluLeuLysGluGluCysTyrAlaGlnLeuHisSerValSerAla100105110AlaProCysProAlaHisAspGlyLeuGluSerAlaLysLeuValLeu115120125LysSerArgSerAspGlyLysHisGlyPheGlyLeuLysGlyLysLeu130135140ArgPheSerProLeuThrCysAlaSerAlaPhePheTrpProHisPhe145150155160LysPheProProLeuProLysTrpAsnHisProProLeuProLysPhe165170175ProLeuProProPheLysGlyPheHisHisHisTyrProIleIlePro180185190ProIleTyrLysLysProLeuProProProSerProValTyrLysPro195200205ProProValProValAsnProProValProIleTyrLysProProPro210215220ValProValTyrLysProProProValProValLysProLeuProPro225230235240ProValProIleTyrLysProProProValGluLysProHisProPro245250255ProValProValTyrLysProProProValProValTyrLysLysPro260265270CysProProProValProValTyrLysSerProProValProValTyr275280285LysLysProHisProProProValProValTyrLysLysProHisPro290295300ProProValProValTyrLysLysProCysProProProValProVal305310315320TyrLysSerProProValProGluProHisProProProValProVal325330335TyrLysLysProHisProProProValProValTyrLysLysProCys340345350ProProProValProValTyrLysSerProProValProGluProHis355360365ProProProValProValHisLysProProProValProValTyrLys370375380LysArgValProProProValProIleTyrLysProProProValPro385390395400ValTyrAsnLysProLeuProProProValProValTyrThrLysPro405410415LeuProProProValProThrTyrLysProLysProLeuProProIle420425430ProTyrLysProLeuProProLeuProLysIleProProPheProLys435440445LysProCysProProLeuProLysLeuProProLeuProLysIlePro450455460ProLysTyrPheHisHisHisProProLeuProLysLeuProProLeu465470475480ProLysIleProProLysTyrPheHisHisHisProLysPheGlyLys485490495TrpProSerLeuProProPheAlaProHisHisPro50050權(quán)利要求1.分離的多核苷酸，其包含編碼具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列的多肽的核酸序列，其中所述的多肽能調(diào)節(jié)棉花纖維發(fā)育。2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的核酸序列選自SEQIDNO.1、2、4、5、7、9、10、16、17、20、21、22、24、25、27和13。3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的多肽如SEQIDNO.26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96所述。4.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的氨基酸序列如SEQIDNO.26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96所述。5.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的棉花纖維發(fā)育包含纖維形成。6.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述的棉花纖維發(fā)育包含纖維延長。7.分離的多核苷酸，其包含與SEQIDNO85或91具有至少80％同一性的核酸序列，其中所述的核酸序列能調(diào)節(jié)至少一個可操作地與其連接的多核苷酸序列在胚珠內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。8.權(quán)利要求7的分離的多核苷酸，其中所述的胚珠內(nèi)皮細(xì)胞是植物纖維或毛狀體的。9.寡核苷酸，其能與權(quán)利要求1或7的分離的多核苷酸特異性地雜交。10.包含權(quán)利要求1的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。11.包含權(quán)利要求7的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。12.權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體，其中該核酸構(gòu)建體還包含至少一個可操作地連接到分離的多核苷酸上的順式-作用調(diào)節(jié)元件。13.權(quán)利要求7的核酸構(gòu)建體，其中所述的多核苷酸序列選自SEQIDNO1、2、4、5、7、9、10、16、17、20、21、22、24、25、27和13。14.權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體，其中所述的順式-作用調(diào)節(jié)元件是如SEQIDNO74、75、85或91所述的或其功能等同物。15.包含權(quán)利要求10和/或11的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。16.包含權(quán)利要求10和/或11的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。17.提高纖維生產(chǎn)性植物的纖維質(zhì)量和/或產(chǎn)量的方法，該方法包含，調(diào)節(jié)至少一種編碼多肽的多核苷酸在纖維生產(chǎn)性植物中的表達(dá)水平或活性，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列，從而提高纖維生產(chǎn)性植物的質(zhì)量和/或產(chǎn)量。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述纖維生產(chǎn)性植物的質(zhì)量包含至少一個選自下述的參數(shù)纖維長度、纖維強度、每單位長度的纖維重量、成熟度比率、均勻性和馬克隆尼氣流式纖維細(xì)度測試儀。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述的調(diào)節(jié)所述至少一種多核苷酸的表達(dá)或活性是上調(diào)。20.權(quán)利要求19的方法，其中通過向棉花中導(dǎo)入權(quán)利要求10和/或11的核酸構(gòu)建體，實現(xiàn)所述的上調(diào)。21.權(quán)利要求17的方法，其中所述的調(diào)節(jié)所述至少一種多核苷酸的表達(dá)或活性是下調(diào)。22.權(quán)利要求21的方法，其中通過基因沉默實現(xiàn)所述的下調(diào)。23.權(quán)利要求22的方法，其中通過向棉花中導(dǎo)入權(quán)利要求9的寡核苷酸，實現(xiàn)所述的基因沉默。24.權(quán)利要求17的方法，其中所述的纖維生產(chǎn)性植物選自棉花、絲綿樹(木棉花，吉貝)、沙漠柳樹、石炭酸灌木、winterfat、輕木、苧麻、洋麻、大麻、洛神葵、黃麻、sisalabaca和亞麻。25.增加植物的生物量的方法，該方法包含，調(diào)節(jié)至少一種編碼多肽的多核苷酸在植物中的表達(dá)水平或活性，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列，從而增加該植物的生物量。26.權(quán)利要求25的方法，其中該植物是單子葉植物。27.權(quán)利要求25的方法，其中該植物是雙子葉植物。28.鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因的方法，該方法包含(a)提供源自棉花纖維的表達(dá)的核酸序列；(b)提供源自胚珠組織的表達(dá)的核酸序列；(c)計算地裝配(a)和(b)所述的表達(dá)的核酸序列，以產(chǎn)生簇；和(d)鑒別所述簇中包含(a)和(b)的表達(dá)的核酸序列的簇，從而鑒別參與棉花纖維發(fā)育的基因。29.權(quán)利要求28的方法，還包含，在(d)之后，鑒別在所述棉花纖維中有差異地表達(dá)的基因。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述的有差異地表達(dá)包含(a)特異性的表達(dá)；和/或(b)表達(dá)隨纖維發(fā)育的變化。31.生產(chǎn)昆蟲抗性植物的方法，其包含調(diào)節(jié)至少一種編碼多肽的多核苷酸在植物的毛狀體中的表達(dá)水平或活性，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列，從而生產(chǎn)昆蟲抗性植物。32.生產(chǎn)棉花纖維的方法，該方法包含(a)產(chǎn)生表達(dá)至少一種多肽的轉(zhuǎn)基因棉花植物，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列；和(b)收獲所述轉(zhuǎn)基因棉花植物的纖維，從而生產(chǎn)棉花纖維。全文摘要提供了分離的多核苷酸。每種分離的多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有與SEQIDNO26、106、107、109、110、112、114、115、118、119、122、123、124、126、95或96至少80％同源的氨基酸序列，其中該多肽能調(diào)節(jié)棉花纖維發(fā)育。還提供了使用這樣的多核苷酸提高纖維生產(chǎn)性植物的纖維質(zhì)量和/或產(chǎn)量的方法，以及使用這樣的多核苷酸生產(chǎn)具有提高的生物量/活力/產(chǎn)量的植物的方法。文檔編號C12N15/11GK101068929SQ200580027481公開日2007年11月7日申請日期2005年6月14日優(yōu)先權(quán)日2004年6月14日發(fā)明者G·羅南,E·戈爾德,R·耶林,R·梅斯納,H·卡奇,S·阿雅爾申請人:伊沃基因有限公司