專利名稱：一種培育抗旱性增強的黑麥草的方法
技術領域：
本發(fā)明的目的是提供一種培育抗旱性增強的黑麥草的方法。
背景技術：
我國北方屬于干旱半干旱地區(qū)，由于降水不足、淋溶作用弱、地下水的蒸發(fā)和蒸騰強烈或降雨給土壤帶入鹽分，土壤的干旱、鹽漬化問題非常嚴重。這一問題在草坪草上的具體表現(xiàn)就是造成泛斑、春季發(fā)芽晚、秋季早衰、生長不良等現(xiàn)象發(fā)生，影響草坪的美觀，降低草坪的價值。目前北方城市綠化用的草坪草品種盡管本身具有一定的防御干旱、低溫的能力，但是由于草坪種植對土壤和水分的要求過高，造成了種植、管理的成本太大，這些因素嚴重限制了草坪草的使用，又因其在保持水土、防止沙塵、城市綠化方面有著不可替代的作用，所以，研究培育出新型抗干旱草坪草品種顯得由為緊迫。由于干旱脅迫抗性屬于數(shù)量性狀，采用常規(guī)育種技術培育抗旱品種，耗時費力，困難大。與傳統(tǒng)育種方法相比，利用分子育種，改良或增加一個關鍵的轉錄因子可以提高植株多方面的抗逆性。
植物在受到逆境(干旱、高鹽、低溫)脅迫時，會產(chǎn)生一系列蛋白來保護自已免受傷害，以維持活力。目前，利用模式植物擬南芥菜研究逆境因素誘導產(chǎn)生的系列蛋白頗為深入，Mie Kasuga等發(fā)現(xiàn)擬南芥菜在受到干旱、高鹽、低溫等逆境因素脅迫時，會激活與之相關的轉錄因子如DREB(DRE，dehydration responsiveelement，binding protein)/CBF(C-repeat/DRE-binding factor)，啟動相應抗性基因的轉錄，如DREB1A、rd29A、kin1、cor6.6、cor15a、rd17、P5CS、erd1、rd22、rd29B等，從而大大提高了植株在逆境下的生存能力(Foolad MR，LP Zhang，Lin GY.Identification and validation of QTLs for salt tolerance duringvegetative growth in tomato by selective genotyping.Genome，2001，44444-454)，劉強等將DREB1A基因轉到擬南芥菜中，正常環(huán)境下可以表達出蛋白，而且在干旱、低溫處理的條件下其表達量比野生型顯著增強，表明植物中同一轉錄因子可以通過相應的順式作用元件同時調控多個基因表達。在干旱條件下，rd29B是表達明顯的蛋白之一(Foolad MR，LP Zhang，Lin GY.Identification andvalidation of QTLs for salt tolerance during vegetative growth in tomatoby selective genotyping.Genome，2001，44444-454)，在其啟動子序列中至少存在一個依賴于ABA的干旱反應的順勢作用元件，而且在高鹽和低溫的條件下都可以誘導rd29B的表達(劉強趙南明等.DREB轉錄因子在提高植物抗逆中的作用?？茖W通報，2000，45(1)11-16)。
DREB、CBF轉錄因子屬于目前已發(fā)現(xiàn)的AP2/EREBP家族中的EREBP型轉錄因子，包括DREB1A～C(CBF3，1，2)和DREB2A～B等許多成員。它們都含有AP2/EREBP結構域，兩者都能與核心序列DRE元件結合。CBF轉錄因子是能夠識別抗凍基因COR(cold-regulated gene)中的CTR/DRE元件并與之結合，從而開啟系列抗逆蛋白表達。目前，已經(jīng)分離出一系列CBF家族成員，CBF1、CBF2、CBF3和CBF4。其中CBF1、CBF2、CBF3基因又分別被命名為DREB1B、DREB1C和DREB1A(Eric J.Stockinger，etal.Transcriptional adaptor and histone acetyltransferase proteins inArabidopsis and their interactions with CBF1，a transcriptional activatorinvolved in cold-regulated gene expression.Nucleic Acids Res.，2001，291524-1533；Volker Haake，Daniel Cook，Jose′Luis Riechmann，Transcriptionfactor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis.PlantPhysiology，2002，130639-648)。已經(jīng)有大量證據(jù)可以證明，將DREB、CBF轉錄因子基因通過轉入植物中可以明顯提高植物的抗旱、抗低溫、抗鹽等逆境脅迫的能力。
選擇啟動子來表達轉錄因子蛋白需要考慮轉基因植株的生長發(fā)育問題，劉強等使用組成型的強啟動子35S超表達轉錄因子DREB1A蛋白導致了擬南芥菜植株出現(xiàn)生長阻礙、倒伏、結實少的現(xiàn)象，因而這可能是由于在非脅迫條件下DREB1A蛋白控制的脅迫誘導基因表達過多造成的(Mie Kasug，Qiang Liu，Setsuko Miura，etal.Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transferof a single stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology1999，17287-292)。因此，抗旱基因能否成功轉入，目的基因能否表達，受體植株能否表現(xiàn)出外源基因所控制的性狀，還需要通過一系列的實驗來鑒定。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種培育抗旱性增強的黑麥草的方法。
本發(fā)明所提供的培育抗旱性增強的黑麥草的方法，是將DREB轉錄因子的編碼基因插入植物表達載體，得到含有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入黑麥草中，得到抗旱性增強的黑麥草。
所述黑麥草是指禾本科黑麥草屬植物，包括多年生黑麥草和一年生黑麥草在內的20多種。
所述植物表達載體可為Ti類質粒載體或病毒載體或基因槍轉化用常規(guī)載體。
所述DREB轉錄因子的編碼基因可來源于擬南芥菜或小麥或水稻或玉米或大豆或油菜等。
所述DREB轉錄因子的編碼基因優(yōu)選為來源于擬南芥菜或小麥。
所述DREB轉錄因子的編碼基因為來源于擬南芥菜的DREB1B基因，如具有Genbank Access No.AB013816的核苷酸序列；或為具有Genbank AccessNo.AB013816的自5′端第612至1320位堿基的DNA片段。為了便于插入表達載體，可在5′設計加上BamHI位點，在3′端設計加上SacI位點，序列全長727bp，如序列表中的序列1，自5′端第1位至第6位脫氧核苷酸為BamHI識別位點，自5′端第722位至第727位脫氧核苷酸為SacI識別位點。
所述DREB轉錄因子的編碼基因為來源于小麥的CBF1基因，具有GenbankAccess No.AF376136的序列，或具有Genbank Access No.AF376136的自5′端第8至657位堿基的DNA片段。為了便于插入表達載體，可在5′設計加上BamHI位點，在3′端設計加上SacI位點，序列全長669bp，如序列表中的序列2。
在所述重組表達載體中，啟動所述DREB轉錄因子的編碼基因轉錄的啟動子是擬南芥菜親水蛋白RD29B基因的啟動子，或擬南芥菜親水蛋白RD29A基因的啟動子，或擬南芥菜水楊酸誘導基因SAG12等脅迫誘導型啟動子；或玉米polyubiqutin基因啟動子，或花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子等組成型啟動子。
所述擬南芥菜親水蛋白RD29B基因的啟動子，含Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位堿基的DNA片段。為了便于插入表達載體，可在5′設計加上HindIII位點，在3′端設計加上BamHI位點，序列全長1706bp，如序列表中的序列3。
所述含有CBF1轉錄因子的編碼基因的重組表達載體為將所述CBF1轉錄因子的編碼基因插入pBPC18的限制性內切酶位點BamHI和SacI的識別位點間得到的重組表達載體pBAC117；或為將所述RD29B啟動子插入pBAC117的限制性內切酶位點HindI和BamHI的識別位點間得到的重組表達載體pBAC122；或為質粒pBAC122用HindIII酶切，插入兩端為HindIII粘性末端的CaMV 35S啟動子與玉米Adh1intron驅動的bar基因以及以NOS 3’為終止子的片段，得到的質粒pBAC127。
所述含有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體為將所述DREB轉錄因子的編碼基因插入pBPC18的限制性內切酶位點BamHI和SacI的識別位點間得到的重組表達載體pBAC118；或為將所述RD29B啟動子插入pBAC118的限制性內切酶位點HindI和BamHI的識別位點間得到的重組表達載體pBAC123；或為將pBAC123用HindIII酶切，插入兩端為HindIII粘性末端的CaMV 35S啟動子與玉米Adh1 intron驅動的bar基因以及以NOS 3’為終止子的片段，得到的質粒pBAC128。
所述方法中，是以黑麥草成熟胚或幼胚為外植體，將含有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體導入黑麥草。
攜帶有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體可通過基因槍法、使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化黑麥草細胞或組織。
所述攜帶有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體優(yōu)選通過基因槍法導入黑麥草。
本發(fā)明的方法，特別適合于多年生黑麥草，尤其是神槍手品種。
本發(fā)明以黑麥草代表性品種-草坪專用型多年生黑麥草品種神槍手(Topgun)為材料，將由擬南芥菜親水蛋白RD29B基因的啟動子驅動的DREB轉錄因子的質粒pBAC122(含CBF1基因)，pBAC123(含DREB1B基因)，pBAC127(含CBF1基因)，pBAC128(含DREB1B基因)導入多年生黑麥草品種Topgun的幼胚、成熟胚愈傷組織中。經(jīng)除草劑Bialaphos抗性篩選和植株再生，最終獲得了98棵轉基因植株。經(jīng)PCR、Dot-blotting的分子檢測，CBF1基因和DREB1B基因分別已整合到多年生黑麥草部分轉基因株系的基因組中。用五種不同濃度的除草劑涂抹黑麥草葉片，非轉基因植株表現(xiàn)為不抗，而轉基因植株最高可以抗到135-200mg/L。葉片脯氨酸含量測定表明，62個轉DREB1B基因株系中有31株脯氨酸含量高于非轉基因植株，36個轉CBF1基因株系中有13株的脯氨酸含量高于非轉基因植株，部分植株提高幅度可達2-4倍。經(jīng)過25天人工溫室干旱處理，有9棵植株顯示了存活跡象，復水后，有4棵植株恢復生長。實驗結果表明，利用逆境誘導型啟動子(RD29B)來增強外源DREB1B、CBF1基因的表達，能顯著改良黑麥草的抗旱能力。


圖1為表達載體示意2為愈傷組織分化出苗照片圖3為除草劑抗性篩選獲得轉基因植株照片圖4為部分T0代轉DREB1B基因植株的PCR檢測圖5為部分T1代轉DREB1B基因植株的點雜交分析圖6為部分轉CBF1基因株系的PCR檢測圖7為部分轉CBF1基因株系的點雜交分析圖8為部分轉pBAC128基因株系的脯氨酸含量分析圖9為部分轉CBF1基因株系的脯氨酸含量分析圖10為轉基因黑麥草株系的除草劑抗性分析圖11a為復水后的轉基因株系123-21圖11b為復水后的轉基因株系122-7圖12為128-14的正常生長植株照片具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
T0表示由黑麥草的愈傷組織得到的轉基因植株，T1表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。
實施例1、培育抗旱性增強的黑麥草Taq DNA聚合酶購于TaKaLa公司，T4DNA連接酶、T-easy vector、限制性內切酶、DNA回收純化試劑盒等購于Promega公司，常規(guī)試劑、有機試劑均過于萬源化學試劑公司，基因槍及其試劑耗材購于BIORAD公司。
一、植物表達載體的構建1、DREB1B基因表達載體pBAC123和pBAC128的構建(1)擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)DREB1B基因的克隆根據(jù)已發(fā)表的擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)的DREB1B基因序列(GenbankAccess No.AB013816)，設計并合成該基因的特異引物P1上游引物5′-GGATCCTGATCAATGAACTCATTTTC，下游引物P25′-GAGCTCCCATTCTAAAAAAGGAAC，以擬南芥菜的基因組DNA(還是cDNA)為模板，利用PCR克隆出該基因。其中，PCR的溫度條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將擴增得到的約730bp DNA片段用DNA回收純化試劑盒回收該片段，用pGEM-T easy vector系統(tǒng)(Promega公司，美國)按供應商提供的方案克隆該片段，測序(上海申友生物技術公司)，測序結果表明，該片段具有序列表中序列1的核苷酸序列。通過與DREB基因序列(Genbank Access No.AB013816)比較，證實克隆到具有Genbank AccessNo.AB013816的自5′端第612至1320位基因序列片段。
(2)DREB1B基因表達載體pBAC123和pBAC128的構建質粒pBAC123和pBAC128的構建方法、過程及基因轉化參照《分子克隆》第二版(Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning-A LaboratoryManual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor laboratory Press，1989)。
具體方法如下1)用SacI和EcoRI雙酶切質粒pSP72(購自Promega公司)，插入約260bp的根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS 3’終止子序列(從質粒載體pBARGUS，用SacI和EcoRI雙酶切，Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。構建成的質粒定名為pBPC18。
2)由PCR克隆獲得的約730bp DREB基因片段，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，經(jīng)DNA測序驗證正確后，用BamHI和SacI雙酶切，插入pBPC18的BamHI和SacI位點。構建成的質粒定名為pBAC118。
3)由擬南芥菜的基因組DNA為模版，上游引物P15′-GCGGAAGCTTCATTTTCTGCTACAG，下游引物P25′-GGATCCTTTCCAAAGCTGTGTTTTCTCTTTTTC進行PCR克隆獲得的1.7kb RD29B啟動子片段(Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位堿基的DNA片段)，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，經(jīng)DNA測序驗證正確后，用HindIII和BamHI雙酶切，插入pBAC118的HindIII與BamHI位點之間。構建成的質粒定名為pBAC123。
4)質粒pBAC123用HindIII酶切，插入兩端為HindIII粘性末端的CaMV 35S啟動子與玉米Adh1 intron驅動的bar基因以及以NOS 3’為終止子的片段(Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。構建的質粒正向插入定名為pBAC128(圖1)，反向插入定名為pBAC128R。pBAC128的目的基因DREB1B以擬南芥菜親水蛋白RD29B基因的啟動子(1.7kb)為驅動，即為逆境誘導表達類型。pBAC128含有CaMV 35S啟動子和玉米Adh1基因的Intron1驅動的bar基因作為選擇標記。
2、CBF1基因表達載體pBAC122和pBAC127的構建(1)小麥(Triticum aestivum)CBF1基因的克隆根據(jù)已發(fā)表的小麥(Triticum aestivum)的DREB1B基因序列(Genbank AccessNo.AF376136)，設計并合成該基因的特異引物P3上游引物5′-GGATCCCAACTGATGGACACCGCCGCTGCCGGC，下游引物P45′-GAGCTCTTAGTCGGATAATTAGTTCCAAAGCGG，以小麥品種京花1號的基因組DNA為模板，利用PCR克隆出該基因。其中，PCR的溫度條件為先94℃預變性5min；然后94℃變性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將擴增得到的約670bp DNA片段用DNA回收純化試劑盒回收該片段，用pGEM-T easy vector系統(tǒng)(Promega公司，美國)按供應商提供的方案克隆該片段，測序(上海申友生物技術公司)，測序結果表明，該片段具有序列表中的序列2的核苷酸序列。通過與DREB基因序列(GenbankAccess No.AF376136)比較，證實克隆到具有Genbank Access No.AF376136的自5′端第8至657位脫氧核苷酸基因序列片段。
(2)CBF1基因表達載體pBAC122和pBAC127的構建質粒pBAC122和pBAC127的構建方法、過程及基因轉化參照《分子克隆》第二版(Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning-A LaboratoryManual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor laboratory Press，1989)。
具體方法如下1)用SacI和EcoRI雙酶切質粒pSP72(購自Promega公司)，插入約260bp的根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS 3’終止子序列(從質粒載體pBARGUS，用SacI和EcoRI雙酶切，Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。構建成的質粒定名為pBPC18。
2)由PCR克隆獲得的約670bp CBF1基因片段，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，經(jīng)DNA測序驗證正確后，用BamHI和SacI雙酶切，插入pBPC18的BamHI和SacI位點。構建成的質粒定名為pBAC117。
3)由擬南芥菜的基因組DNA為模版，上游引物P15′-GCGGAAGCTTCATTTTCTGCTACAG，下游引物P25′-GGATCCTTTCCAAAGCTGTGTTTTCTCTTTTTC進行PCR克隆獲得的1.7kb RD29B啟動子片段(Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位堿基的DNA片段)，采用TA克隆方法插入pGEM-T(Promega)，經(jīng)DNA測序驗證正確后，用HindI和BamHI雙酶切，插入pBAC117的HindIII與BamHI位點之間。構建成的質粒定名為pBAC122。
4)質粒pBAC122用HindIII酶切，插入兩端為HindIII粘性末端的CaMV 35S啟動子與玉米Adh1 intron驅動的bar基因以及以NOS 3’為終止子的片段(Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)。構建的質粒正向插入定名為pBAC127(圖1)，反向插入定名為pBAC127R。pBAC127的目的基因CBF1以擬南芥菜親水蛋白RD29B基因的啟動子(1.7kb)為驅動，即為逆境誘導表達類型。pBAC127含有CaMV 355啟動子和玉米Adh1基因的Intron1驅動的bar基因作為選擇標記。
二、植物表達載體pBAC122、pBAC123、pBAC127、pBAC128轉化黑麥草草坪專用型多年生黑麥草品種“神槍手”為受體品種。它的突出特點是生長迅速、坪用性好、耐濕熱性強、高抗病蟲性(植物內生菌感染率90％以上)。對北方和過渡帶氣候條件具有廣泛的適應性，與其它多年生黑麥草品種或草地早熟禾有極佳的兼容配伍性。
選擇黑麥草種子的成熟胚為外植體進行愈傷組織誘導，需要用8mg/L的2，4-D進行預處理，否則成熟胚很難誘導出愈傷組織。具體方法如下其種子經(jīng)質量百分比濃度為2.8％的次氯酸鈉水溶液消毒10分鐘后，用含有2mg/L 2，4-D的無菌水浸泡1-2天，種子萌動后，將其成熟胚接種在W14+2，4-D 8mg/L+NAA 4mg/L+KT 0.1mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中誘導愈傷。結果在誘導出的617塊愈傷組織中，有36塊愈傷組織在篩選培養(yǎng)基(MS+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+Bialaphos2mg/L)上長出綠芽點，綠芽點分化率為5.8％，最終成苗34叢，成苗率為5.8％，圖2顯示了愈傷組織分化出苗的情況。
用高壓氦氣基因槍PDS1000(基因槍及其試劑耗材購于BIORAD公司)將重組質粒pBAC122與含有bar基因篩選標記的質粒pBARGUS，或pBAC123與含有bar基因篩選標記的質粒pBARGUS，或pBAC127，或pBAC128分別導入黑麥草愈傷組織，具體操作參照張曉東等(張曉東，梁榮奇，陳緒清，楊鳳萍等.優(yōu)質HMW谷蛋白亞基轉基因小麥的獲得及其遺傳穩(wěn)定性和品質性狀分析.科學通報，2003，48(5)474～479)的方法進行。其中，pBAC122或pBAC123分別與含有bar基因篩選標記的質粒pBARGUS(Vasil，et al，Bio/technology，10667-674，1992)共轉化，pBAC122和pBARGUS的摩爾比為4∶1，pBAC123和pBARGUS的摩爾比為4∶1。
將基因槍轉化的愈傷組織轉入愈傷誘導篩選培養(yǎng)基W14+2，4-D 8mg/L+NAA4mg/L+KT 0.1mg/L+Bialaphos 1mg/L中培養(yǎng)1-2周，誘導出愈傷組織再轉入分化篩選培養(yǎng)基MS+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+Bialaphos 2mg/L中分化出苗。最后將幼苗在含2mg/L多效唑的壯苗培養(yǎng)基MS+NAA 0.5mg/L+Bialaphos 2mg/L上生根，成苗后移栽至田間。結果表明經(jīng)2mg/L的除草劑Bialaphos篩選，共獲得98株轉基因植株(T0代)，其中轉CBF1基因的植株有36株，包括轉pBAC122的植株28株和轉pBAC127的植株8株，轉DREB1B基因的植株獲得62株，包括轉pBAC123的植株8株和轉pBAC128的植株54株。轉基因黑麥草的除草劑抗性效果如圖3。
三、轉基因植株的分子分析1、轉DREB1B基因植株的PCR檢測和點雜交分析
(1)T0代轉基因植株的PCR檢測CTAB法提取轉基因黑麥草植株葉片基因組DNA，以未轉化黑麥草植株為陰性對照、質粒pBAC123為陽性對照，PCR產(chǎn)物用1％凝膠電泳檢測。轉基因植株的PCR檢測，使用DREB1B基因上游引物P1和下游引物P2。反應體系為總體積為25μl，10×PCR緩沖液2.5μl，引物(10μM)各1μl，dNTPs 2μl，ddH2O 13μl，Taq酶1U，MgCl22μl，模板DNA 1μg。其循環(huán)擴增程序為先94℃預變性5min；然后94℃變性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR檢測結果表明8株轉pBAC123的植株有4株可擴增得到727bp左右的DREB1B基因的特異片段，54株轉pBAC128的植株有14株可擴增得到727bp左右的DREB1B基因的特異片段。部分T0代轉基因植株的PCR檢測結果如圖4所示，表明所獲得的部分轉基因植株(泳道3，4，7，8，10，14等)與陽性對照質粒(泳道1)都能擴增出了727bp左右的DREB1B基因的特異片段，陰性對照(非轉基因植株，泳道2)沒有擴增帶，表明外源DREB1B基因已經(jīng)進入了轉基因植株。圖4中，泳道15為Gibco公司1kb plus DNA分子量標準，1為陽性對照，2為陰性對照，其余為轉基因植株，其中，泳道3-8為轉pBAC123的植株，泳道9-14為轉pBAC128的植株。
(2)T1代轉基因植株的DNA分子雜交檢測將經(jīng)上述PCR檢測得到727bp左右的DREB1B基因的特異片段(PCR檢測為陽性)的T0代植株進行種植，獲得T1代轉基因植株，分別提取葉片基因組DNA，用地高辛(DIG，Roche)標記727bp的DREB基因(該727bp的DREB1B基因是以擬南芥菜的基因組DNA為模板，利用引物P1和P2 PCR擴增得到)作為探針，進行點雜交檢測。該點雜交分析，使用Bio-Rad公司Bio-Dot Microfiltration點雜交儀進行點膜，按Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit進行雜交和檢測，以PCR法對DREB1B基因進行DIG標記。點雜交結果如圖5所示，表明有部分點為強信號，部分信號(包括轉基因植株)較弱，這說明很可能在黑麥草的基因組中也存在類似的DREB1B轉錄因子或同源性較高的DNA序列。圖5中，點A1陽性對照(pBAC123)，B1空白對照，D8陰性對照CK(未轉基因植株)，其余為轉基因植株(轉pBAC123的植株有4株，轉pBAC128的植株有25株)。
2、轉CBF1基因植株的PCR檢測和點雜交分析(1)T0代轉基因植株的PCR檢測CTAB法提取轉基因黑麥草植株葉片基因組DNA，以未轉化黑麥草植株為陰性對照、質粒pBAC122為陽性對照，PCR產(chǎn)物用1％凝膠電泳檢測。轉基因植株的PCR檢測，使用CBF1基因上游引物P3和下游引物P4。反應體系為總體積為25μl，10×PCR緩沖液2.5μl，引物(10μM)各1μl，dNTPs 2μl，ddH2O 13μl，Taq酶1U，MgCl22μl，模板DNA 1μg。其循環(huán)擴增程序為先94℃預變性5min；然后94℃變性45s，45℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR檢測結果表明28株轉pBAC122的植株中有12株可擴增得到649bp左右的CBF1基因的特異片段，8株轉pBAC127的植株中有4株可擴增得到649bp左右的CBF1基因的特異片段。部分T0代轉基因植株的PCR檢測結果如圖6所示，表明所獲得的部分轉基因植株與陽性對照質粒都能擴增出CBF1基因的特異片段，部分植株有非特異帶，這可能是由于CBF1引物的特異性不高導致的。圖6中，泳道11 Gibco公司1kb plus為DNA分子量標準，9為陽性對照，10為陰性對照(未轉基因植株)，其余為轉基因植株，其中，泳道1-8為轉pBAC122的植株。
(2)T1代轉基因植株的DNA分子雜交檢測將經(jīng)上述PCR檢測得到690bp左右的CBF1基因的特異片段(PCR檢測為陽性)的T0代植株進行種植，獲得T1代轉基因植株，分別提取葉片基因組DNA，用地高辛(DIG，Roche)標記690bp的CBF1基因(該690bp的CBF1基因是以擬南芥菜的基因組DNA為模板，利用引物P3和P4 PCR擴增得到)作為探針，進行點雜交檢測。該點雜交分析，使用Bio-Rad公司Bio-Dot Microfiltration點雜交儀進行點膜，按Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit進行雜交和檢測，以PCR法對CBF1基因進行DIG標記。點雜交結果如圖7所示，表明有部分點為強信號，部分信號(包括轉基因植株)較弱，這說明很可能在黑麥草的基因組中也存在類似的CBF1轉錄因子或同源性較高的DNA序列。圖7中，點C-7陽性對照(pBAC122)，B-7空白對照，A-7陰性對照CK(未轉基因植株)，其余為轉基因植株。
四、黑麥草葉片游離脯氨酸含量的測定1、T0代轉DREB1B基因植株的葉片游離脯氨酸含量的測定脯氨酸作為一種抗旱生理指標與植物的抗旱性關系密切。大量證據(jù)表明，在干旱、低溫高滲等逆境因素條件下，會導致植株體內脯氨酸濃度的迅速增加，從而增強了植株的抗逆性(劉寧，高玉葆，賈彩霞等.滲透脅迫下多花黑麥草葉內過氧化物酶活性和脯氨酸含量以及質膜相對透性的變化.植物生理學通訊，2000，36(1)11-14了；高玉葆，任安芝，劉峰等.黑麥草葉內游離脯氨酸含量對于不同類型和強度的水分脅迫的生理生態(tài)響應.植物生理學通訊，1999，23(3)193-204；高玉葆任安芝劉蜂.模擬草地內黑麥草葉游離脯氨酸含量與葉含水量、土壤含水量之間的相互關系研究，南開大學學報(自然科學版)，1999，32(3)169-176)按照文獻(徐曉峰，朱才.小麥葉中脯氨酸測定方法的研究，生物技術.1997，7(1)40～42)的方法，測定步驟二獲得的62株轉DREB1B基因的T0代黑麥草植株葉片游離脯氨酸含量，具體方法如下采用室內模擬干旱條件的方法，植株停止?jié)菜?5天后，稱取葉片0.1g，剪碎后放入試管中，加5ml 3％(質量百分含量)磺基水楊酸溶液，于沸水浴中浸提10分鐘，冷至室溫。吸取浸提液2ml于另一試管中，加入2ml水，2ml冰乙酸和4ml 2.5％(質量百分含量)酸性茚三酮溶液(以3∶2的冰乙酸和6mol/L磷酸為溶劑進行配制)，至沸水浴中顯色60分鐘，冷卻至室溫。加入4ml甲苯，振蕩，以萃取紅色物質。靜置后，吸取甲苯層于721型分光光度計520nm波長處比色，測其OD值。標準曲線的制作配制濃度為1～10μg/ml的十個系列脯氨酸標準溶液。取標準溶液2ml和2ml 3％磺基水楊酸溶液代替樣品測定中的2ml浸提液和2ml水，按上述程序進行顯色，萃取和比色(波長520nm)，最后繪制標準曲線。
根據(jù)測得的值計算黑麥草葉片游離脯氨酸的含量脯氨酸含量(μg/g)＝C*2.5/W式中C-----以標準曲線獲得的被測樣品的脯氨酸含量(μg)W-----黑麥草葉片重量(g)2.5---提取脯氨酸時浸提液3％磺基水楊酸體積(5ml)與測定時所取樣品液體積(2ml)比62株轉DREB1B基因黑麥草干旱處理后葉片脯氨酸含量的測定結果表明，其中1株轉pBAC123和30株轉pBAC128黑麥草的脯氨酸含量高于對照CK(未轉基因植株)，圖8中顯示了部分轉pBAC128植株的測定結果。圖8中CK-P為對照(未轉基因黑麥草)，其余為轉轉pBAC128植株。
2、T0代轉CBF1基因植株的葉片游離脯氨酸含量的測定按照步驟1的方法對36株步驟二獲得的T0代轉CBF1基因黑麥草植株進行了干旱處理后葉片脯氨酸含量的測定，結果表明其中8株轉pBAC122和5株轉pBAC127黑麥草的脯氨酸含量高于對照CK(未轉基因植株)，其中有些轉基因植株(C127-6、C127-1)的脯氨酸含量比對照要高出2-4倍，圖9中顯示了部分轉CBF1基因植株的測定結果。圖9中，C122表示轉pBAC122植株，C127表示轉pBAC127植株，CK-W和CK為對照(未轉基因黑麥草)。
五、轉基因植株除草劑抗性檢測配置100mg/L、125mg/L、135mg/L、200mg/L、270mg/L五個濃度梯度的Basta水溶液，用棉球分別涂抹步驟二獲得的36株轉CBF1基因T0代黑麥草植株和步驟二獲得的62株轉DREB1B基因的T0代黑麥草植株葉片兩面，8-10天后觀察結果。結果如表1所示，對照(50株未轉基因植株)對五個濃度的除草劑均表現(xiàn)為不抗(圖10中圖片a)，葉片枯黃或枯死；而轉基因植株最高可抗135mg/L-200mg/L或更高(圖10中圖片b)，除270mg/L處理的葉片變黃外，其它濃度處理的葉片仍為綠色。圖10中，數(shù)值表示對葉片進行處理的Basta水溶液的濃度。
表1.抗不同濃度Basta的轉基因黑麥草株數(shù)(株) 六、轉基因植株的抗旱效果鑒定一個黑麥草品種能否抗旱，抗旱程度多大，雖然在相關生理指標可以進行鑒定，但其是否真正具有抗旱性，仍需要通過實際的檢驗。采用室內(室溫不高于26℃)模擬干旱條件的方法，27株T0代轉pBAC122植株，7株T0代轉pBAC123植株，4株T0代轉pBAC127植株，8株T0代轉pBAC128植株，和4株未轉基因對照，在幼苗時期(一次性澆足50ml水)停止?jié)菜?5天，然后恢復澆水。經(jīng)過25天的人工溫室的干旱處理，有9棵轉基因植株顯示了存活跡象(植株中心葉片的下部依然保持綠色，其余葉片萎蔫或頂部有些干枯)，而全部對照植株葉片則失綠、枯干。復水后，有4棵轉基因植株123-21(轉pBAC123植株，圖11a)，128-14(轉pBAC128植株)，122-7(轉pBAC122植株，圖11b)和128-24(轉pBAC128植株)恢復生長，而全部對照植株死亡。圖11a和圖11b中的右側盆中的植株均為未轉基因植株對照，左側盆中的植株均為轉基因植株。說明與非轉基因的對照相比部分轉基因株系具有較強的抗旱性。
最終篩選出了4個抗旱效果較為顯著的轉基因黑麥草株系123-21(轉pBAC123植株)，128-14(轉pBAC128植株)，122-7(轉pBAC122植株)和128-24(轉pBAC128植株)。其中，128-14的正常生長植株照片如圖12。
序列表<160>3<210>1<211>727<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ggatcctgat caatgaactc attttcagct ttttctgaaa tgtttggctc cgattacgag 60cctcaaggcg gagattattg tccgacgttg gccacgagtt gtccgaagaa accggcgggc120cgtaagaagt ttcgtgagac tcgtcaccca atttacagag gagttcgtca aagaaactcc180ggtaagtggg tttctgaagt gagagagcca aacaagaaaa ccaggatttg gctcgggact240ttccaaaccg ctgagatggc agctcgtgct cacgacgtcg ctgcattagc cctccgtggc300cgatcagcat gtctcaactt cgctgactcg gcttggcggc tacgaatccc ggagtcaaca360tgcgccaagg atatccaaaa agcggctgct gaagcggcgt tggcttttca agatgagacg420tgtgatacga cgaccacgga tcatggcctg gacatggagg agacgatggt ggaagctatt480tatacaccgg aacagagcga aggtgcgttt tatatggatg aggagacaat gtttgggatg540ccgactttgt tggataatat ggctgaaggc atgcttttac cgccgccgtc tgttcaatgg600aatcataatt atgacggcga aggagatggt gacgtgtcgc tttggagtta ctaatattcg660atagtcgttt ccatttttgt actatagttt gaaaatattc tagttccttt ttttagaatg720ggagctc 727<210>2<211>669<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2ggatcccaac tgatggacac cgccgctgcc ggctccccgc gtgaggggca caggacggtg 60tgctcggagc cgcccaagag gccggcaggg cggaccaagt tcagggagac gcgccacccg120ctgtaccgcg gcgtgcggcg ccggggccgg ctcgggcagt gggtgtgcga ggttcgcgtg180cgcggcgcgc aagggtacag gctctggctc ggcaccttca ccactgccga gatggcggcg240cgcgcgcacg actccgccgt gctcgcgctc ctcgaccgcg ccgcctgcct caacttcgcc300gactccgcct ggcggatgct gcccgtcctc gcggctggct cgtcccgctt cagcagcgcg360cgggagatca aggacgccgt cgccatcgcc gtcctggagt tccagcggca gcgccccgtc420gtgtcgacgt cggagatgca cgacggcgaa aaggacgccc aaggctcgcc gacgccgagc480gagctgtcca cgtccagcga cttgttggac gagcactggt ttggcggcat ggacgccggc540tcgtactacg cgagcttggc gcaggggatg ctcatggagc cgccgtccgc cagaacgtgg600agcgaggatg gcggcgaata cagcgccgtc tacacgccgc tttggaacta attatccgac660taagagctc669<210>3<211>1706<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aagcttcatt ttctgctaca gaagtgttgt tctctgtaaa gtaatcagaa ggaatgtaat 60caacagaata aatctgctct tgaatgtcct ttgagttctg caggataata tctgacccct120catatttaac ctgcaataag aagactagct aaaatcagat gatgccaaga acaggaacca180gctctaccac tctacagcaa aagcaaaaac tactgttgtg tgtgccaact aaaatcaact240cagggattta ccgggtcatt tttgatctct agaacttcag agaaacattg gagatgatcc300
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1.培育抗旱性增強的黑麥草的方法，是將DREB轉錄因子的編碼基因插入植物表達載體，得到含有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入黑麥草中，得到抗旱性增強的黑麥草。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述DREB轉錄因子的編碼基因來源于擬南芥菜或小麥或水稻或玉米或大豆或油菜。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述DREB轉錄因子的編碼基因來源于擬南芥菜。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述DREB轉錄因子的編碼基因為來源于擬南芥菜的DREB1B基因或為具有Genbank Access No.AB013816的自5′端第612至1320位堿基的DNA片段。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述CBF1轉錄因子的編碼基因來源于小麥。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述CBF1轉錄因子的編碼基來源于小麥的CBF1基因或擬南芥菜或水稻。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述CBF1轉錄因子的編碼基因為來源于小麥的CBF1基因或為具有Genbank Access No.AF376136的自5′端第8至657位堿基的DNA片段。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于在所述重組表達載體中，啟動所述DREB轉錄因子的編碼基因轉錄的啟動子是擬南芥菜親水蛋白RD29B基因的啟動子或RD29A啟動子或SAG12啟動子或玉米Ubi啟動子或CaMV 35S啟動子。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述擬南芥菜親水蛋白RD29B基因的啟動子具有Genbank Access No.D013044的自5′端第85至1784位堿基的DNA片段。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于所述含有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體為pBAC122或pBAC123或pBAC127或pBAC128；所述黑麥草為多年生黑麥草和一年生黑麥草；所述黑麥草優(yōu)選為多年生黑麥草，尤其優(yōu)選為多年生黑麥草神槍手品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育抗旱性增強的黑麥草的方法。本發(fā)明所提供的培育抗旱性增強的黑麥草的方法，是將DREB轉錄因子的編碼基因插入植物表達載體，得到含有DREB轉錄因子的編碼基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入黑麥草中，得到抗旱性增強的黑麥草。本發(fā)明利用逆境誘導型啟動子(RD29B)來增強外源DREB1B、CBF1基因的表達，能顯著改良黑麥草的抗旱能力。
文檔編號C12N15/63GK1762200SQ200510104869
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權日2005年9月23日
發(fā)明者張曉東, 楊鳳萍, 梁榮奇, 張立全, 陳緒清, 孫振元 申請人:北京市農(nóng)林科學院