專利名稱：生產(chǎn)多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在低溫條件下通過表達(dá)具有被整合的編碼目的蛋白的基因的載體和具有被整合的陪伴分子基因的載體來生產(chǎn)目的蛋白的方法。
背景領(lǐng)域最近，各種生物的基因組的分析正趨于完成，且認(rèn)為這些分析在將來將轉(zhuǎn)向作為基因的表達(dá)產(chǎn)物的蛋白的全面的功能分析。通過闡明單個蛋白的性質(zhì)和詳細(xì)分析蛋白之間的相互作用來幫助解釋說明生物學(xué)現(xiàn)象的研究正不斷地快速地增加。另一方面，在確定細(xì)胞內(nèi)受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)中有極大的興趣，所述蛋白特異性地結(jié)合各種生理學(xué)活性的物質(zhì)以傳遞作用。這是因?yàn)榻Y(jié)合受體蛋白的活性物質(zhì)可以是新藥的候選物質(zhì)。因此，關(guān)注投向了篩選新藥。為確定這樣的蛋白的特性，一般方法包括將對應(yīng)的基因整合入載體基因，轉(zhuǎn)化宿主例如細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞，和檢查通過表達(dá)獲得的重組蛋白的特性。
當(dāng)估計(jì)蛋白的準(zhǔn)確性質(zhì)時，所述蛋白是否折疊成正確的三級結(jié)構(gòu)是非常重要的。然而，如果按照蛋白質(zhì)的表達(dá)方法使用上述宿主表達(dá)系統(tǒng)來制備來源于異源生物的蛋白，則人們可能會經(jīng)常遇到這樣的情況，在該況中，由于所述蛋白的異常折疊只獲得具有不同三級結(jié)構(gòu)的異常蛋白。這樣的蛋白在宿主中形成了稱為內(nèi)含體的聚集體。內(nèi)含體的形成是有利的，因?yàn)楸磉_(dá)的蛋白受到保護(hù)而免受宿主細(xì)胞中的蛋白水解酶降解，并且所述蛋白可通過離心容易地從細(xì)胞中分離。然而，為了獲得生物學(xué)活性的目的蛋白，必須通過變性來溶解內(nèi)含體，然后將其再生(重折疊)。當(dāng)對各蛋白重復(fù)試錯法時，溶解/再生的方法主要依靠經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行。在許多情況下不能獲得滿意的產(chǎn)量，且另外，再生并不總是可能的。此外，對相當(dāng)多異源蛋白來說，不能獲得高表達(dá)水平，因?yàn)樗龅鞍妆淮竽c桿菌(Escherichia coli)中的蛋白酶降解了。絕不能說，已經(jīng)充分確立了解決這樣的表達(dá)產(chǎn)物的不溶性或降解的問題的方法。目前，使用上述宿主表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)生物學(xué)活性的蛋白不必定成功。為解決該問題，已嘗試和陪伴分子共表達(dá)等方法，并且已進(jìn)行了一些報道(例如，參見專利文獻(xiàn)1至3)。
DnaK、DnaJ和GrpE是在蛋白的折疊中協(xié)同發(fā)揮作用的陪伴分子。這如下進(jìn)行考慮。首先，當(dāng)DnaJ結(jié)合作為底物的未折疊的蛋白時，DnaK上的ATP被水解，以形成未折疊的蛋白/DnaJ/DnaK復(fù)合物(ADP結(jié)合類型)。然后，GrpE使ADP/ATP發(fā)生交換，以從復(fù)合物中釋放底物蛋白(例如，參見非專利文獻(xiàn)1)。觸發(fā)因子是參與蛋白折疊的分子陪伴之一，且具有這樣的催化活性，即在細(xì)胞中折疊期間催化靶蛋白氨基酸中的脯氨酸殘基的N-末端側(cè)的肽鍵的順反異構(gòu)化反應(yīng)(肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPIase)活性)。
在許多情況下已知在大腸桿菌中不溶解的外源蛋白和GroEL和GroES的共表達(dá)導(dǎo)致該外源蛋白的成功溶解。所述外源蛋白的實(shí)例包括酪氨酸激酶(例如，參見非專利文獻(xiàn)2和3)、谷氨酸消旋酶(例如，參見非專利文獻(xiàn)4)和二氫葉酸還原酶(例如，參見非專利文獻(xiàn)5)。此外，知道由于和DnaK的共表達(dá)導(dǎo)致的人生長激素的增加的溶解性(例如，非專利文獻(xiàn)6)、由于和DnaJ的共表達(dá)導(dǎo)致的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase)的增加的溶解性(例如，非專利文獻(xiàn)4)和由于和DnaK、DnaJ和GrpE的共表達(dá)導(dǎo)致的酪氨酸激酶的增加的溶解性(例如，參見非專利文獻(xiàn)2)。
已進(jìn)行了通過將在大腸桿菌中不溶的蛋白作為和陪伴分子等的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)來使其溶解的嘗試。例如，已知通過將小鼠抗雞溶菌酶Fab抗體片段作為和TcFKBP18(來自古細(xì)菌的陪伴分子)的融合蛋白進(jìn)行表達(dá)來使其溶解獲得了成功(參見專利文獻(xiàn)7)。
然而，通過上述方法還未解決有關(guān)所有蛋白的表達(dá)或折疊的問題。因此，一直以來強(qiáng)烈地需要確立用于有效地生產(chǎn)蛋白的方法。
如果將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌的培養(yǎng)溫度從37℃下降至10-20℃，那么大腸桿菌細(xì)胞的生長臨時停滯，在此期間誘導(dǎo)了一組稱為冷激蛋白的蛋白的表達(dá)。根據(jù)誘導(dǎo)水平將所述蛋白分成兩組第I組(10倍或更多)和第II組(低于10倍)。第I組中的蛋白包括CspA、CspB、CspG和CsdA(例如，參見非專利文獻(xiàn)7和8)。這些蛋白中，CspA的表達(dá)水平(例如，參見專利文獻(xiàn)5)在溫度從37℃轉(zhuǎn)變至10℃后1.5小時，達(dá)到總細(xì)胞蛋白的13％(例如，參見非專利文獻(xiàn)9)。于是，已進(jìn)行了使用cspA基因的啟動子在低溫下生產(chǎn)重組蛋白的嘗試。
對于在低溫條件下使用cspA基因表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)，除了在低溫下通過該基因的啟動子產(chǎn)生的上述高效轉(zhuǎn)錄起始外，還顯示了下述效力。
(1)如果從cspA基因轉(zhuǎn)錄的并且能夠被翻譯的mRNA不編碼功能性CspA蛋白(具體地說，如果其只編碼CspA蛋白的N-末端序列的部分)，那么該mRNA長時間段地抑制其他大腸桿菌蛋白包括冷激蛋白的表達(dá)。在該時間段內(nèi)，優(yōu)選地翻譯所述mRNA(例如，參見非專利文獻(xiàn)7和專利文獻(xiàn)6)。該現(xiàn)象稱為LACE(截短的cspA表達(dá)的低溫依賴性抗生素效應(yīng))效應(yīng)。
(2)由15個核苷酸組成的稱為下游框的序列位于cspA基因的起始密碼子的下游12個核苷酸之后的位置。該序列使得能夠在低溫條件下產(chǎn)生高翻譯效率。
(3)由159個核苷酸組成的5’-非翻譯區(qū)位于cspA基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和起始密碼子之間。該區(qū)域?qū)?7℃下CspA的表達(dá)具有負(fù)效應(yīng)和在底溫下條件下具有正效應(yīng)。
具體地，上面(1)中所述的現(xiàn)象暗示著使用cspA基因進(jìn)行的只有目的蛋白的特異性表達(dá)的可行性。因此，預(yù)期可將該系統(tǒng)用于高純度重組蛋白的生產(chǎn)或同位素標(biāo)記的蛋白的制備以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
然而，上述低溫條件下的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)仍不能用于所有重組蛋白。各蛋白具有內(nèi)在(intrinsic)分子量、等電點(diǎn)和氨基酸組成，并且需要形成獨(dú)特的高級有序的結(jié)構(gòu)以發(fā)揮功能。即使是使用上述表達(dá)系統(tǒng)，還存在這樣的蛋白，對于所述蛋白，不能獲得足夠表達(dá)水平或不能獲得活性的蛋白。
專利文獻(xiàn)1JP-A 11-9274專利文獻(xiàn)2JP-A 2000-255702專利文獻(xiàn)3JP-A 2000-189163專利文獻(xiàn)4JP-A 8-308564專利文獻(xiàn)5WO 90/09447專利文獻(xiàn)6WO 98/27220專利文獻(xiàn)7WO 2004/001041
非專利文獻(xiàn)1Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9110345-10349(1994)非專利文獻(xiàn)2Cell Mol.Biol.，40635-644(1994)非專利文獻(xiàn)3Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921048-1052(1995)非專利文獻(xiàn)4J.Biochem.，117495-498(1995)非專利文獻(xiàn)5Protein.Eng.，7925-931(1994)非專利文獻(xiàn)6Biotechnol.，10301-304(1992)非專利文獻(xiàn)7J.Bacteriol.，1784919-4925(1996)非專利文獻(xiàn)8J.Bacteriol.，1782994-2997(1996)非專利文獻(xiàn)9Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87283-287(1990)發(fā)明內(nèi)容通過本發(fā)明解決的問題考慮到上述的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的主要目的是提供有效地生產(chǎn)保持其活性的目的多肽的方法。
解決問題的方法作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在低溫條件下使用重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)使編碼目的多肽或蛋白的基因表達(dá)后，通過在所用宿主內(nèi)增加陪伴分子基因的表達(dá)，可將按照常規(guī)方法難以作為可溶性蛋白表達(dá)的蛋白作為活性的可溶性蛋白表達(dá)。
此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)按照上述方法將目的多肽或蛋白作為和陪伴分子的融合蛋白來表達(dá)在目的蛋白的增溶中特別有效。和將蛋白作為和陪伴分子的融合蛋白來表達(dá)的常規(guī)方法或使用重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)在低溫條件下表達(dá)目的蛋白的方法的效果相比，這樣的方法在目的蛋白的增溶中的效果是令人吃驚的和出乎意料的。
例如，本發(fā)明提供了用于有效地表達(dá)目的多肽的方法，該方法通過將具有被整合的目的基因的載體和具有被整合的陪伴分子基因的載體轉(zhuǎn)入相同的宿主并誘導(dǎo)兩個基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的第一方面涉及生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括將這樣的宿主暴露于低溫條件下以誘導(dǎo)多肽的表達(dá)，所述宿主具有被轉(zhuǎn)入該宿主的編碼想要的多肽的基因，其中在該宿主中，編碼陪伴分子的基因的表達(dá)被增強(qiáng)。
根據(jù)該第一方面，可通過例如這樣的方法增強(qiáng)編碼陪伴分子的基因的表達(dá)，所述方法是誘導(dǎo)宿主中的陪伴分子基因的表達(dá)；修飾宿主的染色體上的陪伴分子基因；將陪伴分子基因轉(zhuǎn)入宿主；或使用這樣的宿主，在該宿主中，陪伴分子基因的表達(dá)被增強(qiáng)。
根據(jù)該第一方面，可優(yōu)選地使用編碼選自DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES和觸發(fā)因子的陪伴分子的基因。
根據(jù)該第一方面，可將被轉(zhuǎn)入宿主的編碼想要的多肽的基因連接至這樣的DNA的下游，所述DNA編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)。以大腸桿菌cspA基因?yàn)槔齺碚f明所述冷激蛋白基因。
根據(jù)該第一方面，可使用載體將編碼想要的多肽的DNA和編碼陪伴分子的基因轉(zhuǎn)入宿主?？蓪⒕幋a想要的多肽的DNA和編碼陪伴分子的基因相互連接，從而就可編碼該想要的多肽和該陪伴分子的融合蛋白。以勞斯相關(guān)病毒2(RAV-2)逆轉(zhuǎn)錄酶α亞基、RAV-2β亞基、DNA酶或人Dicer PAZ結(jié)構(gòu)域多肽為例說明想要的多肽。
以大腸桿菌為例說明按照該第一方面使用的宿主。
本發(fā)明的第二方面涉及用于生產(chǎn)想要的多肽的一套質(zhì)粒載體，其包括(1)第一載體，其在啟動子的下游具有(a)編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的DNA；和(b)可用于插入編碼想要的多肽的基因且位于(a)的DNA的下游的限制性內(nèi)切酶識別序列；和(2)具有編碼陪伴分子的基因的第二載體，其中選擇(1)和(2)的載體的復(fù)制起點(diǎn)從而使得不產(chǎn)生不相容性。
例如，根據(jù)該第二方面，第一載體可包含這樣的DNA，該DNA編碼來源于大腸桿菌cspA基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)，且第二載體可包含編碼選自DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES和觸發(fā)因子的陪伴分子的基因。能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)?？捎米魉鲚d體。
本發(fā)明的第三方面涉及這樣的表達(dá)載體，該載體在啟動子的下游具有(a)編碼來源于冷激蛋白的基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的DNA；和(b)具有可用于插入編碼想要的多肽的基因且位于(a)的DNA的下游的限制性內(nèi)切酶識別序列的DNA；和(c)編碼陪伴分子的基因。
以這樣的載體為例說明該第三方面的表達(dá)載體，所述這樣的載體含有編碼來自大腸桿菌cspA基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的DNA，或所述這樣的載體含有編碼選自DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES和觸發(fā)因子的陪伴分子的基因。
根據(jù)該第三方面，可用于插入編碼想要的多肽的基因的限制性內(nèi)切酶識別序列可位于這樣的位置，在該位置可插入所述編碼想要的多肽的基因，從而使想要的多肽作為和陪伴分子的融合蛋白表達(dá)。
所述表達(dá)載體可以是能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒。
發(fā)明效果按照本發(fā)明的方法，可能獲得相當(dāng)大量的通過常規(guī)方法難以表達(dá)、同時保持其活性的多肽。
附圖簡述

圖1顯示通過共表達(dá)進(jìn)行的hDi-ASI的表達(dá)的檢查結(jié)果?！癆”和“B”分別顯示CBB染色和抗體染色的結(jié)果。在圖中，“T”表示細(xì)胞提取物級分而“S”表示可溶性組分。
圖2顯示逆轉(zhuǎn)錄酶(RTase)α或逆轉(zhuǎn)錄酶β和觸發(fā)因子的融合蛋白的表達(dá)的檢查結(jié)果?！癆”和“B”分別顯示單獨(dú)表達(dá)和共表達(dá)的結(jié)果，且“C”和“D”分別顯示T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中的融合表達(dá)的結(jié)果和冷激表達(dá)系統(tǒng)中融合表達(dá)的結(jié)果。在圖中，“α”表示RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α，“β”表示RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β，“T”表示細(xì)胞提取物級分，“S”表示可溶性級分，且“P”表示不溶性級分。
圖3顯示DNA酶和觸發(fā)因子的融合蛋白的表達(dá)的檢查結(jié)果?！癆”、“B”和“C”分別顯示單一表達(dá)系統(tǒng)、共表達(dá)系統(tǒng)和融合表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)果。在圖中，“S”表示可溶性級分，且“P”表示不溶性級分。
圖4顯示DNA酶活性測量的結(jié)果。在圖中，“M”表示單獨(dú)的底物，“1”表示使用作為對照的超聲處理的可溶性級分進(jìn)行的DNA酶活性測量的結(jié)果，且“2”表示使用融合表達(dá)系統(tǒng)的超聲處理的可溶性級分進(jìn)行的DNA酶活性測量的結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最優(yōu)模式在下文中，將描述本發(fā)明。
(1)冷激載體根據(jù)本發(fā)明使用的含有編碼想要的多肽的基因的載體是這樣的一種載體，在該載體中，通過將宿主的培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換至比正常的生長溫度更低的溫度(即，通過冷激)來誘導(dǎo)所述多肽的表達(dá)。其用作根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體。如此處所用的，術(shù)語“低溫”是指低于宿主的正常生長溫度的溫度。在下文中，上述載體可稱作冷激載體。用于使用這樣的載體表達(dá)想要的多肽的系統(tǒng)可稱作冷激表達(dá)系統(tǒng)。具有這樣的DNA和連接至所述DNA下游的編碼想要的多肽的基因的載體可用作這樣的載體，所述DNA編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)。如此處所用的，術(shù)語“下游”是指相對于轉(zhuǎn)錄方向的下游位置。
盡管不想限定本發(fā)明，但在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含編碼想要的多肽的基因的載體包含下列元件(A)在所使用的宿主中起作用的啟動子；(B)調(diào)節(jié)(A)的啟動子的作用的調(diào)控區(qū)；和(C)編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的部分或編碼這樣的區(qū)域的部分，在該區(qū)域中，在所述非翻譯區(qū)進(jìn)行了至少一個核苷酸的替代、缺失、插入或添加。
下面進(jìn)行詳細(xì)描述。
關(guān)于(A)的啟動子沒有具體的限定，只要其在所用的宿主中具有起始RNA轉(zhuǎn)錄的活性。具體地，其是可通過將其和這樣的部分組合使用來用作冷反應(yīng)性啟動子的任意啟動子，所述部分編碼來源于(C)的冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)。
關(guān)于(B)的調(diào)控基因沒有具體的限定，只要其可用于調(diào)節(jié)位于(A)的啟動子下游的基因的表達(dá)。例如，可通過將這樣的區(qū)域整合入載體來抑制從啟動子下游的基因翻譯目的蛋白，與從啟動子轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)的RNA(反義RNA)從該區(qū)域轉(zhuǎn)錄。通過在不同于(A)的啟動子的合適的啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄所述反義RNA可調(diào)控目的多肽的表達(dá)。可使用存在于各種基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)中的操縱基因。例如，根據(jù)本發(fā)明可使用來源于大腸桿菌乳糖操縱子的lac操縱基因?？赏ㄟ^使用合適的誘導(dǎo)物例如乳糖或其結(jié)構(gòu)類似物(優(yōu)選地，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))取消lac操縱基因的功能來使啟動子發(fā)揮作用。通常將這樣的操縱基因序列置于啟動子的下游和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的附近。
編碼來源于(C)的冷激蛋白的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的部分是編碼起始密碼子5’的mRNA區(qū)域的部分。已在大腸桿菌冷激蛋白基因(cspA、cspB、cspG和csdA)(J.Bacteriol.，1784919-4925(1996)；J.Bacteriol.，1782994-2997(1996))中表示特性地發(fā)現(xiàn)了所述部分。來自從這樣的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中的5’末端的100個核苷酸或更多核苷酸的部分不被翻譯成蛋白。該部分對于基因表達(dá)的冷反應(yīng)非常重要。如果將該5’-非翻譯區(qū)附著至任意蛋白的mRNA(在其5’末端附著)，那么在低溫條件下發(fā)生從mRNA至蛋白的翻譯。只要保持功能，可在來源于冷激蛋白的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的核苷酸序列中替代、缺失、插入或添加一個或多個核苷酸。
如此處所用的，“區(qū)域”是指核酸(DNA或RNA)的范圍。如此處所用的，“mRNA的5’-非翻譯區(qū)”是指不編碼蛋白并且位于作為從DNA轉(zhuǎn)錄的結(jié)果合成的mRNA的5’側(cè)的區(qū)域。在下文中，所述區(qū)域稱作“5’-UTR(5’-非翻譯區(qū))”。除非另外指出，5’-UTR是指大腸桿菌cspA基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)或其修飾物。
編碼來源于上面所列的冷激蛋白基因的5’-UTR的部分可用于本發(fā)明的載體。具體地，優(yōu)選地可使用來源于大腸桿菌cspA基因的部分。此外，可使用這樣的部分，只要其對多肽的冷特異性表達(dá)有貢獻(xiàn)，在該部分中，對核苷酸序列進(jìn)行了部分修飾。例如，可使用這樣的部分，在該部分中，通過整合上面有關(guān)(B)所述的操縱基因來修飾所述區(qū)域的核苷酸序列?？蛇x擇地，可將編碼冷激蛋白基因的5’-UTR的部分置于(A)的啟動子和編碼待表達(dá)的多肽的基因的起始密碼子之間。可將操縱基因整合入該部分。
除了上述元件外，通過在5’-非翻譯區(qū)的下游包含與所用的宿主的核糖體RNA中的反下游框序列(anti-downstream box sequence)互補(bǔ)的核苷酸序列，可能增加表達(dá)效率。例如，在大腸桿菌的情況下，反下游框序列存在于16S核糖體RNA中的位置1467至位置1481?？赡苁褂镁幋a冷激蛋白的N-末端肽的區(qū)域，該區(qū)域含有和該序列高度互補(bǔ)的核苷酸序列。其中轉(zhuǎn)錄終止序列(終止子)被置于目的蛋白的基因下游的載體有利于目的蛋白的高表達(dá)，這是因?yàn)樗鲚d體的穩(wěn)定性得到了增加。
本發(fā)明的載體可以是常用載體(例如，質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體)中的任一種載體，只要其可用于達(dá)到作為載體的目的。對于除了上述元件外所含的區(qū)域，本發(fā)明的載體可具有例如復(fù)制起點(diǎn)、用作選擇標(biāo)記的藥物抗性基因或操縱基因(例如，lac操縱子的lacIq基因)的功能所必需的調(diào)控基因。如果本發(fā)明的載體在其被轉(zhuǎn)入宿主后被整合入該宿主的基因組DNA中，則不會產(chǎn)生不便。
下面具體地描述質(zhì)粒載體的構(gòu)建。除非另外指出，大腸桿菌CspA蛋白、參與所述蛋白表達(dá)的基因的區(qū)域和該基因中的啟動子區(qū)域在此處分別稱為“CspA”、“cspA基因”和“cspA啟動子”。在天然的cspA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)中，分別地，主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)位于核苷酸426，SD序列(核糖體結(jié)合序列)位于核苷酸609至核苷酸611，CspA的起始密碼子位于核苷酸621至核苷酸623，且CspA的終止密碼子位于核苷酸832至核苷酸834，在GeneBank基因數(shù)據(jù)庫中在目錄號M30139下登記了所述天然的CspA基因，且該基因是可公開獲得的。另外，序列中的從核苷酸462至核苷620的部分編碼5′UTR。以WO 99/27117中描述的一個例子來例示部分修飾的5′UTR。用于實(shí)施例中的載體pCold08NC2包含的5′-UTR區(qū)是其實(shí)例。該核苷酸序列示于SEQ ID NO2。
可將和存在于16S核糖體RNA中的反下游框序列高度互補(bǔ)的核苷酸序列(下游框序列)整合入載體以增加目的基因的表達(dá)效率。存在于編碼大腸桿菌CspA的N-末端部分的區(qū)域的下游框序列和上述反下游框序列只有67％的互補(bǔ)性。使用具有比上面核苷酸序列更高(優(yōu)選地80％或更高，更優(yōu)選地100％(理想地DB序列))的互補(bǔ)性的核苷酸序列可使連接在下游的基因的表達(dá)具有更高的效率。
此外，可將編碼標(biāo)記序列的核苷酸序列或編碼蛋白酶識別氨基酸序列的核苷酸序列整合入載體，所述標(biāo)記序列是用于促進(jìn)表達(dá)的目的基因產(chǎn)物的純化的肽，而所述蛋白酶識別氨基酸序列被用以除去目的基因產(chǎn)物中的額外肽(例如，標(biāo)記序列)。
可將由幾個組氨酸殘基組成的組氨酸標(biāo)記(His標(biāo)記)、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等用作用于純化的標(biāo)記序列。使用螯合柱可容易地純化附著有組氨酸標(biāo)記的多肽。對于其他標(biāo)記序列，也可通過使用具有特異性親和力的配體方便地進(jìn)行純化。因子Xa、凝血酶、腸激酶等可用作被用于除去額外肽的蛋白酶?？蓪⒕幋a用這些蛋白酶特異性切割的氨基酸序列的核苷酸序列整合入載體。
(2)陪伴分子表達(dá)的增強(qiáng)用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法的特征在于在編碼目的多肽的基因表達(dá)后，增強(qiáng)編碼陪伴分子的基因的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明，可將任何蛋白用作陪伴分子，只要其是參與蛋白的折疊的蛋白。其實(shí)例包括來源于大腸桿菌的DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES和觸發(fā)因子。
盡管不想限定本發(fā)明，但為使用冷激載體來進(jìn)行多肽的表達(dá)，優(yōu)選地使用在多肽中的脯氨酸上參與異構(gòu)化的蛋白，例如觸發(fā)因子(也稱為肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶(PPI酶))。陪伴分子不限定于來源于大腸桿菌的陪伴分子。例如，可使用來源于古細(xì)菌、酵母、微生物或嗜冷生物的陪伴分子。
可通過誘導(dǎo)染色體上的編碼陪伴分子的基因表達(dá)，或通過已知技術(shù)，例如染色體上陪伴分子基因的修飾(拷貝數(shù)的增加或啟動子的插入)，通過將陪伴分子基因轉(zhuǎn)入宿主，或通過宿主的誘變獲得高度表達(dá)陪伴分子基因的品系來實(shí)現(xiàn)陪伴分子基因表達(dá)的增強(qiáng)。
例如，如果已知宿主中誘導(dǎo)陪伴分子表達(dá)的條件，那么可使用所述條件誘導(dǎo)染色體上的陪伴分子基因的表達(dá)?？墒褂美猛粗亟M的定點(diǎn)誘變或基因插入技術(shù)對宿主染色體進(jìn)行染色體上的陪伴分子基因的修飾。例如，可使用這樣的誘導(dǎo)型啟動子來誘導(dǎo)表達(dá)，所述啟動子已被插入至在宿主染色體上被誘導(dǎo)的編碼陪伴分子的基因的上游。
在另一個實(shí)施方案中，獲得這樣的用于表達(dá)多肽的宿主的突變品系并將其用作宿主，在所述突變品系中，陪伴分子基因的表達(dá)得到增強(qiáng)。根據(jù)已知的方法，例如通過用誘變劑例如試劑或紫外光處理宿主微生物，然后選擇其中陪伴分子基因的表達(dá)被增強(qiáng)的品系來獲得突變品系。
編碼陪伴分子的基因的表達(dá)的增強(qiáng)是指和正常量相比，宿主中的陪伴分子蛋白的量增加。證實(shí)按照上述方法是否增強(qiáng)了陪伴分子基因的表達(dá)是可能的，例如，通過使用識別陪伴分子的抗體測量陪伴分子蛋白，或通過使用已知的方法(例如，RT-PCR方法、Northern雜交或使用DNA陣列的雜交法)來測量從編碼陪伴分子的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量。
可獨(dú)立地控制陪伴分子的表達(dá)和目的蛋白的表達(dá)是有利的，從而可最優(yōu)化陪伴分子表達(dá)的量和表達(dá)的時間選擇而不降低目的蛋白的表達(dá)水平。為實(shí)現(xiàn)該目的，優(yōu)選地將陪伴分子基因置于可控制的啟動子的下游。此外，優(yōu)選地用于陪伴分子表達(dá)的可控啟動子和用于目的蛋白表達(dá)的啟動子不同。
可通過將陪伴分子基因插入載體并將其轉(zhuǎn)入宿主來增強(qiáng)陪伴分子基因的表達(dá)。所述載體可以是常用載體(例如，質(zhì)粒、噬菌體或病毒載體)中的任一種，只要其可用于達(dá)到作為載體的目的。
通常，兩種緊密相關(guān)的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于單個宿主中。該現(xiàn)象稱為不相容性。根據(jù)本發(fā)明，如果將質(zhì)粒用作包含陪伴分子基因的載體(在下文中也稱作陪伴分子質(zhì)粒)，那么優(yōu)選地使用具有這樣的復(fù)制子的載體，該載體未表現(xiàn)出和用于目的蛋白的表達(dá)載體的不相容性。例如，如果將一個具有ColE1復(fù)制子(例如，WO 99/27117中描述的pCold07)的載體用作目的蛋白的表達(dá)載體，那么可將載體pACYC中的p15A復(fù)制子等用于陪伴分子質(zhì)粒。
根據(jù)本發(fā)明，可進(jìn)一步任選地包含選擇標(biāo)記基因，從而可在用含有陪伴分子基因的載體轉(zhuǎn)化后，容易地進(jìn)行選擇。這些選擇標(biāo)記基因包括氨芐青霉素抗性(Ampr)基因、卡那霉素抗性(Kmr)基因和氯霉素抗性(Cmr)基因。和外源蛋白的表達(dá)載體中包含的選擇標(biāo)記基因不同是想要的。
根據(jù)本發(fā)明使用的陪伴分子質(zhì)粒的具體實(shí)例包括表達(dá)DnaK/DnaJ/GrpE和GroEL/GroES的質(zhì)粒pG-KJE8、表達(dá)GroEL/GroES的質(zhì)粒Gro7、表達(dá)DnaK/DnaJ/GrpE的質(zhì)粒pKJE7、表達(dá)GroEL/GroES和觸發(fā)因子的質(zhì)粒pG-Tf2，以及表達(dá)觸發(fā)因子的質(zhì)粒pTf16(所有質(zhì)粒都來自Takara Bio)。
可使用上述載體將編碼陪伴分子的基因轉(zhuǎn)入宿主，或可將其整合入宿主染色體上來使用。
根據(jù)本發(fā)明，要表達(dá)的外源蛋白可以是任何蛋白，只要其在宿主中是不穩(wěn)定的和/或不溶的。這些外源蛋白包括干擾素、白細(xì)胞介素、白細(xì)胞介素受體、白細(xì)胞介素受體的拮抗劑、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、白血病抑制因子、干細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子、生長激素、胰島素原、胰島素樣生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、肝細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生因子、神經(jīng)生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、尿激酶原、組織纖溶酶原激活物、凝血因子、C蛋白、葡糖腦苷脂酶、超氧物歧化酶、腎素、溶菌酶、P450、凝乳酶原、胰蛋白酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑、脂皮質(zhì)蛋白、苗條蛋白、免疫球蛋白、單鏈抗體、補(bǔ)體成分、血液清蛋白、雪松花粉抗原、低氧誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白、蛋白激酶、原癌基因產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和構(gòu)成病毒的蛋白。
將本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主并進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。宿主的實(shí)例包括，但不限于，原核生物(例如，細(xì)菌)、酵母、真菌、植物、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。表達(dá)載體的特征必需與所用的宿主相匹配。例如，如果在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)蛋白，則表達(dá)載體優(yōu)選地使用從哺乳動物基因組中分離的啟動子(例如，小鼠金屬硫蛋白啟動子)或分離自在例如細(xì)胞中繁殖的病毒的啟動子(例如，桿狀病毒啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子)。
除其他以外，優(yōu)選地使用原核生物例如大腸桿菌作為宿主。如果將革蘭氏陰性細(xì)菌用作宿主，那么可在細(xì)胞質(zhì)或壁膜間隙表達(dá)蛋白。
對于根據(jù)本發(fā)明將陪伴分子載體和表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主的方法，沒有具體的限定，且可使用各種已知的方法。其實(shí)例包括按照磷酸鈣沉淀法的轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體融合、核注射、用病毒或噬菌體感染。本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主。轉(zhuǎn)入宿主的方法可為一步形式，其中同時轉(zhuǎn)移陪伴分子載體和表達(dá)載體，或?yàn)槎叫问剑渲性谵D(zhuǎn)入陪伴分子載體后再轉(zhuǎn)入表達(dá)載體，或在轉(zhuǎn)入表達(dá)載體后再轉(zhuǎn)入陪伴分子載體。使用對應(yīng)于選擇標(biāo)記基因的藥物可篩選共轉(zhuǎn)化的品系?？赏ㄟ^例如蛋白印跡等證實(shí)外源基因的表達(dá)。
在一個方面，本發(fā)明涉及一套用于表達(dá)多肽的載體，其包含上述冷激載體和含有陪伴分子基因的載體的組合。在該方面，優(yōu)選地使用可插入編碼多肽的基因的載體作為冷激載體，該基因的表達(dá)對于目的的實(shí)現(xiàn)是想要的。其實(shí)例包括具有(a)這樣的DNA和(b)這樣的限制性內(nèi)切酶識別序列的載體，所述DNA編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)，而所述識別序列可用于插入編碼想要的多肽的基因且位于(a)的DNA的下游。
在另一個方面，本發(fā)明涉及這樣的載體，在該載體中，編碼陪伴分子的基因被插入至冷激載體。在該情況下，可通過用單個載體轉(zhuǎn)化宿主來制備可用于表達(dá)目的多肽的轉(zhuǎn)化體。
在該方面，可在這樣的位置上安排可用于插入編碼目的多肽的基因的限制性內(nèi)切酶識別序列，在所述位置，將編碼陪伴分子的基因框內(nèi)地連接至編碼目的多肽的基因，從而就可表達(dá)陪伴分子和目的多肽的融合蛋白。在陪伴分子和目的多肽的融合蛋白中，可將陪伴分子連接在目的多肽的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或兩側(cè)。融合蛋白可具有在陪伴分子和目的多肽之間的作為接頭的氨基酸或肽。接頭的鏈長度優(yōu)選地為1至50個氨基酸，更優(yōu)選地3至40個氨基酸，最優(yōu)選地5至30個氨基酸。接頭的氨基酸序列可以是蛋白酶識別序列或這樣的序列，在該序列中插入了安排的多個蛋白酶識別序列。這些蛋白酶識別序列的實(shí)例包括各種蛋白酶例如因子Xa、凝血酶、腸激酶(所有酶都可從Takara Bio獲得)和PreScission蛋白酶(Amersham Biosciences)的識別序列。例如，蛋白酶識別序列優(yōu)選地是由4至8個氨基酸組成的序列。
可通過將編碼目的多肽的基因插入上述載體并將其轉(zhuǎn)入合適的宿主來獲得目的多肽和陪伴分子的融合多肽。如果融合多肽具有包含蛋白酶的識別序列的接頭，那么通過用蛋白酶消化所述多肽可能獲得已和陪伴分子分離的目的多肽。
(3)生產(chǎn)多肽的方法按照例如下列步驟進(jìn)行生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法。
將編碼目的多肽的基因插入這樣的DNA的下游，所述DNA編碼來源于冷激載體中的冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)。將如上所述構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入合適的宿主以制備轉(zhuǎn)化體。
如果以組合的方式使用包含上述編碼陪伴分子的基因的載體，那么再將所述載體轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化體。如果冷激載體具有編碼陪伴分子的基因，那么可單獨(dú)地用載體轉(zhuǎn)化宿主。
在正常條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。例如，在大腸桿菌的情況下，可在大約37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。可在所有培養(yǎng)步驟中在宿主中表達(dá)陪伴分子，或可在目的多肽表達(dá)的時候誘導(dǎo)表達(dá)。依賴于宿主中陪伴分子基因存在的狀態(tài)，可誘導(dǎo)陪伴分子基因的表達(dá)。例如，如果要誘導(dǎo)宿主內(nèi)固有的陪伴分子基因的表達(dá)，則可將宿主置于合適的條件下。如果編碼陪伴分子的基因在異源啟動子的控制下(例如，在將被插入載體的陪位分子基因轉(zhuǎn)入宿主的情況下)，則使用適合于控制轉(zhuǎn)錄的啟動子的方法進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。如果使用這樣的宿主，那么上述誘導(dǎo)方法是不必需的，在所述宿主中，陪伴分子基因的表達(dá)被恒定地增強(qiáng)。
通常在上述的一般培養(yǎng)溫度下增加細(xì)胞數(shù)目后誘導(dǎo)目的多肽的表達(dá)。通過從上述狀態(tài)降低培養(yǎng)溫度來在宿主中誘導(dǎo)冷激反應(yīng)，從而導(dǎo)致目的多肽的優(yōu)選的表達(dá)。盡管不想限定本發(fā)明，但通過將培養(yǎng)溫度下調(diào)至低于一般培養(yǎng)溫度的溫度，例如下調(diào)5℃或更多，優(yōu)選地10℃或更多，來誘導(dǎo)冷激反應(yīng)。如果使用具有置于啟動子的下游的操縱基因的冷激載體，那么可通過使用合適的方法消除操縱基因的功能來誘導(dǎo)啟動子。
在冷激后，繼續(xù)在低溫下進(jìn)一步培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以表達(dá)多肽。目的多肽可通過從所獲得的培養(yǎng)物中收集所述多肽來進(jìn)行生產(chǎn)。可從轉(zhuǎn)化體細(xì)胞純化培養(yǎng)物中的多肽，所述轉(zhuǎn)化體細(xì)胞是從培養(yǎng)物或培養(yǎng)物上清液或兩者中收集的?？墒褂靡阎牡鞍准兓夹g(shù)(例如硫酸銨分級分離、超濾和各種層析)的組合進(jìn)行多肽的純化。
可通過設(shè)計(jì)以這樣的形式存在的表達(dá)多肽來促進(jìn)純化，該形式的多肽通過合適的配體結(jié)合至載體。例如，這樣設(shè)計(jì)載體，從而使大約6個組氨酸殘基的標(biāo)記附著在多肽的N-末端側(cè)。然后，可將所得的融合多肽通過組氨酸殘基結(jié)合至金屬(例如，鎳)螯合物載體。使用這樣的載體可容易地將表達(dá)的多肽和來源于宿主的蛋白分離?？赏ㄟ^用蛋白酶在接頭處切割結(jié)合至載體的表達(dá)的多肽而容易地只將目的多肽從載體上釋放出來。當(dāng)使用咪唑洗脫而不用切割時，很自然地可能從載體釋放表達(dá)的多肽。除了上述的組氨酸標(biāo)記外，可能應(yīng)用這樣的方法，在所述方法中使用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶或其部分作為標(biāo)記和使用谷胱甘肽樹脂(glutathione resin)來進(jìn)行親和層析，可能應(yīng)用這樣的方法，在該方法中使用麥芽糖結(jié)合蛋白或其部分作為標(biāo)記和使用麥芽糖樹脂來進(jìn)行純化等。
此外，可使用對抗體的親和力。可設(shè)計(jì)用于純化的標(biāo)記，以使之位于表達(dá)的蛋白的N-末端側(cè)或C-末端側(cè)。本領(lǐng)域技術(shù)人員一般認(rèn)可基因工程技術(shù)和親和純化法。
因?yàn)槌四康亩嚯耐獾亩嚯牡谋磉_(dá)在這樣的系統(tǒng)(在該系統(tǒng)中，使用上述冷激載體表達(dá)多肽)中受到抑制，所以本發(fā)明的方法對于生產(chǎn)高純度的多肽是有利的。
實(shí)施例下列實(shí)施例更詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明，但并不被解釋為限定其范圍。
在上述方法中，如J.Sambrook等人(編著.)，Molecular CloningA Laboratory Manual第3版，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)中所述進(jìn)行包括質(zhì)粒的制備和限制性內(nèi)切酶消化的基本方法。
實(shí)施例1通過和陪伴分子共表達(dá)的hDi-ASI的表達(dá)的檢查(1)表達(dá)載體的構(gòu)建為表達(dá)由人Dicer的PAZ+RNA酶III結(jié)構(gòu)域(來自人Dicer的氨基酸序列的N末端的第679至第1924)組成的多肽，如下構(gòu)建表達(dá)載體。
首先，使用DNA合成儀基于可公開獲得的Genbank目錄號AB028449下的核苷酸序列合成合成的引物5和6(SEQ ID NOS4和5)，并按照常規(guī)方法進(jìn)行純化。合成的引物5是這樣的合成的DNA，該DNA在核苷酸9至核苷酸14上具有限制性內(nèi)切酶KpnI的識別序列，且在核苷酸16至核苷酸36上具有對應(yīng)于人Dicer的氨基酸序列(SEQ ID NO3)中的氨基酸679至氨基酸685的核苷酸序列。合成的引物6在核苷酸9至核苷酸14上具有限制性內(nèi)切酶HindIII的識別序列，且在核苷酸18至核苷酸35上具有對應(yīng)于人Dicer的氨基酸序列(SEQ ID NO3)中的氨基酸1919至氨基酸1924的核苷酸序列。
使用合成的引物進(jìn)行PCR。PCR的反應(yīng)條件如下。
簡而言之，通過加入2μl模板DNA(人cDNA文庫、人胰腺，Takara Bio)、5μl 10×LA PCR緩沖液(Takara Bio)、5μldNTP混合物(Takara Bio)、10pmol合成的引物5、10pmol合成的引物6、0.5U Takara LA Taq(Takara Bio)和無菌水制備50μl總體積的反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于TaKaRa PCR熱循環(huán)儀(Thermal Cycler)SP(Takara Bio)中并進(jìn)行如下的反應(yīng)30個循環(huán)94℃進(jìn)行1分鐘，55℃進(jìn)行1分鐘和72℃進(jìn)行3分鐘。
反應(yīng)后，將5μl反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。并從電泳凝膠中回收和純化觀察到的大約2.7-kbp的目的DNA片段，并將該片段進(jìn)行乙醇沉淀。在乙醇沉淀后，將回收的DNA重懸浮于5μl無菌水中，并用限制性內(nèi)切酶KpnI(Takara Bio)和限制性內(nèi)切酶HindIII(Takara Bio)對其進(jìn)行雙重消化。在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳后提取和純化KpnI-HindIII消化物以獲得KpnI-HindIII消化的DNA片段。
然后，按照WO99/27117的描述，使用大腸桿菌JM109/pMM047(FERM BP-6523)(于1997年10月31日(原始保藏日期)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Science andTechnology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本)攜帶的質(zhì)粒pMM047作為原材料構(gòu)建pCold08NC2。質(zhì)粒pCold08NC2以從上游至下游的順序具有下列cspA啟動子、lac操縱基因、經(jīng)修飾的來源于大腸桿菌cspA基因的5′-UTR和多克隆位點(diǎn)。此外，所述質(zhì)粒具有l(wèi)acI基因、與大腸桿菌16S核糖體RNA中的反下游框序列完全互補(bǔ)的下游框序列、由6個組氨酸殘基組成的組氨酸標(biāo)記和編碼由因子Xa識別的氨基酸序列的核苷酸序列。載體pCold08NC2中的5′-UTR區(qū)的核苷酸序列示于SEQ ID NO2。
用與在制備KpnI-HindIII消化的DNA片段時使用的限制性內(nèi)切酶相同的限制性內(nèi)切酶切割載體pCold08NC2，并對末端去磷酸化。將所制備的載體和KpnI-HindIII消化的DNA片段混合在一起并使用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將其相互連接。使用20μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為50μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。
通過測序證實(shí)具有插入的目的DNA片段的質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒稱為pCold08 hDi-ASI。該質(zhì)粒被稱為和表示為質(zhì)粒pCold08 hDi-ASI，且自2003年9月26日(原始保藏日期)以來，其一直以保藏號FERMBP-10076保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本。pCold08 hDi-ASI是包含這樣的核苷酸序列的質(zhì)粒，該序列編碼人Dicer的氨基酸序列(SEQ ID NO3)中的氨基酸679至氨基酸1924的氨基酸序列(SEQ ID NO6的核苷酸序列，SEQ ID NO7的氨基酸序列)。從質(zhì)粒表達(dá)的蛋白具有完美的(Perfect)DB序列、His標(biāo)記序列和因子Xa序列。所述蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO8，且核苷酸序列示于SEQ ID NO9。
(2)共轉(zhuǎn)化體(co-transformant)的制備按照氯化鈣法用1ng上述質(zhì)粒pCold08/hDi-ASI和1ng陪伴分子質(zhì)粒pGro7(其表達(dá)GroEL和GroES)、pKJE7(其表達(dá)DnaK、DnaJ和GrpE)、pG-Tf2(其表達(dá)GroEL、GroES和觸發(fā)因子)或pTF16(其表達(dá)觸發(fā)因子)(全部來自Takara Bio)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。
通過使用含有濃度分別為20μg/ml和100μg/ml的氯霉素和氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選以獲得含有pCold08/hDi-ASI和pGro7、pKJE7、pG-Tf2或pTF16的共轉(zhuǎn)化體。所獲得的共表達(dá)hDi-ASI和其中一種陪伴分子的克隆被稱為T1、T2、T3和T4。
通過用pCold08/hDi-ASI單獨(dú)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(Novagen)和使用含有濃度為100ug/ml的氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選來制備作為對照的轉(zhuǎn)化體。把無陪伴分子轉(zhuǎn)移的常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)的克隆稱為C1。
(3)hDi-ASI的表達(dá)使用(1)中獲得的各自轉(zhuǎn)化體檢查hDi-ASI的表達(dá)。使用5ml LB液體培養(yǎng)基(包含1％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、20μg/ml氯霉素、50μg/ml氨芐青霉素)進(jìn)行培養(yǎng)。使用無氯霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照的C1。
在37℃下培養(yǎng)各自轉(zhuǎn)化體。在培養(yǎng)開始后，通過向培養(yǎng)基以0.5mg/ml(對于T1、T2或T4)的終濃度添加L-阿拉伯糖或以5ng/ml(對于T3)的終濃度添加四環(huán)素來誘導(dǎo)陪伴分子的表達(dá)。當(dāng)濁度(OD600)達(dá)到大約0.4時，在15℃下培養(yǎng)15分鐘，以0.5mM的終濃度向培養(yǎng)物中加入IPTG，并在15℃下進(jìn)一步培養(yǎng)24小時以誘導(dǎo)hDi-ASI的表達(dá)。
在誘導(dǎo)hDi-ASI的表達(dá)24小時后，收集細(xì)胞。通過超聲處理破裂細(xì)胞以制備細(xì)胞提取物級分。然后，通過在15,000×g下離心將可溶性級分與不溶性級分分離。將各對應(yīng)于大約3.75×106個細(xì)胞的各自級分的部分進(jìn)行SDS-PAGE。通過CBB染色(A)和使用抗-His標(biāo)記抗體的蛋白印跡(Qiagen)(B)分析的結(jié)果顯示于圖1中。
如圖1中所示，在作為常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)對照的C1的細(xì)胞提取物級分中觀察到具有144000的分子量的目的蛋白，但在可溶性級分中幾乎沒有觀察到該蛋白。另一方面，如在T4中所見到的，在hDi-ASI和觸發(fā)因子共表達(dá)的情況下，當(dāng)和對照比較時，觀察到細(xì)胞提取物級分中hDi-ASI的增加。所述蛋白主要在可溶性級分中被檢測到。在T1、T2或T3的情況下(其中hDi-ASI和另一種陪伴分子共表達(dá))在可溶性級分中幾乎沒有觀察到該蛋白。
如上所述，表明和無陪伴分子轉(zhuǎn)移的常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)，或者和表達(dá)GroEL和GroES；Dnak、DnaJ和GrpE；或GroEL、GroES和觸發(fā)因子的陪伴分子的共表達(dá)相比，和觸發(fā)因子的共表達(dá)在增加hDi-ASI的表達(dá)水平和溶解性上是有效的。
(4)表達(dá)和純化用上面(2)中制備的pTf16和pCold08 hDi-ASI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為50μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長。將生長的菌落接種至兩個備含有500ml TB液體培養(yǎng)基(6g細(xì)菌用胰蛋白胨、12g細(xì)菌用酵母提取物、2ml甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4、25mg氨芐青霉素)的容器中。接種后，以0.5mg/ml的終濃度向其中加入阿拉伯糖。將細(xì)胞在37℃、130rpm下進(jìn)行培養(yǎng)直至對數(shù)生長期，然后冷卻至15℃。冷卻后，以1.0mM的終濃度向其中加入IPTG，并在15℃、130rpm下培養(yǎng)細(xì)胞24小時以進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。然后通過離心收集細(xì)胞，以獲得3.3g濕細(xì)胞。將3.3g濕細(xì)胞重懸浮于13.16ml結(jié)合緩沖液(50mMTris鹽酸緩沖液(pH8.5)、100mM氯化鈉、1mM氯化鎂、蛋白酶抑制劑(完全的，不含EDTA的，Boehringer Mannheim))中。將通過超聲處理破裂的細(xì)胞進(jìn)行離心(12,000rpm，20分鐘)以將上清液提取物和沉淀分離。
如下使用鎳柱進(jìn)一步純化大約13ml上清液提取物。
簡而言之，將對應(yīng)于10ml樹脂體積的Ni-NTA瓊脂(Qiagen)注入50-mm的柱中并用30ml蒸餾水洗滌。然后用100ml結(jié)合緩沖液洗滌樹脂并進(jìn)行收集。向其中加入大約13ml從細(xì)胞破裂溶液制備的上清液并使用旋轉(zhuǎn)搖蕩器在4℃下輕輕混合大約1小時。將其中已吸附目的蛋白的樹脂注入50-mm的柱子中并用50ml結(jié)合緩沖液洗滌2次。然后用50ml的緩沖液A(20mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)、100mM氯化鈉、1mM氯化鎂、10％甘油、20mM咪唑)、50ml緩沖液B(20mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)、800mM氯化鈉、1mM氯化鎂、10％甘油、20mM咪唑)和50ml緩沖液A洗滌樹脂以除去除了目的蛋白外的不必要的蛋白。
洗滌后，用30ml緩沖液C(20mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)、100mM氯化鈉、1mM氯化鎂、10％甘油、100mM咪唑)進(jìn)行洗脫。使用Centricon YM-10(Amicon)濃縮洗脫的樣品，向其中加入10ml緩沖液D(50mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)、250mM氯化鈉、1mM氯化鎂、0.1mM DTT、0.1％Triton X-100、10％甘油)，并濃縮該混合物。重復(fù)該程序兩次。將濃縮物對500ml緩沖液E(50mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)、250mM氯化鈉、1mM氯化鎂、0.1mM DTT、0.1％Triton X-100、50％甘油)進(jìn)行透析以獲得大約220μl蛋白樣品。當(dāng)將其部分在10％SDS聚丙烯酰胺上進(jìn)行電泳時，在對應(yīng)于分子量大約為144,000的位置上觀察到目的蛋白的條帶。將該樣品用于下面的活性確定。
(5)dsRNA降解活性的測量如下測量上述(4)中制備的蛋白樣品的dsRNA降解活性。
首先，使用TurboScript T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(GTS)按照附帶的方案合成作為用于活性測量的底物的dsRNA。
具體地，通過將來自質(zhì)粒pQBI1125(Wako Pure ChemicalIndustries)的編碼紅移綠色熒光蛋白(在下文中稱為GFP)的基因(SEQ ID NO10)插入質(zhì)粒pDON-AI(Takara Bio)來構(gòu)建pDON-rsGFP。使用pDON-rsGFP作為模板和使用合成的引物3(SEQ IDNO11)(其具有T7啟動子序列)和合成的引物4(SEQ ID NO12)進(jìn)行PCR以獲得獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。使用所得的雙鏈DNA作為模板和使用T7RNA聚合酶通過RNA合成反應(yīng)制備大約700bp的dsRNA。通過加入1μg上面制備的dsRNA、1μl上面(3)中制備的蛋白樣品、2μl 5x反應(yīng)緩沖液(100mM tris鹽酸緩沖液(pH8.5)、750mM氯化鈉、12.5mM氯化鎂)和不含核酸酶的水制備總體積10μl的反應(yīng)混合物。在37℃下反應(yīng)混合物反應(yīng)18小時后，將10μl所述反應(yīng)混合物在15％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳。電泳后，用溴化乙錠對凝膠染色以觀察切割的產(chǎn)物。結(jié)果，觀察到大約21個堿基對的降解產(chǎn)物，從而表明其dsRNA降解活性。
如上所述，表明具有dsRNA降解活性的蛋白按照本發(fā)明的方法進(jìn)行表達(dá)。
實(shí)施例2逆轉(zhuǎn)錄酶α和逆轉(zhuǎn)錄酶β的表達(dá)的檢查如下相互比較單獨(dú)的目的蛋白的表達(dá)、目的蛋白和觸發(fā)因子的共表達(dá)以及目的蛋白和觸發(fā)因子的融合蛋白的表達(dá)。使用兩種表達(dá)系統(tǒng)(即，其中使用冷激載體的系統(tǒng)(冷激表達(dá)系統(tǒng))和其中使用T7啟動子和T7RNA聚合酶的組合的表達(dá)系統(tǒng)(T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)))來進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)。
(1)質(zhì)粒載體的構(gòu)建使用DNA合成儀基于大腸桿菌觸發(fā)因子的基因序列(Genbank目錄號NC_000913，位置454357至位置455655)合成合成的引物TFN和TFCP(SEQ ID NOS13和14)，并按照常規(guī)方法對其進(jìn)行純化。
合成的引物TFN是這樣的合成的DNA，該DNA具有編碼來自大腸桿菌觸發(fā)因子的氨基酸序列的N末端的第1至第9個氨基酸的核苷酸序列和在核苷酸4至核苷酸9上的限制性內(nèi)切酶NdeI的識別序列。合成的引物TFCP是這樣的合成的DNA，該DNA具有和編碼來自大腸桿菌觸發(fā)因子的氨基酸序列的C末端的第1至第9個氨基酸的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、和編碼蛋白酶因子Xa的識別序列的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列、限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列、限制性內(nèi)切酶BamHI的識別序列和限制性內(nèi)切酶HindIII的識別序列。從大腸桿菌HB101(Takara Bio)提取作為PCR的模板的基因組DNA。
使用合成的引物和基因組DNA進(jìn)行PCR。PCR的反應(yīng)條件如下。簡而言之，通過加入1μl如上所述制備的模板DNA、10μl 10xPyrobest緩沖液II(Takara Bio)、8μl dNTP混合物(Takara Bio)、100pmol合成的引物TFN、100pmol合成的引物TFCP、2.5U PyrobestDNA聚合酶(Takara Bio)和無菌水來制備總體積為100μl的反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于PCR熱循環(huán)儀SP(Takara Bio)中并進(jìn)行如下的反應(yīng)30個循環(huán)94℃下進(jìn)行30秒，59℃下進(jìn)行30秒和72℃下進(jìn)行2分鐘。
反應(yīng)后，將100μl的反應(yīng)混合物在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從電泳凝膠上回收和純化觀察到的大約1.5kbp的目的DNA片段，將其進(jìn)行乙醇沉淀。乙醇沉淀后，將回收的DNA懸浮于15μl無菌水中，并用限制性內(nèi)切酶NdeI(Takara Bio)和限制性內(nèi)切酶HindIII(Takara Bio)進(jìn)行雙重消化。在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后提取和純化NdeI-HindIII消化物以獲得NdeI-HindIII消化的DNA片段。
然后，用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII雙重消化質(zhì)粒載體pColdII(Takara Bio)，并對末端去磷酸化。將所制備的載體和NdeI-HindIII消化的DNA片段混合在一起并使用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將其相互連接。使用10μl的連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。通過測序證實(shí)具有插入的目的DNA片段的質(zhì)粒。隨后，引入沉默突變以消除質(zhì)粒中的觸發(fā)因子基因序列中的限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列(Genbank目錄號NC_000913，位置455107至位置455112)。將所獲得的具有冷激表達(dá)系統(tǒng)和含有大腸桿菌觸發(fā)因子基因序列的重組質(zhì)粒稱為pColdTF。
如下構(gòu)建使用T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白和大腸桿菌觸發(fā)因子的融合蛋白的質(zhì)粒載體。
首先，用限制性內(nèi)切酶EcoRI(Takara Bio)和限制性內(nèi)切酶EcoO109I(Takara Bio)雙重消化pColdTF，并對末端去磷酸化以獲得EcoRI-EcoO109I消化的DNA片段。然后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和限制性內(nèi)切酶EcoO109I雙重消化pCold08NC2，并將其在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。提取和純化EcoRI-EcoO109I消化物，并將其和EcoRI-EcoO109I消化的DNA片段混合并使用DNA連接試劑盒(Takara Bio)進(jìn)行連接。使用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。將所獲得的重組質(zhì)粒(其中已對pColdTF中的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行了修飾)稱為pColdTF-II。
用限制性內(nèi)切酶XbaI(Takara Bio)消化pColdTF-II，用T4DNA聚合酶(Takara Bio)使其成為平末端，然后用限制性內(nèi)切酶NdeI進(jìn)行降解以獲得含有大腸桿菌觸發(fā)因子的基因的NdeI平末端片段。
用限制性內(nèi)切酶BamHI(Takara Bio)降解質(zhì)粒載體pET16b(Novagen)，用T4DNA聚合酶使其成為平末端，然后用限制性內(nèi)切酶NdeI消化，并對末端去磷酸化。將所制備的載體和含有大腸桿菌觸發(fā)因子基因的NdeI平末端DNA片段混合在一起并用DNA連接試劑盒將其相互連接。使用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。將所獲得的具有T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)和含有大腸桿菌觸發(fā)因子基因序列的重組質(zhì)粒稱為pETTF。
(2)表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶α和逆轉(zhuǎn)錄酶β的載體的構(gòu)建基于勞斯相關(guān)病毒2(RAV-2)逆轉(zhuǎn)錄酶α亞基(在下文中稱為RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α)的氨基酸序列(Genbank目錄號BAA22090，從N末端開始的第1至第572個氨基酸)合成具有SEQ ID NO15的序列的雙鏈DNA。按照大腸桿菌的密碼子選擇修飾核苷酸序列而不改變編碼的氨基酸序列，并設(shè)計(jì)該序列以使之在兩端具有限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列和限制性內(nèi)切酶XbaI的識別序列。
基于勞斯相關(guān)病毒2(RAV-2)逆轉(zhuǎn)錄酶β亞基(在下文中稱為RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β)的氨基酸序列(Genbank目錄號BAA22090)合成具有SEQ ID NO16的序列的雙鏈DNA。按照大腸桿菌的密碼子選擇修飾該核苷酸序列而不改變編碼的氨基酸序列，并設(shè)計(jì)該序列以使之在兩端具有限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列和限制性內(nèi)切酶XbaI的識別序列。
用限制性內(nèi)切酶EcoRI(Takara Bio)和XbaI(Takara Bio)雙重消化兩個合成的雙鏈DNA，并將其在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從電泳凝膠上回收和純化觀察到的目的大小的DNA片段以獲得含有編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α的基因的經(jīng)EcoRI-XbaI消化的DNA片段和含有編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的基因的經(jīng)EcoRI-XbaI消化的DNA片段。
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI雙重消化(1)中制備的pColdTF，并對末端去磷酸化。將所制備的載體和兩種EcoRI-XbaI消化的DNA片段中的一種混合在一起并使用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將其相互連接。使用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。把在冷激表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α的融合蛋白和觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的融合蛋白的質(zhì)粒分別稱為pColdTF-α和pColdTF-β。
此外，按照所述用于pColdTF-α和pColdTF-β的方法(除了使用實(shí)施例1中構(gòu)建的pCold08Nc2取代pColdTF外)制備單獨(dú)表達(dá)RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α和單獨(dú)表達(dá)RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的質(zhì)粒。所制備的質(zhì)粒分別稱為pCold08-α和pCold08-β。
如下構(gòu)建在T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α的融合蛋白以及觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的融合蛋白的質(zhì)粒。
用限制性內(nèi)切酶XbaI(Takara Bio)消化pColdTF-α和pColdTF-β，用T4 DNA聚合酶(Takara Bio)使其成為平末端，然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行消化，并將其在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從電泳凝膠上回收和純化觀察到的目的大小的DNA片段，以獲得含有編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α的基因的EcoRI平末端DNA片段和含有編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的基因的EcoRI平末端DNA片段。
用限制性內(nèi)切酶SalI(Takara Bio)消化(1)中制備的pETTF，用T4DNA聚合酶使其成為平末端，然后用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行消化，并對末端去磷酸化。將所制備的載體和兩種EcoRI平末端DNA片段中的一種混合在一起，并使用DNA連接試劑盒將其相互連接。使用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。用于在T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α的融合蛋白和觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的融合蛋白的質(zhì)粒分別稱為pETTF-α和pETTF-β。
(3)轉(zhuǎn)化體的制備按照氯化鈣法使用在冷激表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α的融合蛋白的pColdTF-α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。通過使用含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選來獲得轉(zhuǎn)化體。
也以相似的方式制備用pColdTF-β轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21的轉(zhuǎn)化體，所述pColdTF-β用于在冷激表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的融合蛋白。
也制備用于和上述融合表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較的下列轉(zhuǎn)化體在單一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α或RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的轉(zhuǎn)化體；在共表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α和觸發(fā)因子的轉(zhuǎn)化體；在共表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β和觸發(fā)因子的轉(zhuǎn)化體；在T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α的融合蛋白的轉(zhuǎn)化體；和在T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)觸發(fā)因子和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的融合蛋白的轉(zhuǎn)化體。
按照這樣的制備方法獲得用于在單一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)化體，該方法除了用質(zhì)粒pCold08-α或pCold08-β轉(zhuǎn)化BL21外，和上述的關(guān)于制備用于在冷激表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)化體的方法相似。
如下制備用于在共表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。首先，按照氯化鈣方法使用質(zhì)粒pTf16和質(zhì)粒pCold08-α或pCold08-β轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。通過使用含有濃度分別為100μg/ml和20μg/ml的氯霉素和氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選來獲得含有質(zhì)粒pTf16和pCold08-α或pCold08-β的共轉(zhuǎn)化體。
按照這樣的制備方法獲得用于在T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)化體，該方法除了使用質(zhì)粒pETTF-α或pETTF-β，和將BL21(DE3)(Novagen)進(jìn)行轉(zhuǎn)化外，和上述有關(guān)制備用于在冷激表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)化體的方法相似。
(4)逆轉(zhuǎn)錄酶α和逆轉(zhuǎn)錄酶β的表達(dá)使用(3)中獲得的轉(zhuǎn)化體檢查逆轉(zhuǎn)錄酶α和逆轉(zhuǎn)錄酶β的表達(dá)。使用5ml含有濃度為50μg/ml的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)用于在冷激表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)化體和用于單一表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。使用5ml含有濃度分別為50μg/ml、20μg/ml和0.5mg/ml的氨芐青霉素、氯霉素和阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)用于共表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。在37℃下培養(yǎng)各自的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)濁度(OD600)達(dá)到大約0.4時，在15℃下進(jìn)行培養(yǎng)15分鐘，以1mM的終濃度向培養(yǎng)物中加入IPTG，并在15℃培養(yǎng)24小時以進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。在表達(dá)誘導(dǎo)24小時后，收集細(xì)胞。
使用5ml含有濃度為50μg/ml的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)用于在T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白的轉(zhuǎn)化體。在37℃下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。當(dāng)濁度(OD600)達(dá)到大約0.4時，以1mM的終濃度向培養(yǎng)物中加入IPTG，并在37℃培養(yǎng)3小時以進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。在表達(dá)誘導(dǎo)3小時后，收集細(xì)胞。
在PBS中懸浮細(xì)胞，并通過超聲處理破裂細(xì)胞以制備細(xì)胞提取物級分。然后，通過在15,000×g下離心將可溶性級分和不溶性級分分開。將各對應(yīng)于大約3.75×106個細(xì)胞的各自級分的部分進(jìn)行SDS-PAGE。通過CBB染色分析的結(jié)果顯示于圖2。
如圖2中所示，在使用pCold08-α或pCold08-β的目的蛋白的單一表達(dá)情況(A)和使用pCold08-α和pTf16、或pCold08-β和pTf16的目的蛋白和觸發(fā)因子的共表達(dá)的情況(B)下，在細(xì)胞提取物級分中觀察到分別對應(yīng)于RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α和RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β的分子量63,000Da和98,000Da的表達(dá)產(chǎn)物，但在可溶性級分中幾乎未觀察到該表達(dá)產(chǎn)物。在使用pETTF-α或pETTF-β的目的蛋白和觸發(fā)因子的融合蛋白在T7啟動子表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的情況(C)下，在不溶性級分中檢測到大部分在細(xì)胞提取物級分中檢測到的目的蛋白。另一方面，在使用pColdTF-α或pColdTF-β的目的蛋白和觸發(fā)因子的融合表達(dá)的情況(D)下，在可溶性級分中檢測到大部分在細(xì)胞提取物級分中檢測到的目的蛋白。
實(shí)施例3DNA酶的表達(dá)(1)表達(dá)DNA酶的載體的構(gòu)建使用pCold08-End1(FERM BP-10313)(2005年2月16日(原始保藏日期)保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki305-8566，日本)作為單獨(dú)表達(dá)DNA酶的質(zhì)粒。該質(zhì)粒包含編碼由254個氨基酸殘基組成的DNA酶的核苷酸序列，且這樣構(gòu)建所述質(zhì)粒，從而使其表達(dá)這樣的271個氨基酸殘基的融合蛋白，在該融合蛋白中，給DNA酶加上了His標(biāo)記、因子Xa的識別序列和接頭序列。
如下構(gòu)建用于表達(dá)觸發(fā)因子和DNA酶的融合蛋白的質(zhì)粒。
首先，使用DNA合成儀基于pCold08-End1的核苷酸序列合成合成的引物NUCN和NUCC(SEQ ID NOS17和18)，并按照常規(guī)方法純化所述引物。合成的引物NUCN是這樣的合成的DNA，該DNA具有編碼來自DNA酶N末端的第1至第7個氨基酸的核苷酸序列和在核苷酸4至核苷酸9上的限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列。合成的引物NUCC是這樣的合成的DNA，該DNA具有和編碼來自DNA酶的N末端的第247至第254個氨基酸的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列以及在核苷酸4至核苷酸9上的限制性內(nèi)切酶BamHI的識別序列。
使用合成的引物進(jìn)行PCR。PCR的反應(yīng)條件如下。簡而言之，通過加入1μl模板DNA(pCold08-End1)、10μl 10x Pyrobest緩沖液II(Takara Bio)、8μl dNTP混合物(Takara Bio)、100pmol合成的引物NUCN、100pmol合成的引物NUCC、2.5U Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)和無菌水來制備總體積100μl的反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于PCR熱循環(huán)儀SP(Takara Bio)中并如下進(jìn)行反應(yīng)30個循環(huán)94℃進(jìn)行30秒，58℃進(jìn)行30秒和72℃進(jìn)行1分鐘。
反應(yīng)后，將100μl反應(yīng)混合物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從電泳凝膠上回收和純化觀察到的大約0.8kbp的目的DNA片段并將其進(jìn)行乙醇沉淀。在乙醇沉淀后，將回收的DNA懸浮于15μl無菌水中，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI(Takara Bio)和限制性內(nèi)切酶BamHI(Takara Bio)進(jìn)行雙重消化。在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后，提取和純化EcoRI-BamHI消化物以獲得EcoRI-BamHI消化的DNA片段。
然后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙重消化實(shí)施例2(2)中制備的pColdTF，并對末端去磷酸化。將所制備的載體和兩種EcoRI-BamHI消化的DNA片段中的一種混合在一起并使用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將其相互連接。使用10μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。制備具有插入的目的DNA片段的質(zhì)粒。將用于表達(dá)觸發(fā)因子和DNA酶的融合蛋白的質(zhì)粒稱作pColdTF-End1。
(2)轉(zhuǎn)化體的制備按照氯化鈣法使用表達(dá)觸發(fā)因子和DNA酶的融合蛋白的pColdTF-End1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。通過使用含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選來獲得轉(zhuǎn)化體。
也制備用于和融合表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較的用于在單一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)DNA酶的轉(zhuǎn)化體和用于在共表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)DNA酶和觸發(fā)因子的轉(zhuǎn)化體。
按照這樣的制備方法獲得在單一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)化體，該方法除了用質(zhì)粒pCold08-End1轉(zhuǎn)化BL21外，和上述轉(zhuǎn)化體的制備方法相似。
如下制備在共表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。首先，按照氯化鈣法，使用質(zhì)粒pCold08-End1和質(zhì)粒pTf16轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。通過使用含有濃度分別為100μg/ml和20μg/ml的氯霉素和氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選來獲得含有質(zhì)粒pCold08-End1和pTf16的共轉(zhuǎn)化體。
(3)DNA酶的表達(dá)使用(2)中獲得的轉(zhuǎn)化體檢查DNA酶的表達(dá)。使用5ml含有濃度為50μg/ml的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)用于融合表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體和用于單一表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。使用5ml含有濃度分別為50μg/ml、20μg/ml和0.5mg/ml的氨芐青霉素、氯霉素和阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)用于共表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。在37℃下培養(yǎng)各自的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)濁度(OD600)達(dá)到大約0.8時，在15℃下培養(yǎng)15分鐘，以1mM的終濃度向培養(yǎng)物中加入IPTG，并在15℃下培養(yǎng)24小時以進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。在進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)24小時后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于PBS，并通過超聲處理破裂細(xì)胞以制備細(xì)胞提取物級分。然后，通過在15,000×g下離心將可溶性級分和不溶性級分分離。將各對應(yīng)于0.05OD(OD600)的各自級分的部分進(jìn)行SDS-PAGE(5-20％的凝膠)。通過CBB染色的分析結(jié)果顯示于圖3中。
如圖3中所示，在使用pCold08-End1的目的蛋白的單一表達(dá)的情況(A)和使用pCold08-End1和pTf16的目的蛋白和觸發(fā)因子的共表達(dá)的情況(B)下，在對可溶性級分或不溶性級分進(jìn)行CBB染色后，未觀察到對應(yīng)于DNA酶的分子量31,000Da的表達(dá)產(chǎn)物的明顯條帶。在使用pColdTF-End1的DNA酶和觸發(fā)因子的融合表達(dá)的情況(C)下，對于可溶性級分，檢測到對應(yīng)于目的蛋白的條帶。
(4)DNA酶活性的測量測量(3)中制備的融合表達(dá)系統(tǒng)的超聲處理的可溶性級分的DNA酶活性。也獲得作為對照的來自單獨(dú)用載體pColdTF(無整合的插入片段)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的超聲處理的可溶性部分，并在相同的時間測量活性。以和上面(2)和(3)中的方式相似的方式獲得作為對照的超聲處理的可溶性級分，只是除了使用pColdTF外。
使用λ-HindIII消化物(Takara Bio)作為活性測量的底物。通過加入1μgλ-HindIII消化物、對應(yīng)于0.025OD(OD600)的超聲處理的可溶性級分、5μl 10x反應(yīng)緩沖液(400mM tris-鹽酸緩沖液(pH7.5)、100mM氯化鈉、60mM氯化鎂、10mM氯化鈣)和不含核酸酶的水來制備總體積50μl的反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物在20℃下反應(yīng)2小時。將10μl的反應(yīng)混合物在1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以分析切割的產(chǎn)物。結(jié)果顯示于圖4中。
如圖4所示，當(dāng)使用超聲處理的可溶性級分作為對照(泳道1)時，幾乎沒有觀察到底物的降解。另一方面，當(dāng)使用DNA酶和觸發(fā)因子的融合表達(dá)系統(tǒng)的超聲處理的可溶性級分(泳道2)時，底物被降解并觀察到DNA酶的活性。
實(shí)施例4hDi-PAZ的表達(dá)的檢查(1)表達(dá)載體的構(gòu)建為表達(dá)包含人Dicer的PAZ結(jié)構(gòu)域(來自人Dicer的氨基酸序列的N末端的第895至第1064個氨基酸)的多肽(來自人Dicer的氨基酸序列的N末端的第892至第1064個氨基酸；也稱作PAZ)，如下構(gòu)建表達(dá)載體。
首先，使用DNA合成儀基于可公開獲得的在Genbank目錄號AB028449下的核苷酸序列合成合成的引物1和2(SEQ ID NOS19和20)，并按照常規(guī)的方法純化所述引物。合成的引物1是這樣的合成的DNA，該DNA具有在核苷酸9至核苷酸14上的限制性內(nèi)切酶KpnI的識別序列和在核苷酸16至核苷酸36上對應(yīng)于人Dicer的氨基酸序列(SEQ ID NO3)中的氨基酸892至氨基酸898的核苷酸序列。合成的引物2具有在核苷酸9至核苷酸14上的限制性內(nèi)切酶HindIII的識別序列和在核苷酸15至核苷酸36上對應(yīng)于人Dicer的氨基酸序列(SEQ ID NO3)中的氨基酸1058至氨基酸1064的核苷酸序列。
使用所述合成的引物進(jìn)行PCR。使用實(shí)施例1-(2)中制備的pCold08/hDi-ASI作為模板DNA。PCR的反應(yīng)條件如下。
簡而言之，通過加入1ng模板DNA、10μl 10x LA PCR緩沖液(Takara Bio)、8μl dNTP混合物(Takara Bio)、10pmol合成的引物5、10pmol合成的引物6、0.5U的Takara Ex Taq(Takara Bio)和無菌水來制備總體積100μl的反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于TaKaRa PCR熱循環(huán)儀MP(Takara Bio)中并進(jìn)行如下的反應(yīng)30個循環(huán)94℃進(jìn)行30秒、55℃進(jìn)行30秒和72℃進(jìn)行2分鐘。
反應(yīng)后，將95μl反應(yīng)混合物在1.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從電泳凝膠上回收和純化觀察到的大約530bp的目的DNA片段，并將其進(jìn)行乙醇沉淀。乙醇沉淀后，將回收的DNA懸浮于5μl無菌水中，并用限制性內(nèi)切酶KpnI(Takara Bio)和限制性內(nèi)切酶HindIII(Takara Bio)進(jìn)行雙重消化。在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳后，提取和純化KpnI-HindIII消化物以獲得經(jīng)KpnI-HindIII消化的DNA片段。
用與在制備KpnI-HindIII消化的DNA片段時所用的酶相同的限制性內(nèi)切酶切割載體pCold08NC2，并對末端去磷酸化。將所制備的載體和KpnI-HindIII消化的DNA片段混合在一起并用DNA連接試劑盒(Takara Bio)將其相互連接。使用6μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。使轉(zhuǎn)化體在含有濃度為1.5％(w/v)的瓊脂和濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長。
具有插入的目的DNA片段的質(zhì)粒稱作pCold08/hDi-PAZ。pCold08/hDi-PAZ是含有這樣的核苷酸序列的質(zhì)粒，該核苷酸序列編碼來自人Dicer的氨基酸序列(SEQ ID NO3)中的氨基酸892至氨基酸1064的氨基酸序列。從所述質(zhì)粒表達(dá)的蛋白具有完美的DB序列、His標(biāo)記序列和因子Xa序列。
按照這樣的方法制備用于表達(dá)觸發(fā)因子和PAZ的融合蛋白的質(zhì)粒，該方法除了將實(shí)施例2-(1)中制備的pColdTF-II用作載體外，和上述有關(guān)pCold08/hDi-PAZ的制備的方法相似。將所述質(zhì)粒稱為pColdTF/hDi-PAZ。
(2)轉(zhuǎn)化體的制備按照氯化鈣法使用用于表達(dá)觸發(fā)因子和hDi-PAZ的融合蛋白的pColdTF/hDi-PAZ轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。通過使用含有濃度為100μg/ml的氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選來獲得轉(zhuǎn)化體。
也制備用于和融合表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較的用于在單一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)hDi-PAZ的轉(zhuǎn)化體和用于在共表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)hDi-PAZ和觸發(fā)因子的轉(zhuǎn)化體。
按照這樣的制備方法獲得在單一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)化體，該制備方法除了用質(zhì)粒pCold08/hDi-PAZ轉(zhuǎn)化BL21外，和用于在融合表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)化體的制備方法相似。如下制備用于在共表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的轉(zhuǎn)化體。首先，按照氯化鈣法使用質(zhì)粒pCold08/hDi-PAZ和質(zhì)粒pTf16轉(zhuǎn)化大腸桿菌A19。通過使用含有濃度分別為50μg/ml和100μg/ml的氯霉素和氨芐青霉素的平板進(jìn)行篩選來獲得含有質(zhì)粒pCold08/hDi-PAZ和pTf16的共轉(zhuǎn)化體。
(3)hDi-PAZ的表達(dá)使用(2)中獲得的轉(zhuǎn)化體檢查hDi-PAZ的表達(dá)。使用3ml含有濃度為50μg/ml的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)用于融合表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體和用于單一表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。使用3ml含有濃度分別為50μg/ml、20μg/ml和0.5mg/ml的氨芐青霉素、氯霉素和阿拉伯糖的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)用于共表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。在37℃下培養(yǎng)各自的轉(zhuǎn)化體。當(dāng)濁度(OD600)達(dá)到大約0.4時，在15℃下進(jìn)行培養(yǎng)15分鐘，以0.5mM的終濃度向培養(yǎng)物中加入IPTG，并在15℃下進(jìn)行培養(yǎng)24小時以進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)。在進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)24小時后，收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于細(xì)胞破裂溶液(50mM tris-HCl(pH8.5)、100mM NaCl、1mMMgCl2、蛋白酶抑制劑(完全不含EDTA))中并通過超聲處理進(jìn)行破裂以制備細(xì)胞提取物級分。然后，通過在15,000×g下離心將可溶性級分和不溶性級分分離。將各對應(yīng)于大約2.5×106個細(xì)胞的各自級分的部分進(jìn)行SDS-PAGE。通過CBB染色進(jìn)行分析。
結(jié)果，在使用pCold08/hDi-PAZ的目的蛋白的單一表達(dá)和使用pCold08/hDi-PAZ和pTf16的目的蛋白和觸發(fā)因子的共表達(dá)的情況下，在細(xì)胞提取物級分中觀察到對應(yīng)于目的蛋白的分子量24,000Da的表達(dá)產(chǎn)物，但在可溶性級分中幾乎未檢測到該表達(dá)產(chǎn)物。在使用pColdTF/hDi-PAZ進(jìn)行的目的蛋白和觸發(fā)因子的融合表達(dá)的情況下，和對照相比，細(xì)胞提取物級分中的目的蛋白的量增加。大部分在可溶性級分中檢測到。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明的方法，可能產(chǎn)生相當(dāng)大量的具有高純度同時保持其活性的目的多肽。
序列表獨(dú)立文字SEQ ID NO2；編碼大腸桿菌cspA基因的突變的5′-UTR的基因SEQ ID NO4；擴(kuò)增編碼人dicer突變體的基因的合成的引物5SEQ ID NO5；擴(kuò)增編碼人dicer突變體的基因的合成的引物6
SEQ ID NO6；編碼人dicer突變體的基因SEQ ID NO7；人dicer突變體的氨基酸序列SEQ ID NO8；人dicer突變體的氨基酸序列SEQ ID NO9；編碼人dicer突變體的基因SEQ ID NO10；編碼紅移綠色熒光蛋白的基因SEQ ID NO11；擴(kuò)增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成的引物3SEQ ID NO12；擴(kuò)增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成的引物4SEQ ID NO13；擴(kuò)增編碼觸發(fā)因子的基因的合成的引物TFNSEQ ID NO14；擴(kuò)增編碼觸發(fā)因子的基因的合成的引物TFCPSEQ ID NO15；編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α亞基的基因SEQ ID NO16；編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β亞基的基因SEQ ID NO17；擴(kuò)增編碼DNA酶的基因的合成的引物NUCNSEQ ID NO18；擴(kuò)增編碼DNA酶的基因的合成的引物NUCCSEQ ID NO19；擴(kuò)增編碼人dicer PAZ結(jié)構(gòu)域的基因的合成的引物1SEQ ID NO20；擴(kuò)增編碼人dicer PAZ結(jié)構(gòu)域的基因的合成的引物2
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>生產(chǎn)多肽的方法<130>665240<150>JP 2004-152598<151>2004-05-21<150>JP 2005-067984<151>2005-03-14<160>20<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1209<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1aagcttcgat gcaattcacg atcccgcagt gtgatttgag gagttttcaa tggaatataa60agatccaatg catgagctgt tgagcagcct ggaacagatt gtttttaaag atgaaacgca120gaaaattacc ctgacgcaca gaacaacgtc ctgtaccgaa attgagcagt tacgaaaagg180gacaggatta aaaatcgatg atttcgcccg ggttttgggc gtatcagtcg ccatggtaaa240ggaatgggaa tccagacgcg tgaagccttc aagtgccgaa ctaaaattga tgcgtttgat300tcaagccaac ccggcattaa gtaagcagtt gatggaatag acttttatcc actttattgc360tgtttacggt cctgatgaca ggaccgtttt ccaaccgatt aatcataaat atgaaaaata420attgttgcat cacccgccaa tgcgtggctt aatgcacatc aacggtttga cgtacagacc480attaaagcag tgtagtaagg caagtccctt caagagttat cgttgatacc cctcgtagtg540cacattcctt taacgcttca aaatctgtaa agcacgccat atcgccgaaa ggcacactta600
attattaaag gtaatacact atgtccggta aaatgactgg tatcgtaaaa tggttcaacg660ctgacaaagg cttcggcttc atcactcctg acgatggctc taaagatgtg ttcgtacact720tctctgctat ccagaacgat ggttacaaat ctctggacga aggtcagaaa gtgtccttca780ccatcgaaag cggcgctaaa ggcccggcag ctggtaacgt aaccagcctg taatctctgc840ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg atttttttat ttgttttcag900gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg960gtgcaatgag aatgcgcaac gccgtaagta aggcgggaat aatttcccgc cgaagactct1020tactctttca atttgcaggc taaaaacgcc gccagctcat aactctcctg tttaatatgc1080aattcacaca gtgaatctct tatcatccag gtgaaaaata aaagcgtgaa acaaatcact1140attaaagaaa gtaatctata tttctgcgca ttccagctct gtgttgattt cacgagtatg1200tactgcacc1209<210>2<211>143<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>編碼大腸桿菌(Escherichia coli)cspA基因的突變的5’-UTR的基因<400>2aauugugagc ggauaacaau uugaugugcu agcgcauauc caguguagua aggcaagucc60cuucaagagc cuuuaacgcu ucaaaaucug uaaagcacgc cauaucgccg aaaggcacac120uuaauuauua aagguaauac acu143<210>3<211>1924<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)
<400>3Met Lys Ser Pro Ala Leu Gln Pro Leu Ser Met Ala Gly Leu Gln Leu1 5 10 15Met Thr Pro Ala Ser Ser Pro Met Gly Pro Phe Phe Gly Leu Pro Trp20 25 30Gln Gln Glu Ala Ile His Asp Asn Ile Tyr Thr Pro Arg Lys Tyr Gln35 40 45Val Glu Leu Leu Glu Ala Ala Leu Asp His Asn Thr Ile Val Cys Leu50 55 60Asn Thr Gly Ser Gly Lys Thr Phe Ile Ala Ser Thr Thr Leu Leu Lys65 70 75 80Ser Cys Leu Tyr Leu Asp Leu Gly Glu Thr Ser Ala Arg Asn Gly Lys85 90 95Arg Thr Val Phe Leu Val Asn Ser Ala Asn Gln Val Ala Gln Gln Val100 105 110Ser Ala Val Arg Thr His Ser Asp Leu Lys Val Gly Glu Tyr Ser Asn115 120 125Leu Glu Val Asn Ala Ser Trp Thr Lys Glu Arg Trp Asn Gln Glu Phe130 135 140Thr Lys His Gln Val Leu Ile Met Thr Cys Tyr Val Ala Leu Asn Val145 150 155 160Leu Lys Asn Gly Tyr Leu Ser Leu Ser Asp Ile Asn Leu Leu Val Phe165 170 175
Asp Glu Cys His Leu Ala Ile Leu Asp His Pro Tyr Arg Glu Phe Met180 185 190Lys Leu Cys Glu Ile Cys Pro Ser Cys Pro Arg Ile Leu Gly Leu Thr195 200 205Ala Ser Ile Leu Asn Gly Lys Trp Asp Pro Glu Asp Leu Glu Glu Lys210 215 220Phe Gln Lys Leu Glu Lys Ile Leu Lys Ser Asn Ala Glu Thr Ala Thr225 230 235 240Asp Leu Val Val Leu Asp Arg Tyr Thr Ser Gln Pro Cys Glu Ile Val245 250 255Val Asp Cys Gly Pro Phe Thr Asp Arg Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Leu260 265 270Leu Met Glu Leu Glu Glu Ala Leu Asn Phe Ile Asn Asp Cys Asn Ile275 280 285Ser Val His Ser Lys Glu Arg Asp Ser Thr Leu Ile Ser Lys Gln Ile290 295 300Leu Ser Asp Cys Arg Ala Val Leu Val Val Leu Gly Pro Trp Cys Ala305 310 315 320Asp Lys Val Ala Gly Met Met Val Arg Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Lys325 330 335His Glu Gln Glu Glu Leu His Arg Lys Phe Leu Leu Phe Thr Asp Thr340 345 350
Phe Leu Arg Lys Ile His Ala Leu Cys Glu Glu His Phe Ser Pro Ala355 360 365Ser Leu Asp Leu Lys Phe Val Thr Pro Lys Val Ile Lys Leu Leu Glu370 375 380Ile Leu Arg Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Arg His Ser Phe Glu Ser Val385 390 395 400Glu Trp Tyr Asn Asn Arg Asn Gln Asp Asn Tyr Val Ser Trp Ser Asp405 410 415Ser Glu Asp Asp Asp Glu Asp Glu Glu Ile Glu Glu Lys Glu Lys Pro420 425 430Glu Thr Asn Phe Pro Ser Pro Phe Thr Asn Ile Leu Cys Gly Ile Ile435 440 445Phe Val Glu Arg Arg Tyr Thr Ala Val Val Leu Asn Arg Leu Ile Lys450 455 460Glu Ala Gly Lys Gln Asp Pro Glu Leu Ala Tyr Ile Ser Ser Asn Phe465 470 475 480Ile Thr Gly His Gly Ile Gly Lys Asn Gln Pro Arg Asn Asn Thr Met485 490 495Glu Ala Glu Phe Arg Lys Gln Glu Glu Val Leu Arg Lys Phe Arg Ala500 505 510His Glu Thr Asn Leu Leu Ile Ala Thr Ser Ile Val Glu Glu Gly Val515 520 525
Asp Ile Pro Lys Cys Asn Leu Val Val Arg Phe Asp Leu Pro Thr Glu530 535 540Tyr Arg Ser Tyr Val Gln Ser Lys Gly Arg Ala Arg Ala Pro Ile Ser545 550 555 560Asn Tyr Ile Met Leu Ala Asp Thr Asp Lys Ile Lys Ser Phe Glu Glu565 570 575Asp Leu Lys Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Ile Leu Arg Asn Lys Cys580 585 590Ser Lys Ser Val Asp Thr Gly Glu Thr Asp Ile Asp Pro Val Met Asp595 600 605Asp Asp His Val Phe Pro Pro Tyr Val Leu Arg Pro Asp Asp Gly Gly610 615 620Pro Arg Val Thr Ile Asn Thr Ala Ile Gly His Ile Asn Arg Tyr Cys625 630 635 640Ala Arg Leu Pro Ser Asp Pro Phe Thr His Leu Ala Pro Lys Cys Arg645 650 655Thr Arg Glu Leu Pro Asp Gly Thr Phe Tyr Ser Thr Leu Tyr Leu Pro660 665 670Ile Asn Ser Pro Leu Arg Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys675 680 685Val Arg Leu Ala Glu Arg Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu690 695 700
His Lys Ile Gly Glu Leu Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu705 710 715 720Thr Val Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr725 730 735Ser Val Pro Gly Arg Pro Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro740 745 750Lys Ala Ile Pro Glu Cys Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln755 760 765Pro Cys Tyr Leu Tyr Val Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro770 775 780Asp Glu Leu Asn Phe Arg Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr785 790 795 800Thr Arg Cys Phe Gly Ile Leu Thr Ala Lys Pro Ile Pro Gln Ile Pro805 810 815His Phe Pro Val Tyr Thr Arg Ser Gly Glu Val Thr Ile Ser Ile Glu820 825 830Leu Lys Lys Ser Gly Phe Met Leu Ser Leu Gln Met Leu Glu Leu Ile835 840 845Thr Arg Leu His Gln Tyr Ile Phe Ser His Ile Leu Arg Leu Glu Lys850 855 860Pro Ala Leu Glu Phe Lys Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val865 870 875 880
Leu Pro Leu Asn Val Val Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Phe885 890 895Lys Phe Met Glu Asp Ile Glu Lys Ser Glu Ala Arg Ile Gly Ile Pro900 905 910Ser Thr Lys Tyr Thr Lys Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp915 920 925Tyr Gln Asp Ala Val Ile Ile Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gln Pro930 935 940His Arg Phe Tyr Val Ala Asp Val Tyr Thr Asp Leu Thr Pro Leu Ser945 950 955 960Lys Phe Pro Ser Pro Glu Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr965 970 975Lys Tyr Asn Leu Asp Leu Thr Asn Leu Asn Gln Pro Leu Leu Asp Val980 985 990Asp His Thr Ser Ser Arg Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn995 10001005Gln Lys Gly Lys Ala Leu Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys101010151020Ala Lys Trp Glu Ser Leu Gln Asn Lys Gln Ile Leu Val Pro Glu102510301035Leu Cys Ala Ile His Pro Ile Pro Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala104010451050
Val Cys Leu Pro Ser Ile Leu Tyr Arg Leu His Cys Leu Leu Thr105510601065Ala Glu Glu Leu Arg Ala Gln Thr Ala Ser Asp Ala Gly Val Gly107010751080Val Arg Ser Leu Pro Ala Asp Phe Arg Tyr Pro Asn Leu Asp Phe108510901095Gly Trp Lys Lys Ser Ile Asp Ser Lys Ser Phe Ile Ser Ile Ser110011051110Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp Asn Tyr Cys Lys His Ser Thr111511201125Ile Val Pro Glu Asn Ala Ala His Gln Gly Ala Asn Arg Thr Ser113011351140Ser Leu Glu Asn His Asp Gln Met Ser Val Asn Cys Arg Thr Leu114511501155Leu Ser Glu Ser Pro Gly Lys Leu His Val Glu Val Ser Ala Asp116011651170Leu Thr Ala Ile Asn Gly Leu Ser Tyr Asn Gln Asn Leu Ala Asn117511801185Gly Ser Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Asp Phe Cys Gln Gly Asn Gln119011951200Leu Asn Tyr Tyr Lys Gln Glu Ile Pro Val Gln Pro Thr Thr Ser120512101215
Tyr Ser Ile Gln Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gln Pro Gln Pro122012251230Ser Asp Glu Cys Thr Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn123512401245Ala Asn Lys Ser Thr Ser Asp Gly Ser Pro Val Met Ala Val Met125012551260Pro Gly Thr Thr Asp Thr Ile Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp126512701275Ser Glu Gln Ser Pro Ser Ile Gly Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly128012851290Pro Asn Pro Gly Leu Ile Leu Gln Ala Leu Thr Leu Ser Asn Ala129513001305Ser Asp Gly Phe Asn Leu Glu Arg Leu Glu Met Leu Gly Asp Ser131013151320Phe Leu Lys His Ala Ile Thr Thr Tyr Leu Phe Cys Thr Tyr Pro132513301335Asp Ala His Glu Gly Arg Leu Ser Tyr Met Arg Ser Lys Lys Val134013451350Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Lys Lys Gly Leu Pro135513601365Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp Pro Pro Val Asn Trp Leu137013751380
Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys Ser Asn Thr Asp Lys138513901395Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met Leu Ala Asn Gly140014051410Lys Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser141514201425Leu Met Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu Asp Asp143014351440Phe Leu Glu Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp Asn Met144514501455Leu Met Gly Ser Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro146014651470Phe Ser Thr Thr Asp Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys147514801485Ser Ser Leu Gly Ser Met Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe149014951500Asp Tyr Ser Ser Trp Asp Ala Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys150515101515Ala Val Glu Glu Asp Asp Phe Val Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser152015251530Glu Glu Asn Cys Gly Val Asp Thr Gly Lys Gln Ser Ile Ser Tyr153515401545
Asp Leu His Thr Glu Gln Cys Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ala Asp155015551560Cys Val Glu Ala Leu Leu Gly Cys Tyr Leu Thr Ser Cys Gly Glu156515701575Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu Cys Ser Leu Gly Leu Lys Val Leu158015851590Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg Glu Lys Ala Leu Cys Pro Thr159516001605Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Leu Ser Val Ser Cys161016151620Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser Ser Val Leu Lys Asp162516301635Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro Arg Cys Met Phe Asp164016451650His Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu Ile Ser Gly Phe165516601665Glu Asn Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys Asn Lys Ala167016751680Tyr Leu Leu Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His Tyr Asn Thr168516901695Ile Thr Asp Cys Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ala Ile170017051710
Leu Asp Tyr Leu Ile Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp Pro Arg Gln171517201725His Ser Pro Gly Val Leu Thr Asp Leu Arg Ser Ala Leu Val Asn173017351740Asn Thr Ile Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp Tyr His Lys174517501755Tyr Phe Lys Ala Val Ser Pro Glu Leu Phe His Val Ile Asp Asp176017651770Phe Val Gln Phe Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln Gly Met Asp177517801785Ser Glu Leu Arg Arg Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys Glu Glu Asp179017951800Ile Glu Val Pro Lys Ala Met Gly Asp Ile Phe Glu Ser Leu Ala180518101815Gly Ala Ile Tyr Met Asp Ser Gly Met Ser Leu Glu Thr Val Trp182018251830Gln Val Tyr Tyr Pro Met Met Arg Pro Leu Ile Glu Lys Phe Ser183518401845Ala Asn Val Pro Arg Ser Pro Val Arg Glu Leu Leu Glu Met Glu185018551860Pro Glu Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr Tyr Asp Gly186518701875
Lys Val Arg Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly Lys Phe Lys188018851890Gly Val Gly Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala Ala Ala Arg189519001905Arg Ala Leu Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln Val Pro Asn191019151920Ser<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼人dicer突變體的基因的合成的引物5<400>4tcgagctcgg tacccgcctc cattgttggt ccacca36<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼人dicer突變體的基因的合成的引物6<400>5tatctagaaa gcttttagct attgggaacc tgaggt 36<210>6<211>3741
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼人dicer突變體的基因<400>6gcctccattg ttggtccacc aatgagctgt gtacgattgg ctgaaagagt tgtcgctctc60atttgctgtg agaaactgca caaaattggc gaactggatg accatttgat gccagttggg120aaagagactg ttaaatatga agaggagctt gatttgcatg atgaagaaga gaccagtgtt180ccaggaagac caggttccac gaaacgaagg cagtgctacc caaaagcaat tccagagtgt240ttgagggata gttatcccag acctgatcag ccctgttacc tgtatgtgat aggaatggtt300ttaactacac ctttacctga tgaactcaac tttagaaggc ggaagctcta tcctcctgaa360gataccacaa gatgctttgg aatactgacg gccaaaccca tacctcagat tccacacttt420cctgtgtaca cacgctctgg agaggttacc atatccattg agttgaagaa gtctggtttc480atgttgtctc tacaaatgct tgagttgatt acaagacttc accagtatat attctcacat540attcttcggc ttgaaaaacc tgcactagaa tttaaaccta cagacgctga ttcagcatac600tgtgttctac ctcttaatgt tgttaatgac tccagcactt tggatattga ctttaaattc660atggaagata ttgagaagtc tgaagctcgc ataggcattc ccagtacaaa gtatacaaaa720gaaacaccct ttgtttttaa attagaagat taccaagatg ccgttatcat tccaagatat780cgcaattttg atcagcctca tcgattttat gtagctgatg tgtacactga tcttacccca840ctcagtaaat ttccttcccc tgagtatgaa acttttgcag aatattataa aacaaagtac900aaccttgacc taaccaatct caaccagcca ctgctggatg tggaccacac atcttcaaga960cttaatcttt tgacacctcg acatttgaat cagaagggga aagcgcttcc tttaagcagt1020gctgagaaga ggaaagccaa atgggaaagt ctgcagaata aacagatact ggttccagaa1080ctctgtgcta tacatccaat tccagcatca ctgtggagaa aagctgtttg tctccccagc1140
atactttatc gccttcactg ccttttgact gcagaggagc taagagccca gactgccagc1200gatgctggcg tgggagtcag atcacttcct gcggatttta gataccctaa cttagacttc1260gggtggaaaa aatctattga cagcaaatct ttcatctcaa tttctaactc ctcttcagct1320gaaaatgata attactgtaa gcacagcaca attgtccctg aaaatgctgc acatcaaggt1380gctaatagaa cctcctctct agaaaatcat gaccaaatgt ctgtgaactg cagaacgttg1440ctcagcgagt cccctggtaa gctccacgtt gaagtttcag cagatcttac agcaattaat1500ggtctttctt acaatcaaaa tctcgccaat ggcagttatg atttagctaa cagagacttt1560tgccaaggaa atcagctaaa ttactacaag caggaaatac ccgtgcaacc aactacctca1620tattccattc agaatttata cagttacgag aaccagcccc agcccagcga tgaatgtact1680ctcctgagta ataaatacct tgatggaaat gctaacaaat ctacctcaga tggaagtcct1740gtgatggccg taatgcctgg tacgacagac actattcaag tgctcaaggg caggatggat1800tctgagcaga gcccttctat tgggtactcc tcaaggactc ttggccccaa tcctggactt1860attcttcagg ctttgactct gtcaaacgct agtgatggat ttaacctgga gcggcttgaa1920atgcttggcg actccttttt aaagcatgcc atcaccacat atctattttg cacttaccct1980gatgcgcatg agggccgcct ttcatatatg agaagcaaaa aggtcagcaa ctgtaatctg2040tatcgccttg gaaaaaagaa gggactaccc agccgcatgg tggtgtcaat atttgatccc2100cctgtgaatt ggcttcctcc tggttatgta gtaaatcaag acaaaagcaa cacagataaa2160tgggaaaaag atgaaatgac aaaagactgc atgctggcga atggcaaact ggatgaggat2220tacgaggagg aggatgagga ggaggagagc ctgatgtgga gggctccgaa ggaagaggct2280gactatgaag atgatttcct ggagtatgat caggaacata tcagatttat agataatatg2340ttaatggggt caggagcttt tgtaaagaaa atctctcttt ctcctttttc aaccactgat2400tctgcatatg aatggaaaat gcccaaaaaa tcctccttag gtagtatgcc attttcatca2460
gattttgagg attttgacta cagctcttgg gatgcaatgt gctatctgga tcctagcaaa2520gctgttgaag aagatgactt tgtggtgggg ttctggaatc catcagaaga aaactgtggt2580gttgacacgg gaaagcagtc catttcttac gacttgcaca ctgagcagtg tattgctgac2640aaaagcatag cggactgtgt ggaagccctg ctgggctgct atttaaccag ctgtggggag2700agggctgctc agcttttcct ctgttcactg gggctgaagg tgctcccggt aattaaaagg2760actgatcggg aaaaggccct gtgccctact cgggagaatt tcaacagcca acaaaagaac2820ctttcagtga gctgtgctgc tgcttctgtg gccagttcac gctcttctgt attgaaagac2880tcggaatatg gttgtttgaa gattccacca agatgtatgt ttgatcatcc agatgcagat2940aaaacactga atcaccttat atcggggttt gaaaattttg aaaagaaaat caactacaga3000ttcaagaata aggcttacct tctccaggct tttacacatg cctcctacca ctacaatact3060atcactgatt gttaccagcg cttagaattc ctgggagatg cgattttgga ctacctcata3120accaagcacc tttatgaaga cccgcggcag cactccccgg gggtcctgac agacctgcgg3180tctgccctgg tcaacaacac catctttgca tcgctggctg taaagtacga ctaccacaag3240tacttcaaag ctgtctctcc tgagctcttc catgtcattg atgactttgt gcagtttcag3300cttgagaaga atgaaatgca aggaatggat tctgagctta ggagatctga ggaggatgaa3360gagaaagaag aggatattga agttccaaag gccatggggg atatttttga gtcgcttgct3420ggtgccattt acatggatag tgggatgtca ctggagacag tctggcaggt gtactatccc3480atgatgcggc cactaataga aaagttttct gcaaatgtac cccgttcccc tgtgcgagaa3540ttgcttgaaa tggaaccaga aactgccaaa tttagcccgg ctgagagaac ttacgacggg3600aaggtcagag tcactgtgga agtagtagga aaggggaaat ttaaaggtgt tggtcgaagt3660tacaggattg ccaaatctgc agcagcaaga agagccctcc gaagcctcaa agctaatcaa3720cctcaggttc ccaatagcta a 3741
<210>7<211>1246<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人dicer突變體的氨基酸序列<400>7Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys Val Arg Leu Ala Glu Arg1 5 10 15Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu His Lys Ile Gly Glu Leu20 25 30Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu Thr Val Lys Tyr Glu Glu35 40 45Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr Ser Val Pro Gly Arg Pro50 55 60Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Glu Cys65 70 75 80Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln Pro Cys Tyr Leu Tyr Val85 90 95Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro Asp Glu Leu Asn Phe Arg100 105 110Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr Thr Arg Cys Phe Gly Ile115 120 125
Leu Thr Ala Lys Pro Ile Pro Gln Ile Pro His The Pro Val Tyr Thr130 135 140Arg Ser Gly Glu Val Thr Ile Ser Ile Glu Leu Lys Lys Ser Gly Phe145 150 155 160Met Leu Ser Leu Gln Met Leu Glu Leu Ile Thr Arg Leu His Gln Tyr165 170 175Ile Phe Ser His Ile Leu Arg Leu Glu Lys Pro Ala Leu Glu Phe Lys180 185 190Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val Leu Pro Leu Asn Val Val195 200 205Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Phe Lys Phe Met Glu Asp Ile210 215 220Glu Lys Ser Glu Ala Arg Ile Gly Ile Pro Ser Thr Lys Tyr Thr Lys225 230 235 240Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp Tyr Gln Asp Ala Val Ile245 250 255Ile Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gln Pro His Arg Phe Tyr Val Ala260 265 270Asp Val Tyr Thr Asp Leu Thr Pro Leu Ser Lys Phe Pro Ser Pro Glu275 280 285Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr Lys Tyr Asn Leu Asp Leu290 295 300
Thr Asn Leu Asn Gln Pro Leu Leu Asp Val Asp His Thr Ser Ser Arg305 310 315 320Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn Gln Lys Gly Lys Ala Leu325 330 335Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys Ala Lys Trp Glu Ser Leu Gln340 345 350Asn Lys Gln Ile Leu Val Pro Glu Leu Cys Ala Ile His Pro Ile Pro355 360 365Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala Val Cys Leu Pro Ser Ile Leu Tyr Arg370 375 380Leu His Cys Leu Leu Thr Ala Glu Glu Leu Arg Ala Gln Thr Ala Ser385 390 395 400Asp Ala Gly Val Gly Val Arg Ser Leu Pro Ala Asp Phe Arg Tyr Pro405 410 415Asn Leu Asp Phe Gly Trp Lys Lys Ser Ile Asp Ser Lys Ser Phe Ile420 425 430Ser Ile Ser Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp Asn Tyr Cys Lys His435 440 445Ser Thr Ile Val Pro Glu Asn Ala Ala His Gln Gly Ala Asn Arg Thr450 455 460Ser Ser Leu Glu Asn His Asp Gln Met Ser Val Asn Cys Arg Thr Leu465 470 475 480
Leu Ser Glu Ser Pro Gly Lys Leu His Val Glu Val Ser Ala Asp Leu485 490 495Thr Ala Ile Asn Gly Leu Ser Tyr Asn Gln Asn Leu Ala Asn Gly Ser500 505 510Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Asp Phe Cys Gln Gly Asn Gln Leu Asn Tyr515 520 525Tyr Lys Gln Glu Ile Pro Val Gln Pro Thr Thr Ser Tyr Ser Ile Gln530 535 540Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gln Pro Gln Pro Ser Asp Glu Cys Thr545 550 555 560Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Asn Lys Ser Thr Ser565 570 575Asp Gly Ser Pro Val Met Ala Val Met Pro Gly Thr Thr Asp Thr Ile580 585 590Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu Gln Ser Pro Ser Ile Gly595 600 605Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro Gly Leu Ile Leu Gln Ala610 615 620Leu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Asp Gly Phe Asn Leu Glu Arg Leu Glu625 630 635 640Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu Lys His Ala Ile Thr Thr Tyr Leu Phe645 650 655
Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg Leu Ser Tyr Met Arg Ser660 665 670Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Lys Lys Gly675 680 685Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp Pro Pro Val Asn Trp690 695 700Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys Ser Asn Thr Asp Lys705 710 715 720Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met Leu Ala Asn Gly Lys725 730 735Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Ser Leu Met740 745 750Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu Asp Asp Phe Leu Glu755 760 765Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp Asn Met Leu Met Gly Ser770 775 780Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro Phe Ser Thr Thr Asp785 790 795 800Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys Ser Ser Leu Gly Ser Met805 810 815Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe Asp Tyr Ser Ser Trp Asp Ala820 825 830
Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys Ala Val Glu Glu Asp Asp Phe Val835 840 845Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys Gly Val Asp Thr Gly850 855 860Lys Gln Ser Ile Ser Tyr Asp Leu His Thr Glu Gln Cys Ile Ala Asp865 870 875 880Lys Ser Ile Ala Asp Cys Val Glu Ala Leu Leu Gly Cys Tyr Leu Thr885 890 895Ser Cys Gly Glu Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu Cys Ser Leu Gly Leu900 905 910Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg Glu Lys Ala Leu Cys915 920 925Pro Thr Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys Asn Leu Ser Val Ser930 935 940Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser Ser Val Leu Lys Asp945 950 955 960Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro Arg Cys Met Phe Asp His965 970 975Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu Ile Ser Gly Phe Glu Asn980 985 990Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys Asn Lys Ala Tyr Leu Leu995 10001005
Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His Tyr Asn Thr Ile Thr Asp101010151020Cys Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ala Ile Leu Asp Tyr102510301035Leu Ile Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp Pro Arg Gln His Ser Pro104010451050Gly Val Leu Thr Asp Leu Arg Ser Ala Leu Val Asn Asn Thr Ile105510601065Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp Tyr His Lys Tyr Phe Lys107010751080Ala Val Ser Pro Glu Leu Phe His Val Ile Asp Asp Phe Val Gln108510901095Phe Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln Gly Met Asp Ser Glu Leu110011051110Arg Arg Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys Glu Glu Asp Ile Glu Val111511201125Pro Lys Ala Met Gly Asp Ile Phe Glu Ser Leu Ala Gly Ala Ile113011351140Tyr Met Asp Ser Gly Met Ser Leu Glu Thr Val Trp Gln Val Tyr114511501155Tyr Pro Met Met Arg Pro Leu Ile Glu Lys Phe Ser Ala Asn Val116011651170
Pro Arg Ser Pro Val Arg Glu Leu Leu Glu Met Glu Pro Glu Thr117511801185Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr Tyr Asp Gly Lys Val Arg119011951200Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly Lys Phe Lys Gly Val Gly120512101215Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala Ala Ala Arg Arg Ala Leu122012251230Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln Val Pro Asn Ser123512401245<210>8<211>1267<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人dicer突變體的氨基酸序列<400>8Met Asn His Lys Val His His His His His His Ile Glu Gly Arg Asn1 5 10 15Ser Ser Ser Val Pro Ala Ser Ile Val Gly Pro Pro Met Ser Cys Val20 25 30Arg Leu Ala Glu Arg Val Val Ala Leu Ile Cys Cys Glu Lys Leu His35 40 45Lys Ile Gly Glu Leu Asp Asp His Leu Met Pro Val Gly Lys Glu Thr50 55 60
Val Lys Tyr Glu Glu Glu Leu Asp Leu His Asp Glu Glu Glu Thr Ser65 70 75 80Val Pro Gly Arg Pro Gly Ser Thr Lys Arg Arg Gln Cys Tyr Pro Lys85 90 95Ala Ile Pro Glu Cys Leu Arg Asp Ser Tyr Pro Arg Pro Asp Gln Pro100 105 110Cys Tyr Leu Tyr Val Ile Gly Met Val Leu Thr Thr Pro Leu Pro Asp115 120 125Glu Leu Asn Phe Arg Arg Arg Lys Leu Tyr Pro Pro Glu Asp Thr Thr130 135 140Arg Cys Phe Gly Ile Leu Thr Ala Lys Pro Ile Pro Gln Ile Pro His145 150 155 160Phe Pro Val Tyr Thr Arg Ser Gly Glu Val Thr Ile Ser Ile Glu Leu165 170 175Lys Lys Ser Gly Phe Met Leu Ser Leu Gln Met Leu Glu Leu Ile Thr180 185 190Arg Leu His Gln Tyr Ile Phe Ser His Ile Leu Arg Leu Glu Lys Pro195 200 205Ala Leu Glu Phe Lys Pro Thr Asp Ala Asp Ser Ala Tyr Cys Val Leu210 215 220Pro Leu Asn Val Val Asn Asp Ser Ser Thr Leu Asp Ile Asp Phe Lys225 230 235 240
Phe Met Glu Asp Ile Glu Lys Ser Glu Ala Arg Ile Gly Ile Pro Ser245 250 255Thr Lys Tyr Thr Lys Glu Thr Pro Phe Val Phe Lys Leu Glu Asp Tyr260 265 270Gln Asp Ala Val Ile Ile Pro Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Gln Pro His275 280 285Arg Phe Tyr Val Ala Asp Val Tyr Thr Asp Leu Thr Pro Leu Ser Lys290 295 300Phe Pro Ser Pro Glu Tyr Glu Thr Phe Ala Glu Tyr Tyr Lys Thr Lys305 310 315 320Tyr Asn Leu Asp Leu Thr Asn Leu Asn Gln Pro Leu Leu Asp Val Asp325 330 335His Thr Ser Ser Arg Leu Asn Leu Leu Thr Pro Arg His Leu Asn Gln340 345 350Lys Gly Lys Ala Leu Pro Leu Ser Ser Ala Glu Lys Arg Lys Ala Lys355 360 365Trp Glu Ser Leu Gln Asn Lys Gln Ile Leu Val Pro Glu Leu Cys Ala370 375 380Ile His Pro Ile Pro Ala Ser Leu Trp Arg Lys Ala Val Cys Leu Pro385 390 395 400Ser Ile Leu Tyr Arg Leu His Cys Leu Leu Thr Ala Glu Glu Leu Arg405 410 415
Ala Gln Thr Ala Ser Asp Ala Gly Val Gly Val Arg Ser Leu Pro Ala420 425 430Asp Phe Arg Tyr Pro Asn Leu Asp Phe Gly Trp Lys Lys Ser Ile Asp435 440 445Ser Lys Ser Phe Ile Ser Ile Ser Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Asp450 455 460Asn Tyr Cys Lys His Ser Thr Ile Val Pro Glu Asn Ala Ala His Gln465 470 475 480Gly Ala Asn Arg Thr Ser Ser Leu Glu Asn His Asp Gln Met Ser Val485 490 495Asn Cys Arg Thr Leu Leu Ser Glu Ser Pro Gly Lys Leu His Val Glu500 505 510Val Ser Ala Asp Leu Thr Ala Ile Asn Gly Leu Ser Tyr Asn Gln Asn515 520 525Leu Ala Asn Gly Ser Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Asp Phe Cys Gln Gly530 535 540Asn Gln Leu Asn Tyr Tyr Lys Gln Glu Ile Pro Val Gln Pro Thr Thr545 550 555 560Ser Tyr Ser Ile Gln Asn Leu Tyr Ser Tyr Glu Asn Gln Pro Gln Pro565 570 575Ser Asp Glu Cys Thr Leu Leu Ser Asn Lys Tyr Leu Asp Gly Asn Ala580 585 590
Asn Lys Ser Thr Ser Asp Gly Ser Pro Val Met Ala Val Met Pro Gly595 600 605Thr Thr Asp Thr Ile Gln Val Leu Lys Gly Arg Met Asp Ser Glu Gln610 615 620Ser Pro Ser Ile Gly Tyr Ser Ser Arg Thr Leu Gly Pro Asn Pro Gly625 630 635 640Leu Ile Leu Gln Ala Leu Thr Leu Ser Asn Ala Ser Asp Gly Phe Asn645 650 655Leu Glu Arg Leu Glu Met Leu Gly Asp Ser Phe Leu Lys His Ala Ile660 665 670Thr Thr Tyr Leu Phe Cys Thr Tyr Pro Asp Ala His Glu Gly Arg Leu675 680 685Ser Tyr Met Arg Ser Lys Lys Val Ser Asn Cys Asn Leu Tyr Arg Leu690 695 700Gly Lys Lys Lys Gly Leu Pro Ser Arg Met Val Val Ser Ile Phe Asp705 710 715 720Pro Pro Val Asn Trp Leu Pro Pro Gly Tyr Val Val Asn Gln Asp Lys725 730 735Ser Asn Thr Asp Lys Trp Glu Lys Asp Glu Met Thr Lys Asp Cys Met740 745 750Leu Ala Asn Gly Lys Leu Asp Glu Asp Tyr Glu Glu Glu Asp Glu Glu755 760 765
Glu Glu Ser Leu Met Trp Arg Ala Pro Lys Glu Glu Ala Asp Tyr Glu770 775 780Asp Asp Phe Leu Glu Tyr Asp Gln Glu His Ile Arg Phe Ile Asp Asn785 790 795 800Met Leu Met Gly Ser Gly Ala Phe Val Lys Lys Ile Ser Leu Ser Pro805 810 815Phe Ser Thr Thr Asp Ser Ala Tyr Glu Trp Lys Met Pro Lys Lys Ser820 825 830Ser Leu Gly Ser Met Pro Phe Ser Ser Asp Phe Glu Asp Phe Asp Tyr835 840 845Ser Ser Trp Asp Ala Met Cys Tyr Leu Asp Pro Ser Lys Ala Val Glu850 855 860Glu Asp Asp Phe Val Val Gly Phe Trp Asn Pro Ser Glu Glu Asn Cys865 870 875 880Gly Val Asp Thr Gly Lys Gln Ser Ile Ser Tyr Asp Leu His Thr Glu885 890 895Gln Cys Ile Ala Asp Lys Ser Ile Ala Asp Cys Val Glu Ala Leu Leu900 905 910Gly Cys Tyr Leu Thr Ser Cys Gly Glu Arg Ala Ala Gln Leu Phe Leu915 920 925Cys Ser Leu Gly Leu Lys Val Leu Pro Val Ile Lys Arg Thr Asp Arg930 935 940
Glu Lys Ala Leu Cys Pro Thr Arg Glu Asn Phe Asn Ser Gln Gln Lys945 950 955 960Asn Leu Ser Val Ser Cys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ser Arg Ser965 970 975Ser Val Leu Lys Asp Ser Glu Tyr Gly Cys Leu Lys Ile Pro Pro Arg980 985 990Cys Met Phe Asp His Pro Asp Ala Asp Lys Thr Leu Asn His Leu Ile995 10001005Ser Gly Phe Glu Asn Phe Glu Lys Lys Ile Asn Tyr Arg Phe Lys101010151020Asn Lys Ala Tyr Leu Leu Gln Ala Phe Thr His Ala Ser Tyr His102510301035Tyr Asn Thr Ile Thr Asp Cys Tyr Gln Arg Leu Glu Phe Leu Gly104010451050Asp Ala Ile Leu Asp Tyr Leu Ile Thr Lys His Leu Tyr Glu Asp105510601065Pro Arg Gln His Ser Pro Gly Val Leu Thr Asp Leu Arg Ser Ala107010751080Leu Val Asn Asn Thr Ile Phe Ala Ser Leu Ala Val Lys Tyr Asp108510901095Tyr His Lys Tyr Phe Lys Ala Val Ser Pro Glu Leu Phe His Val110011051110
Ile Asp Asp Phe Val Gln Phe Gln Leu Glu Lys Asn Glu Met Gln111511201125Gly Met Asp Ser Glu Leu Arg Arg Ser Glu Glu Asp Glu Glu Lys113011351140Glu Glu Asp Ile Glu Val Pro Lys Ala Met Gly Asp Ile Phe Glu114511501155Ser Leu Ala Gly Ala Ile Tyr Met Asp Ser Gly Met Ser Leu Glu116011651170Thr Val Trp Gln Val Tyr Tyr Pro Met Met Arg Pro Leu Ile Glu117511801185Lys Phe Ser Ala Asn Val Pro Arg Ser Pro Val Arg Glu Leu Leu119011951200Glu Met Glu Pro Glu Thr Ala Lys Phe Ser Pro Ala Glu Arg Thr120512101215Tyr Asp Gly Lys Val Arg Val Thr Val Glu Val Val Gly Lys Gly122012251230Lys Phe Lys Gly Val Gly Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Lys Ser Ala123512401245Ala Ala Arg Arg Ala Leu Arg Ser Leu Lys Ala Asn Gln Pro Gln125012551260Val Pro Asn Ser1265
<210>9<211>3804<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼人dicer突變體的基因<400>9atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatcgaag gtaggaattc gagctcggta60cccgcctcca ttgttggtcc accaatgagc tgtgtacgat tggctgaaag agttgtcgct120ctcatttgct gtgagaaact gcacaaaatt ggcgaactgg atgaccattt gatgccagtt180gggaaagaga ctgttaaata tgaagaggag cttgatttgc atgatgaaga agagaccagt240gttccaggaa gaccaggttc cacgaaacga aggcagtgct acccaaaagc aattccagag300tgtttgaggg atagttatcc cagacctgat cagccctgtt acctgtatgt gataggaatg360gttttaacta cacctttacc tgatgaactc aactttagaa ggcggaagct ctatcctcct420gaagatacca caagatgctt tggaatactg acggccaaac ccatacctca gattccacac480tttcctgtgt acacacgctc tggagaggtt accatatcca ttgagttgaa gaagtctggt540ttcatgttgt ctctacaaat gcttgagttg attacaagac ttcaccagta tatattctca600catattcttc ggcttgaaaa acctgcacta gaatttaaac ctacagacgc tgattcagca660tactgtgttc tacctcttaa tgttgttaat gactccagca ctttggatat tgactttaaa720ttcatggaag atattgagaa gtctgaagct cgcataggca ttcccagtac aaagtataca780aaagaaacac cctttgtttt taaattagaa gattaccaag atgccgttat cattccaaga840tatcgcaatt ttgatcagcc tcatcgattt tatgtagctg atgtgtacac tgatcttacc900ccactcagta aatttccttc ccctgagtat gaaacttttg cagaatatta taaaacaaag960tacaaccttg acctaaccaa tctcaaccag ccactgctgg atgtggacca cacatcttca1020
agacttaatc ttttgacacc tcgacatttg aatcagaagg ggaaagcgct tcctttaagc1080agtgctgaga agaggaaagc caaatgggaa agtctgcaga ataaacagat actggttcca1140gaactctgtg ctatacatcc aattccagca tcactgtgga gaaaagctgt ttgtctcccc1200agcatacttt atcgccttca ctgccttttg actgcagagg agctaagagc ccagactgcc1260agcgatgctg gcgtgggagt cagatcactt cctgcggatt ttagataccc taacttagac1320ttcgggtgga aaaaatctat tgacagcaaa tctttcatct caatttctaa ctcctcttca1380gctgaaaatg ataattactg taagcacagc acaattgtcc ctgaaaatgc tgcacatcaa1440ggtgctaata gaacctcctc tctagaaaat catgaccaaa tgtctgtgaa ctgcagaacg1500ttgctcagcg agtcccctgg taagctccac gttgaagttt cagcagatct tacagcaatt1560aatggtcttt cttacaatca aaatctcgcc aatggcagtt atgatttagc taacagagac1620ttttgccaag gaaatcagct aaattactac aagcaggaaa tacccgtgca accaactacc1680tcatattcca ttcagaattt atacagttac gagaaccagc cccagcccag cgatgaatgt1740actctcctga gtaataaata ccttgatgga aatgctaaca aatctacctc agatggaagt1800cctgtgatgg ccgtaatgcc tggtacgaca gacactattc aagtgctcaa gggcaggatg1860gattctgagc agagcccttc tattgggtac tcctcaagga ctcttggccc caatcctgga1920cttattcttc aggctttgac tctgtcaaac gctagtgatg gatttaacct ggagcggctt1980gaaatgcttg gcgactcctt tttaaagcat gccatcacca catatctatt ttgcacttac2040cctgatgcgc atgagggccg cctttcatat atgagaagca aaaaggtcag caactgtaat2100ctgtatcgcc ttggaaaaaa gaagggacta cccagccgca tggtggtgtc aatatttgat2160ccccctgtga attggcttcc tcctggttat gtagtaaatc aagacaaaag caacacagat2220aaatgggaaa aagatgaaat gacaaaagac tgcatgctgg cgaatggcaa actggatgag2280gattacgagg aggaggatga ggaggaggag agcctgatgt ggagggctcc gaaggaagag2340
gctgactatg aagatgattt cctggagtat gatcaggaac atatcagatt tatagataat2400atgttaatgg ggtcaggagc ttttgtaaag aaaatctctc tttctccttt ttcaaccact2460gattctgcat atgaatggaa aatgcccaaa aaatcctcct taggtagtat gccattttca2520tcagattttg aggattttga ctacagctct tgggatgcaa tgtgctatct ggatcctagc2580aaagctgttg aagaagatga ctttgtggtg gggttctgga atccatcaga agaaaactgt2640ggtgttgaca cgggaaagca gtccatttct tacgacttgc acactgagca gtgtattgct2700gacaaaagca tagcggactg tgtggaagcc ctgctgggct gctatttaac cagctgtggg2760gagagggctg ctcagctttt cctctgttca ctggggctga aggtgctccc ggtaattaaa2820aggactgatc gggaaaaggc cctgtgccct actcgggaga atttcaacag ccaacaaaag2880aacctttcag tgagctgtgc tgctgcttct gtggccagtt cacgctcttc tgtattgaaa2940gactcggaat atggttgttt gaagattcca ccaagatgta tgtttgatca tccagatgca3000gataaaacac tgaatcacct tatatcgggg tttgaaaatt ttgaaaagaa aatcaactac3060agattcaaga ataaggctta ccttctccag gcttttacac atgcctccta ccactacaat3120actatcactg attgttacca gcgcttagaa ttcctgggag atgcgatttt ggactacctc3180ataaccaagc acctttatga agacccgcgg cagcactccc cgggggtcct gacagacctg3240cggtctgccc tggtcaacaa caccatcttt gcatcgctgg ctgtaaagta cgactaccac3300aagtacttca aagctgtctc tcctgagctc ttccatgtca ttgatgactt tgtgcagttt3360cagcttgaga agaatgaaat gcaaggaatg gattctgagc ttaggagatc tgaggaggat3420gaagagaaag aagaggatat tgaagttcca aaggccatgg gggatatttt tgagtcgctt3480gctggtgcca tttacatgga tagtgggatg tcactggaga cagtctggca ggtgtactat3540cccatgatgc ggccactaat agaaaagttt tctgcaaatg taccccgttc ccctgtgcga3600gaattgcttg aaatggaacc agaaactgcc aaatttagcc cggctgagag aacttacgac3660
gggaaggtca gagtcactgt ggaagtagta ggaaagggga aatttaaagg tgttggtcga3720agttacagga ttgccaaatc tgcagcagca agaagagccc tccgaagcct caaagctaat3780caacctcagg ttcccaatag ctaa 3804<210>10<211>720<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼紅移綠色熒光蛋白的基因<400>10atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat60ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac120ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca180ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa240cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc300ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt360gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac420aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat480ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca540gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat600tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc660cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga720<210>11<211>42
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成的引物3<400>11gggtaatacg actcactata gggagaatgg ctagcaaagg ag 42<210>12<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼紅移綠色熒光蛋白的基因的合成的引物4<400>12gggtaatacg actcactata gggagatcag ttgtacagtt ca 42<210>13<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼觸發(fā)因子的基因的合成的引物TFN<400>13ggccatatgc aagtttcagt tgaaaccact c 31<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼觸發(fā)因子的基因的合成的引物TFCP<400>14gcaagcttgg atccgaattc tccctacctt cgatcgcctg ctggttcatc agctcgttga60
<210>15<211>1732<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶a亞基的基因<400>15gaattcgacc gttgctctgc acctggctat cccgctgaaa tggaaaccgg accacacccc60ggtttggatc gaccagtggc cgctgccgga aggtaaactg gttgctgtta cccagctggt120tgaaaaagaa ctgcagctgg gtcacatcga accgtctctg tcttgctgga acaccccggt180gttcgttatc cgtaaagctt ctggttctta ccgtctgctg cacgacctgc gtgctgttaa240cgctaaactg gttccgttcg gtgctgttca gcagggtgct ccggttctgt ctgctctgcc300gcgtggttgg ccgctgatgg ttctggacct gaaagactgc ttcttctcta tcccgctggc360tgaacaggac cgtgaagctt tcgctttcac cctgccgtct gttaacaacc aggctccggc420tcgtcgtttc cagtggaaag ttctgccgca gggtatgacc tgctctccga ccatctgcca480gctggttgtt ggtcaggttc tggaaccgct gcgtctgaaa cacccggctc tgcgtatgct540gcactacatg gacgacctgc tgctggctgc ttcttctcac gacggtctgg aagctgctgg600taaagaagtt atcggtaccc tggaacgtgc tggtttcacc atctctccgg acaaaatcca660gcgtgaaccg ggtgttcagt acctgggtta caaactgggt tctacctacg ttgctccggt720tggtctggtt gctgaaccgc gtatcgctac cctgtgggac gttcagaaac tggttggttc780tctgcagtgg ctgcgtccgg ctctgggtat cccgccgcgt ctgatgggtc cgttctacga840acagctgcgt ggttctgacc cgaacgaagc tcgtgaatgg aacctggaca tgaaaatggc900ttggcgtgaa atcgttcagc tgtctaccac cgctgctctg gaacgttggg acccggctca960gccgctggaa ggtgctgttg ctcgttgcga acagggtgct atcggtgttc tgggtcaggg1020
tctgtctacc cacccgcgtc cgtgcctgtg gctgttctct acccagccga ccaaggcttt1080caccgcttgg ctggaagttc tgaccctgct gatcaccaaa ctgcgtgctt ctgctgttcg1140taccttcggt aaagaagttg acatcctgct gctgccggct tgcttccgtg aagacctgcc1200gctgccggaa ggtatcctgc tggctctgcg tggtttcgct ggtaaaatcc gttcttctga1260caccccgtct atcttcgaca tcgctcgtcc gctgcacgtt tctctgaaag ttcgtgttac1320cgaccacccg gttccgggtc cgaccgtttt caccgacgct tcttcttcta cccacaaagg1380tgttgttgtt tggcgtgaag gtccgcgttg ggaaatcaaa gaaatcgttg acctgggtgc1440ttctgttcag cagctagaag ctcgtgctgt tgctatggct ctgctgctgt ggccgaccac1500cccgaccaac gttgttaccg actctgcttt cgttgctaaa atgctgctga aaatgggtca1560ggaaggtgtt ccgtctaccg ctgctgcttt catcctggaa gacgctctgt ctcagcgttc1620tgctatggct gctgttctgc acgttcgttc tcactctgaa gttccgggtt tcttcaccga1680aggtaacgac gttgctgact ctcaggctac cttccaggct tactaatcta ga1732<210>16<211>2709<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β亞基的基因<400>16gaattcgacc gttgctctgc acctggctat cccgctgaaa tggaaaccgg accacacccc60ggtttggatc gaccagtggc cgctgccgga aggtaaactg gttgctgtta cccagctggt120tgaaaaagaa ctgcagctgg gtcacatcga accgtctctg tcttgctgga acaccccggt180gttcgttatc cgtaaagctt ctggttctta ccgtctgctg cacgacctgc gtgctgttaa240cgctaaactg gttccgttcg gtgctgttca gcagggtgct ccggttctgt ctgctctgcc300
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<220>
<223>擴(kuò)增編碼DNA酶的基因的合成的引物NUCN<400>17ggcgaattcg atgtttttgt taattttagg g 31<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼DNA酶的基因的合成的引物NUCC<400>18gcgggatcct taacgaacta agccgttatt ttggc 35<210>19<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼人dicer PAZ結(jié)構(gòu)域的基因的合成的引物1<400>19tcgagctcgg tacccattga ctttaaattc atggaa 36<210>20<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>擴(kuò)增編碼人dicer PAZ結(jié)構(gòu)域的基因的合成的引物2<400>20tatctagaaa gcttaaaggc agtgaaggcg ataaag 3權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括將這樣的宿主暴露于低溫條件下以誘導(dǎo)所述多肽的表達(dá)，該宿主具有被轉(zhuǎn)入該宿主的編碼想要的多肽的基因，其中在該宿主中，編碼陪伴分子的基因的表達(dá)被增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過選自這樣的方法中的一種方法增強(qiáng)編碼陪伴分子的基因的表達(dá)，所述方法是誘導(dǎo)宿主中的陪伴分子基因表達(dá)；修飾宿主染色體上的陪伴分子基因；將陪伴分子基因轉(zhuǎn)入宿主；和使用這樣的宿主，在該宿主中，陪伴分子基因的表達(dá)被增強(qiáng)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述陪伴分子選自DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES和觸發(fā)因子。
4.權(quán)利要求1的方法，其中將被轉(zhuǎn)入宿主的編碼想要的多肽的基因連接至這樣的DNA的下游，該DNA編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中將被轉(zhuǎn)入宿主的編碼想要的多肽的基因連接至這樣的DNA的下游，該DNA編碼來源于大腸桿菌cspA基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中使用載體將編碼想要的多肽的基因和編碼陪伴分子的基因轉(zhuǎn)入宿主。
7.權(quán)利要求6的方法，其中將編碼想要的多肽的基因和編碼陪伴分子的基因相互連接，從而可編碼想要的多肽和陪伴分子的融合蛋白。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述想要的多肽選自RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶α亞基、RAV-2逆轉(zhuǎn)錄酶β亞基、DNA酶和Dicer PAZ結(jié)構(gòu)域多肽。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主是大腸桿菌。
10.用于產(chǎn)生想要的多肽的一套質(zhì)粒載體，其包括(1)第一載體，其在啟動子的下游具有(a)編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的DNA；和(b)可用于插入編碼想要的多肽的基因且位于(a)的DNA的下游的限制性內(nèi)切酶識別序列；和(2)具有編碼陪伴分子的基因的第二載體，其中這樣選擇(1)和(2)的載體的復(fù)制起點(diǎn)，從而使得不產(chǎn)生不相容性。
11.權(quán)利要求10的一套載體，其中所述第一載體包含這樣的DNA，該DNA編碼來源于大腸桿菌cspA基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)。
12.權(quán)利要求10的一套載體，其中所述第二載體包含編碼選自DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES和觸發(fā)因子的陪伴分子的基因。
13.權(quán)利要求10的一套載體，其由能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒組成。
14.一種表達(dá)載體，其在起動子的下游具有(a)編碼來源于冷激蛋白基因的mRNA的5’-非翻譯區(qū)的DNA；(b)具有可用于插入編碼想要的多肽的基因且位于(a)的DNA的下游的限制性內(nèi)切酶識別序列的DNA；和(c)編碼陪伴分子的基因。
15.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其包含編碼來源于大腸桿菌cspA基因的5’-非翻譯區(qū)的DNA。
16.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其是包含編碼選自DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES和觸發(fā)因子的陪伴分子的基因的質(zhì)粒。
17.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其中可用于插入編碼想要的多肽的基因的限制性內(nèi)切酶識別序列位于這樣的位置，在該位置可插入編碼想要的多肽的基因，從而可將想要的多肽作為和陪伴分子的融合蛋白來表達(dá)。
18.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其是能夠在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒。
全文摘要
用于在低溫下生產(chǎn)靶蛋白的方法，其包括不僅誘導(dǎo)具有被導(dǎo)入其中的編碼所述靶蛋白的基因的載體的表達(dá)而且誘導(dǎo)具有被導(dǎo)入其中的陪伴分子基因的載體的表達(dá)。
文檔編號C12P21/02GK1950505SQ200580014919
公開日2007年4月18日 申請日期2005年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月21日
發(fā)明者小代俊浩, 小堀博史, 相良武宏, 遠(yuǎn)藤博, 高藏晃, 友野潤, 佐川裕章, 向井博之, 加藤郁之進(jìn) 申請人:寶生物工程株式會社