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新化合物、新菌株、及應(yīng)用該菌株生產(chǎn)該新化合物的方法

文檔序號(hào):428880閱讀:257來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:新化合物、新菌株、及應(yīng)用該菌株生產(chǎn)該新化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種新的化合物,一種能產(chǎn)生該新化合物的新菌株,以及應(yīng)用該新菌株發(fā)酵生產(chǎn)該新化合物的方法。
背景技術(shù)
日本專利申請(qǐng)?zhí)亻_(kāi)平5-247077公開(kāi)了一種結(jié)構(gòu)式為下式(a)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,分子量為352。它可由在土豆提取物和葡萄糖培養(yǎng)基中的搖瓶發(fā)酵枝孢菌(Cladosporium)101生產(chǎn)出。由7.2L發(fā)酵上清液,可通過(guò)提取和色譜分離得到回收73mg的該化合物。Youji Sakagami等人(Tetrahedron Letters,Vol.36,No.9,pp.1469-1472,1995)由枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)真菌中分離出活性物質(zhì)枝孢菌醇(cladosporol)(1),其分子式為C20H16O6,結(jié)構(gòu)式為下式(b),并認(rèn)為其是一種β-1,3-葡聚糖(β-1,3-glucan)生物合成抑制劑。結(jié)構(gòu)式(a)是結(jié)構(gòu)式(b)的平面結(jié)構(gòu)式。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有藥用價(jià)值的化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種能產(chǎn)生該新化合物的新菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種應(yīng)用該新菌株發(fā)酵生產(chǎn)該新化合物的方法。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年大量深入細(xì)致地研究,發(fā)現(xiàn)、培養(yǎng)、誘變出一種新的菌種,其可產(chǎn)生一種新的化合物,本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究出利用該新菌種來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)該新化合物的方法。
本發(fā)明提供以下結(jié)構(gòu)式(I)的新化合物。
外觀白色晶體熔點(diǎn)187~191℃比旋光度213.01°(丙酮溶液1.230mg/ml)分子量352分子式C20H16O6UVλmaxnm(ε)212nm(見(jiàn)圖6)IR光譜(見(jiàn)圖7)MS圖譜(見(jiàn)圖8)系列NMR光譜1H-NMR(圖9A)、13C-NMR(圖9B)和1H-1H COSY譜(圖9C)X光衍射圖譜(見(jiàn)圖10)本發(fā)明新化合物的空間結(jié)構(gòu)與前述結(jié)構(gòu)式(b)的已有化合物的空間結(jié)構(gòu)不同,本發(fā)明新化合物的環(huán)氧環(huán)是向外的,而前述結(jié)構(gòu)式(b)的已知化合物的環(huán)氧環(huán)是向內(nèi)的。因以上的空間結(jié)構(gòu)不同,本發(fā)明新化合物具有獨(dú)特的生物學(xué)活性,它對(duì)胃癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性,同時(shí),該物質(zhì)還有高效抗真菌、抗病毒的生物活性,可開(kāi)發(fā)成新一代的抗癌藥物、抗真菌藥物和抗病毒藥物,應(yīng)用前景廣闊。
本發(fā)明提供的一種能生產(chǎn)式(I)化合物的新菌種是鏈格孢單孢變種(Alternaria alternate var.monosporus)ST-026-R CGMCC No.0899。
本發(fā)明人從自云南省麗江地區(qū)的老君山海拔2500~3000米的針闊混交林中的7株300年以上的云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)樹(shù)的樹(shù)枝、樹(shù)皮、葉和根皮采集樣品310個(gè)。將樹(shù)皮在無(wú)菌條件下,用60%酒精消毒,無(wú)菌水沖洗,吸干多余水分,將韌皮部一層層撕成薄片,再將樣品切成小塊,按內(nèi)韌皮部至表皮層順序排列,接種在水瓊脂培養(yǎng)基上,在25℃恒溫條件下培養(yǎng)7~15天,相繼長(zhǎng)出不同類型的微生物,對(duì)不同形態(tài)、不同顏色的菌落經(jīng)純化后進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),從中選出能產(chǎn)生本發(fā)明新化合物和紫杉醇且產(chǎn)率較高的菌株作為出發(fā)菌株。對(duì)該菌株進(jìn)行紫外誘變,紫外誘變數(shù)代后,得形態(tài)變異菌株,再以此為出發(fā)菌株繼承誘變,得產(chǎn)生本發(fā)明新化合物和紫杉醇較穩(wěn)定的單孢菌株,以上形態(tài)變異經(jīng)數(shù)代傅代培養(yǎng)較穩(wěn)定,得到本發(fā)明的新單孢菌株。根據(jù)植物命名法規(guī)該菌株命名為鏈格孢單孢變種,學(xué)名為Alternaria alernata var.monosporus,代號(hào)為ST-026-R,菌種保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址北京市中關(guān)村北一條13號(hào),保藏號(hào)為CGMCC No.0899。
本發(fā)明提供的新菌株CGMCC 0899,具有以下微生物學(xué)特性菌絲細(xì)胞長(zhǎng)寬大約相等或長(zhǎng)大于寬2倍左右,細(xì)胞中間縊縮,兩端膨大,在橫隔處也縊縮,整條菌絲似鏈條狀。菌絲分枝短,呈銳角狀分枝。分生孢子鏈短,為復(fù)二叉分枝,孢子多為單細(xì)胞,大小約為20-25um,無(wú)色透明,無(wú)疣狀物,卵形或棍棒狀,孢痕清晰。
本發(fā)明的菌株在PDA瓊脂培養(yǎng)基上,鋪展、致密、圓形、有明顯的兩層輪紋,邊緣整齊,內(nèi)層黑褐色,邊緣灰白色。菌絲無(wú)色或橄欖褐色,分枝,具橫隔膜。具粗細(xì)兩種菌絲,明顯。菌絲生長(zhǎng)快,孢子豐富,五天即可長(zhǎng)滿9cm的培養(yǎng)基表面。菌絲在培養(yǎng)基表面形成木質(zhì)狀硬塊。幼菌絲常形成單個(gè)或成串的透明、長(zhǎng)囊狀或念珠狀芽孢,比菌絲粗2~3倍以上。芽孢可萌發(fā)成新菌絲。菌絲頂部為一個(gè)尖、細(xì)、透明的長(zhǎng)細(xì)胞。
本發(fā)明的菌株產(chǎn)生三種孢子,第一種為分生孢子(氣生孢子),由菌絲分枝頂端長(zhǎng)出孢子鏈,每個(gè)分枝頂部皆能形成孢子鏈,孢子鏈一般由4~6個(gè)孢子組成,少數(shù)可達(dá)8~10個(gè),分生孢子梗多為4個(gè)細(xì)胞,圓柱形、透明、單生、直立。幼分生孢子為倒卵形或橢圓形,表明密布顆粒狀點(diǎn)紋,顏色深,看不清分隔,大小約21~25×11~15um,菌絲寬為4um,喙長(zhǎng)2.0um。自孢子頂部或側(cè)面再形成孢子鏈。成熟的分生孢子為倒卵形,色淺,約25~15um,有4~6~8個(gè)橫隔,1~2個(gè)縱隔。孢子細(xì)胞間有縊縮,喙長(zhǎng)2.0um。第二種為芽孢,在菌絲生長(zhǎng)初期和液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生。應(yīng)為內(nèi)生真菌的特有孢子,長(zhǎng)囊狀或圓球狀,能從側(cè)面萌發(fā)形成菌絲。第三種孢子是初次發(fā)現(xiàn),尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo),即兩條菌絲相平行,產(chǎn)生一接合管,在接合管中部產(chǎn)生一個(gè)透明、淺褐色的長(zhǎng)橢圓形孢子,成熟的孢子由4~6個(gè)橫隔,2~3個(gè)縱隔。其生長(zhǎng)方式類似于藻類水綿的接合生殖,但不同于根霉的有性生殖。
本發(fā)明的新菌株CGMCC 0899除能產(chǎn)生本發(fā)明的新化合物外,還能產(chǎn)生抗癌藥物紫杉醇。
本發(fā)明提供的一種應(yīng)用本發(fā)明的新菌株CGMCC 0899生產(chǎn)本發(fā)明的式(I)新化合物的方法,其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明菌株CGMCC 0899以使在所述菌株細(xì)胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集本發(fā)明的式(I)新化合物,以及從所述細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中回收并提純式(I)新化合物。
所述培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可含有碳源、氮源物質(zhì)。還可以向培養(yǎng)基中加入其它有機(jī)或無(wú)機(jī)物質(zhì)以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和提高本發(fā)明的式(I)新化合物的產(chǎn)率。所述碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘油、淀粉、乳糖、半乳糖??墒褂玫牡窗ǖ幌抻诨ㄉ?、黃豆粉、玉米漿、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸銨、氯化銨。碳源與氮源的比例可以優(yōu)選為150∶1~40∶1。所述的無(wú)機(jī)物包括但不限于磷酸鹽,鎂鹽,例如硫酸鎂,鐵鹽,例如硫酸亞鐵、三氯化鐵,鈉鹽,如酒石酸鉀鈉。所述的培養(yǎng)基可包括但不限于微量元素,例如硼酸、碘化鉀、二氯化鈷、硫酸鋅、硫酸錳,誘導(dǎo)子,例如甲基茉莉酮酸、花生四烯酸、檸檬酸銨、硝酸鈰銨、高錳酸鉀、丙酮酸、對(duì)-香豆酸、硫酸釩、馬尿酸、α-萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、硝酸銀、肉桂酸等,前體物質(zhì),例如苯丙氨酸、苯甲酰胺、苯甲酸鈉、乙酸鈉、乙酰胺、丙酰胺、苯甲酸、乙酸銨等。
所述的培養(yǎng)可以在本領(lǐng)域的常規(guī)或已知條件下進(jìn)行。所述的發(fā)酵可以在需氧條件下,溫度可以為23~29℃,發(fā)酵初始pH值可為5.5~11.0,優(yōu)選6.0~7.0,在發(fā)酵中后期可調(diào)節(jié)pH值為6.0~7.5。培養(yǎng)時(shí)間依培養(yǎng)條件而定,例如,發(fā)酵可進(jìn)行6~9天。在所述發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)選在接種時(shí)加入誘導(dǎo)子甲基茉莉酮酸、花生四烯酸、檸檬酸銨、硝酸鈰銨、高錳酸鉀;優(yōu)選其濃度為(占培養(yǎng)基)0.005%~0.1%。在所述發(fā)酵過(guò)程中,菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí),可加入前體物質(zhì)苯丙氨酸、苯甲酰胺、苯甲酸鈉、乙酸鈉、乙酰胺等物質(zhì);優(yōu)選其濃度為(占培養(yǎng)基)0.005%~0.1%。在發(fā)酵過(guò)程中可用堿性溶液調(diào)節(jié)pH值。
所述的發(fā)酵過(guò)程可以在本領(lǐng)域常規(guī)或已知的裝置和條件下進(jìn)行,例如可使用搖瓶在本領(lǐng)域常規(guī)或已知的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行;也可以在常規(guī)的發(fā)酵罐中進(jìn)行,例如7L、50L發(fā)酵罐。
在所述發(fā)酵過(guò)程中需要使用7L、50L發(fā)酵罐時(shí),可在發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)充碳源,在發(fā)酵前期不用調(diào)節(jié)pH值,在發(fā)酵中后期可調(diào)節(jié)pH值為6.0~7.0??梢圆捎镁z體進(jìn)罐的接種方式。在接種后到菌體生長(zhǎng)至平臺(tái)前期可使用較大通氣量,平臺(tái)期后通氣量可降低。
為了從培養(yǎng)基中分離出本發(fā)明的式(I)新化合物,可以使用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的用于從微生物的培養(yǎng)基中分離代謝物的任何分離方法。例如,菌絲體可以通過(guò)離心或過(guò)濾從發(fā)酵液中分離出來(lái),本發(fā)明的式(I)新化合物可以用一種或一種以上不與水相混的有機(jī)溶劑(例如鹵化烴如二氯甲烷、三氯甲烷等)從濾液中萃取出來(lái)。另一方面,分離出的菌絲體中所包含的本發(fā)明的式(I)新化合物可以通過(guò)例如用一種或一種以上有機(jī)溶劑(例如丙酮、乙酸乙酯或甲醇)從菌絲體中提取出來(lái)。所得本發(fā)明的式(I)新化合物粗產(chǎn)物可以使用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的純化方法純化,例如色譜法、結(jié)晶法。
從所述細(xì)胞和培養(yǎng)基中提取和純化本發(fā)明的式(I)新化合物的方法可包括以下步驟(1)將所述培養(yǎng)過(guò)程所得培養(yǎng)液分離出發(fā)酵菌體和發(fā)酵上清液;(2)用第一有機(jī)溶劑提取所得的發(fā)酵菌體,用第二有機(jī)溶劑萃取所得的發(fā)酵上清液,揮干溶劑;(3)將第(2)步所得物用色譜純化的方法和結(jié)晶的方法純化,得產(chǎn)物本發(fā)明的式(I)新化合物。
在所述發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后,可以在室溫或低于室溫的溫度下,優(yōu)選低于室溫,用稀酸或稀堿溶液調(diào)節(jié)所得發(fā)酵液的pH值為2~9,正?;虮芄庀?,優(yōu)選避光,進(jìn)行預(yù)處理后再進(jìn)行所述分離過(guò)程。所述第(1)步中可以按本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行分離,例如,將所得發(fā)酵液離心或過(guò)濾。
所述第(2)步中可將所得發(fā)酵菌體干燥粉碎后,再用有機(jī)溶劑提取。所述干燥可按照本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行,例如自然干燥、60℃以下溫度下的烘干、真空冷凍干燥等,優(yōu)選真空冷凍干燥,優(yōu)選在避光條件下進(jìn)行。所述從發(fā)酵菌體中提取本發(fā)明的式(I)新化合物用的第一有機(jī)溶劑可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的溶劑,例如丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷等,優(yōu)選用乙酸乙酯。所述從發(fā)酵上清液中萃取本發(fā)明的式(I)新化合物用的第二有機(jī)溶劑可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的溶劑,例如二氯甲烷、三氯甲烷等。所述揮干溶劑可按照本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行,例如自然揮發(fā)、減壓濃縮等。
所述第(3)步中所述的色譜純化可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)或已知的方法進(jìn)行,色譜柱填料可以用硅膠或氧化鋁等,流動(dòng)相可以用正己烷/乙酸乙酯、甲醇/二氯甲烷、乙醇/二氯甲烷、丙酮/二氯甲烷等,也可以使用一個(gè)以上的色譜柱。
所述結(jié)晶的方法是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行。所述結(jié)晶過(guò)程可以是將所得物溶解于甲醇等溶劑中,然后加入一定比例的純水,置4~10℃冰箱中1~12小時(shí),使本發(fā)明的式(I)新化合物晶體析出,過(guò)濾。重復(fù)前述結(jié)晶過(guò)程,直到達(dá)到一定純度,過(guò)濾,真空干燥,即得本發(fā)明的式(I)新化合物純品。所述結(jié)晶過(guò)程也可以是將所得物溶解溶于乙酸乙酯等溶劑中,加入石油醚等溶劑,降溫至4~10℃,使本發(fā)明的式(I)新化合物結(jié)晶析出,過(guò)濾,重復(fù)前述結(jié)晶過(guò)程,直到達(dá)到一定純度,過(guò)濾得到晶體,減壓干燥,即得純化產(chǎn)品。
本發(fā)明的式(I)化合物的體外活性測(cè)定結(jié)果表明,該化合物具有抗腫瘤、抗真菌和抗病毒等生物學(xué)活性。
因此,本發(fā)明還提供一種抗腫瘤的藥物,其含有本發(fā)明的式(I)化合物。
本發(fā)明還提供一種抗真菌的藥物,其含有本發(fā)明的式(I)化合物。
本發(fā)明還提供一種抗病毒的藥物,其含有本發(fā)明的式(I)化合物。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的式(I)化合物在制備抗腫瘤、抗真菌、和/或抗病毒藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物,其含有本發(fā)明的式(I)化合物作為有效成分,并含有常規(guī)或已知的藥學(xué)上可接受的藥用載體。本發(fā)明的藥物組合物可制備成各種常規(guī)或已知的劑型。
由于本發(fā)明新化合物的獨(dú)特空間結(jié)構(gòu),使其具有與前述結(jié)構(gòu)式(b)的已有化合物顯著不同的、而由前述結(jié)構(gòu)式(b)的已有化合物的已知性能無(wú)法料想到的、獨(dú)特的生物學(xué)活性。結(jié)構(gòu)式(b)的已有化合物被認(rèn)為是一種β-1,3-葡聚糖(β-1,3-glucan)生物合成抑制劑,結(jié)構(gòu)式(a)的已有化合物被認(rèn)為是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明新化合物則對(duì)胃癌、白血病、卵巢癌等多種癌癥具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性,同時(shí),該物質(zhì)還有高效抗真菌(例如紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白色念珠菌、枯草桿菌等致病菌)、抗病毒的生物活性,作為新一代的抗癌藥物、抗真菌藥物和抗病毒藥物,應(yīng)用前景廣闊。


圖1、2顯示的是本發(fā)明的新菌株的孢子。
圖3顯示的是本發(fā)明的新菌株的菌絲體。
圖4是本發(fā)明方法制得的式(I)化合物樣品的TLC圖。
圖5是本發(fā)明方法制得的式(I)化合物樣品的HPLC圖譜。
圖6是本發(fā)明方法制得的式(I)化合物樣品的UV圖譜。
圖7是本發(fā)明方法制得的式(I)化合物樣品的IR圖譜。
圖8是本發(fā)明方法制得的式(I)化合物樣品的FAB-MS圖譜。
圖9是本發(fā)明方法制得的式(I)化合物樣品的系列NMR圖譜包括1H-NMR(圖9A)、13C-NMR(圖9B)和1H-1H COSY譜(圖9C)。
圖10是本發(fā)明方法制得的式(I)化合物的X-光衍射圖。
圖11是本發(fā)明的式(I)化合物對(duì)不同細(xì)胞殺傷百分率曲線。
圖12是本發(fā)明的式(I)化合物對(duì)人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的曲線。
具體實(shí)施例方式
下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述,這些描述并不是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解,對(duì)本發(fā)明技術(shù)特征所作的等同替換,或相應(yīng)的改進(jìn),仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1 從紅豆杉樹(shù)樣品分離產(chǎn)紫杉醇的微生物我們從云南省麗江地區(qū)的老君山海拔2500~3000米的針闊混交林中的7株300年以上的云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)樹(shù)的樹(shù)枝、樹(shù)皮、葉和根皮采集樣品310個(gè),各剪成1cm×1cm大小的小塊,經(jīng)50~90%酒精消毒5分鐘后,用勻漿器勻漿,之后,涂布于PDA培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)4-5天后,長(zhǎng)出的菌絲轉(zhuǎn)移到斜面,20℃~35℃培養(yǎng)4天,取1cm2菌體接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(250ml三角瓶裝量100ml,培養(yǎng)基配方葡萄糖2%、黃豆餅粉0.5%、花生餅粉0.2%、MgSO40.01%、KH2PO40.05%),25℃,300rpm于搖床培養(yǎng)16天,用雙層紗布過(guò)濾,得濕菌體,濕菌體于烘箱中(60℃)烘干,再用乙酸乙酯浸提(20克干菌體加入100ml氯仿)12小時(shí),真空濃縮至干得浸膏樣品,加入1ml甲醇溶液,取5ul點(diǎn)樣于硅膠平板上,在三種不同層析系統(tǒng)中展開(kāi)(乙酸乙酯∶異丙醇=95∶5v/v,氯仿∶甲醇=7∶3v/v,氯仿∶乙腈=7∶3v/v)之后60℃、30分鐘烘干,用5%硫酸的乙醇溶液(v/v)顯色,挑選與式(I)化合物和紫杉醇相同遷移率的斑點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的菌體,進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定,得到紅豆杉樹(shù)內(nèi)分離出的微生物菌種(細(xì)菌、真菌),最終鑒定、選出能產(chǎn)式(I)化合物和紫杉醇的內(nèi)生真菌。
實(shí)施例2 產(chǎn)式(I)化合物的新菌株的純化鑒定按實(shí)施例1所得到產(chǎn)紫杉醇幾種菌株在PDA培養(yǎng)基平板上分離純化三代(20~35℃,4~10天)之后,得到ST-026菌株。ST-026菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速,產(chǎn)生豐富的孢子,孢子通常黑色或橄欖綠色。分生孢子梗直接從瓊脂培養(yǎng)基長(zhǎng)出,并在菌絲的側(cè)枝上長(zhǎng)出分枝的分生孢子鏈,孢子鏈由50-70個(gè)孢子組成,最初的孢子直接從孢子梗產(chǎn)生,或從1-2個(gè)孢子土面產(chǎn)生,孢子棒狀,卵形橢圓形,大小約為22-31(25)×9-13(11)UM,有4-5個(gè)橫隔,2-3個(gè)比值隔或斜的隔膜。最初形成的幼孢子為狹卵圓形,有密集的、細(xì)小的疣突起物,這種密集的突起物致使在100倍顯微鏡下看不清孢子內(nèi)部的橫隔。菌絲通常無(wú)色或橄欖綠色,分隔,平直,菌絲細(xì)胞長(zhǎng)約為寬的5倍左右,菌絲分枝初時(shí)為水平狀分枝,頂端細(xì)長(zhǎng)、尖。根據(jù)以上特征和KEISSLER 1912年建立的鏈格孢屬的模式種ALTERMARIA ALTERNATA相對(duì)照,將這個(gè)菌株鑒定為鏈格孢屬的鏈格孢。
以該菌株為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變,經(jīng)12代誘變得一形態(tài)變異菌株UV-012,再以UV-012為出發(fā)菌株繼承誘變,得一產(chǎn)式(I)化合物和紫杉醇較穩(wěn)定的單孢菌株,代號(hào)為ST-026。以上形態(tài)變異經(jīng)5代傳代培養(yǎng)較穩(wěn)定。根據(jù)植物命名法規(guī)命名為鏈格孢單孢變種,學(xué)名為Alternaria alernatavar.monosporus,代號(hào)為ST-026-R,菌種保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,地址北京市中關(guān)村北一橋13號(hào),保藏號(hào)為CGMCC No.0899。
實(shí)施例3 種子培養(yǎng)接種實(shí)施例2所得CGMCC No.0899凍干菌至裝有100ml種子培養(yǎng)基(見(jiàn)表1)的250ml三角瓶中,于20~30℃,100-300rpm搖床培養(yǎng)24-28小時(shí),即得待接種的菌種。
表1種子培養(yǎng)基

實(shí)施例4 搖瓶發(fā)酵將實(shí)施例2所得菌種在斜面種子培養(yǎng)基PDA上培養(yǎng)。采用孢子直接接種的方法,將種齡7天的菌種按接種量2×106個(gè)孢子/100ml培養(yǎng)基,接種到培養(yǎng)基(含蔗糖50g/L,黃豆餅粉2.5g/L,酵母粉0.5g/L,硫酸鎂0.3g/L,磷酸二氫鉀0.35g/L,磷酸氫二鉀0.56g/L,VB110mg/L,三氯化鐵2mg/L,硫酸錳5mg/L,硫酸鋅2.5mg/L,碘化鉀0.7mg/L,硼酸1.4mg/L,pH6.8)中。接種時(shí)加入誘導(dǎo)子花生四烯酸(濃度0.01%)、硝酸鈰銨(濃度0.02%)、高錳酸鉀(濃度0.02%)。
裝量為100ml/250ml三角瓶、培養(yǎng)溫度為25℃、轉(zhuǎn)速150rpm。接種后第4天加入0.005%苯甲酰胺、0.01%苯丙氨酸、0.04%乙酸鈉。發(fā)酵周期為9天。按照實(shí)施例24的方法純化產(chǎn)物。結(jié)果菌體生物量為50g/L,目標(biāo)產(chǎn)物式(I)化合物的產(chǎn)量為780mg/L。
實(shí)施例5至8 搖瓶發(fā)酵按照實(shí)施例4的方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,只是培養(yǎng)基分別為實(shí)施例5蔗糖50g/L、黃豆餅粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.06g/L、碳酸鈣1.2g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH 6.8。結(jié)果菌體生物量為45g/L,目標(biāo)產(chǎn)物式(I)化合物的產(chǎn)量為700mg/L。
實(shí)施例6葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、黃豆餅粉10g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.1g/L、維生素B110mg/L、磷酸氫二鉀0.56g/L、磷酸二氫鉀0.35g/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH 6.8。結(jié)果菌體生物量為48g/L,目標(biāo)產(chǎn)物式(I)化合物的產(chǎn)量為750mg/L。
實(shí)施例7蔗糖40g/L、黃豆餅粉5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂1g/L、磷酸氫二鉀0.6g/L、酒石酸鉀鈉5g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH 6.8。結(jié)果菌體生物量為50g/L,目標(biāo)產(chǎn)物式(I)化合物的產(chǎn)量為760mg/L。
實(shí)施例8葡萄糖5g/L、蔗糖20g/L、可溶性淀粉10g/L、黃豆餅粉3g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.1g/L、維生素B110mg/L、磷酸氫二鉀0.56g/L、磷酸二氫鉀0.35g/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH 6.8。結(jié)果菌體生物量為47g/L,目標(biāo)產(chǎn)物式(I)化合物的產(chǎn)量為760mg/L。
接種時(shí)加入誘導(dǎo)子的量分別為實(shí)施例5花生四烯酸0.005%、硝酸鈰銨0.06%、高錳酸鉀0.01%;實(shí)施例6甲基茉莉酮酸0.01%、硝酸鈰銨0.006、高錳酸鉀0.02%;實(shí)施例7花生四烯酸0.05%、檸檬酸銨0.005%、高錳酸鉀0.008%;實(shí)施例8檸檬酸銨0.05%、硝酸鈰銨0.02%。
接種后第4天加入的前提物質(zhì)分別為實(shí)施例5苯甲酰胺0.008%、苯丙氨酸0.02%、乙酸鈉0.02%;實(shí)施例6苯丙氨酸0.007%、苯甲酸鈉0.05%、乙酰胺0.01%;實(shí)施例7苯甲酰胺0.02%、乙酸鈉0.03%、乙酰胺0.005%;實(shí)施例8苯丙氨酸0.002%、乙酸鈉0.01%、乙酰胺0.09%。
實(shí)施例9 7L罐發(fā)酵按照實(shí)施例3的方法,只是溫度為25℃,150rpm、培養(yǎng)24小時(shí),得到一級(jí)種子的菌絲體,采用菌絲體進(jìn)罐方法,接種量10%,接種到7L發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基(葡萄糖10g/L,蔗糖20g/L,黃豆餅粉2.5g/L,酵母粉0.5g/L,硫酸鎂0.3g/L,磷酸二氫鉀0.35g/L,磷酸氫二鉀0.56g/L,VB110mg/L,三氯化鐵2mg/L,硫酸錳5mg/L,硫酸鋅2.5mg/L,碘化鉀0.7mg/L,硼酸1.4mg/L,pH6.8)中。在接種同時(shí)加入誘導(dǎo)子花生四烯酸(占培養(yǎng)基濃度0.01%)、硝酸鈰銨(0.02%)、高錳酸鉀(0.02%)。發(fā)酵過(guò)程中前期pH值自然(不用控制),菌體生長(zhǎng)達(dá)平臺(tái)期后24小時(shí)后,用2N的氫氧化鈉溶液控制pH值在6.0~7.0之間。在接種后到菌體生長(zhǎng)至平臺(tái)前期通氣量要求較大,例如控制溶氧值達(dá)30%以上,平臺(tái)期后通氣量降低,例如控制溶氧值達(dá)20%以下,有利于式(I)新化合物的合成。于接種后36小時(shí)用流加方法加入1%的蔗糖,持續(xù)24小時(shí)。于接種后第6天一次性加入2%的蔗糖和2%的麥芽糖。在發(fā)酵到96小時(shí),一次性加入前體物質(zhì)0.005%苯甲酰胺、0.01%苯丙氨酸、0.04%乙酸鈉。發(fā)酵周期為9天。結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為805mg/L。
實(shí)施例10 7L罐發(fā)酵菌種為實(shí)施例2所得菌種用常規(guī)孢子培養(yǎng)基(大米、葡萄糖、瓊脂)于23~29℃培養(yǎng)5~9天的菌種斜面,接種量為2×107個(gè)孢子/1L培養(yǎng)基。采用孢子直接進(jìn)罐的方法,將所得孢子接種到7L發(fā)酵罐的培養(yǎng)基(葡萄糖10g/L、蔗糖20g/L、黃豆餅粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L硫酸鎂0.3g/L、磷酸二氫鉀0.35g/L、磷酸氫二鉀0.56g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)中,接種時(shí)加入0.01%的乙酰胺。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程用2N的氫氧化鈉和2N的鹽酸控制pH6.0~7.0,在接種后到生長(zhǎng)平臺(tái)后期通過(guò)調(diào)整通氣量控制溶氧值在30%以上,在生長(zhǎng)平臺(tái)后期以后控制溶氧值在20%以下。并于接種后36小時(shí),用流加的方法加入1%蔗糖,持續(xù)24小時(shí);于接種后第6天流加1%的培養(yǎng)基,持續(xù)24小時(shí),在發(fā)酵到生長(zhǎng)平臺(tái)后期加前體0.1%的乙酰胺。發(fā)酵周期為9天。結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物產(chǎn)量為760mg/L。
實(shí)施例11 7L罐發(fā)酵按照實(shí)施例10的方法發(fā)酵,只是發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖50g/L、黃豆餅粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.06g/L、碳酸鈣3.0g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8。接種時(shí)加入誘導(dǎo)子為乙酰胺(占培養(yǎng)基濃度0.09%)、高錳酸鉀(0.01%)、硝酸鈰銨(0.01%)、花生四烯酸(0.005%)。發(fā)酵過(guò)程中用2N氫氧化鈉和2N鹽酸控制pH6.0~7.0之間。在接種后至生長(zhǎng)平臺(tái)后期,溶氧值控制在30%以上,平臺(tái)后期以后控制溶氧值在20%以下,并于生長(zhǎng)平臺(tái)后期一次性加前體0.1%乙酰胺,發(fā)酵周期為9天。結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為755mg/L。
實(shí)施例12 7L罐發(fā)酵按照實(shí)施例3的方法培養(yǎng)種子,種子培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L、黃豆餅粉5g/L、花生餅粉2g/L、硫酸鎂0.1g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L,pH6.8。種子于25℃,250rpm培養(yǎng)16小時(shí)。
采用常規(guī)的菌絲體進(jìn)罐方法,將所得種子接種于7L發(fā)酵罐中,接種量為15%,發(fā)酵培養(yǎng)基為(蔗糖20g/L、黃豆餅粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.06g/L、碳酸鈣3.0g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接種時(shí)加入誘導(dǎo)子乙酰胺(占培養(yǎng)基濃度0.01%)、高錳酸鉀(0.002%)、硝酸鈰銨(0.005%)、花生四烯酸(0.005%)。發(fā)酵過(guò)程中用2N氫氧化鈉和2N鹽酸控制pH6.0~7.0之間。在接種后至生長(zhǎng)平臺(tái)后期,溶氧值控制在30%以上,平臺(tái)后期以后控制溶氧值在20%以下。接種后36小時(shí)開(kāi)始流加2%蔗糖,持續(xù)24小時(shí),于96小時(shí)一次性加入前體0.1%乙酰胺,同時(shí)流加1%培養(yǎng)基,持續(xù)12小時(shí)。發(fā)酵周期為9天,結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為758mg/L。
實(shí)施例13 7L罐發(fā)酵按照實(shí)施例12的方法進(jìn)行7L罐發(fā)酵,只是接種時(shí)加入誘導(dǎo)子高錳酸鉀(0.02%)、硝酸鈰銨(0.05%)、花生四烯酸(0.005%);接種后36小時(shí)開(kāi)始流加2%蔗糖,持續(xù)24小時(shí),于96小時(shí)一次性加入前體0.01%苯丙氨酸、0.04%苯甲酸鈉,0.01%乙酰胺,同時(shí)流加1%的培養(yǎng)基,發(fā)酵周期為9天,結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為765mg/L。
實(shí)施例14 50L罐發(fā)酵按照實(shí)施例3的方法培養(yǎng)種子,將所得一級(jí)種子接種到培養(yǎng)基(葡萄糖10g/L,蔗糖20g/L,黃豆餅粉2.5g/L,酵母粉0.5g/L,硫酸鎂0.3g/L,磷酸二氫鉀0.35g/L,磷酸氫二鉀0.56g/L,VB110mg/L,三氯化鐵2mg/L,硫酸錳5mg/L,硫酸鋅2.5mg/L,碘化鉀0.7mg/L,硼酸1.4mg/L,pH6.8)中。在接種同時(shí)加入誘導(dǎo)子花生四烯酸(0.01%)、硝酸鈰銨(0.05%)、高錳酸鉀(0.02%)。發(fā)酵過(guò)程中前期pH自然(8.0)。于接種后36小時(shí)用流加方法加入1%的蔗糖和0.2%酵母粉,持續(xù)24小時(shí)。于接種后第6天一次性加入2%的蔗糖和2%的麥芽糖。在發(fā)酵到96小時(shí),一次性加入前體物質(zhì)0.005%苯甲酰胺、0.01%苯丙氨酸、0.04%乙酸鈉。加完前體后,用2N的氫氧化鈉溶液控制pH值在6.0~7.0之間。發(fā)酵周期為9天。在接種后到菌體生長(zhǎng)至平臺(tái)前期通氣量要求較大,如控制溶氧值達(dá)30%以上,平臺(tái)期后通氣量降低,如控制溶氧值達(dá)20%以下,有利于式(I)新化合物的合成。結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為780mg/L。
實(shí)施例15 50L罐發(fā)酵按照實(shí)施例14的方法進(jìn)行50L罐發(fā)酵,只是有以下不同種子培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L、黃豆餅粉5g/L、花生餅粉2g/L、硫酸鎂0.1g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L,pH6.8。種子于25℃,250rpm培養(yǎng)16小時(shí)。
采用常規(guī)的菌絲體進(jìn)罐方法,將所得菌絲體接種到50L發(fā)酵罐中,接種量為15%,發(fā)酵培養(yǎng)基為(葡萄糖10g/L、蔗糖20g/L、黃豆餅粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.06g/L、碳酸鈣3.0g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接種時(shí)加入誘導(dǎo)子乙酰胺(0.01%)、高錳酸鉀(0.02%)、硝酸鈰銨(0.05%)、花生四烯酸(0.005%);發(fā)酵過(guò)程中用2N氫氧化鈉和2N鹽酸控制pH6.0~7.0之間。在接種后至生長(zhǎng)平臺(tái)后期,溶氧值控制在30%以上,平臺(tái)后期以后控制溶氧值在20%以下。接種后36小時(shí)開(kāi)始流加2%蔗糖+0.1%酵母提取物,持續(xù)24小時(shí),于96小時(shí)一次性加入前體0.1%乙酰胺,同時(shí)流加1%培養(yǎng)基,持續(xù)12小時(shí)。發(fā)酵周期為9天,結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為740mg/L。
實(shí)施例16 50L罐發(fā)酵按照實(shí)施例14的方法進(jìn)行50L罐發(fā)酵,只是有以下不同種子培養(yǎng)基為葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、黃豆餅粉5g/L、花生餅粉2g/L、硫酸鎂0.1g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L,pH6.8。種子于25℃,250rpm培養(yǎng)16小時(shí)。
采用常規(guī)的菌絲體進(jìn)罐方法,將所得菌絲體接種到50L發(fā)酵罐中,接種量為15%,發(fā)酵培養(yǎng)基為(葡萄糖10g/L、蔗糖40g/L、黃豆餅粉5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.06g/L、碳酸鈣3.0g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接種時(shí)加入誘導(dǎo)子乙酰胺(0.01%)、高錳酸鉀(0.02%)、硝酸鈰銨(0.05%)、花生四烯酸(0.005%);發(fā)酵過(guò)程中用2N氫氧化鈉和2N鹽酸控制pH6.0~7.0之間。在接種后至生長(zhǎng)平臺(tái)后期,溶氧值控制在30%以上,平臺(tái)后期以后控制溶氧值在20%以下。于96小時(shí)一次性加入前體0.1%乙酰胺,同時(shí)流加1%培養(yǎng)基,持續(xù)12小時(shí)。發(fā)酵周期為9天,結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為738mg/L。
實(shí)施例17 50L罐發(fā)酵按照實(shí)施例14的方法進(jìn)行50L罐發(fā)酵,只是有以下不同種子培養(yǎng)基為葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、黃豆餅粉5g/L、硫酸鎂0.1g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L,pH6.8,也可為常規(guī)種子培養(yǎng)基。種子于25℃,250rpm培養(yǎng)16小時(shí)。
采用常規(guī)的菌絲體進(jìn)罐方法,將所得菌絲體接種到50L發(fā)酵罐中,接種量為15%,發(fā)酵培養(yǎng)基為(蔗糖50g/L、黃豆餅粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.06g/L、碳酸鈣3.0g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接種時(shí)加入誘導(dǎo)子乙酰胺(0.03%);發(fā)酵過(guò)程中用2N氫氧化鈉和2N鹽酸控制pH6.0~7.0之間。在接種后至生長(zhǎng)平臺(tái)后期,溶氧值控制在30%以上,平臺(tái)后期以后控制溶氧值在20%以下。于96小時(shí)一次性加入前體0.1%乙酰胺,同時(shí)流加1%培養(yǎng)基,持續(xù)12小時(shí)。發(fā)酵周期為9天,結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為725mg/L。
實(shí)施例18 50L罐發(fā)酵按照實(shí)施例14的方法進(jìn)行50L罐發(fā)酵,只是有以下不同種子培養(yǎng)基為葡萄糖20g/L、黃豆餅粉5g/L、花生餅粉2g/L、硫酸鎂0.1g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L,pH6.8。種子于25℃,250rpm培養(yǎng)16小時(shí)。
采用常規(guī)的菌絲體進(jìn)罐方法,將所得菌絲體接種到50L發(fā)酵罐中,接種量為15%,發(fā)酵培養(yǎng)基為(葡萄糖10g/L、蔗糖20g/L、黃豆餅粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸鎂0.06g/L、磷酸氫二鉀0.56g/L、磷酸二氫鉀0.35g/L、維生素B110mg/L、三氯化鐵2mg/L、硫酸錳5mg/L、硫酸鋅2.5mg/L、碘化鉀0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。發(fā)酵過(guò)程中用2N氫氧化鈉和2N鹽酸控制pH6.0~7.0之間。在接種后至生長(zhǎng)平臺(tái)后期,溶氧值控制在30%以上,平臺(tái)后期以后控制溶氧值在20%以下。接種后36小時(shí)開(kāi)始流加2%蔗糖+0.1%酵母提取物,持續(xù)24小時(shí),于96小時(shí)一次性加入前體0.01%苯丙氨酸、0.04%苯甲酸鈉、0.05%乙酸鈉,同時(shí)流加1%培養(yǎng)基,持續(xù)12小時(shí)。發(fā)酵周期為9天,結(jié)果終產(chǎn)物式(I)新化合物的產(chǎn)量為730mg/L。
實(shí)施例19至23 產(chǎn)物的分離和純化將實(shí)施例9至13所得發(fā)酵液用板框壓濾機(jī)過(guò)濾,收集過(guò)濾出的發(fā)酵菌體和發(fā)酵上清液。將所得菌體分別通過(guò)自然吹干、真空冷凍干燥、60℃烘干、80℃、100℃烘干,分別得干燥菌體151、146、145、143、142g/7L,將干燥菌體粉碎,分別加入(菌絲體∶溶劑=1∶20)乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯,分別提取24、26、30、30、25小時(shí),減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑得浸膏。實(shí)施例20所得提取浸膏的TLC圖見(jiàn)圖4,HPLC圖譜見(jiàn)圖5。由圖可見(jiàn)樣品中含有相當(dāng)大含量的式(I)新化合物。圖4、5中箭頭表標(biāo)出的斑點(diǎn)或峰是式(I)新化合物的斑點(diǎn)或峰。
將前面過(guò)濾所得的發(fā)酵上清液加入相同體積的三氯甲烷或二氯甲烷、振搖萃取1~2小時(shí),高速離心(8000rpm,10~30min),靜置10分鐘,分離出有機(jī)溶劑層,減壓濃縮得浸膏。
將前面所得物用流動(dòng)相溶解后,溶液分別裝入色譜柱硅膠或氧化鋁(200~400目,柱徑高(CM)5×40)中,流動(dòng)相分別為1%~10%乙醇/CH2Cl2或甲醇/CH2Cl2、1%~30%丙酮/CH2Cl2、在中壓下梯度洗脫,流速10~40ml/min,收集純化產(chǎn)物,減壓濃縮,得純度約92%的式(I)新化合物。
將所得純度約92%的式(I)新化合物溶于甲醇中,慢慢加入純水,加熱至40~60℃,當(dāng)式(I)新化合物晶體形成時(shí),停止加水,將溶液緩慢降溫至4℃~10℃,過(guò)濾。減壓干燥,即得純度為98%的式(I)新化合物。重復(fù)前述重結(jié)晶過(guò)程2至3次,過(guò)濾,減壓干燥,即得純度為99.5%的式(I)新化合物。
實(shí)施例24-25 產(chǎn)物的分離和純化將實(shí)施例14、15所得發(fā)酵液離心分離,收集發(fā)酵菌體和發(fā)酵上清液。將所得發(fā)酵菌體冷凍干燥,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎為菌粉,干菌粉加入乙酸乙酯中,浸泡振搖12小時(shí),過(guò)濾得提取液,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏。
將所得發(fā)酵上清液分別加入相同體積的三氯甲烷或二氯甲烷,振搖萃取1~2小時(shí),高速離心后分離出有機(jī)溶劑層,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏。
將前面由菌體或發(fā)酵上清液所得物浸膏用流動(dòng)相溶解后,溶液分別裝入色譜柱硅膠或氧化鋁(200~400目,柱徑高(CM)5×40)中,流動(dòng)相分別為1%~10%丙酮/CH2Cl2,在中壓下梯度洗脫,流速20~60ml/min,收集純化產(chǎn)物,減壓干燥,得純度約92%的式(I)新化合物。
將所得純度約92%的式(I)新化合物溶于乙酸乙酯中,緩慢加入1.5~2倍體積的石油醚,當(dāng)式(I)新化合物結(jié)晶出現(xiàn)時(shí),溶液緩慢降溫至4℃~10℃,過(guò)濾,重復(fù)前述重結(jié)晶過(guò)程2~4次,過(guò)濾,減壓干燥,即得純度為99.5%以上的式(I)新化合物。
實(shí)施例26按照實(shí)施例24的方法,對(duì)實(shí)施例4至8及16至18所得物進(jìn)行分離純化,得式(I)新化合物,總回收率為78%。
實(shí)施例27按照實(shí)施例19-26的方法,對(duì)實(shí)施例10至17所得物進(jìn)行分離純化,只是在實(shí)施例10至17所得發(fā)酵液分離前,用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH溶液慢慢滴入發(fā)酵液中,不斷攪拌,調(diào)其pH分別為6.8、6.5(操作時(shí)避光進(jìn)行),5.5,4.5(操作時(shí)避光進(jìn)行),3.0,7.5(操作時(shí)避光進(jìn)行),8.0,6.0(操作時(shí)避光進(jìn)行)。得純化的式(I)新化合物,總回收率為82%。
實(shí)施例28 產(chǎn)物的鑒定對(duì)實(shí)施例19至27所得式(I)新化合物進(jìn)行紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)、X光衍射分析,結(jié)果見(jiàn)圖6至圖9。由圖可見(jiàn)本發(fā)明方法制得的式(I)化合物具有式(I)的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例29 式(I)化合物的體外抗癌細(xì)胞藥效學(xué)研究以下是對(duì)式(I)化合物的體外抗癌細(xì)胞藥效學(xué)研究的試驗(yàn)。
1.檢測(cè)方法MTT法2.培養(yǎng)基含2%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基3.儀器(1).CO2培育箱美國(guó)謝而登(2).318MC型酶標(biāo)儀SANCO上海三科儀器有限公司4.細(xì)胞培養(yǎng)條件溫度37℃;CO2濃度4.7%;培養(yǎng)時(shí)間24-48小時(shí)。
初篩結(jié)果見(jiàn)表1和圖11。圖11顯示了式(I)化合物對(duì)不同細(xì)胞殺傷百分率曲線。
結(jié)果表明實(shí)施例4制得式(I)化合物樣品在5ug/ml的濃度下,對(duì)L1210(小鼠淋巴白血病細(xì)胞)、B16(小鼠黑色素瘤細(xì)胞)、A2780(人卵巢癌細(xì)胞)和MGC(人胃癌細(xì)胞)具有很高的活性,其活性分別達(dá)到97.00%、72.53%、90.91%、85.52%,對(duì)Eca-109(食道癌細(xì)胞)基本沒(méi)有活性,這說(shuō)明本發(fā)明的式(I)化合物對(duì)不同的癌細(xì)胞的殺傷能力具有選擇性,而不是毒性,可開(kāi)發(fā)成抗癌藥物。
表1.式(I)化合物對(duì)不同細(xì)胞殺傷百分率

備注酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為546nm實(shí)施例30 式(I)化合物凍干粉針劑對(duì)人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)治療作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察本發(fā)明式(I)化合物對(duì)人胃癌MGC803裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用及作用強(qiáng)度。
受試物取實(shí)施例4制得的本發(fā)明式(I)化合物1.5g置配液瓶中,加入適量的聚氧乙烯脂肪酸酯和甘露醇,再加入注射用水,充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?,超濾除菌,分裝于100支西林瓶中,于真空冷凍干燥機(jī)中凍干,得式(I)化合物的凍干制劑,15mg/瓶,臨用前用0.9%生理鹽水稀釋至所需濃度。
劑量設(shè)置式(I)化合物的劑量為15mg/kg、10mg/kg及5mg/kg。
動(dòng)物BALB/cA裸小鼠,雌性,40-45日齡,體重18±2g。每組動(dòng)物數(shù)陰性對(duì)照組12只,給藥組6只。
移植瘤人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤,由MGC-803細(xì)胞株接種于裸小鼠皮下而建立。細(xì)胞接種量為5×106,接種形成移植瘤后,在裸小鼠體內(nèi)傳3代后使用。
實(shí)驗(yàn)方法取生長(zhǎng)旺盛期的瘤組織剪切成1.5mm3左右,在無(wú)菌條件下,接種于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下。裸小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑,待腫瘤生長(zhǎng)至100-200mm3后將動(dòng)物隨機(jī)分組。各實(shí)驗(yàn)組于第1、第6天靜脈注射給藥。對(duì)照組給等量生理鹽水。每周2次測(cè)量腫瘤直徑,同時(shí)稱小鼠體重。腫瘤體積(tumor volume,TV)的計(jì)算公式為T(mén)V=1/2×a×b2其中a、b分別表示長(zhǎng)、寬。根據(jù)測(cè)量的結(jié)果計(jì)算出相對(duì)腫瘤體積(relative tumor volume,RTV),計(jì)算公式為RTV=Vt/V0。其中V0為分籠給藥時(shí)(即d0)測(cè)量所得腫瘤體積,Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%),計(jì)算公式如下T/C(%)=(TRTV/CRTV)×100TRTV治療組RTV;CRTV陰性對(duì)照組RTV。
療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)T/C(%)>60%為無(wú)效,T/C(%)<=60%,并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理p<0.05為有效。
結(jié)果和結(jié)論式(I)化合物的凍干粉針劑對(duì)人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)性治療結(jié)果見(jiàn)表2和圖12。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以式(I)化合物的凍干粉針劑15mg/kg于第1、第6天靜脈注射給藥,對(duì)人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用非常明顯,T/C值為0.18%,治療三周后一只荷瘤小鼠腫瘤完全消退。
表2式(I)化合物的凍干粉針劑對(duì)人胃癌MGC-803裸小鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)性治療結(jié)果

實(shí)施例31 式(I)化合物凍干粉針劑的回體法(ex vivo)小鼠對(duì)比實(shí)驗(yàn)對(duì)照組BDF-1小鼠♂6只,腹腔注射L1210(小鼠淋巴白血病細(xì)胞)(未經(jīng)式(I)化合物的凍干粉針劑處理),1×105個(gè)/只,結(jié)果見(jiàn)表3。
回體法(ex vivo)實(shí)驗(yàn)組BDF-1小鼠♂6只,腹腔注射經(jīng)體外用式(I)化合物的凍干粉針劑處理過(guò)的L1210(小鼠淋巴白血病細(xì)胞),1×105個(gè)/只,體內(nèi)不再給藥。體外細(xì)胞處理方法式(I)化合物的凍干粉針劑7.5mg/ml,吸出20ul+0.98ml生理鹽水=150ug/ml,從中吸出67ul(含藥10ug)+L12101.5ml+鹽水0.433ml,每ml L1210細(xì)胞含5ug式(I)化合物,置室溫作用2小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表4。
表3對(duì)照組腹腔注射L1210細(xì)胞(未經(jīng)式(I)化合物處理)

表4回體法(ex vivo)實(shí)驗(yàn)組腹腔注射L1210細(xì)胞(經(jīng)式(I)化合物處理)

以上試驗(yàn)結(jié)果表明在體外經(jīng)式(I)化合物處理過(guò)的L1210(小鼠淋巴白血病細(xì)胞)已全部被殺死,不能使BDF-1小鼠致病。
實(shí)施例32 式(I)化合物凍干粉針劑對(duì)小鼠淋巴白血病細(xì)胞L1210移植模型的實(shí)驗(yàn)治療作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察式(I)化合物對(duì)小鼠淋巴白血病細(xì)胞L1210移植動(dòng)物模型的存活周期的延長(zhǎng)作用。
實(shí)驗(yàn)方法取BDF-1小鼠♀18只,腹腔注射L1210(小鼠淋巴白血病細(xì)胞),1×105個(gè)/只,隨機(jī)分3組,6只/組,各實(shí)驗(yàn)組于第1、第6天皮下注射給藥。對(duì)照組給等量生理鹽水。
受試物式(I)化合物的凍干粉針劑,15mg/瓶,臨用前用0.9%生理鹽水稀釋至所需濃度。
劑量設(shè)置實(shí)驗(yàn)1組皮下注射,50mg/kg式(I)化合物的凍干粉針劑。
實(shí)驗(yàn)2組皮下注射,25mg/kg式(I)化合物的凍干粉針劑。
實(shí)驗(yàn)3組皮下注射,12.5mg/kg式(I)化合物的凍干粉針劑。
結(jié)果和結(jié)論式(I)化合物的凍干粉針劑對(duì)小鼠淋巴白血病細(xì)胞L1210移植動(dòng)物模型存活周期的延長(zhǎng)作用結(jié)果見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以式(I)化合物的凍干粉針劑50mg/kg于第1、第6天皮下注射給藥,對(duì)小鼠淋巴白血病細(xì)胞L1210移植動(dòng)物模型存活周期的延長(zhǎng)作用非常明顯,延長(zhǎng)率達(dá)87%。
表5式(I)化合物的凍干粉針劑對(duì)小鼠淋巴白血病細(xì)胞L1210移植模型存活周期的延長(zhǎng)作用

實(shí)施例33 式(I)化合物的體外抗病毒藥效學(xué)研究以下對(duì)式(I)化合物的體外抗病毒藥效學(xué)研究。
檢測(cè)材料與方法病毒株柯薩奇B3病毒。
樣品處理將實(shí)施例4制得的式(I)化合物樣品臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度,用培養(yǎng)液作3倍稀釋,共8個(gè)稀釋度。
陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑(RBV)測(cè)試方法Veo細(xì)胞種96孔培養(yǎng)板,24小時(shí)后分別感染柯薩奇B3病毒1/210-5(316TCID50感染量)吸附2小時(shí),棄病毒液,按以上稀釋度加入樣品,同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔和病毒對(duì)照孔,36小時(shí)觀察細(xì)胞病變程度(CPE),用Reed-Muench法分別計(jì)算樣品對(duì)柯薩奇B3病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表6。
表6

注(1)表中“-”表示樣品在最大無(wú)毒劑量無(wú)抗柯薩奇B3病毒活性。
(2)TC50半數(shù)有毒濃度;IC50對(duì)病毒半數(shù)抑制濃度;SI選擇指數(shù),SI=TC50/IC50。
由表可見(jiàn),測(cè)試結(jié)果顯示本發(fā)明制得新化合物樣品具有抗柯薩奇B3病毒作用。
實(shí)施例34 式(I)化合物的體外抗真菌藥效學(xué)研究以下對(duì)式(I)化合物的體外抗真菌藥效學(xué)研究。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察式(I)化合物對(duì)紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白色念珠菌、枯草桿菌等致病菌的殺傷作用。
實(shí)驗(yàn)方法與操作MTT法。
菌懸液的制備用培養(yǎng)基制備孢子懸液使菌濃為2×103個(gè)/ml。紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白色念珠菌、枯草桿菌等孢子,紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白色念珠菌的培養(yǎng)基為“沙氏培養(yǎng)基”(廣東環(huán)凱微生物科技公司),枯草桿菌的培養(yǎng)基為“細(xì)菌培養(yǎng)基”(廣東環(huán)凱微生物科技公司)。
樣品濃度及稀釋方法實(shí)施例4制備的式(I)化合物樣品濃度①2mg/ml;②1mg/ml;③0.5mg/ml;④0.25mg/ml。
樣品使用量每孔50ul。
結(jié)果和結(jié)論式(I)化合物對(duì)紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白色念珠菌、枯草桿菌等致病菌的均有顯著的殺菌作用。結(jié)果見(jiàn)表7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以式(I)化合物用量≥50ug/孔時(shí),其殺菌作用達(dá)99%以上。
表7式(I)化合物對(duì)紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白色念珠菌、枯草桿菌等致病菌的殺傷作用
權(quán)利要求
1.一種具有以下結(jié)構(gòu)式(I)的化合物。
2.一種能生產(chǎn)權(quán)利要求1所述(I)化合物的微生物,鏈格孢單孢變種(Alternaria alternate var.monosporus)ST-026-R CGMCC No.0899。
3.一種制備權(quán)利要求1所述式(I)化合物的方法,其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求2所述微生物以使在所述微生物細(xì)胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集式(I)化合物,以及從所述細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中回收并提純式(I)化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于所述培養(yǎng)基含有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘油、淀粉、乳糖、半乳糖和其他有助于所述微生物生長(zhǎng)的常規(guī)或已知碳源物質(zhì)中一種或一種以上的碳源物質(zhì),以及于花生粉、黃豆粉、玉米漿、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸銨、氯化銨和其他有助于所述微生物生長(zhǎng)的常規(guī)或已知氮源物質(zhì)中一種或一種以上的氮源物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于所述培養(yǎng)基還含有磷酸鹽、鎂鹽、鐵鹽、鈉鹽和/或其他有助于所述微生物生長(zhǎng)的常規(guī)或已知無(wú)機(jī)或有機(jī)鹽物質(zhì);和/或硼酸、碘化鉀、二氯化鈷、硫酸鋅、硫酸錳和其他有助于所述微生物生長(zhǎng)的常規(guī)或已知微量元素中的一種或一種以上的微量元素。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于所述培養(yǎng)基還含有甲基茉莉酮酸、花生四烯酸、檸檬酸銨、硝酸鈰銨、高錳酸鉀、丙酮酸、對(duì)-香豆酸、硫酸釩、馬尿酸、α-萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、硝酸銀、肉桂酸和其他有助于所述微生物生長(zhǎng)的常規(guī)或已知誘導(dǎo)子物質(zhì)中的一種或一種以上的誘導(dǎo)子物質(zhì);和/或苯丙氨酸、苯甲酰胺、苯甲酸鈉、乙酸鈉、乙酰胺、丙酰胺、苯甲酸、乙酸銨和其他有助于所述微生物生長(zhǎng)的常規(guī)或已知前體物質(zhì)中的一種或一種以上的前體物質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于所述培養(yǎng)基含有選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、甘油、淀粉、乳糖、半乳糖中一種或一種以上的碳源物質(zhì);選自花生粉、黃豆粉、玉米漿、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸銨、氯化銨中一種或一種以上的氮源物質(zhì);磷酸鹽、鎂鹽、鐵鹽、和/或鈉鹽;選自硼酸、碘化鉀、二氯化鈷、硫酸鋅、硫酸錳中的一種或一種以上的微量元素;選自甲基茉莉酮酸、花生四烯酸、檸檬酸銨、硝酸鈰銨、高錳酸鉀、丙酮酸、對(duì)-香豆酸、硫酸釩、馬尿酸、α-萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、硝酸銀、肉桂酸中的一種或一種以上的誘導(dǎo)子物質(zhì);以及選自苯丙氨酸、苯甲酰胺、苯甲酸鈉、乙酸鈉、乙酰胺、丙酰胺、苯甲酸、乙酸銨中的一種或一種以上的前體物質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任何之一所述的方法,其特征在于所述的培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行,溫度為23~29℃,發(fā)酵初始pH值為5.5~11.0,在發(fā)酵中后期調(diào)節(jié)pH值為6.0~7.5;如果所述的微生物是在7L、50L或其他相當(dāng)?shù)某R?guī)或已知發(fā)酵罐中發(fā)酵,接種方式采用常規(guī)或菌絲體進(jìn)罐的接種方式,在所述發(fā)酵過(guò)程中流加補(bǔ)充碳源和/或氮源,在發(fā)酵前期不用調(diào)節(jié)pH值。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法,其特征在于所述的誘導(dǎo)子物質(zhì)是在接種時(shí)加入,其濃度為(占培養(yǎng)基)0.005%~0.1%;所述的前體物質(zhì)是在所述微生物發(fā)酵過(guò)程中,菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期加入,其濃度為(占培養(yǎng)基)0.005%~0.1%。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任何之一所述的方法,其特征在于所述的回收并提純式(I)化合物的步驟包括以下步驟(1)將所述培養(yǎng)過(guò)程所得培養(yǎng)液分離出發(fā)酵菌體和發(fā)酵上清液;(2)用第一有機(jī)溶劑提取所得的發(fā)酵菌體,用第二有機(jī)溶劑萃取所得的發(fā)酵上清液,揮干溶劑;(3)將第(2)步所得物用色譜純化的方法和結(jié)晶的方法純化,得產(chǎn)物式(I)化合物;所述的第(3)步驟中所述的色譜純化方法中使用一個(gè)或一個(gè)以上的色譜柱,色譜柱填料包括硅膠或氧化鋁,流動(dòng)相包括正己烷/乙酸乙酯、甲醇/二氯甲烷、乙醇/二氯甲烷、丙酮/二氯甲烷;所述的第(3)步驟中所述的結(jié)晶方法是將待純化物溶解于甲醇溶劑中,加入水,置4~10℃冰箱中1~12小時(shí),使式(I)化合物晶體析出,過(guò)濾;或?qū)⒋兓锶芙馊苡谝宜嵋阴ト軇┲?,加入石油醚,降溫?~10℃,使式(I)化合物結(jié)晶析出,過(guò)濾;前述的結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行一次或一次以上;干燥,即得純式(I)化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其特征在于在所述的第(1)步驟前用酸或堿溶液調(diào)節(jié)所述培養(yǎng)過(guò)程所得培養(yǎng)液的pH值為2~9。
12.含有權(quán)利要求1所述的式(I)化合物的藥物組合物。
13.一種抗腫瘤的藥物,其含有權(quán)利要求1所述的式(I)化合物。
14.一種抗真菌的藥物,其含有權(quán)利要求1所述的式(I)化合物。
15.一種抗病毒的藥物,其含有權(quán)利要求1所述的式(I)化合物。
16.權(quán)利要求1所述的式(I)化合物在制備抗腫瘤、抗真菌、和/或抗病毒藥物中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求1所述的式(I)化合物在制備治療包括淋巴白血病、黑色素瘤細(xì)胞、卵巢癌、胃癌等疾病的藥物,及抗柯薩奇B3病毒、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、白色念珠菌、枯草桿菌等的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的新化合物。本發(fā)明還提供一種能生產(chǎn)式(I)新化合物的新菌種,鏈格孢單孢變種(Altemaria alternate var.monosporus)ST-026-R CGMCC No.0899。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明菌株以使在所述菌株細(xì)胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集本發(fā)明的式(I)新化合物,從所述細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中回收、提純,即得本發(fā)明的式(I)新化合物。該化合物具有很好的抗癌、抗真菌、抗病毒等生物學(xué)活性。
文檔編號(hào)C12P17/02GK1880309SQ20051010566
公開(kāi)日2006年12月20日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月29日
發(fā)明者陳杰鵬, 王榮華, 鄧士謹(jǐn), 段麗麗, 趙素蘭, 邱雪蓮, 韋少明, 程首先, 陳沛澤, 李潔, 鄭卓君 申請(qǐng)人:汕頭市雙駿生物科技有限公司, 海逸生物科技私人有限公司
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