專利名稱：酶和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備酶的方法以及利用該方法所得到的酶，該酶具體指特別適合于異核核磁共振研究或其它的生化研究、功能研究及結(jié)構(gòu)研究的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)。
尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)是一類涉及腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲的絲氨酸蛋白酶。uPA的抑制劑有可能用作前列腺癌、乳腺癌和其它癌癥的藥物。uPA是一種以二硫鍵結(jié)合的411個(gè)殘基的多結(jié)構(gòu)域糖蛋白，它被纖溶酶激活產(chǎn)生2-鏈uPA。因此uPA配體鑒定是藥學(xué)研究的重要目標(biāo)。
核磁共振(NMR)提供了一種在氨基酸和原子水平上檢測(cè)溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的方法。波譜中的信號(hào)位置對(duì)氨基酸環(huán)境特別敏感，這些信號(hào)的位置變化與蛋白質(zhì)和另一種分子間的相互作用相關(guān)。
EP-B-0866967描述了一種利用核磁共振(NMR)鑒定靶生物分子的配體的技術(shù)。該方法依賴于氨基酸殘基的鑒定，該殘基經(jīng)歷由配體與蛋白質(zhì)結(jié)合引起的化學(xué)位移擾動(dòng)，并且將這些化學(xué)位移擾動(dòng)繪制到先前一般通過X射線晶體學(xué)或同源建模解析的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)上。該方法需要含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記(15N、15N/2H和/或13C/2H)的蛋白質(zhì)樣品。該技術(shù)可用于鑒定與特定生物分子結(jié)合的化合物，其在藥學(xué)研究項(xiàng)目中可作為先導(dǎo)物。因此它作為用蛋白質(zhì)NMR進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的抑制劑設(shè)計(jì)(有時(shí)稱為SAR-by-NMR)的方法。
因此用這種方法研究uPA是可取的。文獻(xiàn)記載了幾種不同的uPA構(gòu)建物已經(jīng)產(chǎn)生晶體結(jié)構(gòu)(Spraggon，G.，et al.(1995)Structure 3，681-691；Neinaber，V.et al.(2000)J.Biol.Chem.275，7239-7248；Katz，B.et al.Chemistry and Biology(2000)7，299-312；Zeslawska，E.et al.(2000)J.Mol.Biol.301，465-475)。
SAR-by-NMR方法一般需要大量(＞100mg)的15N(2H)均勻標(biāo)記的蛋白質(zhì)。為了識(shí)別哪個(gè)化學(xué)位移對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)中的哪個(gè)氨基酸，通常需要序列特異性的分配。因此必須記錄三共振異核NMR試驗(yàn)，該試驗(yàn)需要15N、13C(2H)均勻標(biāo)記的蛋白質(zhì)以進(jìn)行順序共振分配(assignment)。
先前由SAR-by-NMR領(lǐng)域?qū)＜褹bbott實(shí)驗(yàn)室開展的異核NMR研究(EP-B-0866967)依賴于由部分15N標(biāo)記方法制成的基于昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)樣品(Hadjuk等，2000)。這些研究給出的15N-1H HSQC波譜，質(zhì)量差，與部分、不均勻的生物合成標(biāo)記相符合，其只能有限地應(yīng)用于研究和最優(yōu)化uPA抑制劑的SAR-by-NMR方法。該研究不能進(jìn)行順序分配(sequential assignment)，因此不能將在配體結(jié)合試驗(yàn)中測(cè)定的誘導(dǎo)的化學(xué)位移擾動(dòng)直接就蛋白質(zhì)序列進(jìn)行解釋。
現(xiàn)有技術(shù)通常只允許在細(xì)菌表達(dá)宿主中生物合成的15N、13C(或這些核與2H的任意組合)均勻標(biāo)記的蛋白質(zhì)。然而uPA等以多二硫鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)通常只以不溶性形式在細(xì)菌中表達(dá)，因此為了支持上述NMR試驗(yàn)，需要一種有效的“重折疊”方法。
先前已報(bào)道了一種從包涵體重折疊uPA的方法(Winkler等，1985)，后來用該方法生產(chǎn)出成功用于X射線晶體學(xué)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的蛋白質(zhì)(Spraggon等，1985；Zeslawska等，2000)。但是，Zeslawska等描述的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法，不能產(chǎn)生足量的天然蛋白質(zhì)(以LMW-uPA為對(duì)照，相當(dāng)于每克濕細(xì)胞沉淀＜10μg天然uPA)以支持用于NMR研究的穩(wěn)定同位素標(biāo)記。
因此需要制備足夠數(shù)量和質(zhì)量的均一穩(wěn)定同位素標(biāo)記的uPA以有效開展例如SAR-by-NMR。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備包含尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)或其活性片段，或它們各自的具有uPA活性的變體的可溶性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將所述蛋白質(zhì)與pH為8.5-10.5的緩沖液接觸，所述緩沖液含有形成氧化還原對(duì)的還原劑和氧化劑，其中與氧化劑相比，還原劑過量存在，還原劑的濃度為至少5mM。
合適的蛋白質(zhì)為修飾形式的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)或其活性片段或它們各自的具有uPA活性的變體。
這里所用的術(shù)語“修飾形式的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)”指該蛋白質(zhì)的非天然形式，由于它們是截短的、突變的或具有與之融合的蛋白質(zhì)，和/或攜帶同位素標(biāo)記而與天然蛋白不同。突變蛋白的例子是有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被別的氨基酸取代的蛋白質(zhì)，還有發(fā)生末端缺失或內(nèi)部序列缺失的缺失變體，或者是在序列中插入了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的插入突變體。
尤其，該蛋白質(zhì)為尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)的非天然活性片段或其變體。這種蛋白質(zhì)的具體例子為如下面所述的uPA的非天然截短形式或片段的變體。特別是它們?cè)贜端區(qū)域發(fā)生突變。此外，該蛋白質(zhì)具有少量(如多至10個(gè)，優(yōu)選多至5個(gè))的氨基酸取代。
上面描述的條件比傳統(tǒng)使用的重折疊條件還原性更強(qiáng)，pH更高，能提供格外高產(chǎn)量的優(yōu)質(zhì)修飾uPA或uPA型蛋白質(zhì)。尤其所得到的蛋白質(zhì)被重折疊，從而具有“類似天然”的三維結(jié)構(gòu)和活性，因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)和活性非常象天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。
通過使用具有上述性質(zhì)的特定重折疊緩沖液來獲得這些條件。
合適的蛋白質(zhì)為均一的穩(wěn)定同位素標(biāo)記形式，它可用于諸如NMR研究。
特別地，緩沖液的pH為9-10，最合適的pH為9.5。
合適的氧化還原對(duì)包括試劑，例如谷胱甘肽、半胱氨酸等，的還原形式和氧化形式，這對(duì)于熟練的化學(xué)家來說是顯而易見的。特別地，氧化還原對(duì)包括還原的谷胱甘肽和氧化的谷胱甘肽。與氧化劑相比，還原劑明顯過量。例如還原劑∶氧化劑的比率為至少5∶1，適合的范圍為5∶1-15∶1。特別的還原劑∶氧化劑比率約為10∶1。
還原劑的濃度還必須很高，為至少5mM，合適地為8mM-15mM，優(yōu)選約10mM。
用于本方法的特別優(yōu)選的緩沖液含有50mM甘氨酸、10mM還原的谷胱甘肽(GSH)、1mM氧化的谷胱甘肽(GSSG)。
它進(jìn)一步任選地包含一種或更多種的添加劑，添加劑選自非去垢劑的磺酸甜菜堿(sulphobetaine，NDSB201)，例如濃度為0.5-1M，優(yōu)選1M；精氨酸，如L、D或D/L精氨酸或其鹽，例如L-精氨酸鹽酸鹽，如濃度為0.8-1.2M(如0.9M)；L-脯氨酸，如濃度為0.8-1.2M(如1M)；或3-[{3-膽酰胺丙基(cholamidopropyl))二甲氨基]-丙磺酸鹽(Chaps)，如濃度為10-30mM(如20mM)；或十二烷基麥芽糖苷，如濃度為0.004-0.01％w/v(如0.006％w/v)。
優(yōu)選的添加劑為NDSB201。
這種方法得到的蛋白質(zhì)能制成質(zhì)量足夠好的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的樣品以對(duì)uPA進(jìn)行完全而強(qiáng)大的SAR-by-NMR程序。
蛋白質(zhì)優(yōu)選為修飾型人uPA，特別是其活性片段或它們中任意一種的變體。
這里所用的術(shù)語“變體”指具有不同于衍生它們的基礎(chǔ)序列(這里為天然uPA，優(yōu)選天然人uPA)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列中有一個(gè)或更多個(gè)的氨基酸被其它的氨基酸取代。氨基酸取代可以認(rèn)為是“保守的”，如果其中一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有廣義相似性質(zhì)的氨基酸取代。非保守取代中氨基酸被不同類型的氨基酸取代。廣義上說，更少的非保守取代是可能的，在不改變多肽的生物活性的情況下。合適的變體與基礎(chǔ)序列有至少70％的同一性，更合適有至少80％的同一性，如至少90％的同一性，優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少98％的同一性。
這里的同一性可用諸如BLAST算法或Lipman-Pearson算法等判斷，其中K tuple2，空隙扣分(gap penalty)4，空隙長度罰分(gap lengthpenalty)12，標(biāo)準(zhǔn)PAM評(píng)分矩陣(scoring matrix)(Lipman，D.J.和Pearson，W.R.，Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches，Sciencel，1985，Vol.227，1435-1441)。
術(shù)語“其片段”指給定氨基酸序列的任何部分，它具有與完整氨基酸序列相同的酶活性。片段適宜地含有來自基礎(chǔ)序列的至少100個(gè)連續(xù)氨基酸，優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)氨基酸。
例如，本發(fā)明方法可用于制備對(duì)應(yīng)Nagai等測(cè)定的全長人uPA序列(Nagai，et al，(1985)，Gene 36，183-188.7)中第147-403位氨基酸的片段，優(yōu)選對(duì)應(yīng)第147-411位氨基酸的片段，序列的編號(hào)方式如該參考文獻(xiàn)所示。
用于本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)包括這種片段的變體，該變體中對(duì)野生型序列進(jìn)行了一個(gè)或更多的修飾，從而降低或消除該酶的蛋白酶活性。例如，已發(fā)現(xiàn)野生型人uPA序列中第356位置上的絲氨酸殘基突變成不同于絲氨酸的氨基酸(特別是丙氨酸)能消除蛋白酶活性。
此外，本發(fā)明特別優(yōu)選的蛋白質(zhì)具有半胱氨酸殘基突變以便去除二硫鍵，如不除去，該二硫鍵能將剩余的A鏈多肽束縛到催化性B鏈。野生型序列中第148位和第279位上的半胱氨酸特別適于突變成諸如絲氨酸族，以便產(chǎn)生更順應(yīng)于SAR-by-NMR的產(chǎn)物。
如果需要，也可以在蛋白質(zhì)的N端加入殘基，特別是蛋氨酸和丙氨酸殘基，如上述Zeslawska等(2000)所述。但是對(duì)于本發(fā)明方法，這種加入是任選的。
特別地，本發(fā)明方法所用的蛋白質(zhì)包括uPA或如上所述的它的片段或變體，它融合了利于蛋白質(zhì)純化的氨基酸序列。這種序列的具體的例子為標(biāo)記序列，例如“組氨酸標(biāo)記”，其在蛋白質(zhì)末端(優(yōu)選N末端)含有至少4個(gè)(合適地至少6個(gè))連續(xù)組氨酸殘基?；蛘撸渌阎募兓蛄欣绻入赘孰?S-轉(zhuǎn)移酶(GST序列)可與uPA融合。
特別地，利用本發(fā)明純化的用于重折疊的蛋白質(zhì)構(gòu)建體為SEQ IDNO 1的蛋白質(zhì)或其變體，尤其是SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)。
SEQUENCE ID NO 11 hhhhhhrsaq sgqktlrprf kiiggeftti enqpwfaaiy rrhrggsvty51 vcggslispc wvisathcfi dypkkedyiv ylgrsrlnsn tqgemkfeve101 nlillhkdysa dtlahhndia llkirskegr caqpsrtiqt iclpsmyndp151 qfgtsceitg fgkenstdyl ypeqlkmtvv kdishrecqq phyygsevtt201 kmlcaadpqw ktdscqgdsg gplvcslqgr mtltgivswg rgcalkdkpg251 vytrvshflp wirshtkeen glalSEQUENCE ID NO 21 hhhhhhrsaq sgqktlrprf kiiggeftti enqpwfaaiy rrhrggsvty51 vcggslispc wvisathcfi dypkkedyiv ylgrsrlnsn tqgemkfeve101 nlilhkdysa dtlahhndia llkirskegr caqpsrtiqt islpsmyndp151 qfgtsceitg fgkenstdyl ypeqlkmtvv klishrecqq phyygsevtt201 kmlcaadpqw ktdscqgdsg gplvcslqgr mtltgivswg rgcalkdlkpg251 vytrvshflp wirshtkeen glal在該序列中，所用的每一個(gè)字母對(duì)應(yīng)常規(guī)的氨基酸單字母編碼。
如果需要，在純化的后期用纖溶酶對(duì)該蛋白質(zhì)構(gòu)建物進(jìn)行蛋白酶切割(在K158與I159之間)以制備最終用于NMR試驗(yàn)的I159-L411。
用作起始材料的uPA在從緩沖液中沉淀出來之前適當(dāng)進(jìn)行變性，這可以通過例如使用8M尿素或6M鹽酸胍(Gdn)等變性劑來實(shí)現(xiàn)。
合適的用作起始材料的蛋白質(zhì)是在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，例如真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，中表達(dá)的重組uPA或其活性片段，或它們各自的變體。特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，uPA在原核細(xì)胞中表達(dá)，特別是在大腸桿菌等細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。這樣能得到高水平的蛋白質(zhì)。本發(fā)明重折疊模式的功效使得這種材料可用于制備適合于SAR-by-NMR研究的高質(zhì)量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記的材料。
可以用常規(guī)方法從包涵體中回收蛋白質(zhì)。
具體地，用含有編碼目的蛋白質(zhì)的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。例如，該核酸可以包含Nagai等(1985supra.)描述的野生型uPA序列或優(yōu)選編碼上述uPA的活性片段或變體的該序列的修飾形式。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，存在于野生型序列的密碼子中至少有一些經(jīng)過修飾以使它們被優(yōu)化以用于在細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)。如現(xiàn)有技術(shù)所理解的，特別是出現(xiàn)在序列起始部分的密碼子，如前20個(gè)密碼子(更合適地前10個(gè)密碼子)針對(duì)細(xì)菌(優(yōu)選大腸桿菌)偏好進(jìn)行優(yōu)化。這保證能實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)。
可以用常規(guī)方法從培養(yǎng)細(xì)胞中的包涵體中回收表達(dá)的蛋白質(zhì)。特別地，可以將細(xì)胞懸浮于稀釋劑中，尤其是在pH約為8.0的緩沖液中。特別的緩沖溶劑包含50mM NaH2PO4和0.3M NaCl。在該階段，緩沖液中任選地包含蛋白酶抑制劑，例如需要時(shí)可以加入無EDTA的蛋白酶抑制劑片(Roche，Inc.)以減少因蛋白酶活性而引起的蛋白質(zhì)損失。
然后通過諸如使用乳化劑等方式裂解細(xì)胞并通過例如使用離心機(jī)進(jìn)行分離。然后適當(dāng)?shù)貙⑷コ锨逡汉椭|(zhì)層后剩下的固體殘留物重懸浮于例如緩沖液(例如pH范圍為7.5-10.5(合適地8左右)，任選地含有變性劑，例如鹽酸胍和/或尿素)中?；蛘?，如果需要，該階段使用的緩沖溶液包含用于本發(fā)明方法的重折疊緩沖液，該重折疊緩沖液中任選地含有變性劑，例如鹽酸胍和/或尿素。
然后在合適的條件下培養(yǎng)懸浮液以溶解包涵體。合適的條件包括30℃維持適當(dāng)時(shí)間段，如1-3小時(shí)。然后適當(dāng)?shù)厝コ锨逡?，并通過離心等方式去除任何殘?jiān)粤粝碌鞍踪|(zhì)溶液。
任選地，對(duì)去除上清液后的固體殘留物進(jìn)行進(jìn)一步的重懸/培養(yǎng)步驟以進(jìn)一步提高產(chǎn)量。
如果需要，本階段使用的緩沖液的pH為8.5-10.5，合適地pH約為9。任選地，通過將蛋白質(zhì)與下述適當(dāng)重折疊緩沖液接觸無需進(jìn)一步純化就可以使蛋白質(zhì)重折疊。
然而，優(yōu)選用柱層析等方法純化該溶液。在上下文中，包括純化標(biāo)記是有用的，因?yàn)樗馕吨繕?biāo)蛋白與柱子結(jié)合直至被合適的緩沖液洗脫。合適的柱材料和洗脫緩沖液對(duì)于熟練的生化學(xué)家來說是顯而易見的。特別地，可以用與溶液本身用的緩沖液相似的緩沖液處理柱子，然后使用一種緩沖液或更多種pH逐漸降低的緩沖液(如pH降至4.5)以洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)。合適的緩沖液是變性緩沖液，如上述含有尿素或鹽酸胍的緩沖液。
在下文中將合適的緩沖液例子描述為緩沖液B、C和D。
然后洗脫液中的純化蛋白質(zhì)的重折疊適當(dāng)?shù)赝ㄟ^將其稀釋至上述含有過量還原劑的相對(duì)高pH(8.5-10.5)的緩沖液中而進(jìn)行。用快速稀釋至復(fù)性(重折疊)緩沖液中的方法適當(dāng)實(shí)現(xiàn)復(fù)性。實(shí)現(xiàn)快速稀釋的方法可以是將蛋白質(zhì)溶液低流速(如約0.1ml/分鐘)泵抽至有效混合/攪拌的更大體積復(fù)性緩沖液中，以至于復(fù)性緩沖液的體積比維持在比加入的蛋白質(zhì)溶液體積過量10倍以上，優(yōu)選大100倍過量。可以在一段延長時(shí)間內(nèi)繼續(xù)攪拌，如1小時(shí)到1周，適當(dāng)?shù)?天或2天以上。
可以使用超濾設(shè)備等進(jìn)行隨后的濃縮，然后用活化緩沖液(如pH為8.0)進(jìn)行透析。離心去除在透析過程中形成的任何沉淀物。所得到的溶液含有目標(biāo)復(fù)性蛋白質(zhì)，復(fù)性蛋白質(zhì)可以用例如柱層析(如使用苯甲脒瓊脂糖純化技術(shù))和凝膠過濾等方法從殘留物中分離?？墒褂玫奶囟ǖ姆磻?yīng)條件例子在下文中闡述。
如果期望或需要，任何產(chǎn)物例如沉淀物可以通過變性而再循環(huán)(如使用上述變性劑)和重折疊。
用本發(fā)明方法，有可能使uPA構(gòu)建物十分高水平地以不溶性包涵體的形式在細(xì)菌中表達(dá)，并且以足以進(jìn)行大規(guī)模的氘、15N和13C標(biāo)記的數(shù)量對(duì)uPA構(gòu)建物進(jìn)行純化、溶解和有效重折疊。用本方法可從50g細(xì)菌糊(cell paste)中回收得到約5mg蛋白質(zhì)。
因此在一個(gè)具體方面，本發(fā)明提供了一種制備包含uPA或活性片段，或它們各自的具有uPA活性的變體的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括用編碼所述蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，從細(xì)胞內(nèi)的包涵體中分離蛋白質(zhì)，在緩沖溶液中使蛋白質(zhì)變性，使蛋白質(zhì)在pH為8.5-9.5的緩沖液中復(fù)性/重折疊，所述緩沖液含有形成氧化還原對(duì)的還原劑和氧化劑，其中與氧化劑相比，還原劑過量存在，還原劑的濃度為至少5mM。
可用這些方法得到的可溶解的、復(fù)性蛋白質(zhì)例如uPA構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。
這種復(fù)性材料可以用傳統(tǒng)方法進(jìn)行生物合成標(biāo)記，用于EP-B-00866967所述的用NMR鑒定uPA配體的方法中。在該方法中，在可能是uPA配體的待測(cè)化合物的存在下，對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行NMR分析?；蛘?，可用其它鑒定配體的方法分析本方法得到的材料，如用等溫滴定量熱法和差示掃描量熱法，如以下文獻(xiàn)所述Ladbury et al.，‘BiocalorimetryApplications ofcalorimetry in the biologicla sciences’(1996)(Edition l)John Wiley & Sons Ltd，London，orWard et al.Progress in Medicinal Chemistry(2001)，38309-76。
或者所得到的材料可用于其它生化、功能和結(jié)構(gòu)研究，包括可用于通過X射線晶體學(xué)解析結(jié)構(gòu)的晶體的制備?，F(xiàn)在參照附圖對(duì)本發(fā)明舉例說明，其中

圖1表示對(duì)Abbott記錄的uPA核磁共振(NMR)波譜(左；Hajduk等，J.Med.Chem.，433862-3866，2000)與本發(fā)明方法得到的uPA的NMR波譜(右)進(jìn)行的比較。Y軸和x軸分別代表氮和質(zhì)子維度的化學(xué)位移，單位為ppm。
圖2表示通過SDS-PAGE對(duì)還原條件和非還原條件下的活化的重折疊uPA-AZ進(jìn)行的比較。在還原條件(20mMDDT)或非還原條件(無DTT)下，使活化的重折疊uPA-AZ樣品(約10微克)在SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸變性，在10％Bis-Tris Novex凝膠(Invitrogen公司)上分析雙份樣品，用考馬斯蘭染色。結(jié)果顯示，還原電泳道和非還原電泳道都有單一的主帶。所觀察到的非還原樣品的遷移距離略長于(表觀分子質(zhì)量更小)還原樣品的遷移距離，這與其存在分子內(nèi)二硫鍵相一致。非還原電泳道中缺少任何更大表觀分子量的電泳帶，表明不存在分子間二硫鍵，說明沒有出現(xiàn)錯(cuò)折疊的二硫鍵結(jié)合的聚集體。
在以下實(shí)施例中，所述緩沖液如下表所概括緩沖液A、50mM NaH2PO4、0.3M NaCl pH8.0。加8片mini-complete(無EDTA)蛋白酶抑制劑B、8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris.HCl、10mM b-巰基乙醇pH8.0C、8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris.HCl、10mM b-巰基乙醇pH6.3D、8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris.HCl、10mM b-巰基乙醇pH4.5E、50mM甘氨酸、10mM還原的谷胱甘肽(GSH)、1mM氧化的谷胱甘肽(GSSG)、1M非去垢劑的硫甜菜堿(Non-detergent sulphurbetaine，NDSB 201)、pH9.5F、15mM Tris-HCl、50mM NaCl、pH8.0G、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、pH7.5所有的緩沖液均即配即用。
實(shí)施例1uPA克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增由編碼人uPA的cDNA得到uPA編碼序列。本研究中制備的構(gòu)建物是包含催化結(jié)構(gòu)域的截短型人uPA。該構(gòu)建物還對(duì)野生型uPA序列進(jìn)行如下修飾在5’末端加入密碼子MHHHHHHRSA；分別通過Quickchange誘變和PCR引入C148S和C279A突變以去除二硫鍵；通過PCR使編碼QCGQKT的前6個(gè)密碼子沉默突變成大腸桿菌偏愛的密碼子。以下稱該構(gòu)建物為uPA-AZ。該構(gòu)建物設(shè)計(jì)成當(dāng)uPA-AZ發(fā)生纖溶酶介導(dǎo)的蛋白水解活化時(shí)，生成含有uPA159-411、C279A的片段，該片段已經(jīng)被揭示能產(chǎn)生晶體(Zeslawska等，2000)。用于擴(kuò)增uPA編碼序列的寡核苷酸引物如下5’引物GTCTCAGCAC TCGAGATCAG GTGTGACTGC GGATCCAGG3’引物GTCTCAGCAC TCGAGTTAGA GGGCCAGGCC ATTCTCTT然后將PCR產(chǎn)物插入pCR-BluntII TOPO中，通過DNA測(cè)序來證實(shí)序列。然后uPA編碼序列經(jīng)BgIII和XhoI消化切割并與BamHI/XhoI消化的pT73.3#6His連接，得到最終的細(xì)菌表達(dá)載體。在大腸桿菌中表達(dá)和蛋白質(zhì)純化在下列條件下，6His-uPA147-411，C148S，C279A(uPA-AZ)在大腸桿菌中表達(dá)。在37℃下用含有10μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)pT73.36His-uPA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的BL21Star(DE3)細(xì)胞。在搖瓶培養(yǎng)中在OD600nm 0.8左右時(shí)加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在離心收獲培養(yǎng)物前繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。
相同的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系用于高密度發(fā)酵。按下述方式制備種子培養(yǎng)物從平板培養(yǎng)物中移取10μl菌環(huán)量的細(xì)胞，將它接種到2升錐形瓶中的600ml含有10μg/ml四環(huán)素、2.0g/L葡萄糖和1.0g/L15NH4Cl的M9液體培養(yǎng)基中。37℃下，培養(yǎng)物在軌道搖床(250rpm)上培養(yǎng)29小時(shí)。在工作容積為30升的Braun Biostat C發(fā)酵罐中傾入20升確定的最少培養(yǎng)液，其組成(g/L)如下K2SO41.0；MgSO4.7H2O 0.75；H3PO4(85％)0.055；Na2SO40.025；葡萄糖25.0；15NH4Cl 10.0；微量元素(如下所述)2ml/L；鹽酸硫胺素0.008；FeSO4.7H2O 0.025；AlCl3.6H2O 0.2；CoCl2.6H2O 0.08；H3BO40.01；KI 0.2；NiSO4.6H2O0.1；Na2Mo4.2H2O 0.5；ZnSO4.7H2O 0.5；MnSO40.379；CuCl2.2H2O0.02。
600ml種子培養(yǎng)物接種到該制備的培養(yǎng)基中，用噴氣裝置以0.5vol/vol/min通氣保持在37℃。通過自動(dòng)控制攪拌速度使溶解氧強(qiáng)度保持在50％飽和度。用2M H2SO4和5M NaOH保持pH為6.6。
當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到OD550nm＝5.0時(shí)，加入IPTG使終濃度達(dá)到0.4mM來誘導(dǎo)uPA-AZ表達(dá)。繼續(xù)誘導(dǎo)8小時(shí)，直到生物量達(dá)到OD550nm＝20。用冷凍離心機(jī)離心收獲細(xì)胞糊(cell paste)，提取之前在-80℃下保存細(xì)胞糊。
用顯微鏡檢查大腸桿菌細(xì)胞中包涵體的存在情況來檢查不溶性u(píng)PA-AZ的表達(dá)。用SDS-PAGE凝膠電泳來確定表達(dá)水平(占總微生物蛋白的百分比)。
解凍50g細(xì)胞糊，通過勻漿重懸浮于500ml緩沖液A中。
過兩遍Emulsiflex乳化器以裂解細(xì)胞懸液，然后以25,000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘。棄去上清液，輕輕刮除沉淀(pellet)頂部的脂質(zhì)層并棄去。通過勻漿將沉淀重懸于新鮮的緩沖液A中，然后再次以25,000rpm旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后將沉淀重懸于200ml變性緩沖液B(約5ml/g濕沉淀)，30℃水浴中不定期攪拌培養(yǎng)1小時(shí)以溶解包涵體，然后以25,000rpm旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。輕輕倒出上清液后再次以25Krpm旋轉(zhuǎn)30分鐘，然后純化如下。
純化取一半上述上清液，加樣至經(jīng)緩沖液B預(yù)平衡的30mlNi-NTA柱(XK26)上，先后用10CV緩沖液B和10CV變性緩沖液C洗滌。倒置柱子，在5C V變性緩沖液D中洗脫uPA-AZ。取另一半上清液，如上操作，合并洗脫液。在這階段合并的洗脫液為67ml，A280nm＝3.7(約2.55mg/ml，因此總共約170mg uPA-AZ)。在柱子穿過液(columnflow-through)中沒有觀測(cè)到uPA-AZ。
重折疊(快速稀釋)純化的變性u(píng)PA-AZ在超速離心機(jī)的45Ti轉(zhuǎn)子中以45Krpm旋轉(zhuǎn)30分鐘以去除任何微量的聚集的蛋白質(zhì)。然后以1/30左右的比例將上清液稀釋到2000ml緩沖液E中，得到蛋白質(zhì)終濃度約為100μg/ml。4℃下，以低流速(約0.1ml/min)泵抽蛋白質(zhì)溶液至4L燒瓶中(磁力攪拌器快速攪拌下)實(shí)現(xiàn)快速稀釋。待蛋白質(zhì)全部移入后放慢攪拌，4℃下放置混合物5天左右?？梢钥吹缴倭康某恋砦?。
活化4℃下，通過使用10k NMWL Pellican濃縮器的UF對(duì)重折疊混合物進(jìn)行濃縮(約12小時(shí))，然后用活化緩沖液(上述緩沖液F)o/n透析。透析產(chǎn)生大的沉淀物，它含總蛋白質(zhì)的40％左右。透析物在45Ti轉(zhuǎn)子中以45Krpm旋轉(zhuǎn)30分鐘以去除不溶性蛋白和任何聚集體。
每毫升uPAf(1mg/ml)中加入1μl纖溶酶懸浮液(Roche)，4℃下孵育過夜。經(jīng)過該孵育，蛋白質(zhì)構(gòu)建物被蛋白酶剪切(K158至I159之間)，產(chǎn)生I159-L411片段(活化的uPA-AZ)。
苯甲脒瓊脂糖純化然后將溶液加至苯甲脒-瓊脂糖(Sigma)柱(Vt＝15ml，XK16，在緩沖液F中預(yù)平衡)上，用緩沖液F洗滌直至獲得平坦基線。
用含5mM苯甲脒的活化緩沖液將活化uPA-AZ從倒置的柱中洗脫出來，重復(fù)做兩批。
凝膠過濾合并活化uPA-AZ洗脫物峰級(jí)分(eluate peak fractions)，分兩批裝入Superdex75柱16/60，每批約5ml。在緩沖液G中預(yù)平衡柱并跑柱。觀察到單一蛋白質(zhì)峰。
然后將活化uPA-AZ峰級(jí)分濃縮至適當(dāng)濃度1-15mg/ml后使用，或濃縮至1-5mg/ml后在-20℃下速凍保存。
uPA活性分析所有的uPA活性分析均用SPECTROZYME UK分析(產(chǎn)品號(hào)244，American Diagnostica Inc.)進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)與人LMW-uPA(產(chǎn)品號(hào)125，American Diagnostica Inc.)(數(shù)據(jù)沒有給出)的活性相當(dāng)。典型地，將0.5體積預(yù)冷的分析緩沖液(50mMTris HCL，pH8.3)與0.5體積預(yù)冷的底物溶液(0.2mg/ml S-2444)和0.5ml預(yù)冷的試驗(yàn)樣品混合后在20℃下孵育。然后用分光光度計(jì)間隔記錄或連續(xù)記錄405nm處的吸光率。
在time-course分析中對(duì)重折疊的活化uPA-AZ與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行活性比較，標(biāo)準(zhǔn)物包括可得商品LMW uPA(產(chǎn)品號(hào)244，AmericanDiagnostica Inc.)和按照Katz等(2000)記載的方法制備的材料，比較顯示兩者的活性幾乎相同，這表明重折疊物的活性基本上達(dá)到天然物的水平。
重折疊的活化uPA的表征在還原條件和非還原條件下的重折疊混合物的SDS-PAGE分析表明所有蛋白質(zhì)基本上均為以二硫鍵結(jié)合的單體，因?yàn)榉沁€原樣品中只觀察到一條帶，沒有聚集帶，與還原帶相比，非還原帶以略小的表觀分子質(zhì)量遷移(圖2)，正如二硫鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)所期望的那樣。用動(dòng)態(tài)光散射和凝膠過濾來表征純化的重折疊uPA，兩種分析均符合文獻(xiàn)(沒有給出數(shù)據(jù))預(yù)期的單體狀態(tài)。ESI質(zhì)譜分析得到的uPA質(zhì)量觀測(cè)值(28399.0)與1個(gè)質(zhì)量單位(沒有給出數(shù)據(jù))中含有5個(gè)二硫鍵的活化uPA構(gòu)建物(uPA159-411，C148S，C279A)的預(yù)期質(zhì)量(28398.12)相符合。
實(shí)施例2uPA的核磁共振(NMR)研究303K溫度下，在帶有三共振(1H/13C/15N/)單梯度5mm超低溫探頭(single-gradient 5mm cryoprobe)的Bruker Avance 600MHz系統(tǒng)上進(jìn)行uPA的NMR試驗(yàn)。活化uPA-AZ樣品提供于50mM HEPES，pH7.4，50mMNaCl中。在NMR試驗(yàn)之前，用購自Millipore(Billerica，MA，USA)的Amicon Ultra-15離心過濾設(shè)備將蛋白質(zhì)樣品充分透析至含有50mM HEPES，pH為7.3的NMR緩沖液中。蛋白質(zhì)濃度為0.1mM。加入5％(v/v)D2O作為鎖定溶劑(lock solvent)。
采用質(zhì)子維的演化時(shí)間(evolution time)為85毫秒和氮維(dimension)的演化時(shí)間為25毫秒，記錄15N-1H橫向馳豫優(yōu)化譜-異核單量子相干譜(TROSY-HSQC)試驗(yàn)(Pervushin等，J.Biomol.NMR，12345-348，1998)?？偛东@時(shí)間為18分鐘。數(shù)據(jù)集用nmrPipe程序(Delaglio等，J.Biomol.NMR，6277-293，1995)處理，用SPARKY程序(Goddard和Kneller，加利福尼亞大學(xué)，舊金山，美國)進(jìn)行分析。
用這種規(guī)程得到的uPA波譜的質(zhì)量很高，展現(xiàn)預(yù)期的此種大小的蛋白質(zhì)的峰數(shù)量(見圖1B)，和以前記錄的波譜(見圖1A)形成對(duì)比。這點(diǎn)十分重要，因?yàn)檫@意味著有可能監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)中任何氨基酸所發(fā)生的變化，如果它與配體有相互作用的話。
事實(shí)上，發(fā)現(xiàn)NMR分析的靈敏度足以檢測(cè)在存在著已知抑制劑的情況下蛋白質(zhì)環(huán)境所出現(xiàn)的變化。
本發(fā)明方法得到的uPA的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是有可能從15N和13C均勻標(biāo)記的uPA樣品的三共振異核NMR波譜中得到序列共振分配(sequential resonance assignment)。這就有可能通過在uPA的三維結(jié)構(gòu)上繪制經(jīng)歷化學(xué)位移擾動(dòng)的氨基酸殘基來鑒定抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)。
另外，NMR分析已用于鑒定許多新穎的抑制劑以及用于證實(shí)其它篩選方法的命中物(hits)。
權(quán)利要求
1.一種制備包含修飾形式的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)或其活性片段，或它們各自的具有uPA活性的變體的可溶性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將所述蛋白質(zhì)與pH為8.5-10.5的緩沖液接觸，所述緩沖液含有形成氧化還原對(duì)的還原劑和氧化劑，其中與氧化劑相比，還原劑過量存在，并且其中還原劑的濃度為至少5mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中蛋白質(zhì)為尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)的非天然活性片段或其變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中蛋白質(zhì)為穩(wěn)定同位素均勻標(biāo)記形式。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中緩沖液的pH為9-10。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中緩沖液的pH為9.5。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中氧化還原對(duì)包括還原的谷胱甘肽和氧化的谷胱甘肽。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中還原劑∶氧化劑的比率為至少5∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中還原劑∶氧化劑的比率為5∶1-15∶1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中還原劑∶氧化劑的比率約為10∶1。
10.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中還原劑的濃度為8mM-15mM。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中還原劑的濃度約為10mM。
12.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中緩沖液包括50mM甘氨酸、10mM還原的谷胱甘肽(GSH)、1mM氧化的谷胱甘肽(GSSG)。
13.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中緩沖液進(jìn)一步包括一種或更多種選自例如非去垢劑的磺酸甜菜堿(NDSB201)、精氨酸或其鹽、L脯氨酸、3-[{3-膽酰胺丙基)二甲氨基]1-丙磺酸鹽(Chaps)或十二烷基麥芽糖苷的添加劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中添加劑為非去垢劑的磺酸甜菜堿(NDSB201)。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)為人uPA。
16.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白質(zhì)與用于該蛋白質(zhì)純化的氨基酸序列融合。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中蛋白質(zhì)如SEQ ID NO2所述SEQ ID NO21 hhhhhhrsaq sgqktlrprf kiiggeftti enqpwfaaiy rrhrggsvty51 vcggslispc wvisathcfi dypkkedyiv ylgrsrlnsn tqgemkfeve101 nlilhkdysa dtlahhndia llkirskegr caqpsrtiqt islpsmyndp151 qfgtsceitg fgkenstdyl ypeqlkmtvv klishrecqq phyygsevtt201 kmlcaadpqw ktdscqgdsg gplvcslqgr mtltgivswg rgcalkdkpg251 vytrvshflp wirshtkeen glal。
18.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在預(yù)備步驟中，蛋白質(zhì)被變性。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中用8N尿素或6M鹽酸胍進(jìn)行變性。
20.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其中蛋白質(zhì)產(chǎn)物隨后經(jīng)過纖溶酶消化步驟。
21.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白質(zhì)是在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組修飾uPA或其活性片段或它們各自的變體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中從宿主細(xì)胞中的包涵體內(nèi)回收蛋白質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中用編碼所述蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且其中存在于野生型核酸序列的密碼子中至少有一些經(jīng)過修飾以使它們?yōu)樵诩?xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)而被優(yōu)化。
25.一種制備包含uPA或活性片段，或它們各自的具有uPA活性的變體的可溶性蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括用編碼所述蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從細(xì)胞內(nèi)的包涵體中分離蛋白質(zhì)，在緩沖溶液中使蛋白質(zhì)變性，從pH為8.5-9.5的緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)，所述緩沖液含有形成氧化還原對(duì)的還原劑和氧化劑，其中與氧化劑相比，還原劑過量存在，并且其中還原劑的濃度為至少5mM。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中該產(chǎn)物經(jīng)過纖溶酶消化以形成uPA活性片段。
27.可由上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法得到的可溶性蛋白質(zhì)，包括修飾的uPA或活性片段或它們各自的具有uPA活性的變體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的蛋白質(zhì)，它被同位素15N均勻標(biāo)記(≥98％)，當(dāng)在303K溫度下，在pH為7.3的50mM HEPES緩沖液中檢測(cè)時(shí)，具有圖1B所示的15N-1H TROSY-HSQC NMR波譜。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的蛋白質(zhì)，其中同位素標(biāo)記包括15N或13C或這些核與2H的任意組合。
30.一種鑒定uPA配體的方法，所述方法包括在待測(cè)化合物存在下，用NMR、等溫滴定量熱法或差示掃描量熱法分析根據(jù)權(quán)利要求27-29中的任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，前提是在NMR分析時(shí)，適當(dāng)?shù)貥?biāo)記所述材料。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的鑒定uPA配體的方法，所述方法包括通過NMR進(jìn)行分析，其中蛋白質(zhì)是穩(wěn)定同位素均勻標(biāo)記的形式。
32.根據(jù)權(quán)利要求27-29中任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)在進(jìn)行X射線晶體學(xué)分析中的應(yīng)用。
全文摘要
一種制備包含修飾形式的尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)或其活性片段，或它們各自的具有uPA活性的變體的可溶性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將所述蛋白質(zhì)與pH為8.5－10.5的緩沖液接觸，該緩沖液含有形成氧化還原對(duì)的還原劑和氧化劑，其中與氧化劑相比，還原劑過量存在，還原劑的濃度為至少5mM。本發(fā)明的另一個(gè)方面是可以用該方法得到的物質(zhì)。它重折疊成“天然樣”形狀，可用于NMR分析等研究以檢測(cè)配體。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1950500SQ200580014922
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者M·S·B·麥阿利斯特, A·皮內(nèi)達(dá)－盧切納 申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司