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酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素b12的方法

文檔序號:554630閱讀:356來源:國知局
專利名稱:酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素b12的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種腺苷輔酶維生素B12的生產(chǎn)方法,尤其是指利用生物催化工程和藥物化學(xué)制劑相關(guān)技術(shù)來生產(chǎn)。
背景技術(shù)
腺苷輔酶維生素B12(以下簡稱腺苷輔酶B12)是由5′-脫氧腺嘌呤核苷取代普通維生素B12的氰基而成的新型維生素B12制劑,是維生素B12在體內(nèi)的活化形式,具有抗貧血、抗組胺、護(hù)肝、神經(jīng)保護(hù)、蛋白同化、促進(jìn)生長等生理作用。與常用普通維生素B12相比,腺苷輔酶B12具有毒性小、可直接被機(jī)體利用、對組織的親和力大、在體內(nèi)的利用率高、活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在臨床上主要用于治療惡性貧血及其他巨幼紅細(xì)胞性貧血以及其他B12適應(yīng)癥,如神經(jīng)炎、急慢性肝炎的輔助治療等。腺苷輔酶B12還是形成消化道正常上皮細(xì)胞的必要物質(zhì),對損傷的胃粘膜修復(fù)具有良好的促進(jìn)作用。腺苷輔酶B12還被廣泛用于治療由對腫瘤的化學(xué)或放射性治療導(dǎo)致的白細(xì)胞減少癥。腺苷輔酶B12的應(yīng)用為維生素B12適應(yīng)癥的治療提供了更好的基礎(chǔ)。目前腺苷輔酶B12的生產(chǎn)主要依靠發(fā)酵法,其生產(chǎn)工藝復(fù)雜,終產(chǎn)品純化難度大,純化粹取要求使用多種有機(jī)溶劑,生產(chǎn)成本高,轉(zhuǎn)化率低,對環(huán)境容易造成污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,以解決目前生產(chǎn)存在的工藝復(fù)雜、生產(chǎn)周期長、成本高和污染大的問題。
本發(fā)明采用三磷酸腺苷和羥鈷型維生素B12作為合成腺苷輔酶維生素B12的起始原料,其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001-0.05mol/l。
應(yīng)用經(jīng)酶工程技術(shù)篩選優(yōu)化的三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶作為催化劑在反應(yīng)體系的pH值為8.0±1.0條件下,反應(yīng)時(shí)間1-3小時(shí),在酶促反應(yīng)中含有0.002-0.1mol/l濃度的三磷酸腺苷,0.002-0.1mol/L的MnCl2,一步獲得終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12,原料轉(zhuǎn)化率大于90%。該技術(shù)大大簡化了腺苷輔酶維生素B12生產(chǎn)的下游純化和制劑工藝。
本發(fā)明方法的特征為反應(yīng)體系中使用的還原劑為四氫硼鉀(Potasium Borohydride,KBH4,四氫硼鈉Sodium Borohydride,NaBH4,四氫鋰鋁Lithium Aluminum Hydride,LiAlH4,或Ferredoxin(flavodoxin)NADP+Reductase等生物還原系統(tǒng)。
本發(fā)明方法的特征為合成的反應(yīng)進(jìn)程用高壓液色譜儀和紫外/可見分光光度計(jì)監(jiān)測。
本發(fā)明方法的特征為使用疏水層析進(jìn)行催化反應(yīng)體系中終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12的分離和純化,疏水層析采用反向疏水樹質(zhì)。
本發(fā)明方法的特征為利用減壓蒸發(fā)和低溫結(jié)晶技術(shù)獲得高純度腺苷輔酶維生素B12粉末狀結(jié)晶制劑。
我們利用酶工程技術(shù)篩選優(yōu)化的三磷酸腺苷ATP維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶催化效率高、催化反應(yīng)調(diào)價(jià)簡單,為酶促大規(guī)模生產(chǎn)腺苷輔酶B12奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。利用體外酶催化法生產(chǎn)腺苷輔酶B12,具有生產(chǎn)工藝簡單,催化反應(yīng)條件可控,終產(chǎn)品純化容易等特點(diǎn),為低成本生產(chǎn)腺苷輔酶B12提供了一條新的途徑。
本發(fā)明克服了微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)工藝繁瑣、終產(chǎn)品的純化工藝尤其復(fù)雜、投入大、轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)。經(jīng)酶工程優(yōu)化的三磷酸腺苷ATP維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶具有催化活性高、催化條件簡單等優(yōu)點(diǎn)。小試結(jié)果表明利用三磷酸腺苷(ATP)維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶可將三磷酸腺苷和維生素B12在簡單條件下一步轉(zhuǎn)化成腺苷輔酶維生素B12,工藝流程短,生產(chǎn)條件溫和,對環(huán)境無污染。由于三磷酸腺苷和維生素B12等反應(yīng)原料價(jià)格低廉,利用三磷酸腺苷ATP維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶體外催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12將大大降低了生產(chǎn)成本。該技術(shù)工藝具有明顯的創(chuàng)新優(yōu)勢和市場競爭力,將為在短時(shí)間內(nèi)占領(lǐng)國內(nèi)外腺苷輔酶B12市場打下良好基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)材料和方法工程菌和試劑大腸桿菌基因重組工程菌,該菌種已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村,保藏日期2005年10月17日,保藏編號CGMCCNo.1491,分類命名大腸埃希氏菌Escherichia coli,攜帶三磷酸腺苷ATP羥鈷型維生素B12(Cob(I)alamin)腺苷轉(zhuǎn)移酶基因。各分析純級試劑配成以下濃度備用。1mol/l TRIS-HCl緩沖液,pH值為8.0;3mol/l CoCl2;1mol/l MnCl2;0.4mol/l ATP;0.2mol/l羥鈷型維生素B12;固體四氫硼鉀Potasium Borohydride(KBH4),Lithium Borohydride(LiBH4),四氫硼鈉Sodium Borohydride(NaBH4),四氫鋰鋁Lithium Aluminum Hydride(LiAlH4),或SodiumCyanoborohydride(NaBH3CN),去離子水。碳十八(C18),碳八(C8)等硅膠反向疏水樹質(zhì)。
1、培養(yǎng)基A培養(yǎng)基蛋白胨10g/l;酵母粉5g/l,NaCl 10g/l,四環(huán)素10μg/ml。上述試劑用去離子水溶解后,在120℃滅菌25分鐘,然后在接種時(shí)加入四環(huán)素達(dá)25μg/ml,B培養(yǎng)基在A培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂后進(jìn)行滅菌,條件同A培養(yǎng)基,滅菌后未凝固前加入四環(huán)素,加入量為10μg/ml,凝固后即制成瓊脂平板培養(yǎng)基。
2、發(fā)酵將上述瓊脂平板培養(yǎng)基(B培養(yǎng)基)上培養(yǎng)的三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶基因工程菌,挑起單菌落,接入20ml A培養(yǎng)基中(含10μg/ml四環(huán)素),37℃搖床培養(yǎng)20小時(shí)。
將以上的菌液接種到61的A培養(yǎng)基中(含10μg/ml四環(huán)素),37℃搖床培養(yǎng)20小時(shí)左右,測菌液的OD600=1.8以上。
將二級培養(yǎng)后收集的菌液進(jìn)行離心,轉(zhuǎn)速為4000rpm,離心時(shí)間10分針,棄去上清液,收集沉淀的菌體,-70℃凍存。
3、酶液的制作將發(fā)酵獲得的工程菌細(xì)胞,檢驗(yàn)后目的蛋白應(yīng)占總蛋白的20以上,用Tris-HCl,pH8.0緩沖液進(jìn)行懸浮,每克細(xì)胞泥用4毫升緩沖液,懸浮后的菌液利用均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎,操作的壓力為60MPa,溫度控制在15℃以下,循環(huán)兩次。收集懸浮液進(jìn)行離心,轉(zhuǎn)速為15000rpm,溫度為4±2℃。離心后收集上清液備用,24小時(shí)內(nèi)使用可儲存在4℃,長期儲存溫度-70℃。
實(shí)施例一 酶催化腺苷輔酶維生素B12合成(1)以一升的反應(yīng)體系為例1、加入試劑向反應(yīng)釜中分別加入以下配制好的試劑1mol/l Tris-HCl緩沖液50毫升;0.1mol/l CoCl25毫升;0.1mol/l MnCl210毫升;0.5mol/l ATP 10毫升;0.5mol/l羥鈷型維生素B12 10毫升;去離子水定容至1升;充氮除氧后加入四氫硼鉀Potasium Borohydride(KBH4)10克。
2、反應(yīng)溫度和時(shí)間設(shè)置反應(yīng)溫度為30±5℃,10分鐘后加入100IU三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶,讓反應(yīng)時(shí)間持續(xù)2-3小時(shí),用高效液相色譜儀和UV/VIS分光光度計(jì)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程直至反應(yīng)完成。在結(jié)束反應(yīng)的上述混合液中加入鹽酸,終濃度為0.1mol/l,15000rpm離心10分鐘,棄去沉淀物,收集上清液備用。
實(shí)施例二 酶催化腺苷輔酶維生素B12合成(2)以一升的反應(yīng)體系為例3、加入試劑向反應(yīng)釜中分別加入以下配制好的試劑1mol/l Tris-HCl緩沖液50毫升;0.1mol/l CoCl25毫升;0.1mol/l MnCl210毫升;0.5mol/l ATP 20毫升;0.5mol/l羥鈷型維生素B12 20毫升;去離子水定容至1升;充氮除氧后加入四氫硼鈉Sodium Borohydride(NaBH4)15克。
4、反應(yīng)溫度和時(shí)間設(shè)置反應(yīng)溫度為30±5℃,10分鐘后加入200IU腺苷三磷酸維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶,讓反應(yīng)時(shí)間持續(xù)2-3小時(shí)直至反應(yīng)完成。在結(jié)束反應(yīng)的上述混合液中加入鹽酸,終濃度為0.1mol/l,15000rpm離心10分鐘,棄去沉淀物,收集上清液備用。
實(shí)施例三 酶催化腺苷輔酶維生素B12合成(3)以一升的反應(yīng)體系為例5、加入試劑向反應(yīng)釜中分別加入以下配制好的試劑1mol/l Tris-HCl緩沖液50毫升;0.1mol/l CoCl210毫升;0.1mol/l MnCl220毫升;0.5mol/l ATP 30毫升;0.5mol/l羥鈷型維生素B12 30毫升;去離子水定容至1升;充氮除氧后加入Sodium Cyanoborohydride(NaBH3CN)20克。
6、反應(yīng)溫度和時(shí)間設(shè)置反應(yīng)溫度為30±5℃,10分鐘后加入250IU腺苷三磷酸維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶,讓反應(yīng)時(shí)間持續(xù)2-3小時(shí)直至反應(yīng)完成。在結(jié)束反應(yīng)的上述混合液中加入鹽酸,終濃度為0.1mol/L,15000rpm離心10分鐘,棄去沉淀物,收集上清液備用。
實(shí)施例四 腺苷輔酶維生素B12的層析純化1、層析介質(zhì)的處理反向C18硅膠樹脂(Silica-based Reversed-phase C18 Resin,Waters)溶于去離子水后裝柱,用甲醇清洗3個(gè)柱體積,用去離子水沖洗3個(gè)柱體積。
2、上樣將已除蛋白的反應(yīng)混合液以每分鐘0.02個(gè)柱體積的流速加到層析柱上,每毫升介質(zhì)約可吸附15毫克的腺苷輔酶維生素B12。
3、沖洗上樣后用去離子水沖洗10個(gè)柱體積,至260nm和370nm波長檢測無吸收為止。
4、洗脫用95%甲醇進(jìn)行洗脫,收集260波長處的洗脫峰。收集液放在4-8℃冷藏箱中避光保存、備用。
實(shí)施例五 腺苷輔酶維生素B12的濃縮干燥1、層析純化收集液的濃縮將含有腺苷輔酶維生素B12的層析純化收集液加入減壓濃縮器中進(jìn)行避光減壓蒸發(fā)直至所以甲醇和水份除去為止。濃縮溫度不高于40±5℃,濃縮壓力應(yīng)低于-0.1Mpa。
2、腺苷輔酶維生素B12的結(jié)晶將含有腺苷輔酶維生素B12的層析純化收集液加入減壓濃縮器中進(jìn)行避光減壓蒸發(fā)至腺苷輔酶B12濃度約0.1mol/l時(shí),將盛有腺苷輔酶B12溶液的燒瓶移至冷水中降溫至4±2攝氏度,向腺苷輔酶B12溶液中緩慢加入丙酮攪拌直至有晶體析出。該結(jié)晶溶液在4±2攝氏度保存6小時(shí)后繼續(xù)加入少量丙酮,在4±2攝氏度保存6小時(shí)后過濾收集腺苷輔酶B12晶體,用少量乙醚沖洗后減壓干燥晶體。腺苷輔酶B12晶體收獲率超過90%。
權(quán)利要求
1.一種酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,其特征在于合成反應(yīng)使用的起始原料為三磷酸腺苷和羥鈷型維生素B12,其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001-0.05mol/l。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,其特征在于在酶促反應(yīng)中含有0.002-0.1mol/公升濃度的三磷酸腺苷,0.002-0.1mol/l的MnCl2,反應(yīng)體系的pH值為8.0±1.0。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,該方法的特征為反應(yīng)體系中使用的還原劑為四氫硼鉀,四氫硼鈉,四氫鋰鋁,或NaBH3CN等生物還原系統(tǒng)。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,該方法的特征為合成的反應(yīng)進(jìn)程用高壓液色譜儀和紫外/可見分光光度計(jì)監(jiān)測。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,該方法的特征為使用疏水層析進(jìn)行催化反應(yīng)體系中終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12的分離和純化。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,該方法的特征為利用減壓蒸發(fā)和低溫結(jié)晶技術(shù)獲得高純度腺苷輔酶維生素B12粉末狀結(jié)晶制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶催化生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12的方法,屬于腺苷輔酶維生素B12的生產(chǎn)方法。利用三磷酸腺苷維生素B12腺苷轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)腺苷輔酶維生素B12,其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001-0.05mol/l。該方法具有工藝簡潔、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低的特點(diǎn)。利用本發(fā)明中的生產(chǎn)工藝獲得的終產(chǎn)物腺苷輔酶維生素B12純度高、穩(wěn)定性強(qiáng),可加工成多種劑型,為藥用腺苷輔酶維生素B12的大規(guī)模生產(chǎn)提供了一條新途徑。
文檔編號C12P19/42GK1814773SQ20051011901
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者陳大偉 申請人:吉林省奇健生物技術(shù)有限公司
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