專利名稱：：用于抗人乳頭瘤病毒型16的salmonella疫苗菌株的密碼子經(jīng)優(yōu)化的hpv16li的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及如在SEQIDNO:1中提供的編碼抗原HPV16LI蛋白的新核酸序列(HPV16L1S),其中該所述序列具有至少一個經(jīng)修飾的密碼子以在原核微生物中轉(zhuǎn)化時優(yōu)化重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，以提高所得原核微生物的免疫原性。本發(fā)明還涉及用編碼HPV16(人乳頭瘤病毒)主要衣殼蛋白并表達該相應蛋白的核酸轉(zhuǎn)化的原核微生物的減毒林。另外，本發(fā)明公開一種生產(chǎn)用于治療乳頭瘤病毒感染和相關(guān)癌變危險的基于原核微生物的疫苗的方法。
背景技術(shù)：
：宮頸癌是全世界婦女癌癥死亡的第二主要原因，且實際上所有這些肺瘤可歸因于人乳頭瘤病毒(HPVs)亞型的感染，其中，發(fā)現(xiàn)HPV16是最常見的(6,41)。因此期待抗這些HPVs的有效疫苗，以對此癌癥和其前期病變發(fā)病率，以及歸因于這些病毒的少見肺瘤具有明顯效果。首位候選的是預防疾病的亞單位HPV病毒樣顆粒(sub-unitHPVvirus-likeparticle)(VLP)疫苗(在(35)和(24)中評論)。原理功效試驗的證據(jù)顯示用HPV16VLPs接種的婦女受到高度保護以防通過此病毒型的生殖器黏膜感染(19)。然而，其預期目標人群將會比兒童期疫苗的預期目標人群年長的疫苗的多次注射的要求可能表現(xiàn)在廣泛實行上的實質(zhì)性的障礙。在發(fā)展中國家這尤其正確，這些發(fā)展中國家占有大于四分之三的全世界宮頸癌病例(6)。已將經(jīng)減毒但仍有侵入性的重組減毒Sa7iMo刀e/7a菌抹廣泛用作黏膜疫苗載體以將病原體特異保護的抗原決定部位遞送至翻膜相關(guān)性、淋巴樣組織中。通過此途徑，抗該載體和外源抗原的黏膜和系統(tǒng)免疫應答均可以獲得(在(ll，22，36)中評論)。我們已示出如果經(jīng)減毒的Saimo"e77ae"feWca血清變型Typhimurium菌林表現(xiàn)出PhoPc表型，則用表達該HPV16主要衣殼蛋白LI(在VLPs中自組裝)的6W7230i3e"a的小鼠的鼻接種，在血清和生殖分泌物中誘導出抗-HPV16的構(gòu)象與中和抗體(3，4，31)。然而，即使用原始PhoPc抹，也需要雙鼻免疫以誘導高抗-HPV16VLP抗體效價，而口免疫是無效的(31)。在缺乏抗生素選擇時低水平LI表達和LI編碼的質(zhì)粒的高不穩(wěn)定性的觀察結(jié)果強烈表明LI蛋白或LI基因?qū)毦赡苁怯卸镜?。由于該病毒LI基因此設計并測試用于在Sa/mo"e7/a中翻譯的具有經(jīng)優(yōu)化的密碼子的編碼LI蛋白的合成核芬酸序列(在此以后標記為L1S)?；谶@樣的VLPs且在目前在臨床試驗中測試的該HPV疫苗已證明是良好耐受性的、高免疫原性的及能夠防止HPV16誘導的宮頸上皮內(nèi)瘤變的發(fā)展(由[Schiller,2004弁1431〗和[Lowy,2003#1397]評論)。然而，這些昂貴的疫苗要求多次肌肉用藥以生效，且由于多數(shù)宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家，這些疫苗對于最需要它們的人來說似乎是難以得到的。因此非常需要開發(fā)其它具有全世界適應性的策略?；顪p毒6^7/fiOi2e^a菌抹可能是有效的抗原遞送系統(tǒng)，由于它們在口接種之后能夠表達外源抗原并引起抗同源和異源抗原的黏膜及系統(tǒng)免疫應答(在[Sch5del，1992#245;Curtiss，1994#466;Levine，1997弁1416]中評論)。在本研究中，我們已進一步優(yōu)化了抗HPV16的基于SaZmoneZ/a的疫苗以便能夠在婦女中測試它。我們已首先用卡那霉素抗性基因替換了用于質(zhì)粒維持的氨節(jié)霉素選擇標記，已知其更高的生物安全記錄的該卡那霉素抗性基因?qū)τ谠谌祟愔械氖褂檬歉涌山邮艿?FDA在1994[Administration,1994#1522]中批準)。然后，我們已在三個已顯示在人類中是安全的SaZmaaeWae"&Wca血清變型Typhi疫苗抹，即目前已得到許可的傷寒癥疫苗Ty21a[Germanier，1975#103],以及兩個高免疫原性的傷寒癥疫苗候選Ty800[Hohmann，1996弁596]詳口CVD908htrA[Tacket，1997弁643]中觀'H式了；亥#斤質(zhì)粒。使用小鼠的鼻內(nèi)免疫模型[Galen，1997#661],比較由此三菌抹引起的抗同源和異源抗原的免疫應答。我們的數(shù)據(jù)顯示在用該新重組菌抹鼻或口免疫之后抗-HVP16YLP的體液反應大大增加。引起關(guān)注的是，這與增加的LI表達無關(guān)，而與在體外和體內(nèi)LIS-表達質(zhì)粒的顯著的穩(wěn)定性有關(guān)。另外，如在其它其減毒適于人類{吏用的Salmonellaenterica血清變型Typhimurium菌才朱戶斤顯示的那樣，免疫原性不限于PhoPc。圖1顯示密碼子經(jīng)優(yōu)化的HPV16L1S可讀框。(SEQIDNO:1)在給出的L1S的核苷酸序列中，加下劃線的為經(jīng)修飾的密碼子和用粗體的為經(jīng)修飾的核苷酸。圖2顯示在PhoP。Ll和PhoP。L1S重組菌林中HPV16L1的表達。圖3顯示LI和LIS-質(zhì)粒在體外的穩(wěn)定性。圖4顯示在用PhoPcL1S鼻和口接種后，抗-HPV16VLP系統(tǒng)的(A)和陰道的(B)抗體效價。圖5顯示在用％4989L1S、x4990L1S、PhoP"LlS和AroAL1S鼻或口接種后，抗-HPV16VLP系統(tǒng)的IgG效價。圖6為在用PhoPckanL1S、Phop-kanLlS禾口AAroAkanL1S口接種后，血清抗-HPV16VLP抗體效價的比較。圖7顯示在不同6^7z3ei^en'ca血清變型Typhi菌株中kanLIS質(zhì)粒在體外的穩(wěn)定性。圖8是在用Ty21akanL1S、Ty800kanL1S和CVD908htrAkanL1S鼻接種后，血清抗-HPV16VLP抗體效價的比較。圖9是HPV16VLP和鞭毛蛋白—特異004+T細胞增值的比較。圖10顯示在用Ty21akanL1S鼻接種的小鼠的血清和陰道分泌物中HPV16-中和與抗-HPV16VLP抗體。圖ll顯示在4義用Ty21akanLIS的或在初始時用經(jīng)純化的VLPs的鼻接種的小鼠的血清和陰道分泌物中HPV16中和與抗-HPV16VLP抗體。在說明書中涉及的表的詳細說明表1&1A涉及在本研究中使用的Salmonella菌林。表2涉及在鼻或口免疫后兩周，攜帶Ll-或LlS-編碼質(zhì)粒的6^Zmoi2e77aPhoPc的回收。表2A涉及在口免疫后兩周，攜帶氨,青霉素e或卡那霉素抗性基因的Ss7i2a2e77aPhoP。LIS-編碼質(zhì)粒的回收。表3涉及在鼻免疫后一周，攜帶kanLIS質(zhì)粒的不同AS^/mo"a/7aez^ei-ica血清變型Typhi的回收。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供如在SEQIDNO:l中提供的編碼抗原HPV16Ll蛋白的新核酸序列(HPV16LIS),其中，所述序列具有至少一個經(jīng)修飾的密碼子，以在原核微生物中轉(zhuǎn)化時優(yōu)化重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，以提高所得原核微生物的免疫原性時。本發(fā)明的另一目的是構(gòu)建包含SEQIDNO:l的重組載體pFS14nsdHPV16Ll和pFS14nsdHPV16kanLIS,其中前者攜帶氨芐青霉素且后者攜帶卡那霉素作為選擇標記。本發(fā)明的又一目的是提供用編碼HPV16(人乳頭瘤病毒)主要衣殼蛋白并表達該相應蛋白的核酸轉(zhuǎn)化的原核微生物的減毒株。本發(fā)明的再一目的是提供一種生產(chǎn)用于治療乳頭瘤病毒感染和相關(guān)癌變危險的基于原核微生物的疫苗的方法。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明提供如在SEQIDNO:l中提供的新核酸序列(HPV16LIS),基于編碼抗原HPV16Ll蛋白的人乳頭瘤病毒型16(HPV16),其中所述序列具有至少一個經(jīng)修飾的密碼子，以當在原核微生物中轉(zhuǎn)化時優(yōu)化重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，以提高所得原核微生物的免疫原性，優(yōu)選該菌抹屬于6^7/23o"eWa種。本發(fā)明進一步涉及構(gòu)建包含SEQIDNO:1的重組載體pFS14nsdHPV16Ll和pFS14nsdHPV16kanLIS,其中前者攜帶氨千青霉素且后者攜帶卡那霉素作為選擇標記。本發(fā)明進一步提供用包含SEQIDNO:l的pFS14nsdHPV16Ll或pFS14nsdHPV16kanLIS轉(zhuǎn)化的屬于Sa/723o"e〃a種的減毒抹。此外，本發(fā)明公開一種生產(chǎn)用于治療乳頭瘤病毒感染和相關(guān)的癌變危險的基于SaZrac^e/7a的疫苗的方法。具體實施方式有用單次口接種誘導長效系統(tǒng)和翁膜免疫的理論優(yōu)勢，將對全世界實行具有非常大的價值。然而，盡管我們已在小鼠中顯示了此策略的可行性(31),但在將基于SaZmo72e/7a的疫苗能夠安全地用于在婦女中測試之前還必須應對幾個缺點。這些缺點包括需要特殊的SaZmoi2e77a表型(PhoP(3，4))和免疫的鼻途徑以有效誘導中和抗體反應，以及LI-編碼質(zhì)粒沒有抗生素選擇時不穩(wěn)定(31,4)或在用半致死互補系統(tǒng)使其穩(wěn)定時弱表達((3)的觀察結(jié)果。在這里，我們報導通過使用用于HPV16LI衣殼基因(HPV16L1S)表達的密碼子優(yōu)化策略解決了這些問題的大多數(shù)。的確，當用鼻或口途徑遞送不同減毒的細菌時，在^aZmo2e/7a中合成的L1S基因穩(wěn)定表達并帶來更高免疫原性。在哺乳動物細胞中天然乳頭瘤病毒衣殼基因的表達是有限的，但是造成的HPVDNA疫苗的免疫原性缺乏可以通過密碼子優(yōu)化解除(20，23和42)。對于其它DNA疫苗已i/v識到密碼子選4奪對免疫原性的影響(l，12，32和38)，其中較高的異源基因表達導致較高的免疫原性。對于在^3//30726//3中的翻譯，由于原始HPV16衣殼基因的密碼子選擇也不是最理想的，我們期望密碼子優(yōu)化的L1S基因的表達將產(chǎn)生更高的VLP表達及由此更高的重組5^7/7303e/^的免疫原性。令我們驚訝的是，不同減毒的LlS重組Sa/i230i2eZ/a的較高的免疫原性與在這些細菌中產(chǎn)生的較高量的L1/VLPs不相關(guān)。事實上，此對立是正確的，與原始LI序列的表達(VLP量在20和60(ig/1011CFU之間，(4))相比，當表達LIS基因時(范圍從AroAUS菌才朱的3jig/1011CFU至x4989IJS的23pg/1011CFU)，產(chǎn)生較少量的HPV16VLPs。這與用經(jīng)優(yōu)化的人HPV16LI基因在哺乳動物細胞中獲得的>104的1^表達增加形成對比(20)。然而，我們應該注意，我們不能排除當Sa^30"e77a入侵其中代謝作用約束(metabolicconstraints)不同的小鼠組織時，在細菌中VLPs的表達量可能變化。不幸地，我們不能測量VLP在體內(nèi)表達，因為回收的細菌數(shù)量相對低(103-104CFU/器官)和獲得的VLP表達低(〈lfg/細菌)。與密碼子優(yōu)化的LIS序列的表達相關(guān)的另一值得注意的特征是在不存在抗生素選擇時，LIS-表達質(zhì)粒在體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性提高。由于其帶來由該細菌攜帶的該VLP抗原的較長的持久性，這可能有助于重組SaZmo"e77a的較高的免疫原性。此解釋與以下的觀點一致在黏膜相關(guān)性淋巴樣組織中較長的抗原持久性是成為由6^7i23o"e77a疫苗菌抹引起的免疫應答的基礎(chǔ)的關(guān)鍵機理(34),且與其它的已接觸抗原黏膜淋巴樣組織的抗原起始量是用于誘導有效免疫應答的關(guān)鍵點的提議(8，IO)形成對比。已使用不同的途徑來提高質(zhì)粒在細菌載體中的穩(wěn)定性(在(13，25)中評論)。它們包括使用體內(nèi)可誘導的啟動子或平衡的致死質(zhì)粒穩(wěn)定化系統(tǒng)，但是，據(jù)我們所知以前沒有報道過優(yōu)化異源抗原的密碼子來誘導質(zhì)粒穩(wěn)定性。引起關(guān)注的是，該質(zhì)粒的穩(wěn)定性和較低的VLP表達與LIS表達細菌在體外較迅速的生長速率相關(guān)。采取將在翻-澤系統(tǒng)中的該投入(investment)優(yōu)化以提供最大的細菌生長速率，并且這通過在不同tRNA和它們的關(guān)連密碼子之間充分的平衡來實現(xiàn)(5)。我們的觀察結(jié)果表明優(yōu)化該異源LI基因的密碼子選擇，釋放出允許翻譯內(nèi)生的細菌蛋白的tRNA池，由此，提高損害L1/VLP表達的生長速率。此在體外提高的生長速率與在體內(nèi)細菌的增強入侵和/或持續(xù)不相關(guān)，由此，我們不能預見LlS表達可能影響Sa7/230i2eZ^疫苗菌抹的安全性。該PhoPcL1S在小鼠中的免疫原性的確提高了，并且與用經(jīng)純化的HPV16VLPs誘導的免疫原性相比良好，其是目前在三期臨床試驗中最主要的原型預防亞基(prototypeprophylacticsub-unit)疫苗(在(24)中評i侖)。用PhoPcLlS的單次鼻免疫誘導出，與用lpg經(jīng)純化的HPV16VLPs三次皮下注射，或用與黏膜佐劑霍亂毒素共同使用的5pgVLP劑量的三次鼻/氣霧免疫類似的血清和陰道抗-HVP16VLPsIgG效價，包括誘導用于黏膜方法的在陰道清洗液中的特異IgA(2，29)。雖然我們已示出用重組^a^2^刀e/h的鼻接種在低劑量時可以是高效的，并且沒有伴隨的肺炎(28)，但是在用此途徑在人類中免疫時仍存在安全上的憂慮。在此，我們報道可以將較安全的口服進入用作用免疫原性的PhoPcL1S的單次口接種，雖然該VLP-特異效價比下面的鼻免疫低，但是它們與在三次不含佐劑的鼻/氣霧5ngVLP用藥之后誘導的效價類似(2)。在人類中測試基于HPV166^77zone77s疫苗的最主要的限制之一是，該包含單一減毒突變的PhoPc菌抹的已報道的可逆性(PhoQ24(27))以及此表型在小鼠中誘導有效抗-VLP反應的必要性(3，4)。在此，我們顯示其它S.^7^i/23"27'"i23菌株(x4989,PhoP"和aroA)能夠在鼻接種后在小鼠中誘導抗-VLP反應，這些菌林的減毒突變已在6UjTin'中測試并顯示在人類中是安全的(x4632(30,39)，Ty800(15)和CVD908-htrA(40))。然而，該效價比通過PhoPc菌抹誘導的效價低一或兩個數(shù)量級，這與我們以前的發(fā)現(xiàn)一致(3，4)。該PhoQ24的表達(3)是否可以增強該新LlS重組菌抹的免疫原性還有待測試。雖然口免疫比鼻免疫效果低，但是該AroAL1S的免疫原性較少受口服進入的影響。由于包含Aro缺失的S.typhi菌抹(CVD908htrA)具有在人類中的最好的安全和免疫原性記錄(在(13，21和33)中評論)，此結(jié)果是非常鼓舞人心的。此重組CVD908htrALIS菌林可代表用于預防HPV16感染和相關(guān)病變的最好的候選口服活疫苗以在人類志愿者中測試。許多年以來，產(chǎn)生具有全世界適用性的抗宮頸癌的預防疫苗一直是我們的主要目標。在此，我們報道在基于SaZmo72e77a的疫苗的開發(fā)上的決定性的改進，即，可接受的選擇標記和安全疫苗菌株的鑒定，現(xiàn)在這將允許在婦女中測試此疫苗。重組細菌疫苗的開發(fā)經(jīng)常需要使用選擇性標記。不幸地，我們使用天冬氨酸B-半醛脫氬酶平^f致死載體-宿主系統(tǒng)[Curtiss，1990#59]以穩(wěn)定L1S在PhoPc中的表達的嘗試沒有誘導出任何VLP-特異免疫應答(數(shù)據(jù)未示出)。因此我們已選出了抗生素選擇標記即，卡那霉素，其具有確定的生物安全記錄且其使用已由FDA批準[Administration,1994#1522]。該卡那霉素選擇性標記將不會給微生物帶來任何試驗室以外的可選擇的優(yōu)勢并且該表型在自然界中已非常普遍。事實上，對卡那霉素的普遍的細菌抗性已限制了此抗生素在人類醫(yī)藥中的使用和酶的高底物特異性保證抗現(xiàn)代抗生素治療的抵抗或阻礙的發(fā)展的缺乏。引起關(guān)注的是，雖然此卡那霉素抗性基因的存在進一步提高了在體內(nèi)該L1S表達質(zhì)粒在Phopc中的穩(wěn)定性，但是用包含該kanL1S質(zhì)粒的三個減毒的*9a7i22oze77aez力erAa血清變型Typhimurium口免疫i秀導的免疫應答，與用包含氨節(jié)青霉素Lis質(zhì)粒的細菌獲得的免疫應答類似[Baud，2004#1439]。除在人類中作為重組疫苗測試的Salmonellaenterica血清變型TyphimuriumPhoP—菌才朱之夕卜[Angelakopoulos，2000#1194]，該基于Salmonella的疫苗是首先被開發(fā)作為抗傷寒疫苗的經(jīng)減毒的Salmonellaenterica血清變型Typhi菌抹(在[Levine，2001#1428〗中評論)。兩種候選傷寒疫苗Ty800[Hohmann,1996#596]和CVD908htrA[Tacket，1997#643]以與Typhimurium菌抹(PhoP-andAroA)同樣方式包含減毒作用(分別為PhoPQ和aro)，在此將其選作用于HPV16VLP的潛在的疫苗載體。此外我們還測試了已經(jīng)得到許可的疫苗Ty21a。三個重組菌抹的體外分析顯示了相似的VLP表達水平和相對的質(zhì)粒不穩(wěn)定性，就此方面來說，該kanLlS質(zhì)粒在Typhi菌4朱中不如其在Typhimurium菌株中穩(wěn)定，但是它比在PhoPc中的amp質(zhì)粒穩(wěn)定[Baud,2004#1439]。當使用脲酶編碼質(zhì)粒時，同樣觀察到質(zhì)粒在Typhi中不穩(wěn)定，4旦在Typhimurium中則不然[Angelakopoulos,2000#1194]。在小鼠中鼻滴給予高劑量的經(jīng)減毒的Salmonellaenterica血清變型Typhi引起一系列免疫應答，這與在口服l會予減毒林的志愿者中觀察到的免疫應答類似(在[Pasetti，2003#1404]中評論)。這支持用此小動物模型來預臨床評估活SW/30刀e77a疫苗候選物的免疫原性和功效。我們首先使用此模型來研究該kanL1S質(zhì)粒的體內(nèi)穩(wěn)定性。在免疫后一周從肺中回收相對高數(shù)量的細菌，反映在深度麻醉下用鼻接種可實現(xiàn)優(yōu)異的肺輩巴向[Balmelli，1998#930;Londono-Arcila，2002#1526],然而，與之前的研究一致，在此后的時間點幾乎沒有細菌從脾回收[Pasetti，2000#1494;Lee，2000#1530;Pickett，2000弁1158]。雖然在回收的所有Ty21a細菌中發(fā)現(xiàn)該kanLIS質(zhì)粒，但是其僅存在于極少數(shù)CVD908htrA和Ty800細菌中。據(jù)我們所知，以前沒有報道過在鼻鼠科動物模型中用重組Ty800的試驗，而以前在Ty21a[Gentschev,2004#1531]和CVD908htrA[Londono—Arcila，2002#1526]中均觀察到質(zhì)粒穩(wěn)定性。在CVD908htrA中該kanL1S獨特的不穩(wěn)定性可能與在我們的質(zhì)粒中存在組成型啟動子而不是在其它重組CVD908htrA菌抹常用的體內(nèi)可誘導nirB啟動子有關(guān)[Wang，2001#1533;Londono-Arcila,2002#1526;Ruiz-Perez，2002#1532]。在CVC908htrA和Ty800中該kanLIS的不穩(wěn)定性可能與這些細菌抗HVP16VLPs的低免疫原性有關(guān)。我們的數(shù)據(jù)清楚的顯示在鼻鼠科動物模型中只有該重組Ty21akanLIS能夠誘導強抗-HPV16VLP抗體和VLP-特異CD4+T細胞反應。相反，CVD908htrA和Ty800均比Ty21a誘導出更強的抗-LPS和抗-鞭毛蛋白抗體，以及鞭毛蛋白-特異CD4T細胞反應(對于Ty800)。此發(fā)現(xiàn)與先前的研究一致，是將CVD908htrA和/或Ty800與Ty21a在鼠科動物鼻模型[Wang，2001弁1533]或人類中進行了比較。本發(fā)明的實施方案涉及通過修飾它們的密碼子合成基于HPV(HumanPapillomaVirus)例如HPV16、HPV18、4531等主要衣殼蛋白的新核酸序列，用于當轉(zhuǎn)入原核4敖生物時，優(yōu)化重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，以提高所得原核微生物免疫原性。該原核微生物4尤選選自由6^/mo"e/7asps、Asc力er/c力yaco/i、/S72_'《e7/aj^rw'zzh、Z/3"oZac/Z/w61、iWyco^s"eria或Z^sfe"'a組成的組中，優(yōu)選6^/mo73a/7a印s。進一步，該Sa/mozzeZ/asps減毒抹選自由SaZmc)"e//aei2fe27'ea血清變型Typhimurium、Sa/mozzeZ/a^XPA厶Sa7/Z20ZZe77a^XP力i/3iZJ7'i7773或/S^7/zOi2e7/a(fwZZz'/2纟且成合勺纟且中。另夕卜，該6^/mozzeZ/a菌抹優(yōu)選選自由iS^/moneY/aez^en'ca血清變型TyphimuriumPhoPc(CS022)、SaZmo"e/7aan力erica血清變型TyphimuriumPhoP(CS015)、6^//MO/3e〃aei2farz.ca血清變型Typhimuriumx4989(AcyaAcrp-cdt和AaroA(SL7207))、5^7moHe77aez,en'ca血清變型Typhi、Ty21a、CVD908htrA、Ty800組成的組中。病毒型16(HPV16)的免疫原性的方法，其包括以下步驟a.通過修飾密碼子選擇合成如在SEQIDNO:l中所示的編碼抗原HPV16Ll蛋白的新核酸，b.通過替換在質(zhì)粒載體pFSl4nsdHPVl6Ll或pFS14nsdHPV16kanLlS中的原始HPV16L1基因構(gòu)建包含SEQIDNo:l的重組pFS14nsdHPV16LlS載體，c.將來自步驟(b)的該重組質(zhì)粒載體引入經(jīng)減毒的微生物以獲得重組接種物，d.在小鼠中給予重組接種物。另一實施方案涉及用編碼HPV(人乳頭瘤病毒)主要衣殼蛋白并表達該相應蛋白的經(jīng)密碼子修飾的核酸轉(zhuǎn)化的原核微生物減毒抹，其中至少一個密碼子是經(jīng)修飾的。該HPV主要衣殼蛋白選自由HPV16、HPV18、HPV31和HPV45組成的組中，優(yōu)選HPV16Ll。該上述菌抹包含新核酸序列SEQIDNO:1。本發(fā)明的又一實施方案涉及一種新核酸，其具有一個或更多經(jīng)修飾的密碼子，用于優(yōu)化在5^//730"6"3菌抹中的重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，以提高所得Sa/ii20"e/h菌林的免疫原性。優(yōu)選地，在本發(fā)明中在HPV16L1序歹'J中已改變來自506個原始密碼子中的163個。而本發(fā)明的又一實施方案提供含有如SEQIDNO:l中所示的DNA序列的重組質(zhì)粒載體，其中該所述重組質(zhì)粒載體為pFSl4nsd-HPV16L1S或pFSnsd-HPV16kanLlS。本發(fā)明的另一實施方案涉及抗HPV16的基于6^/ino刀eWa的疫苗的給藥模型，該模型可能選自由口、內(nèi)鼻、陰道或直腸組成的組中。本發(fā)明另一實施方案提供原核微生物減毒林在制備用于預防或治療處理乳頭瘤病毒感染和相關(guān)的癌變危險的藥物中的用途?，F(xiàn)在非限制性地參考附圖通過實施例來描述本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明實施方案實施例實施例1質(zhì)粒構(gòu)建和所用的細菌菌林該L1S基因由瑞士Buchs的Microsynth合成?？勺x框在5'以ATco7限制性位點和在3'以i/i'i36/Z^限制性位點為側(cè)翼(flanked)。將該LISA^o/-i/i'"o77/片斷插入，替換在質(zhì)粒pFS14nsdHPV16-Ll(31)中的原始LIiVco/-T7yz^7W片斷。將該所得質(zhì)粒，pFS14nsdHPV16-L1S通過電穿孑L(37)引入經(jīng)減毒的ezfer/ca血清變型Typhimurium菌抹PhoPc，(CS022(27))和PhoP"(CS015(26))，兩者都是來自的美國波士頓的JohnMekalanos的贈品，x4989(Acj^4ci75，(4)),x4990G4cyav4ci7-cW,(4))和4arcM(SL7207(16))，是來自IreneCorthesy-Theulaz，Lausanne,CH的贈品。HPV16LI和VLP分析如先前所述15(31),使用抗-HPV16LImAb，CAMVIR-1(Anawa)通過蛋白質(zhì)印跡分析LI在Sa7/230刀e77a溶菌產(chǎn)物中的表達。將數(shù)據(jù)歸一化為如通過培養(yǎng)物的OD600測量的在細菌中的含量。使用識別在HPV16VLPs、H16E70和H16V5上的構(gòu)象性抗原決定部位的兩種單克隆抗體，通過如先前所述的夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(sandwichELISA)(4)測量該HPV16VLP含量(9).20。小鼠的免疫，該免疫應答的分析及^.^7/2//23"27'17/23的回收在所有試驗中使用來自法國IffaCredo的六周齡雌性BALB/c小鼠。在如前所述(17，31)麻醉下，胃灌(108~9CFU)或鼻滴(1067CFU)服用二十JLLl的細菌接種物。按照早期報道(17，31)進行血液和陰道清洗液(vaginalwashes)取樣以及通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定抗-HPV16VLP抗體效價。如前所述(31)，測定在來自安樂死的小鼠的器官中的6^Zmo"e77aez^er/ca血清變型Typhimurium的回收。設計用于在Sa//220/2e//a中翻譯的具有經(jīng)優(yōu)化的密碼子的HPV16LI核苷酸序列考慮用于翁3譯在SaZmoi2eWaei^eWca血清變型Typhimurium中的主要內(nèi)源蛋白的密碼子(7，14)，以設計經(jīng)優(yōu)化的LI可讀框(orf)。將來自原始HPV16LI序列的506個密碼子(HPV16114/B(18))中的163個，修飾為在Sa/722o刀e/7a中最經(jīng)常使用的密碼子(見圖l-SEQIDNO:1)。這包括所有在SaZmof2e7/a中極少發(fā)現(xiàn)的原始LI序列(136)的密碼子和一些(27/72)不經(jīng)常使用的密碼子。然后，通過新LIS可讀框在質(zhì)粒pFSl4nsd-HPV16LI(31)中替換該LI可讀框，產(chǎn)生pFS14nsd-HPV16LIS。將該新質(zhì)粒首先引入經(jīng)減毒的6^//23oae77aez^eWca血清變型Typhimurium菌抹PhoP。(27)以產(chǎn)生此后稱為PhoPcLIS的重組菌林。隨后生產(chǎn)四個其它的LIS重組減毒6^Zmoi3e77a菌抹(見下文)，表l總結(jié)了不同的菌抹和在此研究中使用的縮寫。HPV16LI和VLP的表達通過蛋白質(zhì)印跡比較LI蛋白在PhoPcLI和PhoPcLIS的指數(shù)培養(yǎng)物的溶菌產(chǎn)物中的表達(見圖2A)。令人驚訝地，在細菌培養(yǎng)物中LI的表達沒有隨新L1S序列而提高反而降低2倍(圖2B)。當通過夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法比較在兩個重組菌林中生產(chǎn)的VLPs量時，該發(fā)現(xiàn)得到確認(見圖2C)。當用單克隆接種50mlLB后比較達到對數(shù)中期的時間時，注意到兩個菌抹在生長速率上的顯著不同(對于PhoPcL1S大約7小時，對于PhoP。LI大約15小時)。這可能表明關(guān)于該相應關(guān)連tRNAs的LI經(jīng)優(yōu)化的密碼子選擇使生長速率最大化而沒有伴隨L1S翻譯的增加。L1S編碼質(zhì)粒在體外和體內(nèi)的穩(wěn)定性發(fā)明人先前已寺艮道在體內(nèi)缺乏抗生素選沖奪時，在iS^/7Zo72e/^中通過質(zhì)粒分離，該原始LI-編碼質(zhì)粒迅速丟失(4，31)。首次比較該LlS-和LI-編碼質(zhì)粒在體外的穩(wěn)定性。為此目的，在缺乏抗生素選擇的情況下，在四個連續(xù)0/N培養(yǎng)期間，比較仍舊含有LI-或LIS-編碼質(zhì)粒的細菌的百分比(見圖3)。正如所期待的，該L1-編碼質(zhì)粒迅速丟失。相反，在缺乏抗生素選擇時，在約50代時間后，在大多數(shù)細菌中回收到該LIS-編碼質(zhì)粒。在小鼠的鼻或口免疫后，進一步在體內(nèi)研究LIS-編碼質(zhì)粒的穩(wěn)定性(見表2)。與原始Ll-編碼質(zhì)粒相反(4),該LlS編碼質(zhì)粒在"l妄近感染位點/入口的器官中完全穩(wěn)定至少兩個周。然而，在更遠的器官，例如脾中觀察到LIS質(zhì)粒的一些不穩(wěn)定性，其中約10%的細菌仍包含L1S質(zhì)粒但是無一檢測到包含LI質(zhì)粒。我們還應該注意到?jīng)]有包含L1S的細菌的侵入力或持續(xù)性更高的證據(jù)，盡管觀察到在體外這些細菌高速的生長能力。在用PhoPcL1S鼻或口接種后產(chǎn)生抗-HPVI6VLP的系統(tǒng)的和黏膜的抗體最終目的是測試該HPV16L1S基因的表達是否會提高在6^^230"6//3ez^eWca血清變型Typhimurium中的HPV16VLP抗原的免疫原性。因此，我們用PhoPcLlS菌株通過鼻或口途徑使成組的雌性BALB/c小鼠免疫。在圖4中示出在單次免疫后的4至6、8和24周在小鼠的血清和陰道分泌物中測量的抗-VLP的抗體效價。單次鼻接種在血清中誘導出高且長持久的抗-HPV16VLP的IgG效價，以及在陰道清洗液中的特異IgG和IgA效價。這些抗體效價與在用原始PhoPeLI菌林雙鼻接種后誘導的效價類似，但主要的提高是它們比用原始PhoP。LI菌抹單鼻接種獲得的效價高一到兩個數(shù)量級(4,31)。引起關(guān)注的是，用PhoPcLlS的口接種同樣是高免疫原性的，雖然比鼻接種低，而即使用原始PhoPc菌抹兩次口接種也是無效的(31)。兩次鼻或三次口劑量的PhoPeLIS(數(shù)據(jù)未示出)的給予沒有提高免疫應答。在用表達該HPV16L1S基因的不同減毒的Sa/iT2072e/^e/^e/v'ca血清變型Typhimurium菌林鼻或口接種后抗-HPV16VLP的系統(tǒng)抗體發(fā)明人先前已示出用表達原始LI編碼質(zhì)粒的不同減毒的AS^Zmo刀a/7ae刀fe"-ca血清變型Typhimurium菌林鼻接種小鼠僅誘導出低或沒有抗-HPV16VLPs抗體(4)。已知用表達LIS編碼質(zhì)粒的PhoP。菌抹觀察到高免疫原性，我們進一步將此質(zhì)粒引入包括％4989、A4990、PhoP"和AroA的不同菌抹(準確的減毒作用物，縮寫和參考文獻見表l)。在圖5中示出在用這些新重組菌林單次鼻或口接種后7周在小鼠中測量的該抗-HVP16VLPIgG效價。與我們先前的觀察相反，在單次鼻接種后所有該新重組菌林誘導出一致的抗-HPV16VLP體液反應，雖然其效價比用PhoPcLIS菌抹獲得的效價低約一個數(shù)量級(見圖4)。如所預期的，口免疫的免疫原性較低，但AroALIS菌抹除外，其在兩種途徑接種后誘導出類似的抗-HPV16VLPIgG效價。實施例2質(zhì)粒構(gòu)建和所用的細菌菌林在質(zhì)粒pFS14nsdHPV16-L1S[Baud,2004#1439]中，如下用卡那霉素抗性編碼序列替換氨芐青霉素抗性編碼序列。用pET-9a(Novagen)質(zhì)粒DNA作為模板通過PCR產(chǎn)生含有卡那霉素編碼序列和啟動子的SacII-XbaI片斷。所用的引物是位于從卡那霉素第一個ATG上游54個核苦酸處且含有SacII限制性位點(加下劃線)的25-mer引物5，-GGGCCGCGGTGGTCATGAACAATAA-3',和含有Xbal限制性位點(力口下劃線)的28-mer引物5，-GGGTCTAGAAGCTGTCAAACATGAGAAT-3，。用Expand高保真PCR(ExpandHighFidelityPCR)(RocheMolecularBiochemicals)通過反向PCR產(chǎn)生含有整個pFSl4nsdHPV16-L1S質(zhì)粒序列，但沒有氨千青霉素抗性基因的另一SacII-XbaI大片段，用以下引物位于從氨節(jié)青霉素的ATG上游92個核苷酸處且含有SacII位點(力。下劃線)的28-mer引物5，-GGGCCGCGGTTTGTAGAAACGCAAAAAG-3,和含有Xbal位點(加下劃線)及氨千青霉素的終止密碼子(粗體)的28-mer引物5'-GGGTCTAGATCCTAACTGTCAGACCAAG-3，。將該兩個SacII-Xbal片斷連接在一起以產(chǎn)生質(zhì)粒pFS14nsd-kan3-HPV16-LIS。通過電穿孑L[Schddel，1990b#242]將該新質(zhì)粒引入經(jīng)減毒的SaZmo"6Z^e"&Wca血清變型Typhimurium菌抹PhoPc,(CS022[Miller,1990#181])、PhoP-(CS015[Miller，1989#178])、和AaroA(SL7207[Hoiseth，1981#123])，及引入該經(jīng)減毒的6^Zmo刀e7/ae刀"Wca血清變型TyphiTy800[Hohmann，1996#596]CVD908htrA[Tacket，1997#643〗和Ty21a([Ger腦nier，1975#103]，Bernabiotech，Switzerland)。hpv16l1和vlp分析使用抗-HPV16LlmAb，CAMVIR-1(Anawa)通過如先前所述[Nardellihaefliger,1997#742]的蛋白質(zhì)印跡分析Ll在SaZmoi3e7hlysates中的表達。將數(shù)據(jù)歸一化為在細菌中的含量。使用識別在HPV16VLPs、H16E70或H161A和H16V5上的構(gòu)象性抗原決定部位的兩種單克隆抗體[Christensen，1996#1053],通過如先前所述的夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法測量該HPV16VLP的含量[Benyacoub，1999#1050]。小鼠的免疫，抗-hpv16vlp抗體的分析及^a7/22ozzeWa回收在所有試驗中使用來自法國IffaCredo的六周齡雌性，BALB/c小鼠。在如先前所述的麻醉下[Hopkins,1995#381;Nardellihaefliger，1997#742]，胃灌(109CFU)或鼻滴(107-9CFU)月^用20k1的細菌4妄種物。4要月、早期凈艮道[Hopkins，1995#381;Nardellihaefliger,1997#742]進行血液和陰道清洗液取樣以及通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定抗-HPV16VLP抗體效價。按照先前的描述[Nardellihaefliger，1997#742],測定在來自安樂死的小鼠的器官中的Sa/TTJOZze/Zae"fe/7'ca血清變型Typhimurium或Typhi的回^:。中和分析按照在[PastranaDV，2004#1429]中的詳纟曰描述，用分泌的堿性磷酸酶(SEAP)HPV16假病毒進行中和分析。筒要地，用兩倍連續(xù)血清稀釋物將稀釋2000倍的optiprep純化的SEAPHPV16，支病毒在水上培育1小時，用該假病毒-抗體混合物感染293TT細胞3天。使用GreatESCAPESEAPChemiluminescenceKit(BDClontech)測定在1Opl澄清的細胞上清夜中的SEAP含量。將中和效價定義為引起SEAP活性(100。/qSEAP活性在50至100相對光照單位的范圍)至少50%降低的最高血清稀釋的倒數(shù)。增殖分析通過如先前所述[Balmelli,2002#1357]的機械解離分離脾細胞。依照制造商的用法說明書用抗-CD4+-涂覆的微珠(MiltenyiBiotec，Galdbach，德國)通過石茲性抗體細月包分選(MACS)來純化CD4+T細胞。用單獨的或具有刀豆球蛋白A(2.5[ig/ml)的培養(yǎng)基作為陰性和陽性對照，以及用HPV16VLPs(2jig/ml，GMP制備)和鞭毛蛋白(10pg/ml，純化自Ty21a),將來自天然或經(jīng)免疫的小鼠的004+T細胞培育三天，然后在一夜內(nèi)將0.5jiCurie的3Hthimidine加入并以每分鐘計數(shù)(cpm)測量參入。在卡那霉素抗性PhoPc菌抹中HPV16LlS的表達及質(zhì)粒穩(wěn)定性通過由卡那霉素選擇性基因替換在原始pFSnsdHPV16LIS[Baud,2004#1439]中的氨千青霉素抗性基因構(gòu)建表達HPV16L1S的卡那霉素抗性質(zhì)粒。使用反向PCR方法來擴增該氨千青霉素抗性基因序列兩側(cè)的該整個質(zhì)粒，并將該所得片斷與卡那霉素抗性編碼序列連沖姿(詳見材料和方法)。該所得質(zhì)粒標記為pFSnsd-kanLIS,并在PhoPc中電穿孔以產(chǎn)生PhoPc-kanLlS(縮寫和在本研究中使用的菌抹的參考文獻見表1A)。如所期望的，在該新菌抹中HPV16VLPs的體外表達與在氨千青霉素抗性菌抹PhoPc—LIS(約1(VgVLPs/1011CFU，[Baud，2004#1439])中測量的表達類似。在兩菌抹間同樣觀察到類似的生長速率，用約7小時來達到對數(shù)中期，且質(zhì)粒穩(wěn)定性非常高，在不存在抗生素時，四個連續(xù)過夜培養(yǎng)后幾乎100%的細菌仍包含該質(zhì)粒。與該氨芐青霉素質(zhì)粒相比，該kanL1S質(zhì)粒的穩(wěn)定性在體內(nèi)增加，在所有檢測的器官中，在口免疫和此后兩周所有細菌包含該kanL1S質(zhì)粒(見表2A)。用攜帶kanLlS編碼質(zhì)粒的PhoPc、PhoP陽和AroA口免疫后的抗-HPV16VLPs體液反應進一步將該kanLIS質(zhì)粒引入兩個經(jīng)減毒的Sa/moz^/hez^eWca血清變型Typhimurium菌林PhoP墨和AroA(見表1A)，已表明其在^jA230i3e7he"&Wca血清變型Typhi疫苗菌抹中的減毒突變在人類中是安全的。用三個重組6^Zmoze77sei2&Wca血清變型Typhimurium菌抹通過口服進入三個5至10個小鼠的組免疫一次，并在免疫后6周比較在血清和陰道清洗液中的HPV16VLPs特異抗體反應(見圖6)。引起關(guān)注的是，通過AroAkanLlS菌抹誘導的該抗-VLP抗體效價似乎與通過PhoPckanL1S和通過前面的PhoPeL1S菌抹誘導的效價同樣高[Baud,2004#1439]。這些抗體效價在至少四個月內(nèi)是穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)未示出)。相反，正如以前對于Phop-L1S所報道，通過PhoP-kanL1S誘導的該抗-VLPs抗體效價較低，[Baud,2004#1439]。同樣在用PhoPc和AroakanLIS免疫的小鼠的陰道分泌物中誘導出HPV16VLP特異IgG和IgA，但是在PhoP-kanL1S后沒有檢測到。在使用口免疫的小鼠模型中獲得的這些數(shù)據(jù)表明包含Aaro缺失的重組Sa/mo72e77aei^erica血清變型Typhi可能比包含APhoP/phoQ缺失的那些的免疫原性更南。在三個^a/7nane/7ae/^ar/ca血清變型Typhi疫苗菌林中kanLIS質(zhì)粒的表達和穩(wěn)定性我們將該kanLIS質(zhì)粒引入對于我們可以得到的三個Sa7737073e77aei3,eWca血清變型Typhi疫苗菌抹，即，Ty800(APhoP/phoQ，[Hohmann,1996#596〗)、CVD908-htrA(AaroC，AaroD，htraA,[Tacket，1997弁643])和Ty21a[Germanier，1975#103](已獲得許可的typhoid疫苗菌林)(縮寫和參考文獻見表1A)。在此三菌抹中VLPs的體外表達類似(20至3CVgVLP/1011kanL1S質(zhì)粒的穩(wěn)定性(見圖7)。與以前用Sa/moneWae"力en'ca血清變型Typhimurium菌林的結(jié)果相反，在該疫苗菌抹中觀察到較低的kanL1S質(zhì)粒穩(wěn)定性。在第二個過夜后發(fā)生質(zhì)粒的緩慢丟失，但是在五個連續(xù)過夜后，在Ty21akanL1S、Ty800kanL1S和CVD908-htrAkanLISA中該質(zhì)粒仍然分別在9、7和18%的細菌中保留。在人類中5^//330i2e_//aez^eWca血清變型Typhi疫苗菌株僅進行有限的循環(huán)(rounds)或復制并且，它們在小鼠中通過口服進入是非侵入性的。如通過重組CVD908htrA顯示，如果通過鼻途徑以高的劑量服用該細菌，可以短期感染小鼠[Pickett,2000#1158][Pasetti，2000#1494]。由此在用109CFU的CVD908-htrAkanLlS和Ty21akanL1S或107CFU的Ty800kanL1S鼻內(nèi)免疫后一周，我們檢測了從小鼠的肺和脾回收的Sa7znc^e77a中kanL1S質(zhì)粒穩(wěn)定性。后面的菌林只能以低的劑量給藥，因為否則其對于小鼠是致死的，與在小鼠中用豬胃教蛋白腹膜內(nèi)注射這樣的PhoPQ缺失細菌后的先前發(fā)現(xiàn)一致[Baker，1997#659]。引起關(guān)注的是，在Ty21akanL1S免疫后從肺回收的所有細菌都包含該kanLIS,而在Ty800kanLIS和CVD908-htrAkanL1S免疫后極少(分別為7.9和0.8%)包含該kanL1S質(zhì)粒(見表3)。這表明在鼻鼠科動物模型中該kanL1S質(zhì)粒在Ty21a中比在其它測試的SaZmoae/he72力ehca血清變形Typhi疫苗菌抹中更穩(wěn)定。在鼻內(nèi)鼠科動物模型中，通過表達HPV16VLPs的i5a77Z20i2e77ae/^e/7'ca血清變型Typhi疫苗菌林誘導的體液的和細胞的免疫應々合在兩個每月一次的間隔鼻內(nèi)用藥后(對于CVD908-htra和Ty21a為109CFU,及對于Ty800重組菌林為107CFU)，在多組5至10個雌性BALB/c小鼠中，評價三個重組6^Zmozze77aez^eWca血清變型Typhi菌抹的免疫原性。在血清中測量八周抗該異源HPV16VLP抗原以及抗兩個同源抗原LPS和鞭毛蛋白的IgG效價(見圖8)。引起關(guān)注的是，僅在用Ty21akanL1S的兩次免疫后誘導出高抗-VLPIgG效價，而由兩種其它菌株誘導出低或幾乎不能沖全觀'J的效1^介。一目反，Ty800kanL1S牙口CVD908htrakanLlS"i秀導出比Ty21kanLIS(在第8周時p〈0.01)高的抗-LPS和抗-鞭毛蛋白IgG效價，這表明前兩個重組菌林已成功地感染小鼠并誘導出抗同源抗原的體液反應。T輔助應答(Thelperresponses)參與產(chǎn)生和維持高抗體效價，因此同樣檢測了抗鞭毛蛋白和HPV16VLPs的細胞免疫應答。在免疫八周后，將該小鼠殺死并用從脾純化004+T細胞測量抗原特異增殖(見圖9)。僅在用Ty21akanLIS(p<O.OOl)兩次鼻內(nèi)接種后顯著地誘導出004+T細胞的HPV16VLP刺激，這與抗-HPV16VLPs效價的誘導一致。相反，僅在用Ty800kanLlS(pO.OOl)接種后沖僉測出CD4+T細胞的顯著的鞭毛蛋白特異刺激。在僅用Ty21akanL1S或在初始時用皮下VLP用藥免疫的小鼠的血清或生殖分泌物中誘導HPV16-中和效價。在第0和4周，額外組的5個雌性BALB/c小鼠接受了兩次Ty21kanLIS(ca.109CFU)的鼻用藥，在8周時進行血液和陰道分泌物的取樣。在血清和陰道分泌物兩者中，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法和SEAPHPV16假病毒中和分析分別測定抗畫HPV16VLP和HPV16-中和抗體效價(見圖IOA)。如先前所報道的，在用重組iS^Zmoi3e77aez^erica血清變型typhimuriumL1S菌才朱免疫后，該HPV16-中和效價比該抗-VLP酶聯(lián)免疫吸附測定法效價稍低[Baud,2004#1439]。此外，我們在此示出在陰道分泌物中i秀導出抗-HPV16VLPIgGs和IgAs,并且那些分泌物含有HPV16-中和抗體(見圖10-B)。我們還研究了用lpg經(jīng)純化的VLPs的皮下(s.c.)引發(fā)，對通過用Ty21akanL1S的次優(yōu)免疫(即單次109CFU鼻用藥)誘導的免疫應答的影響。數(shù)據(jù)顯示(圖ll)用lpgVLPs的皮下引發(fā)的確導致在血清中抗-VLPIgG效價的顯著增長，伴隨單一Ty21akanLIS(p<0.01,與沒有VLP引發(fā)相比)的鼻增長。相反，在誘導出的抗-VLP陰道IgG中沒有統(tǒng)計學上的差別，而當將VLP和Ty21akanL1S都給藥日于，僅誘導出抗-VLP陰道IgA。中和效價有待測定。參考文獻1.Andre，S.,B.Seed,J.Eberle，W.Schraut，A.Bultmann,andJ.Haas.1998.IncreasedimmuneresponseelicitedbyDNAvaccinationwithasyntheticgpl20sequencewithoptimizedcodonusage.J.Virol.72:1497-1503.2.Balmelli,C，R.Roden，A.Potts,J.Schiller,P.DeGrandi，andD.Nardelli-Haefliger.1998.Nasalimmunizationofmicewithhumanpapillomavirustype16virus-likeparticleselicitsneutralizingantibodiesinmucosalsecretions.J.Virol.72(10):8220-8229.3.Baud,D.，J.Benyacoub，V.Revaz，M.Kok，F(xiàn).Ponci,M.Bobst，R.CurtissIII，P.DeGrandi，andD.Nardelli-Haefliger.2004.Immunogenicityagainsthumanpapillomavirustype16viruslikeparticlesisstronglyenhancedbythePhoPcphenotypein*^7722<9/26//3typhimurium.Infect.Immun.72:750-756.4.Benyacoub，J.，S.Hopkins,A.Potts,S.Kelly，J.-P.Kraehenbuhl,R.Curtiss，P.DeGrandi,andD.Nardelli-Haefliger.1999.ThenatureoftheattenuationofS.typhimuriumstrainsexpressinghumanpapillomavirustype16viruslikeparticlesdeterminesthespecificantibodyresponsesinnasallyimmunizedmice.Infect.Immun.67:3674-3679.5.Berg，O.G.，andC.G.Kurland.1997.Growthrate-optimisedtRNAabundanceandcodonusage.J.Mol.Biol.270:544-550.6.Bosch，F(xiàn).X.，A.Lorincz，N.Munoz，C.J.Meijer，andK.V.Shah.2002.Thecausalrelationbetweenhumanpapillomavirusandcervicalcancer.J.Clin.Pathol.55:244-265.7.Burns,D.M.,andI.R.Beacham.1985.RarecodonsinE.coliandS.typhimuriumsignalsequences.FEBSlett.189:318-324.8.Cardenas,L.,U.Dasgupta,andJ.D.Clements.1994.InfluenceofstrainviabilityandantigendoseontheuseofattenuatedmutantsofSa/moneT/aasvaccinecarriers.Vaccine12(9):833-40.9.Christensen，N.D.，J.Dillner，C.Eklund，丄J.Carter,G.C.Wipf,C.A.Reed，N.M.Cladel,andD.A.Galloway.1996.SurfaceconformationalandlinearepitopesonHPV-16andHPV-18LIvirus-likeparticlesasdefinedbymonoclonalantibodies.Virol，223(1):174-84.10.Covone，M.G.，M.Brocchi，E.Palla,Dias,da，Silveira，W,R.Rappuoli，andC.L.Galeotti.1998.LevelsofexpressionandimmunogenicityofattenuatedAS^/rac^e/Zae"力e27'casei'ovartyphimuriumstrainsexpressingAscAe27'ei2iaco/z.mutantheat-labileenterotoxin.Infect.Immun.66(1):224-31.11.Curtiss,R.，J.O.Hassan，J.Herr，S.M.Kelly，M.Levine,G.G.Mahairas，D.Milich，D.Peterson,F.Schodel，J.Srinivasan,C.Tacket，S.A.Tinge,andR.Wright.1994.NonrecombinantandrecombinantavirulentjS^/mozze/ZaVacines，p340-351.InG.P.e.a.Talwar(ed.)，RecombinantandSyntheticVaccines.NarosaPublishingHouse,NewDelhi,India.12.Demi'L.,A.Bojak，S.Steck，M.Graf，J.Wild,R.Schirmbeck,H.Wolf，andR.Wagner.2001.MultipleeffectsofcodonusageoptimizationonexpressionandimmunogenicityofDNAcandidatevacinesencodingthehumanimmunodeficiencyvirustype1Gagprotein.J.Virol.75:10991-11001.13.Garmory，H.，K.A.Brown，andR.W.Titball.2002./S^7i3C)Z2ei/avaccinesforuseinhumans:presentandfutureperspectives.FEMSMicrobiol.Rev.26:339-353.14.Grosjean，H.，andW.Fiers.1982.Preferentialcodonusageinprokaryoticgenes:theoptimalcodon-anticodoninteractionenergyandtheselectivecodonusageinefficientlyexpressedgenes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7077-7081.15.Hohmann，E.L.，C.A.Oletta，K.P.Killeen，andS.I.Miller.1996.Phop/phoq-deletedSa7御zze77atyphi(ty800)isasafeandimmunogenicsingle-dosetyphoidfevervaccineinvolunteers.J.Infect.Dis.173(6):1408-1414.16.Hoiseth，S.K.andB.A.D.Stocker.1981.Aromatic-dependent*S^7/roi2e//atyphimuriumarenon-virulentandeffectiveaslivevaccines.Nature291:238-239.17.Hopkins,S.,J.-P.Kraehenbuhel,F.Schodel，A.Potts,D.Peterson,P.DeGrandi,andD.Nardelli-Haefliger.1995.Arecombinant/S^7/30Z2a/7atyphimuriumvaccineinduceslocalimmunitybyfourdifferentroutesofimmunization.Infect.Immun.63:3279-3286.18.Kirnbauer，R.,J.Taub，H.Greenstone,R.Roden，M.Durst，L.Gissmann，D.R.Lowy，andJ.T.Schiller.1993.Effici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d等人2004的數(shù)據(jù)表3:在鼻免疫一周后攜帶kanL1S質(zhì)粒的不同Sa//720i2e7/ae"&2^ca血清變型Typhi的回收<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>aCFU/器官土SEM的平均值(logM)ND沒有檢測到(〈1.3CFU/器官)權(quán)利要求1.一種如在SEQIDNO1中所示的編碼抗原HPV16L1蛋白的新核酸序列(HPV16L1S)，其中所述序列具有一個或多個經(jīng)修飾的密碼子以在原核微生物中轉(zhuǎn)化時優(yōu)化重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，從而提高所得原核微生物的免疫原性。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的新核酸序列，將其通過質(zhì)粒載體或直才妻通過4爭4b選自由s/s、jB^c力en'c/2j'aco/i、*9/2_z'《e//ayei^z'i2is、丄3(^oZsd77ws、Afycc^a"ej7's、或Zys力e27'a纟且成的纟且中，優(yōu)選SaZmane77asps的原核微生物的基因組DNA引入減毒林。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新核酸序列，將其引入選自由6^/^22aneZ/ae刀力arica血；青哭型Typhimurium、6^/iMOi2e/7a^ypAASa/iioi2力j^pin'i72UjT7.lzo或6^7iizozzel/ac/i7Z/i"纟且成的纟且中的AS^/mo3e77asps的減毒抹中。4.一種權(quán)利要求3所述的新核酸序列，將其引入6^/^06//3sps的減毒4朱中，其中該*S^/mo3e//a菌材、選自由Sa/mc^e/Zaei2ferj'ca血清變型TyphimuriumPhoPc(CS022)、6^7/wo"e7/aei^ei"ica血清變型TyphimuriumPhoP(CS015)、*9a/mc>/3eZ/a血清變型Typhimurium乂4989(AcyaAcrp-cdt和AaroA(SL7207))、SaZmo2e7/aez^erica血5青變型Typhi、Ty21a、CVD908htrA、Ty圃組成的組中。5.—種如在SEQIDNO:1中提供的編碼抗原HPV16Ll蛋白的新核酸序列(HPV16L1S)，其中該所述序列具有一個或多個經(jīng)修飾的密碼子以在SaZmoi3e菌林中轉(zhuǎn)化時優(yōu)化重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，從而提高所得Sa7moi2e77a菌抹的免疫原性。6.—種用編碼HPV(人乳頭瘤病毒)主要衣殼蛋白并表達該相應蛋白的密碼子經(jīng)修飾的核酸轉(zhuǎn)化的原核微生物減毒抹，其中至少一個密碼子是經(jīng)修飾過的。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的減毒抹，其中該HPV主要衣殼蛋白選自由HPV16、HPV18、HPV31和HPV45組成的組中。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的減毒株，其中該主要衣殼蛋白是HPV16Ll。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的減毒林，其中該菌抹包含根據(jù)權(quán)利要求l所述的新核酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的減毒抹，其中該所述原核微生物選Za"oZa"77ws、il^7coAa"e2v.a、或Zj^&i^3組成的組中，優(yōu)選11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的經(jīng)減毒的Sa/723Oi3e7^j菌抹，其中該*9a/moe//a沖勿種選自由Sa7/wo/2e77aez^arica血；青變型Typhimurium、Sa/i230i3e/7aei3terj.ca血5青變型fj/pizASa/izpozze/Za^/p力ii2ui^uzn或/S^/ti2o"eZ/au^/z'i3纟且成的纟且,^f尤選Sa/m0"e/7ae"feWca血清變型Typhii。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的經(jīng)減毒的Sa力wo2e77a菌抹，其中該19a/i20i3a/7a菌才朱選自由6^/mone//3e"fer/cs血5青變型TyphimuriumPhoPc(CS022)、AS^AnoneWae"力eWca血清變型TyphimuriumPhoP—(CS015)、SaZmone!^ei2farz'ea血5青變型Typhimuriumx4989(AcyaAcrp-cdt和AaroA(SL7207))和SaZrao"e7/ae刀力e27'ca血清變型Typhi、Ty21a、CVD908htrA、Ty800組成的組中。13.根據(jù)權(quán)利要求l所述的新核酸，其中所述序列具有一個或多個經(jīng)修飾的密碼子，以優(yōu)化在Sa/i730i2e7/a菌抹中的重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，以便提高該所得Sa/i230i2e/7a菌林的免疫原性。14.根據(jù)權(quán)利要求l所述的核酸，其中已將506個原始密碼子中的163個改變。15.—種重組質(zhì)粒載體，其含有如在SEQIDNO:l中所示的DNA序列。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的重組質(zhì)粒載體，其中所述載體是pFS14nsd-HPV16LlS或pFSnsd-HPV16kanL1S。17.—種提高原核微生物對人乳頭瘤病毒16(HPV16)的免疫原性的方法，其包括以下步驟a.通過修飾密碼子選擇，合成如在SEQIDNO:l中所示的編碼抗原HPV16Ll蛋白的新核酸，b.通過替換在質(zhì)粒載體pFS14nsdHPV16Ll或pFS14nsdHPV16kanL1S中的原始HPV16L1基因，構(gòu)建包含如在SEQIDNO:l中所示的DNA序列的重組pFS14nsdHPV16LlS載體，c.將該來自步驟(b)的重組質(zhì)粒載體引入經(jīng)減毒的微生物以獲得重組接種物，和d.在小鼠中給予重組接種物。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中在步驟(c)中，重組質(zhì)粒載體的引入通過電穿孔進行。19.一種提高Sa//230i3e//a菌抹對人乳頭瘤病毒16型(HPV16)的免疫原性的方法，其包括以下步驟a.通過修飾密碼子選擇，合成編碼抗原HPV16Ll蛋白的新核酸SEQIDNO:i，b.通過替換在質(zhì)粒載體pFS14nsdHPV16Ll中的原始HPV16L1基因，構(gòu)建包含如在SEQIDNO:1中所示的DNA序列的重組pFS14nsdHPV16LlS載體，c.將該來自步驟(b)的重組質(zhì)粒載體引入經(jīng)減毒的Sa/720"e77a菌才朱以獲得重組接種物，和d.在小鼠中給予重組接種物。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在步驟(c)中，重組質(zhì)粒載體的引入通過電穿孔進行。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在步驟(c)中，該Sa7i730"e77a菌林選自由*9aZmoi2e77aei3ferica血清變型TyphimuriumPhoPc(CS022)、SaA30i2e/7aei^ei7'ca血清變型TyphimuriumPhoP一(CS015)、AS^/mooeT/ie刀力erica血；青變型Typhimuriumx4989(AcyaAcrp-cdt和AaroA(SL7207))和Sa7i32o"e77aei2&Wca血清變型Typhi、Ty21a、CVD908htrA、Ty800組成的組中。22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在步驟(d)中，該基于6'aAno"e7/a的抗HPV16疫苗的給藥模型可以選自由口、內(nèi)鼻、陰道或直腸組成的組中。23.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的原核微生物的減毒抹，在制備用于乳頭瘤病毒感染和相關(guān)的癌變危險的預防或治療處理的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及如在SEQIDNO1中提供的編碼抗原HPV16L1蛋白的一種新核酸序列(HPV16L1S)，其中所述序列具有至少一個經(jīng)修飾的密碼子，以在原核微生物中轉(zhuǎn)化時優(yōu)化重組質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性，以提高該所得原核微生物的免疫原性，本發(fā)明進一步涉及構(gòu)建包含SEQIDNO1的重組載體pFS14nsdHPV16L1和pFS14nsdHPV16kanL1S，其中前者帶有氨卞青霉素和后者帶有卡那霉素作為選擇標記。本發(fā)明還涉及用編碼HPV16(人乳頭瘤病毒)主要衣殼蛋白并表達該相應蛋白的核酸轉(zhuǎn)化的原核微生物的減毒株。另外，本發(fā)明公開一種基于原核微生物生產(chǎn)用于治療乳頭瘤病毒感染和相關(guān)的癌變危險的疫苗的方法。文檔編號C12N15/63GK101115766SQ200580027887公開日2008年1月30日申請日期2005年6月20日優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日發(fā)明者丹尼斯·納爾戴里申請人:印度免疫有限公司