專利名稱：包含氨基酸插入的遺傳改造的吡咯并喹啉醌依賴性葡萄糖脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
血液葡萄糖濃度的測定在糖尿病的臨床診斷和管理中是極其重要的。全世界大約有1億5千萬人患有慢性疾病糖尿病，據(jù)WHO分析，該數(shù)字在2025年可能翻番。盡管糖尿病易于診斷和治療，成功的長期管理需要快速且準(zhǔn)確地報告血液葡萄糖濃度的低成本診斷工具。PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶(EC1.1.99.17)催化下述反應(yīng)，在該反應(yīng)中，葡萄糖被氧化成葡糖酸內(nèi)酯。因此，這類酶被用于測量血糖。一種這樣的工具是基于可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GlucDOR，EC1.1.99.17)的診斷條，該酶是最初從醋酸鈣不動桿菌中獲得的含有吡咯并喹啉醌的酶。
醌蛋白使用醌作為輔助因子將醇、胺和醛糖氧化成相應(yīng)的內(nèi)酯、醛和醛糖酸(Duine，J.A.Energy generation and the glucosedehydrogenase pathway in Acinetobacter在“The Biology ofAcinetobacter”(1991)一書295-312，New York，Plenum Press；Duine，J.A.，Eur J Biochem 200(1991)271-284；Davidson，V.L.，在“Principlesand applications of quinoproteins”(1993)整本書中，New York，MareelDekker；Anthony，C.，Biochem.J.320(1996)697-711；Anthony，C.和Ghosh，M.，Current Science 72(1997)716-727；Anthony，C.，Biochem.Soc.Trans.26(1998)413-417；Anthony，C.和Ghosh，M.，Prog.Biophys.Mol.Biol.69(1998)1-21)。在這些醌蛋白中，那些包含了非共價結(jié)合的輔助因子2，7，9-三羧基-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-4，5-二酮(PQQ)的醌蛋白組成了最大的亞組(Duine 1991，同上)。至今已知的所有細(xì)菌醌葡萄糖脫氫酶屬于具有PQQ作為輔助因子的該亞組(Anthony和Ghosh1997，同上，Goodwin，P.M.和Anthony，C.，Adv.Microbiol.Physiol.40(1998)1-80；Anthony，C.，Adv.in Phot.and Resp.15(2004)203-225)。
在細(xì)菌中已表征了兩類PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶(EC1.1.99.17)一類是膜結(jié)合的(m-GDH)，另一類是可溶的(s-GDH)。兩類沒有顯著的序列同源性(Cleton-Jansen，A.M.，等，Mol.Gen.Genet.217(1989)430-436；Cleton-Jansen，A.M.，等，Antonie VanLeeuwenhoek 56(1989)73-79；Oubrie，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96(1999)11787-11791)。它們在動力學(xué)以及它們的免疫學(xué)性質(zhì)方面也是不同的(Matsushita，K.，等，Bioscience Biotechnol.&Biochem.59(1995)1548-1555)。m-GDH廣泛分布于革蘭氏陰性細(xì)菌中，而s-GDH僅在不動桿菌菌株例如醋酸鈣不動桿菌(Duine，J.A.，1991a；Cleton-Jansen，A.M.等，J.Bacteriol.170(1988)2121-2125；Matsushita和Adachi，1993)和鮑曼不動桿菌(A.baumannii)(JP11243949)的周質(zhì)間隙中被發(fā)現(xiàn)。
通過檢索序列數(shù)據(jù)庫，已經(jīng)在大腸桿菌(E.coli)K-12和集胞藻(Synechocystis sp.)中鑒定出了與全長醋酸鈣不動桿菌s-GDH同源的兩條序列。此外，也在綠膿桿菌(P.aeruginosa)和百日咳桿菌(Bordetellapertussis)(Oubrie等，1999 a，b，c)以及中間腸桿菌(Enterobacterintermedium)(Kim，C.H.等，Current Microbiol.47(2003)457-461)的基因組中分別發(fā)現(xiàn)了與醋酸鈣不動桿菌s-GDH同源的兩條不完全的序列。由這四個未被表征的蛋白推斷出的氨基酸序列與醋酸鈣不動桿菌s-GDH非常相近，在推定的活性位點中，很多殘基是絕對保守的。這些同源蛋白很可能具有相似的結(jié)構(gòu)且催化相似的PQQ-依賴性反應(yīng)(Oubrie等，1999 a，b，c；Oubrie A.，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)143-151；Reddy，S.，和Bruice，T.C.，J.Am.Chem.Soc.126(2004)2431-2438；Yamada，M.等，Biochim.Biophys.Aeta 1647(2003)185-192)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌s-GDHs和m-GDHs具有相當(dāng)不同的序列和不同的底物特異性。例如，醋酸鈣不動桿菌包含兩種不同的PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶，一種是在體內(nèi)有活性的m-GDH，另一種被命名為s-GDH，該酶僅可以顯示體外活性。Cleton-Jansen等，1988；1989 a，b克隆了編碼兩種GDH酶的基因且測定了這兩個GDH基因的DNA序列。在m-GDH和s-GDH之間沒有明顯的同源性，確認(rèn)了m-GDH和s-GDH代表了兩個完全不同的分子的事實(Laurinavicius，V.，等，Biologija(2003)31-34)。醋酸鈣不動桿菌的s-GDH基因已被克隆進(jìn)大腸桿菌。在細(xì)胞中產(chǎn)生之后，s-GDH被轉(zhuǎn)運通過胞質(zhì)膜進(jìn)入周質(zhì)間隙(Duine，J.A.，Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway inAcinetobacter在“The Biology of Acinetobacter”(1991)一書295-312，New York，Plenum Press；Matsushita，K.和Adachi，O.，Bacterialquinoproteins glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase在“Principles and applications of Quinoproteins”(1993)一書47-63，NewYork，Marcel Dekker)。和來自醋酸鈣不動桿菌的天然s-GDH一樣，在大腸桿菌中表達(dá)的重組s-GDH是同二聚體，每個單體具有1個PQQ分子和三個鈣離子(Dokter，P.等，Biochem.J.239(1986)163-167；Dokter，P.等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.43(1987)195-200；Dokter，P.等，Biochem.J.254(1988)131-138；Olsthoorn，A.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333，Oubrie，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96(1999)11787-11791，Oubrie，A.，等，Embo J.18(1999)5187-5194)。s-GDH將廣泛的單糖和二糖氧化成相應(yīng)的酮，該酮進(jìn)一步水解成醛糖酸，且s-GDH也能夠為PMS(吩嗪metosulfate)、DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)、WB(Wurster氏藍(lán))和短鏈泛醌例如泛醌Q1和泛醌Q2(Matsushita，K.，等，Biochem.28(1989)6276-6280；Matsushita，K.，等，Antonie VanLeeuwenhoek 56(1989)63-72)、一些人造電子受體例如N-甲基吩嗪甲硫酸鹽(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Biochem.37(1998)13854-13861)以及導(dǎo)電聚合物(Ye，L.，等，Anal.Chem.65(1993)238-241)提供電子?？紤]到s-GDH對葡萄糖的高度特異活性(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，(1996)同上)以及對廣泛的人造電子受體的特異性，該酶非常適合于分析應(yīng)用，特別是在診斷應(yīng)用中用于測定葡萄糖的(生物)感應(yīng)器或測試條中(Kaufmann，N.等，Development and evaluation of anew system for determining glucose from fresh capillary blood andheparinised blood在“Glucotrend”(1997)一書1-16，BoehringerMannheim GmbH；Malinauskas，A.；等，Sensors and Actuators，BChemical B100(2004)395-402)。
葡萄糖氧化可被至少三組相當(dāng)不同的酶催化，即由NAD/P-依賴性葡萄糖脫氫酶、由黃素蛋白葡萄糖氧化酶或由醌蛋白GDHs催化(Duine，J.A.，Biosens.Bioelectronics 10(1995)17-23)。已經(jīng)觀察到被還原的s-GDH相當(dāng)慢的自氧化，證明氧是s-GDH的非常弱的電子受體(Olsthoorn和Duine，1996)。s-GDH可以高效地將被還原的醌上的電子提供給介體(mediator)例如PMS、DCPIP、WB和短鏈泛醌例如Q1和Q2，但它不能高效地將電子直接提供給氧。
監(jiān)測例如來自糖尿病患者的血液、血清和尿液中的葡萄糖水平的傳統(tǒng)測試條和感應(yīng)器使用葡萄糖氧化酶。該酶的性能依賴于氧濃度。在不同海拔在空氣具有不同氧濃度的情況下的葡萄糖測量可能產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的主要優(yōu)勢在于其不依賴于氧。該重要特征在例如US6,103,509中被討論，其中，膜結(jié)合GDH的一些特征已被研究。
對本領(lǐng)域的重要貢獻(xiàn)是將s-GDH和合適的介體一同使用?；趕-GDH的實驗方法和測試條裝置在US5,484,708中詳細(xì)公開。該專利也包含了用于葡萄糖測量的實驗設(shè)置和基于s-GDH的測試條的生產(chǎn)的具體信息。在該專利以及所引用文獻(xiàn)中說明的方法在此通過參考并入本文。
涉及本領(lǐng)域以及包含關(guān)于具有葡萄糖脫氫酶活性的酶的各種應(yīng)用模式的具體信息的其它專利或申請是US5,997,817；US6,057,120；EP0620283；和JP11-243949-A。
利用s-GDH和指示劑的商業(yè)系統(tǒng)是由Roche Diagnostics GmbH分銷的Glucotrend系統(tǒng)，該指示劑在反應(yīng)發(fā)生時產(chǎn)生顏色變化(Kaufmann等，1997同上)。
除了以上討論的使用PQQ-依賴性s-GDH的益處之外，在葡萄糖的測定中也必須考慮一個不足。該酶與m-GDH相比具有相對廣的底物譜。也就是說，s-GDH不僅氧化葡萄糖也氧化一些其它的糖包括麥芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖(Dokter等，1986a；OubrieA.，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)143-151)。對除了葡萄糖以外的其它糖的反應(yīng)活性在某些情況下可能破壞測定血液葡萄糖水平的準(zhǔn)確性。特別是對腹膜透析患者，使用糊精(葡萄糖多聚體)的治療可使他們的體液例如血液中包含高水平的其它糖，特別是麥芽糖(Wens，R.，等，Perit.Dial.Int.18(1998)603-609)。
因此，臨床樣品例如從糖尿病患者尤其是具有腎臟并發(fā)癥的患者和特別是在進(jìn)行透析的患者中獲得的樣品可能包含顯著水平的其它糖，尤其是麥芽糖。對從這些嚴(yán)重患者獲取的樣品進(jìn)行的葡萄糖測定可能受到麥芽糖的破壞(Davies，D.，Perit.Dial.Int.14(1994)45-50；Frampton，J.E.；和Plosker，G.L.，Drugs 63(2003)2079-2105)。
在文獻(xiàn)中很少有關(guān)于嘗試制備具有改變的底物特異性的經(jīng)修飾的PQQ-依賴性s-GDH的報道。Igarashi，S.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.264(1999)820-824報道了在位點Glu277引入點突變生成具有改變的底物特異性特征的突變體。
Sode，EP 1 176 202報道了在s-GDH內(nèi)的某些氨基酸取代產(chǎn)生了對葡萄糖具有提高的親和力的突變體s-GDH。在EP1167519中，相同的作者報道了具有改進(jìn)的穩(wěn)定性的突變體s-GDH。此外，相同的作者在JP2004173538中報道了對葡萄糖具有提高的親和力的其它s-GDH突變體。
Kratzsch，P.等，WO02/34919報道了s-GDH對葡萄糖相比于其它糖底物特別是相比于麥芽糖的特異性可以通過在s-GDH的某些位點的氨基酸取代得以提高。
Takeshima，S.，等(EP1367120)報道了突變的s-GDH，該s-GDH包含了某些氨基酸取代或在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的氨基酸序列的位點427和428之間的氨基酸插入。
然而，盡管用以產(chǎn)生具有進(jìn)一步改良性質(zhì)的s-GDH突變體或變體的相當(dāng)一些改進(jìn)已被報道，其它的和/或另外的改進(jìn)仍然是需要的。
因此存在對s-GDH的另外的突變體或變體形式的巨大要求和臨床需要，該突變體或變體形式單獨地或與已知的突變組合帶來對作為底物的葡萄糖的提高的特異性。
本發(fā)明的任務(wù)是提供s-GDH的新的突變體或變體，其單獨地或與已知的突變組合產(chǎn)生較之其它選定的糖分子例如半乳糖或麥芽糖而言對葡萄糖顯著提高的底物特異性。
令人吃驚的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的氨基酸序列的s-GDH的位點428和429之間進(jìn)行氨基酸插入，可能顯著提高s-GDH對葡萄糖較之其它糖的底物特異性，且因此至少部分地克服了本領(lǐng)域已知的上述問題。
通過提供根據(jù)本發(fā)明和如在此以下所述以及所附權(quán)利要求書中的s-GDH的插入變體，較之其它選定的糖分子而言對葡萄糖的底物特異性已被顯著提高。
由于新形式的s-GDH提高的底物特異性，在各種應(yīng)用領(lǐng)域中對葡萄糖測定的顯著的技術(shù)進(jìn)步成為可能。改良的s-GDH變體可被用于對生物樣品中葡萄糖的特異性進(jìn)行檢測或測量，特別是在測試條裝置或生物感應(yīng)器中進(jìn)行，這具有極大的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及可溶形式的EC 1.1.99.17(也被稱作PQQ-依賴性可溶葡萄糖脫氫酶(s-GDH))的變體，所述變體包含在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌中獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點428和429的氨基酸位點之間的至少一個氨基酸殘基的插入，且可選地，還包含一或多個氨基酸取代，優(yōu)選地在位點348和428的取代。
本發(fā)明還提供了呈現(xiàn)出改良性質(zhì)特別是提高的葡萄糖特異性的s-GDH優(yōu)選變體，以及編碼這些變體的多核苷酸序列，包含這樣的多核苷酸序列的表達(dá)載體，以及包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的變體在葡萄糖的測量方法中的應(yīng)用，特別是通過測試條裝置或生物感應(yīng)器進(jìn)行的測量。
提供以下的實施例、參考文獻(xiàn)、序列表以及附圖來幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真正范圍示于所附的權(quán)利要求中。應(yīng)當(dāng)理解的是在不背離本發(fā)明的精神的情況下可以對提供的流程進(jìn)行修改。


圖1根據(jù)序列同源性比對的醋酸鈣不動桿菌PQQ-依賴性s-GDH(上)和鮑曼不動桿菌s-GDH(下)的蛋白質(zhì)序列。
圖2實施例1中提及的pACSGDH載體的示意圖，該載體分別包含可溶性PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的野生型或突變的DNA序列。
圖3實施例1中提及的pACSGDH載體的核苷酸(DNA)序列，該序列包含可溶性PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的野生型DNA序列。
具體實施例方式
如上所述，具有葡萄糖脫氫酶活性的兩種完全不同類型的醌蛋白酶(膜結(jié)合的和可溶的)被一同分在EC1.1.99.17組下。這兩種類型似乎彼此并不相關(guān)。
就本發(fā)明的目的而言，僅可溶形式的GDH(s-GDH)是相關(guān)的，下文中對其改進(jìn)的變體進(jìn)行討論。
在第一
具體實施例方式
中，本發(fā)明涉及EC1.1.99.17的可溶形式，其也被稱作PQQ-依賴性可溶葡萄糖脫氫酶(s-GDH)的變體，所述變體包含在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌中獲知的s-GDH野生型序列(SEQ IDNO2)的位點428和429的氨基酸位點之間的至少一個氨基酸殘基的插入，以及可選地還包含一或多個氨基酸取代。
優(yōu)選地，僅一個氨基酸被插入下述氨基酸位點之間，所述氨基酸位點對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌中獲知的s-GDH野生型序列(SEQ IDNO2)的位點428和429。
進(jìn)一步優(yōu)選的是，s-GDH變體包含位于下述氨基酸位點之間的氨基酸的插入，所述氨基酸位點對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌中獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點428和429，該s-GDH的特征在于所述的插入的氨基酸選自亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。插入的氨基酸優(yōu)選是脯氨酸。
本領(lǐng)域已知可以從不動桿菌菌株中分離出可溶PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的野生型DNA-序列。最優(yōu)選的是從醋酸鈣不動桿菌型菌株LMD 79.41中進(jìn)行分離。在SEQ ID NO2中提供了該野生型s-GDH(成熟蛋白)的序列。不動桿菌的其它LMD菌株也可被用作野生型s-GDH的來源?？蓪⑦@些序列與從醋酸鈣不動桿菌中獲得的序列進(jìn)行比對，且對序列進(jìn)行比較。篩選其它細(xì)菌菌株的DNA文庫例如針對大腸桿菌K-12描述的DNA文庫(Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333)，并鑒定出這樣的基因組中與s-GDH相關(guān)的序列看起來也是可行的。這樣的序列和還沒有被鑒定出的同源序列可被用于生成具有提高的底物特異性的s-GDH變體。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“變體”涉及下述s-GDH蛋白，該蛋白與相應(yīng)的野生型序列相比在下述氨基酸位點之間具有氨基酸的插入，所述氨基酸位點對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQID NO2)的位點428和429。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“突變體”涉及下述s-GDH蛋白，當(dāng)與從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)相比時，該蛋白與相應(yīng)野生型序列相比具有至少一個氨基酸取代。
因此術(shù)語“變體”或“突變體”均可相互用于下述s-GDH蛋白，該蛋白相比于相應(yīng)的野生型序列在下述氨基酸位點之間具有氨基酸的插入，這些位點對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌中獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點428和429，且該蛋白還具有至少一個的氨基酸取代。
在另一種優(yōu)選的具體實施方式
中，將改良的s-GDH變體的酶性質(zhì)或功能性質(zhì)分別與野生型酶或在位點428和429之間沒有氨基酸插入的突變體進(jìn)行比較。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選變體其特征在于相對于相應(yīng)的野生型酶，該變體具有較之至少一種其它的選定的糖底物而言提高了2倍的對葡萄糖的底物特異性。
為了計算底物特異性或交叉反應(yīng)性，一種簡單的方法是將把葡萄糖作為底物測量的活性設(shè)定為100％，且將用其它選定的糖測量出的活性與葡萄糖的值進(jìn)行比較。有時，為了避免重復(fù)，簡單使用術(shù)語特異性，而并不特別提到一方面是葡萄糖另一方面是選定的其它糖底物。
本領(lǐng)域的專家將認(rèn)同，對酶活性的比較最好使用充分確定的實驗條件在待研究底物分子的等摩爾濃度下進(jìn)行。否則必須進(jìn)行濃度差異的校正。
為了評價底物特異性(的改進(jìn))必須選擇標(biāo)準(zhǔn)化的和充分確定的實驗條件。如實施例7中所述，對s-GDH對葡萄糖作為底物以及其它選定的糖底物的酶活性進(jìn)行了測量。
根據(jù)針對葡萄糖或選定的不同的糖(優(yōu)選麥芽糖)的酶活性的這些測量，評價交叉反應(yīng)性(及對其的改進(jìn))。
s-GDH對選定糖的(交叉)反應(yīng)性的百分比被計算作交叉反應(yīng)性[％]＝(選定糖的活性/葡萄糖的活性)×100％。
根據(jù)以上公式，野生型s-GDH對麥芽糖的(交叉)反應(yīng)性被確定為大約105％。野生型s-GDH對半乳糖的(交叉)反應(yīng)性被測量為大約50％(比較，表1)。
根據(jù)以下公式計算(改進(jìn)的)特異性特異性(改進(jìn))＝(葡萄糖突變體活性/葡萄糖野生型活性)×(選定糖野生型活性/選定糖突變體活性)在與野生型酶比較時，因此，對葡萄糖的特異性比對麥芽糖(麥芽糖/葡萄糖)的特異性有至少10倍提高的s-GDH形式，用麥芽糖作為底物時具有用葡萄糖作為底物測量的活性的最多10.5％?；蛘?，如果例如突變體s-GDH對麥芽糖的交叉反應(yīng)性為20％(如上所述進(jìn)行確定和計算)，因此該突變體與野生型s-GDH相比具有5.25倍提高的底物特異性(麥芽糖/葡萄糖)。
術(shù)語對底物的“比活性(specific activity)”是本領(lǐng)域公知的，其優(yōu)選被用于描述每一定量的蛋白質(zhì)的酶活性。本領(lǐng)域已知多種方法使用葡萄糖或其它糖作為底物來測定GDH分子的比活性(Igarashi，S.，等，(1999)同上)?？捎糜谶@些測量的一種方法在實施例部分詳細(xì)描述。
盡管選擇很多不同的糖分子并與任何這些選定的糖分子進(jìn)行比較從而研究s-GDH的葡萄糖特異性是可能的，優(yōu)選地選擇臨床相關(guān)的糖分子用于這樣的比較。優(yōu)選選定的糖選自甘露糖、阿洛糖、半乳糖、木糖和麥芽糖。優(yōu)選地，麥芽糖或半乳糖被選定且測試突變體s-GDH對葡萄糖較之對半乳糖或麥芽糖的提高的底物特異性。在更優(yōu)選的具體實施方式
中，選定的糖是麥芽糖。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的s-GDH變體對葡萄糖特異性的提高例如麥芽糖/葡萄糖是相當(dāng)可觀的。因此更優(yōu)選地，對葡萄糖的所述底物特異性與對至少一種選定的其它糖底物的底物特異性相比提高了至少3倍。其它優(yōu)選具體實施方式
包含具有提高的葡萄糖底物特異性的s-GDH突變體，該底物特異性與其它選定的糖分子相比至少高5倍或同樣優(yōu)選地至少高10倍。
s-GDH的突變很多情況下產(chǎn)生對底物葡萄糖的比活性急劇降低的酶變體。但是，對底物葡萄糖的(絕對的或總體的)比活性多于10倍的降低可能對常規(guī)應(yīng)用是關(guān)鍵的。因此，優(yōu)選的是，具有對底物葡萄糖提高的特異性的s-GDH呈現(xiàn)出用野生型酶測量的葡萄糖比活性的至少10％。當(dāng)然，更優(yōu)選的是，這些突變的酶呈現(xiàn)了野生型s-GDH相應(yīng)葡萄糖活性的至少20％或更優(yōu)選的至少30％。
進(jìn)一步優(yōu)選的是這樣的突變體，這些突變體的麥芽糖比活性是測試條上或液體測試中測量的相應(yīng)野生型酶的麥芽糖比活性的10％或更少或甚至僅有5％或更少，而其葡萄糖的比活性與相應(yīng)野生型酶的葡萄糖比活性相比≥10％。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過進(jìn)一步修飾這樣的變體使其在某些充分確定的氨基酸位點額外包含一或多個氨基酸取代，從而進(jìn)一步提高在位點428和429之間包含插入的s-GDH變體的底物特異性是可能的。
通過參照從SEQ ID NO2獲知的氨基酸位點，對本發(fā)明的成果進(jìn)行詳細(xì)說明，SEQ ID NO2是從醋酸鈣不動桿菌型菌株LMD 79.41中分離的s-GDH的野生型序列。通過恰當(dāng)?shù)男蛄斜容^，可以容易地鑒定出對應(yīng)于SEQ ID NO2的位點的不同s-GDH分離物的氨基酸位點。
s-GDH序列和SEQ ID NO2的野生型序列的多重比對和比較使用GCG Package 10.2版的PileUp程序(Genetics Computer Group公司)進(jìn)行。PileUp創(chuàng)造了多序列比對，該比對使用Feng，D.F.和Doolittle，R.F.，J.Mol.Evol.25(1987)351-360的漸進(jìn)比對法的簡化，并且相同、相似或不同氨基酸殘基的積分矩陣被相應(yīng)地確定。該方法首先進(jìn)行兩個最接近序列的成對比對，產(chǎn)生兩個比對序列的簇(cluster)。隨后可將該簇與下一個最相關(guān)的序列或比對序列的簇進(jìn)行比對。通過兩個獨立序列的成對比對的簡單延伸可以對兩個序列簇進(jìn)行比對。通過一系列的漸進(jìn)成對比對實現(xiàn)最終的比對，漸進(jìn)成對比對包括逐漸不相似的序列和群，直至所有的序列已被包含在最終的成對比對中。通過該方法，其它同源s-GDH分子中分別對應(yīng)于醋酸鈣不動桿菌s-GDH的SEQ IDNO1和2中的位點可輕易鑒定。這就是為何在此提供的氨基酸位點應(yīng)被理解為SEQ ID2中的氨基酸位點或在其它同源s-GDH分子中對應(yīng)的位點的原因。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包含了在對應(yīng)于s-GDH的位點348的位點的氨基酸取代以及在位點428和429之間具有氨基酸插入的s-GDH突變體就對于葡萄糖的特異性而言呈現(xiàn)了突出的正面效應(yīng)。如表1中所證實，已經(jīng)識別和生成了具有提高的葡萄糖特異性的各種s-GDH變體。如果位點蘇氨酸348的氨基酸被合適的其它氨基酸取代且合適的氨基酸被插入位點428和429之間，可以觀察到變體s-GDH的葡萄糖特異性的提高。因此本發(fā)明的一種非常優(yōu)選的具體實施方式
涉及下述PQQ-依賴性s-GDH變體蛋白，該蛋白包含在從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的氨基酸428和429之間的插入，并還包含對應(yīng)于位點348的氨基酸位點的氨基酸殘基取代。
還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了進(jìn)一步提高包含了氨基酸428和429之間的插入和位點348的氨基酸殘基取代的s-GDH變體對葡萄糖的特異性，在對應(yīng)于SEQ ID NO2的位點169、171、245、341、349和/或428的氨基酸位點的進(jìn)一步的氨基酸取代是有利的。
從醋酸鈣不動桿菌型菌株LMD 79.41分離出的s-GDH的位點348的蘇氨酸殘基或在位點428和429之間的氨基酸插入對s-GDH的底物結(jié)合的作用均非本領(lǐng)域已知(Oubrie，A.，等，Embo J.18(1999)5187-5194；Oubrie，A.和Dijkstra，B.W.，Protein Sci.9(2000)1265-1273)。為何特別是s-GDH的這兩個改良提高了對葡萄糖較之對其它感興趣的糖分子(特別是較之麥芽糖)的底物特異性，目前沒有化學(xué)或物理解釋。
在另一種優(yōu)選的具體實施方式
中，變體s-GDH的特征在于在位點348的氨基酸殘基蘇氨酸被選自以下的氨基酸殘基取代丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸。在一種更優(yōu)選的具體實施方式
中，甘氨酸被用于取代位點348的蘇氨酸。術(shù)語T348G是技術(shù)人員已知的，其表示在位點348的蘇氨酸被甘氨酸置換。
另一優(yōu)選具體實施方式
是可溶形式的EC1.1.99.17也被稱作PQQ-依賴性可溶葡萄糖脫氫酶的變體，所述變體包含在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點428和429的氨基酸位點之間的至少一個氨基酸殘基的插入以及在對應(yīng)于位點428的氨基酸位點的至少一個氨基酸殘基取代。優(yōu)選地，在位點428的天冬酰胺由亮氨酸、脯氨酸和纈氨酸取代。更優(yōu)選地，在位點428的取代由脯氨酸實現(xiàn)。
本發(fā)明的一組優(yōu)選的s-GDH變體包含在位點348的氨基酸殘基的取代和/或在位點428的氨基酸取代，和在位點428和429之間的氨基酸插入?？蛇x地，這些變體可被進(jìn)一步修飾，以包含在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點169、171、245、341和/或349的氨基酸位點的一或多個氨基酸取代。
如果在本發(fā)明的變體中對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點169的氨基酸被取代，優(yōu)選地，天然存在的氨基酸亮氨酸由苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代。更優(yōu)選地，位點169的取代由苯丙氨酸實現(xiàn)。
如果在本發(fā)明的變體中對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點171的氨基酸被取代，優(yōu)選地，天然存在的氨基酸酪氨酸由選自以下的氨基酸取代丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸。更優(yōu)選地，位點171的取代由甘氨酸實現(xiàn)。
如果在本發(fā)明的變體中對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點245的氨基酸被取代，優(yōu)選地，天然存在的氨基酸谷氨酸由天冬氨酸、精氨酸或谷氨酰胺取代。更優(yōu)選地，位點245的取代由天冬氨酸實現(xiàn)。
如果在本發(fā)明的變體中對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點341的氨基酸被取代，優(yōu)選地，天然存在的氨基酸甲硫氨酸由纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸取代。更優(yōu)選地，位點341的取代由纈氨酸實現(xiàn)。
如果在本發(fā)明的變體中對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點349的氨基酸被取代，優(yōu)選地，天然存在的氨基酸纈氨酸由丙氨酸、甘氨酸取代。更優(yōu)選地，位點349的取代由丙氨酸實現(xiàn)。
如在WO02/34919中所述，在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌中分離出的野生型序列的s-GDH序列的位點348的氨基酸取代可被用于顯著地提高s-GDH的葡萄糖特異性。技術(shù)人員將在WO02/34919中發(fā)現(xiàn)其它合適的位點，這些位點可被取代并與根據(jù)本發(fā)明的插入組合。
在另一種優(yōu)選的具體實施方式
中，除了在氨基酸殘基428和429之間的插入外，本發(fā)明的s-GDH變體包含至少兩個選自以下位點的氨基酸取代對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQID NO2)的氨基酸位點的位點171、245、341、348和349。
在還一種優(yōu)選的具體實施方式
中，除了在氨基酸殘基428和429之間的插入外，本發(fā)明的s-GDH變體包含至少三個選自以下位點的氨基酸取代對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQID NO2)的氨基酸位點的位點171、245、341、348和349。
如同技術(shù)人員將認(rèn)同的，進(jìn)行不以顯著程度影響s-GDH性質(zhì)的氨基酸取代例如沉默突變是可能的。然而本發(fā)明的變體和SEQ ID NO2相比具有不多于45個氨基酸的交換。優(yōu)選地，變體將包含20個或更少的氨基酸取代，更優(yōu)選地，將僅存在10個氨基酸取代或更少的取代。
在實施例部分給出本發(fā)明的s-GDH變體。這些變體也代表了本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方式
。至今發(fā)現(xiàn)的具有最小的葡萄糖干擾的變體包含在氨基酸428和429之間的插入，優(yōu)選地由脯氨酸實現(xiàn)，且分別包含突變Y171G、E245D、M341V和T348G或突變L169F、Y171G、E245D、M341V、T348G。這兩個變體也是本發(fā)明的其它優(yōu)選的具體實施方式
。
氨基酸序列分析揭示在一方面來自醋酸鈣不動桿菌和另一方面來自鮑曼不動桿菌的野生型s-GDH中發(fā)現(xiàn)的序列基元(motives)似乎在與本發(fā)明識別的與提高葡萄糖特異性主要相關(guān)的位點附近非常保守，所述位點即對應(yīng)于來自醋酸鈣不動桿菌的野生型s-GDH的位點428和429附近的插入位點。
包含氨基酸序列AGNXaaVQK(SEQ ID NO2)的PQQ-依賴性s-GDH的變體代表了本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方式
。SEQ ID NO2對應(yīng)于醋酸鈣不動桿菌野生型s-GDH的位點426-431或鮑曼不動桿菌野生型s-GDH的位點427-432，但分別包含了在位點428和429(醋酸鈣不動桿菌)或429和430(鮑曼不動桿菌)之間的一個氨基酸(Xaa)插入。
在一種優(yōu)選具體實施方式
中，本發(fā)明涉及包含了序列G-N-Xaa-V-Q-K-D(SEQ ID NO11)的變體s-GDH。優(yōu)選地，包含了SEQ ID NO11的s-GDH變體的進(jìn)一步的特征在于所述插入的氨基酸Xaa選自以下氨基酸亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，更優(yōu)選地，Xaa是脯氨酸殘基。
如以上進(jìn)一步解釋的，可以對野生型s-GDH的位點428的氨基酸天冬酰胺進(jìn)行氨基酸取代。在這種情況下，SEQ ID NO11將包含被取代的氨基酸而非P428。
本領(lǐng)域已知產(chǎn)生突變體蛋白的大量可能性?；诒景l(fā)明公開了位點428和429之間的氨基酸插入的關(guān)鍵重要性的重要發(fā)現(xiàn)，技術(shù)人員現(xiàn)在可以容易地進(jìn)一步生成s-GDH的合適變體。例如這些變體可以通過被稱作隨機突變(Leung，D.W.，等，Technique 1(1989)11-15)和/或定點突變(Hill，D.E.，等，Methods Enzymol.155(1987)558-568)的方法獲得。生成具有理想性質(zhì)的蛋白的其它方法是提供嵌合構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含來自至少2個不同來源的序列元件，或完全合成合適的s-GDH基因。本領(lǐng)域的此類已知方法可與本發(fā)明公開的信息組合使用以提供s-GDH的突變體或變體，該突變體或變體包含例如其它的氨基酸取代以及公開的SEQ ID NO2的位點428和429之間的插入。
本發(fā)明的s-GDH變體可通過例如以從醋酸鈣不動桿菌型菌株LMD 79.41分離的s-GDH基因作為起始以及以同源序列作為起始進(jìn)行制備。在該申請的上下文中，術(shù)語“同源的”指包含與SEQ ID NO2相比具有至少90％一致性的s-GDH氨基酸序列。換句話說，在使用PileUp程序合適比對后，這樣的同源s-GDH的至少90％的氨基酸與在SEQ ID NO2中所示的氨基酸相同。
人們將理解DNA和氨基酸序列的變化天然存在，或可使用本領(lǐng)域已知方法有意引入。由于與SEQ ID NO2相比所述序列中的一或多個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、倒置或添加，這些變化可造成在整個序列中多達(dá)10％的氨基酸差異。這些氨基酸取代可以例如以涉及的殘基的極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)的相似性為基礎(chǔ)進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似的親水性數(shù)值的具有不帶電荷的極性頭部基團(tuán)或非極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括以下亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。其它涵蓋的變化包括此前所述的多肽的鹽和酯，以及此前所述的多肽的前體，例如具有N-末端取代的前體，如甲硫氨酸、N-甲酰甲硫氨酸被用作引導(dǎo)序列。這些變化可在不必背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下進(jìn)行。
根據(jù)本領(lǐng)域目前已知的方法或根據(jù)在實施例部分中給出的方法，獲得編碼以上討論的任何s-GDH突變體的多核苷酸序列是可能的。本發(fā)明因此也包含編碼如上所述s-GDH蛋白質(zhì)的分離的多核苷酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包括包含本發(fā)明核酸序列的表達(dá)載體，該序列可操作地連接能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)序列表達(dá)的啟動子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包括包含本發(fā)明核酸序列的表達(dá)載體，該序列可操作地連接能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)引導(dǎo)序列表達(dá)的啟動子序列。優(yōu)選的載體是質(zhì)粒，如在圖2和3中顯示的pACSGDH。
用于本發(fā)明的表達(dá)載體典型包含了復(fù)制起點、用于選擇的抗生素抗性、表達(dá)啟動子和s-GDH基因變體的全部或部分。表達(dá)載體也可包括本領(lǐng)域已知的其它DNA序列，例如信號序列(為了更好的折疊、轉(zhuǎn)運至周質(zhì)或分泌)、為了更好地調(diào)節(jié)表達(dá)的誘導(dǎo)子、或用于克隆的切割位點。
選定的表達(dá)載體的特征必須與將被使用的宿主細(xì)胞相容。例如，當(dāng)在大腸桿菌細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時，表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)包括從大腸桿菌細(xì)胞基因組中分離出的啟動子(例如lac或trp)?？梢允褂煤线m的復(fù)制起點如ColE1質(zhì)粒復(fù)制起點。合適的啟動子包括例如lac和trp。同樣優(yōu)選地，表達(dá)載體包括了編碼選擇標(biāo)記的序列如抗生素抗性基因。作為選擇性標(biāo)記，氨芐青霉素抗性或卡那霉素抗性可方便地使用。所有的這些材料是本領(lǐng)域已知的且是商業(yè)上可獲得的。
含有理想的編碼和控制序列的合適的表達(dá)載體可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建，在Sambrook等，“Molecular CloningALaboratory Manual”(1989)Cold Spring Harbor，NY，Cold SpringHarbour Laboratory Press一書中描述了多種此類技術(shù)。
本發(fā)明還涉及含有下述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼突變體s-GDH的全部或部分的DNA序列。該宿主細(xì)胞優(yōu)選地含有下述表達(dá)載體，該載體包含了實施例2-8中顯示的具有一或多個突變的一DNA序列的全部或部分。合適的宿主細(xì)胞包括例如可從Pomega(2800Woods Hollow Road，Madison，WI，美國)獲得的大腸桿菌HB101(ATCC33694)，可從Stratagene(11011 North Torrey Pine Road，La Jolla，CA，美國)獲得的XL1-Blue MRF’。
表達(dá)載體可通過本領(lǐng)域已知的各種方法被引入宿主細(xì)胞。例如，表達(dá)載體對宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可通過聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法(Sambrook等，1989，同上)進(jìn)行。但是，將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞的其它方法例如電穿孔法、基因槍注射或原生質(zhì)融合也可使用。
一旦包含了s-GDH的表達(dá)載體已被引入合適的宿主細(xì)胞，可在允許理想的s-GDH變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。通過例如抗生素選擇，含有理想的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞可被輕易鑒定出，該表達(dá)載體具有編碼突變體s-GDH的全部或部分的DNA序列。s-GDH變體的表達(dá)可通過不同的方法鑒別，例如測量s-GDH mRNA轉(zhuǎn)錄子的產(chǎn)生、免疫檢測基因產(chǎn)物或檢測基因產(chǎn)物的酶活性。優(yōu)選地，使用酶實驗。
本發(fā)明還教導(dǎo)了s-GDH變體的產(chǎn)生和篩選。如本領(lǐng)域所知進(jìn)行隨機突變和飽和突變。針對對葡萄糖的底物特異性(對葡萄糖相比于麥芽糖的活性)和KM值對變體進(jìn)行篩選。調(diào)節(jié)選擇的實驗條件以確保例如通過單個氨基酸取代帶來的預(yù)期的小的增強可被測量。實施例3中給出了選擇或篩選合適突變體的一種模式。采用這種方法，較之野生型酶的任何變化或改進(jìn)可被清楚地檢測到。
當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解不是所有的表達(dá)載體和DNA調(diào)節(jié)序列將同樣好地行使功能以表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。也不是所有的宿主細(xì)胞對相同的表達(dá)系統(tǒng)同樣好地行使功能。但是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用在此提供的指導(dǎo)，在無不當(dāng)實驗的情況下將可對表達(dá)載體、DNA調(diào)節(jié)序列和宿主細(xì)胞作出合適的選擇。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)當(dāng)前發(fā)明的s-GDH變體的方法，該方法包括在適于本發(fā)明的突變體s-GDH產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。對于細(xì)菌宿主細(xì)胞而言，典型的培養(yǎng)條件是含有碳和氮源、合適的抗生素和誘導(dǎo)試劑(根據(jù)所使用的表達(dá)載體)的液體培養(yǎng)基。典型的合適的抗生素包括氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素等。典型的誘導(dǎo)試劑包括IPTG、葡萄糖、乳糖等。
優(yōu)選地，通過在表達(dá)編碼突變體s-GDH的DNA序列的宿主細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)來獲得本發(fā)明的多肽。也可以通過由編碼突變體s-GDH的DNA序列編碼的mRNA的體外翻譯獲得本發(fā)明的多肽。例如，DNA序列可如上所述被合成并被插入合適的表達(dá)載體中，該載體隨后可被用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。
包含如上定義和說明的分離的多核苷酸的表達(dá)載體代表了本發(fā)明的另一優(yōu)選具體實施方式
，該多核苷酸與能夠促進(jìn)其在無細(xì)胞的肽合成系統(tǒng)中的表達(dá)的啟動子序列可操作地連接。
隨后可使用各種常規(guī)的蛋白純化技術(shù)，對例如通過以上說明的步驟產(chǎn)生的多肽進(jìn)行分離純化。例如，層析步驟如離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析可被使用。
本發(fā)明的改良的s-GDH變體的主要應(yīng)用之一是用于測試條以監(jiān)測糖尿病患者的血液葡萄糖水平。如以上討論的，PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶對氧的不敏感性是其相比葡萄糖氧化酶的巨大優(yōu)勢。更重要地，由于s-GDH變體具有對葡萄糖的提高的特異性和對其它糖顯著降低的酶活性，可能存在于待分析樣品中的麥芽糖、半乳糖和/或其它相關(guān)糖引起的干擾被顯著減少。當(dāng)然可以研究很多類型的樣品。體液如血清、血漿、腸道流體或尿液是這些樣品的優(yōu)選來源。
本發(fā)明還包含使用本發(fā)明的s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中的葡萄糖的方法。特別優(yōu)選的是，檢測樣品中葡萄糖的改進(jìn)的方法的特征在于所述的葡萄糖的檢測、測定或測量是使用感應(yīng)器或測試條裝置進(jìn)行的。
同樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是用于檢測或測量樣品中葡萄糖的裝置，該裝置包含本發(fā)明的s-GDH突變體以及所述測量需要的其它試劑。
本發(fā)明的具有改進(jìn)的底物特異性的s-GDH變體也可被非常有益地用于生物感應(yīng)器(D′Costa，E.J.，等，Biosensors 2(1986)71-87；Laurinavicius，V.，等，Analytical Letters 32(1999)299-316；Laurinavicius，V.，等，Monatshefte fuer Chemie 130(1999)1269-1281；Malinauskas，A.等，Sensors and Actuators，BChemical 100(2004)395-402)對樣品或反應(yīng)器中的葡萄糖進(jìn)行在線監(jiān)測。為達(dá)到此目的，例如，s-GDH變體可被用于包被氧不敏感的玻璃電極以對葡萄糖濃度進(jìn)行更精確的確定，該電極具鋨絡(luò)合物，該絡(luò)合物含有氧化還原導(dǎo)電環(huán)氧網(wǎng)絡(luò)(Ye等，1993，同上)。
本發(fā)明的具有改進(jìn)的底物特異性的s-GDH變體還有其它可能的應(yīng)用。例如，這些s-GDH變體可被用于醛糖酸的制備過程。野生型s-GDH在底物氧化生成葡萄糖酸和其它醛糖酸中具有高的轉(zhuǎn)化(turnover)。通過使用對葡萄糖更專一的s-GDH變體，葡萄糖酸的制備將生成少得多的副產(chǎn)物。使用具有不同底物特異性的其它s-GDH變體，可能根據(jù)需要生成不同的醛糖酸。
在以下實施例中，除非指明其它商業(yè)來源，所有的試劑、限制性酶和其它材料都獲自Roche Diagnostics德國，且根據(jù)供應(yīng)商提供的說明進(jìn)行使用。用于DNA的純化、表征和克隆的操作和方法是本領(lǐng)域公知的(Ausubel，F(xiàn).，等，在“Current protocols in molecular biology”(1994)一書中Wiley Verlag)且技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
以下實施例進(jìn)一步闡述了本發(fā)明。這些實施例不旨在限制本發(fā)明的范圍，但提供了對發(fā)明的進(jìn)一步理解。
實施例1在大腸桿菌中克隆與表達(dá)野生型醋酸鈣不動桿菌可溶PQQ依賴性葡萄糖脫氫酶根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程從醋酸鈣不動桿菌菌株LMD 79.41中分離出s-GDH基因。野生型s-GDH基因被亞克隆進(jìn)含有用于可調(diào)節(jié)表達(dá)的mgl啟動子的質(zhì)粒(參考專利申請WO88/09373)。新的構(gòu)建體被稱作pACSGDH(見圖2和3)。重組質(zhì)粒被引入選自大腸桿菌組的宿主生物體。隨后在合適的條件下培養(yǎng)這些生物體，呈現(xiàn)s-GDH活性的菌落被選出。
使用QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen)根據(jù)生產(chǎn)商的方法從上述克隆的200ml過夜培養(yǎng)物中分離出質(zhì)粒pACSGDH。將質(zhì)粒重懸在1ml bidest水中。使用Beckman DU 7400光度計測定質(zhì)粒的濃度。
產(chǎn)量為600μg。隨后使用瓊脂糖凝膠電泳測定質(zhì)粒的質(zhì)量。
實施例2產(chǎn)生突變體T348G作為產(chǎn)生插入變體的重要的起始模板，具有突變T348G的突變體s-GDH被制造出來。選擇s-GDH的該突變體因為已知該突變體具有較之對葡萄糖而言對麥芽糖降低的活性(見WO02/34919)。
使用QuickChange定點突變試劑盒(Stratagene，目錄號200518)用甘氨酸取代位點348的蘇氨酸由。設(shè)計合適的引物。
用于突變的5’-和3’-引物彼此互補且在中心位置包含了用于將蘇氨酸替換成甘氨酸的經(jīng)修飾的密碼子(ACA到GGG)。這些核苷酸在各端側(cè)翼有12至16個核苷酸。核苷酸的序列與側(cè)翼于氨基酸交換的密碼子的正義和反義DNA鏈相同。不同于正義鏈的密碼子ACA＝蘇氨酸和反義鏈的TGT，取而代之的是引物包含了正義鏈的GGG＝甘氨酸和反義鏈的CCC(見SEQ ID NO3和4)。
根據(jù)手冊進(jìn)行PCR反應(yīng)和DpnI消化。此后，1μl的樣品被用于XL-MRF’-細(xì)胞的電穿孔。電穿孔通過使用BioRad大腸桿菌脈沖儀(BioRad)用2.5KV在0.2cm的比色皿中實現(xiàn)。在于37℃在1mL LB中培養(yǎng)1小時后，將細(xì)菌涂布于LB-氨卡青霉素瓊脂平板(100μg/ml氨芐青霉素)上且在37℃對細(xì)菌進(jìn)行過夜培養(yǎng)。使用以下的篩選法檢查突變的s-GDH克隆。
實施例3篩選上述在瓊脂盤上的突變體菌落被挑入含有200μl LB-氨卡青霉素-培養(yǎng)基/孔的微滴定平板(MTPs)中且在37℃過夜培養(yǎng)。這些平板被稱作母平板。
從各母平板中，5μl樣品/孔被轉(zhuǎn)移至含有5μl每孔B(B＝細(xì)菌蛋白提取試劑；Pierce No.78248)的MTP中進(jìn)行細(xì)胞破碎且加入240μl用于活化s-GDH的0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)；50mM Hepes；15mM CaCl2pH7.0/孔。為了實現(xiàn)全酶(holoenzyme)的形成，將MTP在25℃培養(yǎng)2小時且在10℃培養(yǎng)過夜。該平板被稱作工作平板。
從工作平板上將3×10μl樣品/孔轉(zhuǎn)移至三個空MTP。此后，一個平板用葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)濃度測試，第二個平板用降低的葡萄糖濃度(1.9mM而非30mM)測試且第三個平板用麥芽糖或另一選定的糖分子作為底物測試。所有選定的其它糖分子以等摩爾標(biāo)準(zhǔn)濃度即30mM被使用。對于所有實驗而言，已經(jīng)含有待分析糖的90μl介體溶液(見實施例7)被使用。
計算dE/min且將使用30mM葡萄糖作為底物的值設(shè)定為100％活性。將從其它糖獲得的值與葡萄糖值比較且計算百分比活性((例如對于麥芽糖dE/min麥芽糖/dE葡萄糖)×100)。這等價于(變體)酶的交叉反應(yīng)活性。
將從1.9mM葡萄糖獲得的值與30mM葡萄糖值進(jìn)行比較并計算百分比活性((dE/min 1.9mM葡萄糖/30mM葡萄糖)×100)。這給出了％值，該值提供了對被分析的變體的KM值的間接指示。根據(jù)該計算，更高的％值表示更低的(＝更好的)KM值。
以下突變體已經(jīng)被鑒定出

實施例4對通過定點突變得到的突變體s-GDH基因的測序含有突變體s-GDH T348G的基因的質(zhì)粒被分離(高純度質(zhì)粒分離試劑盒，Roche Diagnostics GmbH，No.1754785)且使用ABI Prism染料終止測序試劑盒和ABI 3/73和3/77測序儀(Amersham PharmaciaBiotech)進(jìn)行測序，該突變體具有25-30％麥芽糖/葡萄糖交叉反應(yīng)活性。
使用以下引物正義鏈GDH 15’-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3’(＝SEQ IDNO5)GDH 25’-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3’(＝SEQ ID NO6)結(jié)果已經(jīng)獲得了理想的DNA突變和氨基酸水平，產(chǎn)生了在位點348的T至G的改變(成熟酶)。沒有發(fā)現(xiàn)基因上的其它突變。
實施例5在T348G的基礎(chǔ)上產(chǎn)生插入變體通過使用QuickChange定點突變試劑盒(Stratagene，目錄號200518)產(chǎn)生插入變體。設(shè)計了用于在氨基酸位點428和429(見序列ID NO2)之間進(jìn)行插入的合適引物，且根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行PCR，其中使用s-GDH突變體(突變體T348G，見實施例4)。
對于引物而言，在插入位點的相應(yīng)的密碼子被隨機合成以得到所有可能的20種氨基酸交換。這些密碼子核苷酸在兩端側(cè)翼有11至13個核苷酸。
正義鏈in429X_F5’-CTGCCGGAAATNNNGTCCAAAAAGATG-3’(＝SEQID NO7)反義鏈
in429X_R5’-CATCTTTTTGGACNNNATTTCCGGCAG-3’(＝SEQ IDNO8)根據(jù)手冊進(jìn)行PCR反應(yīng)和DpnI消化。此后，如上所述使用1μl的各反應(yīng)物進(jìn)行XL1F-細(xì)胞的電穿孔。在37℃在1ml LB中培養(yǎng)1小時后，將細(xì)菌涂布于LB-氨卡青霉素瓊脂平板上(100μg/ml氨芐青霉素)，在37℃過夜培養(yǎng)細(xì)菌。對突變的s-GDH克隆進(jìn)行所述的篩選步驟。為了在統(tǒng)計學(xué)上確保具有20種可能的氨基酸插入的變體被篩選，測試了200個克隆。如上所述對具有改變的底物特異性的克隆進(jìn)行質(zhì)粒分離和測序。
結(jié)果表1

實施例6產(chǎn)生對葡萄糖相對于麥芽糖具有更高底物特異性的進(jìn)一步的插入突變體在WO02/34919中，已經(jīng)鑒定出了在s-GDH不同位點的若干氨基酸交換以提高對葡萄糖相比于例如麥芽糖的底物特異性。氨基酸交換T348G與在其它位點例如在位點169、171、245、341和/或349的氨基酸取代的組合進(jìn)一步提高了底物特異性。其中說明的對麥芽糖/葡萄糖的底物特異性分別為3，5和7％的兩個突變體被選定以根據(jù)本發(fā)明在位點428和429之間進(jìn)行插入(在該例中插入脯氨酸)。通過使用SEQID NO9和10的引物完成插入。
SEQ ID NO9insP429_F5’-GATACTGCCGGAAATCCAGTCCAAAAAG-3’SEQ ID NO10 insP429_R5’-CTTTTTGGACTGGTCCTCCGGCAGTATC-3’按照上文所述來進(jìn)行下述操作模板的質(zhì)粒DNA分離、定點突變PCR、電穿孔、篩選、選定的突變體的DNA測序。
結(jié)果

從上表中可以清楚地看出，底物特異性麥芽糖/葡萄糖已經(jīng)極大地改變。已發(fā)現(xiàn)和野生型s-GDH的麥芽糖/葡萄糖轉(zhuǎn)化相比，麥芽糖的轉(zhuǎn)化從105％減少到2-4％。突變體C/1和D/1被詳細(xì)檢測。
實施例7對野生型或變體s-GDH的分別純化和酶活性分析收獲生長的細(xì)胞(LB-Amp.37℃)并將其重懸在磷酸鉀緩沖液pH7.0中。通過French Press細(xì)胞破碎儀(700-900巴)進(jìn)行細(xì)胞破碎。離心后，將上清液上樣到用10mM磷酸鉀緩沖液pH7.0平衡過的S-瓊脂糖(AmershamBiosciences)柱上。洗滌后，使用鹽梯度0-1M NaCl將s-GDH洗脫。顯示出s-GDH活性的片段被收集，用磷酸鉀緩沖液pH7.0進(jìn)行透析并在重新平衡的S-瓊脂糖柱上再次進(jìn)行層析?；钚云伪皇占沂褂肧uperdex200柱(Amersham Biosciences)對其進(jìn)行凝膠過濾。活性片段被收集并儲存在20℃。
對純化的野生型和變體s-GDH分別進(jìn)行的酶實驗和蛋白測定使用來自Pierce的蛋白分析試劑號23225進(jìn)行蛋白測定(用BSA的校準(zhǔn)曲線，30分鐘，37℃)。
用0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ)；50mM Hepes；15mM CaCl2pH7.0將GDH樣品稀釋至1mg蛋白/ml，并將其在25℃放置30分鐘進(jìn)行恢復(fù)或活化。
在活化后，用50mM Hepes；15mM CaCl2pH7.0將樣品稀釋至大約0.02U/ml，且將50μl的各稀釋樣品加入1000μl的0.2M檸檬酸鹽緩沖液(pH5.8；在25℃)，該緩沖液含有0.315mg/ml作為介體的(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺(見美國專利5,484,708)和30mM糖。
在25℃下在最初5分鐘中檢測在620nm的消光。
在以上實驗條件下，1單位酶活性對應(yīng)于1mMol介體/分鐘的轉(zhuǎn)化。
計算活性＝(總體積×dE/min[U/ml])∶(ε×樣品體積×1)(ε＝消光系數(shù)；ε620nm＝30[1×mmol-1×cm-1])分別用葡萄糖和麥芽糖(Merek，德國)進(jìn)行實驗。
結(jié)果

從上表中明顯看出，包含在s-GDH的位點428和429之間的插入的新變體C/1和D/1在麥芽糖/葡萄糖交叉反應(yīng)性上呈現(xiàn)出進(jìn)一步的改進(jìn)。盡管有各種氨基酸取代且盡管有插入，酶活性(針對葡萄糖每毫克/蛋白質(zhì))仍然多于相應(yīng)的野生型酶活性的10％。
實施例8在麥芽糖存在或不存在的情況下對葡萄糖的測定在麥芽糖存在或不存在的情況下分別將野生型s-GDH和s-GDH的變體C/1和D/1用于葡萄糖測定。對照樣品含有50mg葡萄糖/dl?！皽y試”樣品分別含有50mg葡萄糖/dl和100或200mg/dl麥芽糖。相同量的GDH活性(U/ml；見以上的酶實驗)被用于各實驗。
在比色皿中混合1ml 0.315mg(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺ml/0.2M檸檬酸鹽pH5.80.033ml對照或測試樣品通過向比色皿中加入0.050ml s-GDH(其對于葡萄糖的轉(zhuǎn)化所需的s-GDH而言是過量的)開始實驗。監(jiān)測在620nm的吸收變化。在2-5分鐘后，觀察到恒定值且計算dE/5min。用野生型s-GDH測量對照樣品獲得的值被設(shè)定為100％。其它值與該對照值進(jìn)行比較并計算為％。
結(jié)果當(dāng)使用新變體時，在測試樣品中觀察到明顯更少的麥芽糖干擾。明顯地，為以最佳效果將樣品中的葡萄糖與麥芽糖區(qū)分，可以進(jìn)一步優(yōu)化s-GDH的濃度。過多的酶將增加麥芽糖的轉(zhuǎn)化，太少的酶將不能轉(zhuǎn)化所有的葡萄糖且因此將無法達(dá)到吸收的終點。
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<221>CDS<222>(1)..(1362)<400>1gat gtt cct cta act cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa tca gag aac48Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn1 5 10 15ttt gac aag aaa gtt att cta tct aat cta aat aag ccg cac gcg ttg96Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30tta tgg gga cca gataat caa att tgg tta act gag cga gca aca ggt144Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45
aag att cta aga gtt aat cca gag tcg ggt agt gta aaa aca gtt ttt192Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60cag gta cca gag att gtc aat gat gct gat ggg cag aat ggt tta tta240Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80ggt ttt gcc ttc cat cct gat ttt aaa aat aat cct tat atc tat att288Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95tca ggt aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aac336Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110caa acg att att cgt cgt tat acc tat aat aaa tca aca gat acg ctc384Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125gag aag cca gtc gat tta tta gca gga tta cct tca tca aaa gac cat432Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140cag tca ggt cgt ctt gtc att ggg cca gat caa aag att tat tat acg480Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160att ggt gac caa ggg cgt aac cag ctt gct tat ttg ttc ttg cca aat528Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175caa gca caa cat acg cca act caa caa gaa ctg aat ggt aaa gac tat576Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln G1n Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190cac acc tat atg ggt aaa gta cta cgc tta aat ctt gat gga agt att624
His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205cca aag gat aat cca agt ttt aac ggg gtg gtt agc cat att tat aca672Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220ctt gga cat cgt aat ccg cag ggc tta gca ttc act cca aat ggt aaa720Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240tta ttg cag tct gaa caa ggc cca aac tct gac gat gaa att aac ctc768Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255att gtc aaa ggt ggc aat tat ggt tgg ccg aat gta gca ggt tat aaa816Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270gat gat agt ggc tat gct tat gca aat tat tca gca gca gcc aat aag864Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285tca att aag gat tta gct caa aat gga gta aaa gta gcc gca ggg gtc912Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300cct gtg acg aaa gaa tct gaa tgg act ggt aaa aac ttt gtc cca cca960Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320tta aaa act tta tat acc gtt caa gat acc tac aac tat aac gat cca 1008Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335act tgt gga gag atg acc tac att tgc tgg cca aca gtt gca ccg tca 1056Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350
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1 5 10 15Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160
Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285Ser Ile Lys Asp Leu A1a Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro
305 310 315 320Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile370 375 380Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Va1 Pro Met385 390 395 400Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys435 440 445Phe Thr Tyr Lys Ala Lys450
<210>3<211>29<212>DNA<213>人造的<220>
<223>T348G有義鏈的引物序列<400>3catttgctgg ccaggggttg caccgtcat 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人造的<220>
<223>T3486反義鏈的引物序列<400>4atgacggtgc aacccctggc cagcaaatg 29<210>5<211>20<212>DNA<213>人造的<220>
<223>測序引物GDH 1<400>5ttaacgtgct gaacagccgg 20<210>6
<211>20<212>DNA<213>人造的<220>
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<223>合成肽<220>
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1.可溶形式的EC1.1.99.17的一種變體，所述可溶形式的EC1.1.99.17也被稱作PQQ-依賴性可溶葡萄糖脫氫酶(s-GDH)，所述變體包含在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌獲知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的位點428和429的氨基酸位點之間的至少一個氨基酸殘基的插入以及可選地還包含一或多個氨基酸取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體，其進(jìn)一步的特征在于所述的插入的氨基酸選自苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸構(gòu)成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的變體，其中所述的插入的氨基酸是脯氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的變體，其進(jìn)一步的特征在于該變體包含在對應(yīng)于位點348的氨基酸位點的氨基酸殘基的取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變體，其進(jìn)一步的特征在于在位點348的蘇氨酸由選自以下氨基酸構(gòu)成的組的氨基酸取代丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的PQQ-依賴性s-GDH的變體，其進(jìn)一步的特征在于該變體包含至少一個在對應(yīng)于位點428的氨基酸位點的氨基酸殘基的取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的PQQ-依賴性s-GDH的變體，其進(jìn)一步的特征在于在位點428的天冬酰胺由選自以下氨基酸殘基構(gòu)成的組的氨基酸殘基取代亮氨酸、脯氨酸和纈氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的變體，包含在位點348和428的取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的變體，還包含在位點171的取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的變體，還包含在位點245的取代。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的變體，還包含在位點341的取代。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的變體，還包含在位點169的取代。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的變體，還包含在位點349的取代。
14.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的s-GDH變體蛋白的分離的多核苷酸。
15.一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求14中定義的分離的多核苷酸，該多核苷酸與能夠促進(jìn)所述多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列可操作地連接。
16.一種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體。
17.一種制備s-GDH變體的方法，包含在適于制備酶變體的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞。
18.一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求14中定義的分離的多核苷酸，該多核苷酸與能夠促進(jìn)所述多核苷酸在無細(xì)胞肽合成系統(tǒng)中表達(dá)的啟動子序列可操作地連接。
19.一種方法，用于使用權(quán)利要求18所述的構(gòu)建體在無細(xì)胞肽合成系統(tǒng)中在適于制備所述酶變體的條件下制備s-GDH變體。
20.一種方法，用于使用根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項權(quán)利要求所述的s-GDH變體檢測、測定或測量樣品中的葡萄糖，所述的改進(jìn)包括將樣品與所述變體接觸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其進(jìn)一步的特征在于所述的葡萄糖的檢測、測定或測量通過使用感應(yīng)器或測試條裝置進(jìn)行。
22.一種檢測或測量樣品中葡萄糖的裝置，包含根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項權(quán)利要求所述的s-GDH變體和所述測量所需的其它試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及可溶性吡咯并喹啉醌(PQQ)－依賴性葡萄糖脫氫酶的改良變體，該變體包含在對應(yīng)于從醋酸鈣不動桿菌中獲知的氨基酸序列的位點428和429之間的氨基酸插入，本發(fā)明涉及編碼這樣的變體s－GDH的基因，涉及具有提高的對葡萄糖的底物特異性的這樣的s－GDH變體蛋白，并涉及這些s－GDH變體的不同應(yīng)用，特別是用于測定樣品中的糖尤其是葡萄糖的濃度。
文檔編號C12Q1/32GK1989241SQ200580024581
公開日2007年6月27日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者M·博尼特茲-杜拉特, J·拉杰鮑爾, R·施穆克, P·克拉特茲施, W·-R·克納佩 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司