專利名稱：治療性肽和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學領域。更具體的，本發(fā)明涉及炎癥以及包含TREM-1蛋白的某些序列的蛋白質(zhì)和肽及其功能等同體(文中稱之為TREM1-肽)在治療疾病如敗血癥和膿毒性休克中的用途。
背景技術：
敗血癥構成了對重癥護理資源的顯著消耗并仍舊是重癥護理單位中經(jīng)常存在的問題。據(jù)估計，每年在美國和歐洲都有400000至500000個患者受到了這樣的感染。盡管支持性療法和抗菌療法均取得了進步，但發(fā)病率和死亡率仍舊居高不下。在那些患有膿毒性休克和多器官障礙的患者中，死亡率從無并發(fā)癥的敗血癥的40％變動到了80％?，F(xiàn)在條件發(fā)病機理正變得日益明確。更多地了解免疫、炎癥和血液介質(zhì)的復雜網(wǎng)絡就可以開發(fā)合理和新的療法。
感染后，先天和識別免疫應答相繼形成，這兩個階段特異性和復雜性逐步增強，最終導致清除感染因子并恢復內(nèi)穩(wěn)態(tài)。先天免疫應答作為第一道防線，并且是經(jīng)由模式識別受體如Toll樣受體(TLR)的活化，通過各種病原相關的微生物模式(PAMP)(3)而起始(1，2)的。TLR的活化觸發(fā)了大量諸如TNF-α和IL-1β的細胞因子的釋放，這在諸如敗血癥的重大感染的情況下，能加速組織損傷和致命的休克(4，5)。盡管TNF-α和IL-1β拮抗劑作為可能感興趣的敗血癥治療劑在此環(huán)境下出現(xiàn)，但不幸的是，它們在臨床試驗中顯示出有限的功效(6-8)。這可能歸因于這樣的事實，即這些細胞因子對于清除感染來說是必需的，而去除它們會造成致命的細菌生長(9-11)。
其中，參與感染應答的另一種受體，即表達在髓樣細胞-1上的觸發(fā)受體(TREM-1)，是最近發(fā)現(xiàn)的受體家族TREM家族的成員，其在嗜中性粒細胞和單核細胞亞型的表面表達。TREM受體通過與適配分子DAP12的結合而活化髓樣細胞。業(yè)已報道在微生物產(chǎn)物的存在下，TREM-1的結合觸發(fā)了前炎性細胞因子的合成。
表達在髓樣細胞-1上的觸發(fā)受體(TREM)-1是最近發(fā)現(xiàn)的細胞表面分子，其在人和鼠分葉核嗜中性粒細胞和成熟單核細胞上均已被鑒定出(12)。它屬于免疫球蛋白超家族并在稱之為DAP12的適配蛋白的輔助下，激活下游信號轉(zhuǎn)導路徑(12-15)。Bouchon和同事們證明，在諸如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細菌的存在下，在細胞培養(yǎng)物和來自感染患者的組織樣品中的嗜中性粒細胞和單核細胞上TREM-1的表達都被極大地上調(diào)(16)。與之驚人地相反，在來自非感染性炎性疾病如由免疫復合物造成的牛皮癬、潰瘍性結腸炎或脈管炎的患者的樣品中，TREM-1并不上調(diào)(16)。另外，當TREM-1與其配體結合時，存在著LPS和前炎性細胞因子TNF-α和GM-CSF的擴大合成的協(xié)同效應，連同IL-10產(chǎn)量的抑制(17)。在LPS誘導的膿毒性休克的鼠模型中，阻斷TREM-1信號轉(zhuǎn)導防止動物死亡，這進一步凸顯出該分子的關鍵作用(13，16)。
最近的研究證實TREM-1在針對感染的炎癥反應中起了關鍵的作用(參見BOUCHON等(2000)《免疫學雜志》(J.Immunol.)1644991-4995)。在髓樣細胞上TREM-1表達增加以應答人的細菌和真菌感染。相似的，在小鼠中，由脂多糖(LPS)誘導的休克與TREM-1表達增加相關。另外，用可溶TREM-1/Ig融合蛋白作為“誘騙”受體處理小鼠，會防止鼠死于LPS或大腸桿菌(E.Coli)。
名稱為“186個分泌蛋白質(zhì)”的US6,420,526要求保護未指明而且未加例證的分離的TREM-1片段，其包含人TREM-1至少30個連續(xù)的氨基酸。沒有提供與這些片段相關的生物學數(shù)據(jù)。
如US2003165875A中所述，人IgG1恒定區(qū)和小鼠TREM-1胞外結構域或人TREM-1胞外結構域之間的融合蛋白在小鼠中顯示出抗內(nèi)毒素血癥的效果。
本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，某些衍生自TREM-1蛋白的肽能作為TREM-1蛋白的拮抗劑起作用，因此在治療敗血癥和膿毒性休克中具有應用。本發(fā)明人進一步證實了該肽也能在體內(nèi)調(diào)節(jié)感染觸發(fā)的前炎性級聯(lián)反應，從而在敗血癥動物模型中抑制高反應性及死亡。
以前，本發(fā)明人鑒定出了可溶形式的TREM-1(sTREM-1)，并觀察到其在膿毒性休克患者血清樣品中的顯著水平，但對照組中沒有。如本文所述，本發(fā)明人研究了其在敗血癥中調(diào)節(jié)炎癥的假定性的作用(參見Gibot等(2004)《國際醫(yī)學年報》(Ann.Intern.Med.)141(1)9-15和Gibot等(2004)《新英格蘭醫(yī)學雜志》(N.Engl.J.Med.)350(5)451-8)。
如本文所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可溶形式的TREM-1(sTREM-1)在鼠的感染侵入期間釋放到外周血中。本發(fā)明人也證實了單核細胞為sTREM的主要來源，并證明模擬TREM-1胞外結構域部分的合成肽能在體外調(diào)節(jié)活化單核細胞的細胞因子產(chǎn)量。
本發(fā)明人觀察到了sTREM-1是由LPS體外活化的單核細胞以及膿毒性休克實驗模型所涉及的動物血清中的單核細胞分泌的。在體外和體內(nèi)，模擬TREM-1短的高度保守結構域的合成肽都削弱人單核細胞的細胞因子產(chǎn)量，并防止敗血病動物的高反應性及死亡。這些肽不僅在預防而且在下調(diào)前炎性細胞因子有害效果方面都是有效的。這些數(shù)據(jù)證實，對于治療感染如敗血癥或膿毒性休克，或?qū)τ谥委煍⊙Y樣病情，TREM-1肽對TREM-1的體內(nèi)調(diào)節(jié)是一種有價值的治療工具。

發(fā)明內(nèi)容
由此，本發(fā)明提供了用于治療感染性疾病，尤其是敗血癥和膿毒性休克，或用于治療敗血癥樣病情的方法和組合物。
如本文所述，本發(fā)明人確定，若干TREM-1蛋白胞外部分的肽(參見表1)，并入了來自“CDR2”和“CDR3”的序列，它們令人驚訝的具有與前述敗血癥模型中IgG1恒定區(qū)和TREM-1胞外結構域融合蛋白相似的活性。這些肽也具有超過蛋白質(zhì)的優(yōu)點，尤其在生產(chǎn)的成本上。
因此，本發(fā)明提供了這樣的多肽，其包含源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的一個或多個序列。優(yōu)選所述多肽包含所述TREM-1蛋白的少于30個的連續(xù)氨基酸。
如表1所示，例如，這種肽或多肽的例子含有或包含來自TREM-1蛋白的15-25個氨基酸(“AA”)的肽，并含有或包含為來自該蛋白質(zhì)的天然序列所側接的受體的全部或部分CDR結構域(3-6AAs)，其長度可以變化，只要該CDR樣結構域的功能不喪失即可。比如，該肽衍生自TREM-1受體蛋白氨基酸序列，如表2(人)和表3(小鼠)所示。
表1顯示了衍生自鼠TREM-1“mPX”(NCBI參照序列(RefSeq)NP_067381)或人TREM-1“hPX”(NCBI參照序列(RefSeq)NP_061113)的肽。下劃線標出的氨基酸跨越人TREM-1互補決定區(qū)(CDR)，如Radaev等2003Structure(Camb.)11(12)，1527-1535(2003)所述。
表2顯示了人TREM-1氨基酸序列NP_061113。下劃線標出的氨基酸跨越人TREM-1互補決定區(qū)(CDR)2(RPSKNS；[SEQ ID NO20])和3(QPPKE[SEQ ID NO21])，如Radaev等2003 Structure(Camb.)11(12)，1527-1535(2003)所述。
表3顯示了小鼠TREM-1氨基酸序列NP_067381。下劃線標出的氨基酸跨越小鼠TREM-1互補決定區(qū)(CDR)2(RPFTRP；[SEQ ID NO22])和3(HPPND[SEQ ID NO23])。
表1.包括來自人和小鼠TREM-1CDR2和CDR3的序列的肽

表2.人TREM-1氨基酸序列NP_061113

表3.小鼠TREM-1氨基酸序列NP_067381

由此，本發(fā)明提供了分離或重組制備的基本上包含或由源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的一個或多個序列組成的多肽或肽，或如本文所定義的此類多肽的片段、同源物、衍生物、融合蛋白或變體，其在本文中統(tǒng)稱為“本發(fā)明的多肽或肽”或“TREM-1肽或TREM-1多肽”，優(yōu)選這些實體包含TREM-1蛋白的少于30個的連續(xù)氨基酸，例如，如表2或表3所示。通常當本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)或其片段、同源物、衍生物、或變體旨在用于(如治療)特定的物種時，則TREM-1蛋白CDR2或CDR3序列選自于該物種的TREM-1蛋白氨基酸序列，或者如果序列未知，則選自于類似物種。例如，用于治療人類疾病，尤其是敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)，將包含包括人TREM-1蛋白CDR2或CDR3的全部或部分的一個或多個序列。
此外，本發(fā)明提供了分離的包含以下氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)，或其片斷、同源物、衍生物或變體，所述氨基酸序列與氨基酸序列SEQ ID NO20、21、22、23具有至少約60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性。本發(fā)明還提供了分離的包含以下氨基酸序列的肽、多肽或蛋白質(zhì)，或其片段、同源物、衍生物或變體，所述氨基酸序列包含或由TREM-1蛋白的至少約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29或更多個連續(xù)氨基酸組成，其中3個或以上的連續(xù)氨基酸源自SEQ ID NO20、21、22、23的序列(換句話說，代表TREM-1蛋白CDR2或CDR3全部或部分的序列存在于所述肽、多肽或蛋白質(zhì)之中)。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的肽、多肽或蛋白質(zhì)，或其片段、同源物、衍生物或變體具有TREM-1全長蛋白的生物學活性，如抗原性、免疫原性、觸發(fā)前炎性趨化因子和細胞因子、動員胞質(zhì)Ca2+、蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化、介質(zhì)釋放、以及其他能容易檢測的活性。通常，這樣的肽、多肽或蛋白質(zhì)，或其片段、同源物、衍生物或變體能治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情，或在敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的實驗模型中有活性，例如通過作為TREM-1受體活性拮抗劑來起作用。這樣的肽、多肽或蛋白質(zhì)，或其片段、同源物、衍生物或變體特征在于能治療、改善、或減輕敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的癥狀。
尤其，本發(fā)明提供了具有抗敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的TREM-1多肽，其由(i)對應于天然TREM-1蛋白序列的5至29，如15-25個氨基酸的連續(xù)序列，該序列包括來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸；或(ii)其中一個或多個氨基酸由其他提供的氨基酸保守取代，可來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸不被取代的這樣的序列；或(iii)在其N和C末端之一或兩端都連上異源多肽的(i)或(ii)的序列組成。例如，在一種多肽中，其中天然TREM-1蛋白序列是標識為[SEQ ID NO1]的人類序列，CDR2和CDR3序列分別是RPSKNS和QPPKE。在此類多肽中，來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸可以是QPP、PPK、PKE、RPS、PSK、SKN或KNS。此類多肽可以包含序列QPPK、QPPKE或RPSKNS。例如，在其中天然TREM-1蛋白序列是標識為[SEQ ID NO2]的小鼠序列的多肽中，CDR2和CDR3序列分別是RPFTRP和HPPND。在此類多肽中，來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸可以是HPP、PPN、PND、RPF、PFT、FTR或TRP。此類多肽可以包含序列HPP、HPPN、HPPND或RPFTRP。
在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽是或包含SEQ ID No.7，其公開在Gibot等(2004)J Exp Med200，1419-1426中。
在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽不是也不包含SEQ ID No.7。
在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽是或包含選自SEQ ID No.3、4和6的序列。
在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽是或包含選自SEQ ID No.16、17、18和19的序列。
在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽是或包含源自CDR2的序列。
在某些實施方案中，本發(fā)明的多肽是或包含源自CDR3的序列。
提供了本發(fā)明的多肽或肽用于治療，尤其治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情，并用于制備治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的藥物。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明的多肽或肽的組合物和藥物組合物，以及利用本發(fā)明的多肽或肽治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的方法。另外，提供了本發(fā)明的多肽或肽用于治療以恢復敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情中的血液動力學參數(shù)，并用于制備治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情中的異常血液動力學參數(shù)的藥物。
術語“在髓樣細胞上表達的觸發(fā)受體”或“TREM”指一組活化受體，其在不同類型的髓樣細胞上選擇性地表達，如肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞(DCs)和嗜中性粒細胞，并可以在免疫和炎癥應答中發(fā)揮決定性的作用。TREM基本上是跨膜糖蛋白，在它們的胞外結構域具有Ig型折疊，并因此屬于Ig-SF。這些受體含有短的胞外結構域，但缺少信號轉(zhuǎn)導介質(zhì)的停泊基序，并需要適配蛋白如DAP12進行細胞活化。
如本文所用的術語“髓樣細胞”指一系列骨髓來源的細胞系，包括粒細胞(嗜中性粒細胞、嗜曙紅細胞和嗜堿性粒細胞)、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞。另外，也包括髓樣起源的外周血樹突細胞，以及體外在適宜培養(yǎng)條件下來源于單核細胞的樹突細胞和巨噬細胞。
如本文所定義的術語“敗血癥、膿毒性休克”或“敗血癥或膿毒性休克”指全身性炎癥應答綜合癥(SIRS)的亞型。當懷疑或證實感染時，術語“敗血癥”通常是SIRS的保留用法。在非常病重的患者中已顯示出針對系列損傷的生理學變量模式，所述損傷包括外傷、燒傷、胰腺炎和感染。這些模式包括炎癥反應、白細胞增多或嚴重白血球減少癥、高熱癥或低溫癥、心動過速或呼吸急促，并統(tǒng)稱全身性炎癥應答綜合癥(SIRS)。該定義強調(diào)在這些狀況中的炎癥過程的重要性，而無論存在感染與否。在出現(xiàn)器官灌注不足的證據(jù)時，敗血癥進一步演變成了嚴重敗血癥，這通過器官功能障礙的跡象顯示出來，如血氧過少、尿過少、乳酸酸中毒或腦功能改變?！澳摱拘孕菘恕笔峭ǔ２l(fā)低血壓的嚴重的敗血癥，在人體中定義為即使有充足的體液復蘇，心臟收縮血壓也低于90mmHg。因為器官灌注和充氧失調(diào)，敗血癥和SIRS可能并發(fā)兩個或多個器官衰竭，這稱作多器官衰竭(MOF)。除了感染的全身效應，全身炎癥反應可以發(fā)生在嚴重炎癥狀況下，如胰腺炎和燒傷。繼外傷損害出現(xiàn)的炎癥反應跡象沒有太好的定義。在重癥護理單位中，革蘭氏陰性菌牽涉到50至60％的敗血癥病例，而革蘭氏陽性菌占另外35至40％的病例。剩下的病例歸因于較不常見的真菌、病毒和原生動物。
如本文使用的術語“敗血癥樣病情”指那些狀態(tài)，其中患者呈現(xiàn)出與敗血癥或膿毒性休克相似的癥狀，但是感染因子并非如在敗血癥中所見的那樣，是相似炎癥介質(zhì)級聯(lián)反應和/或血液動力學參數(shù)改變的基本或起始成因，例如在急性或慢性肝衰竭患者中(參見Wasmuth HE等《肝臟病學雜志》(J Hepatol.)2005年2月；42(2)195-201)，在心搏動停止后的復蘇后疾病的病例中(參見AdrieC等Curr Opin Crit Care.2004年6月；10(3)208-12)，在癌癥化療后治療敗血癥樣病情的治療中(參見Tsuji E等《國際癌癥雜志》(Int J Cancer.)2003年11月1日；107(2)303-8)，在用重組TNF-alpha或相似療法進行高熱分離肢體灌輸?shù)幕颊咧?參見Zwaveling JH等Crit Care Med.1996年5月；24(5)765-70)或者新生兒中的敗血癥樣病患(參見Griffin MP等《兒科研究》(Pediatr Res.)2003年6月；53(6)920-6)。
本文使用的術語“抗敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的活性”指分子如肽、多肽或工程抗體治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的能力，或在敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的實驗模型中有活性，如通過作為TREM-1受體活性拮抗劑來起作用。
典型的，本發(fā)明多肽的適應癥是抗敗血癥或膿毒性休克。
術語“基本上的序列同一性”，在與肽/氨基酸序列聯(lián)用時，指在序列上基本相同或相似的肽/氨基酸序列，引起構型上的類似從而造成相似的生物活性。該術語并不旨在暗示共同的序列進化。
典型的，具有“基本上的序列同一性”的肽/氨基酸序列是在序列上至少50％、更優(yōu)選至少80％相同的序列，其至少涵蓋已知參與期望活性的任何區(qū)域。最優(yōu)選的，除了在末端，不超過5個殘基不同。優(yōu)選的，至少在前述區(qū)域中，序列區(qū)別為“保守修飾”的形式。
為確定兩條肽/氨基酸序列或兩條核酸序列的序列同一性百分比，為最佳比較目的而將序列進行比對(如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或兩者中都引入空位以進行最佳比對，而且為比較目的可忽略非同源序列)。例如，為比較目的進行比對的參照序列的長度是參照序列長度的至少30％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少60％，并且甚至更優(yōu)選至少70％、80％、或90％(如，當將第二序列與具有如100個氨基酸殘基的第一氨基酸序列進行比對時，將比對至少30，優(yōu)選至少40，更優(yōu)選至少50，甚至更優(yōu)選至少60，并且甚至更優(yōu)選至少70、80、或90個氨基酸殘基)。然后比較在相應氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當?shù)谝恍蛄兄械奈恢脼榈诙蛄邢鄳恢蒙系南嗤被釟埢蚝塑账崴紦?jù)時，則那個位置上分子是相同的(如文中所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩序列間的同一性百分比是序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，其中將空位數(shù)和每個空位的長度考慮在內(nèi)，它們是為最佳比對兩序列而需要引入的。序列比較和兩序列間的同一性百分比的確定可利用數(shù)學算法來完成。在一個實施方案中，兩氨基酸序列間的同一性百分比利用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))來確定，其被整合進了GCG軟件包的GAP程序中(可在http//www.gcg.com中獲得)，其使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，且空位權重為16、14、12、10、8、6或4，而長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一個實施方案中，兩核苷酸序列間的同一性百分比利用GCG軟件包的GAP程序(可在http//www.gcg.com中獲得)來確定，使用了NWSgapdna.CMP矩陣，且空位權重為40、50、60、70或80，而長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一個實施方案中，兩氨基酸或核苷酸序列間的同一性百分比利用E.Meyers和W.Miller算法(CABIOS，411-17(1989))來確定，其被整合進了ALIGN程序(2.0版)中，其使用了PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列能進一步用作“查詢序列”來對公共數(shù)據(jù)庫進行檢索以鑒定諸如其他家族成員或相關序列。這樣的檢索可利用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進行。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程序進行，得分＝100，字長＝12，從而獲得與本發(fā)明NIP2b、NIP2cL和NIP2cS核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可用XBLAST程序進行，得分＝50，字長＝3，從而獲得與本發(fā)明NIP2b、NIP2cL和NIP2cS蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。要獲得用于比較目的的空位比對，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402所述，可利用空位BLAST。當利用BLAST和空位BLAST程序時，可使用各自程序(如NBLAST和XBLAST)的默認參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
術語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在文中可互換使用。本文使用的術語“肽”指具有兩個或更多氨基酸或氨基酸類似物(包括非天然產(chǎn)生的氨基酸)的鏈，相鄰氨基酸由肽(-NHCO-)鍵連接。因而，本發(fā)明的肽包括寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、擬位(mimetopes)和擬肽。制備擬位和擬肽的方法是本領域公知的。
術語“擬位”和“擬肽”在文中可互換使用?；衔颴的“擬位”指一種化合物，其中對于X的功能活性所必需的X的化學結構為其他模擬X構型的化學結構所代替。擬肽的實例包括肽化合物，其中肽主鏈為一個或多個苯二氮分子(參見如，James，G.L.等(1993)《科學》(Science)2601937-1942)和“回-反”肽(參見Sisto的美國專利No.4,522,752)所取代。術語“擬位”和“擬肽”也指除了自然形成的氨基酸之外的部分，其構型和功能可用作含肽化合物中特定氨基酸的替代物而不會顯著程度地不利地干擾肽的功能。氨基酸模擬物的實例包括D-氨基酸。用一個或多個D-氨基酸取代的肽可用眾所周知的肽合成操作制備。其他取代包括具有帶官能團的變體側鏈的氨基酸類似物，如b-氰丙氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸、正亮氨酸、3-磷酸絲氨酸、高絲氨酸、二羥苯丙氨酸、5-羥色氨酸、1-甲基組氨酸、或3-甲基組氨酸。
如文中所用的化合物X的“類似物”指一種化合物，其保留了對于X的功能活性所必需的X的化學結構，還包含某些不同于X的某些化學結構。自然產(chǎn)生的肽的類似物的例子是包括一個或多個非天然產(chǎn)生的氨基酸的肽。術語“類似物”也旨在包括修飾的擬位和/或擬肽、修飾的肽和多肽，以及肽和多肽的等位變體。所以肽的類似物將產(chǎn)生基本上同源的肽類似物，或換句話說，其與原始肽具有基本上的序列同一性。術語“氨基酸”包括本領域公認的含義并廣義上涵蓋式I的化合物 優(yōu)選的氨基酸包括天然產(chǎn)生的氨基酸、以及合成衍生物、和衍生自蛋白質(zhì)的氨基酸，如，諸如酪蛋白的蛋白質(zhì)，即酪蛋白氨基酸(casamino acids)，或如酵母、動物制品、如肉水解液、或植物制品、如大豆蛋白、棉子蛋白、或玉米漿的酶或化學水解液(參見如，Traders’Guide to Fermentation Media，TradersProtein，Mephis，TN(1988)，《生物技術工業(yè)微生物學教科書》(BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiogy)，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1989)，和《玉米漿產(chǎn)品數(shù)據(jù)表》(Product Data Sheet for Corn Steep Liquor)，GrainProcessing Corp.，IO)。
術語“天然產(chǎn)生的氨基酸”包括生物系統(tǒng)中通常構成大多數(shù)多肽的20種氨基酸殘基的任何一種、見于纖維蛋白的稀有氨基酸(如，4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、N-甲基賴氨酸、3-甲基組氨酸、鎖鏈賴氨酸、異鎖鏈賴氨酸)，以及在蛋白質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)生的氨基酸(如，氨基丁酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨酸、黎豆氨酸和-氰丙氨酸)。
術語“天然產(chǎn)生的氨基酸的側鏈”旨在包括任何天然產(chǎn)生的氨基酸的側鏈，如式I中R所代表的。所屬領域技術人員會理解式I的結構旨在涵蓋諸如脯氨酸的氨基酸，其中側鏈為環(huán)或雜環(huán)結構(如，脯氨酸中的R基團和氨基形成5元雜環(huán))。
文中使用的術語“同源物”指一系列具有共同生物活性和/或結構域、并具有足夠的如本文所定義的氨基酸同一性的肽或多肽的任何成員，，所述生物活性包括抗原性/免疫原性和炎癥調(diào)節(jié)活性。這樣的同源物可以來自相同或不同的動物物種。
文中使用的術語“變體”指給定肽的天然產(chǎn)生的等位變異體或給定肽或蛋白質(zhì)的重組制備的變異體，其中一個或多個氨基酸殘基通過氨基酸取代、添加或缺失而修飾。
本文中使用的術語“衍生物”指以其他方式修飾的給定肽或蛋白質(zhì)的變異體，即通過任何類型的分子共價連接于肽或蛋白質(zhì)，優(yōu)選具有生物活性，其包括非天然產(chǎn)生的氨基酸。
優(yōu)選的，這樣的同源物、變體和衍生物能治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情，或在敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的實驗模型中有活性，如作為TREM-1受體活性拮抗劑來起作用。
“分離”或“純化”的肽或蛋白質(zhì)是基本沒有來自獲得蛋白質(zhì)的細胞或組織來源的細胞材料或其他污染蛋白，或在化學合成時基本沒有化學前體或其他化學物質(zhì)。
用語“基本上沒有細胞材料”包括多肽/蛋白制品，其中多肽/蛋白質(zhì)是從分離或重組產(chǎn)生它的細胞的細胞成份中分離。因此，基本上沒有細胞材料的多肽/蛋白質(zhì)包括具有少于約30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(以干重計)的污染蛋白的多肽/蛋白制品。當重組產(chǎn)生多肽/蛋白質(zhì)時，也優(yōu)選基本上沒有培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基相當于少于約20％、10％或5％的蛋白制品的體積。當通過化學合成產(chǎn)生多肽/蛋白質(zhì)時，優(yōu)選基本沒有化學前體或其他化學物質(zhì)，即從參與蛋白質(zhì)合成的化學前體或其他化學物質(zhì)中分離出來。由此，這樣的多肽/蛋白質(zhì)制品具有少于約30％、20％、10％、5％(以干重計)的化學前體或目的多肽/蛋白質(zhì)片段以外的化合物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，多肽/蛋白質(zhì)是分離或純化的。
除了上述多肽，本發(fā)明的多肽也包括那些多肽，其具有共同生物活性和/或結構域，并具有如本文定義的足夠的氨基酸同一性(同源性)。這些同源物可以來自相同或不同的動物物種，優(yōu)選來自哺乳動物，更優(yōu)選來自嚙齒動物，如小鼠和大鼠，并且最優(yōu)選來自人。優(yōu)選的，它們顯示出TREM-1的至少一個結構和/或功能特征，并優(yōu)選能治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情，如作為TREM-1受體活性拮抗劑來起作用。這樣的修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入。氨基酸修飾能通過任何本領域已知方法來制備，各種方法對于所屬領域技術人員來說是可以獲得的并且是常規(guī)的。
另外，在進行氨基酸取代時，通常待取代的氨基酸殘基是保守的氨基酸取代(即“保守性取代”)，如極性殘基用極性殘基取代，親水殘基用親水殘基取代，疏水殘基用疏水殘基取代，帶正電荷的殘基用帶正電荷的殘基取代，或帶負電荷的殘基用帶負電荷的殘基取代。另外，待修飾的氨基酸殘基一般不是種間高度或完全保守的，和/或?qū)Ρ３制湓醋缘碾暮?或蛋白質(zhì)的生物學活性來說是關鍵的。
本發(fā)明的肽可用任何方便的方式直接合成。通常在整個合成期間要保護存在著的反應基團(如氨基、巰基和/或羧基)。一部分本發(fā)明的肽，即其中所包含的氨基酸是遺傳編碼的氨基酸的那些，通過所屬領域技術人員公知的表達系統(tǒng)，將能在原核和真核宿主中表達。分離純化諸如微生物表達肽的方法也是公知的。編碼這些本發(fā)明的肽的多核苷酸構成了本發(fā)明的另一方面。本文所用的“多核苷酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚體，為分離片段的形式或作為更大構建體的組分，如諸如質(zhì)粒的表達載體。本發(fā)明的多核苷酸序列包括DNA、RNA和cDNA序列。由于遺傳密碼子的簡并性，當然不止一個多核苷酸能編碼根據(jù)本發(fā)明的特定肽。當選擇細菌宿主表達肽時，可能需要采取步驟保護宿主免受表達的抗菌肽影響。這樣的技術是本領域已知的，并包括使用抗特定表達肽的細菌菌株，或表達這樣的融合肽，其在一端或兩端具有能使根據(jù)本發(fā)明肽的抗生素活性失效的部分。在后一種情況下，肽可在收獲后裂解以產(chǎn)生活性肽。如果肽摻入了化學修飾，則表達肽的活性/穩(wěn)定性可能低，并僅受合成后化的學修飾調(diào)節(jié)。
另外，本發(fā)明也包括本發(fā)明多肽的衍生物。例如，但并非限制性地，衍生物可包括修飾的肽或蛋白質(zhì)，如通過糖基化、乙?；⒕垡叶蓟?、磷酸化、酰胺化、通過已知保護/封閉基團衍生化、蛋白酶水解切割、與細胞配體或其他蛋白質(zhì)連接等進行。各種化學修飾可通過已知技術進行，包括但不限于，特異性化學裂解、乙?；?、甲?；?。另外，衍生物可包含一個或多個非經(jīng)典氨基酸。所屬領域技術人員會知道各種修飾肽的方法以增加效力、延長活性和/或提高半衰期。在一個例子(WO0210195)中，通過在肽的N端、肽的C端、或肽鏈的游離氨基或羧基上通過酰胺鍵與至少一個剛性構型的取代基偶聯(lián)來進行修飾。具有相似效果的肽修飾的其他例子在如WO2004029081、WO03086444、WO03049684、WO0145746、WO0103723和WO9101743中描述。
本發(fā)明進一步提供了抗體，其包含本發(fā)明的肽或多肽，或模擬本發(fā)明的肽或多肽的活性。這樣的抗體包括但不僅限于多克隆、單克隆、雙特異性、多特異性、人、人源化、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫鍵相連的Fv，以及包含VL或VH結構域或者甚至互補決定區(qū)(CDR)的能特異結合本發(fā)明多肽的片段。在另一個實施方案中，也可以用本領域公知的各種噬菌體展示方法來產(chǎn)生抗體。利用本領域已知方法也可采用重組產(chǎn)生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技術，如PCT公開WO 92/22324；Mullinax等《生物技術》(BioTechniques)，12(6)864-869，1992；和Sawai等，1995，AJRJ 3426-34；和Better等，1988，《科學》(Science)2401041-1043所述(特此將其中每篇都全文納入作為參考)?？捎糜谏a(chǎn)單鏈Fv和抗體的技術例子包括那些如美國專利No.4,946,778和5,258,498；Huston等，1991，《酶學方法》(Methods in Enzymology)20346-88；Shu等，1993，《美國國家科學院進展》(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)907995-7999；和Skerra等，1988，《科學》(Science)2401038-1040中所述的。對于一些應用，包括抗體在人體中的體內(nèi)應用和體外檢測試驗，優(yōu)選使用嵌合、人源化或人抗體。嵌合抗體是一種分子，其中抗體的不同部分來源于不同的動物物種，如具有來源于鼠單克隆抗體可變區(qū)和來源于人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領域已知的，如參見Morrison，1985，《科學》(Science)2291202；Oi等，1986，《生物技術》(Biotechniques)4214；Gillies等，1989，《免疫學方法雜志》(J.Immunol.Methods)125191-202；美國專利No.5,807,715、4,816,567和4,816,397；特此將它們都全文納入作為參考。人源化抗體是來自非人物種的抗體分子，其將來自非人物種的具有一個或多個互補決定區(qū)(CDR)的期望抗原和來自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)(或在本發(fā)明的情況下，一個或多個源自TREM-1蛋白的CDR)結合在一起。如本領域已知的，人框架區(qū)中的框架殘基能用來自CDR供體抗體的相應殘基替換以改變、優(yōu)選增強抗原結合。這些框架替代通過本領域公知的方法來鑒定，如通過CDR和框架殘基相互作用的建模從而鑒定出對抗原結合重要的框架殘基，并通過序列比較來鑒定特定位置上不尋常框架殘基。參見如，Queen等，美國專利No.5,585,089；Riechmann等，1988，《自然》(Nature)332323，1988，特此將它們都全文納入作為參考?？贵w可利用各種本領域已知技術來人源化，包括諸如，CDR移植(EP239,400；PCT公開文件WO91/09967；美國專利No.5,225,539、5,530,101和5,585,089)、表面重塑(veneering or resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，《分子免疫學》(Molecular Immunology)，28(4/5)489-498；Studnicka等，1994，《蛋白質(zhì)工程》(Protein Engineering)，7(6)805-814；Roguska等，1994，《美國國家科學院進展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91969-973，和鏈改組(美國專利No.5,565,332)，特此將它們都全文納入作為參考。
全人抗體對于治療人類患者特別理想。人抗體可通過各種本領域已知技術制備，包括上述噬菌體展示方法，其使用來源于人免疫球蛋白序列的抗體庫。參見美國專利No.4,444,887和4,716,111；以及PCT公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，特此將其中每篇都全文納入作為參考。也可用轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人抗體(參見Lonberg和Huszar(1995)，《國際免疫學綜述》(Int.Rev.Immunol.)1365-93)。例如，生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體的詳細技術討論和生產(chǎn)這些抗體的方案，參見PCT公開WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735；歐洲專利No.0598877；美國專利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5.939.598；特此將它們都全文納入作為參考。另外，諸如Abgenix公司(Freemont，CA)、Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)的公司利用與上述相似的技術，可致力于提供直接抗所選抗原的人抗體。識別所選表位的全人抗體可用稱之為“導向選擇”的技術來產(chǎn)生。在該方法中，選擇的非人單克隆抗體如小鼠抗體，被用于指導選擇識別相同表位的全人抗體(Jespers等，1988，《生物技術》(Bio/technology)12899-903)。與異源多肽融合或綴合的抗體可用于本領域公知的體外免疫測試和純化方法(如親合層析)中。參見諸如PCT公開WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，1994，《免疫學通訊》(Immunol.Lett.)3991-99；美國專利No.5,474,981；Gillies等，1992《美國國家科學院進展》(Proc Natl.Acad.Sci.USA)891428-1432；和Fell等，1991，《免疫學雜志》(J.Immunol.)1462446-2452，特此將它們都全文納入作為參考。
在另一方面，本發(fā)明提供了鑒定結合或調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽活性的化合物或配體的方法。此方法包括在測試化合物存在或不存在下測量多肽生物學活性，并鑒定改變(提高或降低)多肽生物活性的測試化合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種融合蛋白，其包含生物活性分子和本發(fā)明多肽的一個或多個結構域或其片段。尤其是，本發(fā)明提供了這樣的融合蛋白，其包含與本發(fā)明多肽的一個或多個結構域或其片段重組融合或化學綴合(包括共價和非共價綴合)的生物活性分子。
本發(fā)明進一步包括融合蛋白，其中本發(fā)明多肽或其片段與異源多肽(即無關多肽或其部分，優(yōu)選該多肽的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個氨基酸)重組融合或化學綴合(包括共價和非共價綴合)以產(chǎn)生融合蛋白。融合不必是直接的，但可以通過接頭序列進行。
在一個例子中，融合蛋白中本發(fā)明多肽或其片段可與來源于各種類型的免疫球蛋白的序列融合。例如，本發(fā)明多肽可與人IgG1或IgM分子的恒定區(qū)(如，鉸鏈、CH2和CH3結構域)融合，(如，如Hudson & Souriquso(2003)《自然醫(yī)學》(Nature Medcine)9(1)129-134所述)，從而使得融合多肽或其片段在體內(nèi)更加可溶和穩(wěn)定?？贵w片段的短半衰期也可通過“聚乙二醇化”而延長，即與聚乙二醇融合(參見Leong，S.R.等(2001)《細胞因子》(Cytokine)16106-119)。在這類融合的一個例子中，如WO 0183525所述，F(xiàn)c結構域與生物學活性肽融合。通過共價將Fc結構域與所選肽的至少一個氨基酸連接來生產(chǎn)藥理學活性化合物。連接到載體會增加肽的半衰期，否則其會在體內(nèi)迅速降解。
可選的，非經(jīng)典的備選蛋白支架(如參見Nygren & Skerra(2004)《免疫學方法雜志》(J Immunol Methods)209(1-2)3-28或WO03049684)能用于摻入和復制本發(fā)明肽的性質(zhì)，如通過將源于TREM-1CDR2或CDR3的肽序列插入到蛋白框架中以支持與在固定空間排列中的CDR2或CDR3具有結構/功能相似性的構型可變的環(huán)。
此類融合蛋白或基于框架的蛋白質(zhì)可用作免疫原以產(chǎn)生識別本發(fā)明多肽或其片段的特異性抗體。在另一個優(yōu)選實施方案中，此類融合蛋白或基于框架的蛋白質(zhì)可向個體給藥從而在體內(nèi)抑制配體和其受體間的相互作用。這種相互作用的抑制會阻斷或阻遏某些參與敗血癥和膿毒性休克細胞應答。
在一個方面，融合蛋白包含本發(fā)明的多肽，所述多肽在其N端與異源信號序列融合。大量信號序列可商業(yè)獲得。例如，蜂毒肽和人胎盤堿性磷酸酶(Stratagene；La Jolla，CA)的分泌序列可作為真核異源信號序列獲得。對于原核異源信號序列的例子，可列出phoA分泌信號(Sambrook等，同上；和《現(xiàn)代分子生物學方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，1992，Ausubel等編，John Wiley & Sons)和蛋白A分泌信號(Pharmacia Biotech；Piscataway，NJ)。另一個例子是桿狀病毒被膜蛋白的gp67分泌序列(《現(xiàn)代分子生物學方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，1992，Ausubel等編，John Wiley & Sons)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的多肽可與標簽序列融合，如六組氨酸肽，如在pQE載體中提供的標簽(QIAGEN公司，9259Eton大街，Chatsworth，CA，91311)，其中許多都可由商業(yè)上獲得。如Gentz等1989，《美國國家科學院進展》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86821-824所述，六組氨酸方便了融合蛋白的純化，肽標簽的其他例子是血球凝集素“HA”標簽，其對應于源自流感病毒血球凝集素蛋白的表位(Wilson等，1984，《細胞》(Cell)37767)和“flag”標簽(Knappik等，1994，《生物技術》(Biotechniques)17(4)754-761)。這些標簽尤其適用于純化重組產(chǎn)生的本發(fā)明的多肽。
融合蛋白可通過標準的重組DNA技術或通過蛋白質(zhì)合成技術來制備，如使用肽合成儀。例如，編碼融合蛋白的核酸分子可通過包括自動化DNA合成儀的常規(guī)技術來合成。可選的，可利用錨定引物來進行基因片段的PCR擴增，引物在兩個連續(xù)基因片斷間產(chǎn)生互補的突出端，其隨后能退火并再擴增從而產(chǎn)生嵌合基因序列(參見如，《現(xiàn)代分子生物學方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，1992，Ausubel等編，John Wiley & Sons)。編碼融合蛋白的核酸序列能插入合適的表達載體中，即包含轉(zhuǎn)錄和翻譯插入蛋白質(zhì)編碼序列的必要元件的載體。已知有大量宿主-載體系統(tǒng)和選擇系統(tǒng)。在具體的實施方案中，融合蛋白的表達受組成型啟動子的調(diào)控。在另一個實施方案中，融合蛋白的表達受誘導型啟動子的調(diào)控。根據(jù)這些實施方案，啟動子可以是組織特異性的啟動子。包含插入編碼融合蛋白的基因插入子的表達載體可通過三種常規(guī)方法鑒定(a)核酸雜交，(b)“標記”基因功能的存在或缺失，以及(c)插入序列的表達。在第一種方法中，出現(xiàn)在表達載體中的編碼融合蛋白的基因能通過核酸雜交來檢測，其中使用了包含與編碼融合蛋白的插入基因同源的序列的探針。在第二種方法中，重組載體/宿主系統(tǒng)能根據(jù)某些“標記”基因功能(如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中包含體的形成，等)的存在或缺失來鑒定和選擇，這是由在載體中編碼融合蛋白的核酸序列造成的。例如，如果將編碼融合蛋白的核酸序列插入到載體的標記基因序列中，則包含編碼融合蛋白的基因插入子的重組子能通過標記基因功能的缺失來鑒定。在第三種方法中，重組表達載體能通過檢測重組子表達的基因產(chǎn)物(即，融合蛋白)來鑒定。例如，這些測試可基于體外測試系統(tǒng)中的融合蛋白的物理或功能性質(zhì)，如與抗融合蛋白抗體結合。對于長期、高產(chǎn)的重組蛋白生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，可工程化穩(wěn)定表達融合蛋白的細胞系。除了利用包含病毒復制起點的表達載體，可用受合適表達調(diào)節(jié)元件(如，啟動子、增強子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點等)調(diào)節(jié)的DNA和選擇標記轉(zhuǎn)化宿主細胞。在引入外源DNA后，可使工程細胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標記賦予選擇抗性，并使細胞穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合入它們的染色體中，且生長形成集落，其依次可被克隆并擴展到細胞系中。該方法可有利地用于改造細胞系表達差異表達或路徑基因蛋白。一旦本發(fā)明的融合蛋白通過重組表達而產(chǎn)生，則可通過任何本領域已知的純化蛋白質(zhì)的技術來純化，如，通過層析(如，離子交換，親和，尤其通過特異抗體的親和性，和大小篩柱層析)、離心、差異溶解，或通過其他標準純化蛋白質(zhì)技術。
本發(fā)明也提供了通過給藥本發(fā)明的肽或多肽來治療患有敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的患者的方法。在另一個實施方案中，調(diào)節(jié)分子可以是模擬本發(fā)明多肽活性的抗體。尤其，本發(fā)明提供了治療或改善個體敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的方法，其包括向所述個體給藥治療有效量的前述權利要求之任一的肽或多肽。在該方法中，給藥的肽或多肽可以與序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有基本上的序列同一性，是SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19，或SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的活性片段、類似物或衍生物，或與SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少80％的序列同一性。
在一個方面，本發(fā)明提供了通過給藥本發(fā)明的肽或多肽來預防敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的方法。有敗血癥或膿毒性休克危險的個體可以通過本領域已知的諸如診斷或預后試驗來鑒定(對于特別適合的診斷方法，參見WO 2004081233，Gibot等(2004)《國際醫(yī)學年報》(Ann Intern Med.)141(1)9-15和Gibot等(2004)《新英格蘭醫(yī)學雜志》(N Engl J Med.)350(5)451-8。如，在本中所述的預后試劑可用于治療處于諸如前述疾病危險的個體。本發(fā)明的方法適用于哺乳動物，如人、非人靈長類、羊、豬、牛、馬、山羊、狗、貓和嚙齒動物，如小鼠和大鼠。通常，本發(fā)明的方法將用于人個體。
另外，本發(fā)明提供了藥物細合物，其包含本發(fā)明的多肽或模擬本發(fā)明的多肽的抗體或其片段。本發(fā)明的肽、多肽和抗體(本文中也稱為“活性化合物”)可摻入適于給藥的藥物組合物。該組合物一般包含肽、蛋白質(zhì)、或抗體和藥學上可接受載體。
本文中使用的用語“藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑”旨在包括任何和所有與藥物給藥相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。這些介質(zhì)和試劑用作藥物活性物質(zhì)的用途是本領域公知的。除了任何常規(guī)的不與活性化合物相容的介質(zhì)和試劑范圍之外，都可考慮其在組合物中應用。輔助的活性化合物也可摻進該組合物中。
本發(fā)明包括制備包含本發(fā)明肽或多肽的藥物組合物的方法。該組合物可進一步包括附加的活性劑。因此，本發(fā)明進一步包括通過將本發(fā)明肽或多肽和一種或多種附加的活性劑與藥學上可接受載體配伍來制備藥物組合物的方法。
本發(fā)明的藥物組合物配成適于其目的給藥途徑。給藥途徑的例子包括腸胃外，如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、關節(jié)內(nèi)、腹膜內(nèi)和胸膜內(nèi)，以及口服、吸入和直腸給藥。用于腸胃外、皮內(nèi)、或皮下應用的溶液或懸液可包括以下成分無菌稀釋劑，如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成容劑；抗細菌劑，如苯甲醇或甲基對羥基苯甲酸酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如醋酸、檸檬酸或磷酸鹽以及調(diào)節(jié)滲透壓的試劑，如氯化鈉或葡萄糖?？捎盟峄驂A調(diào)節(jié)pH，如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外制劑可封裝在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制的多劑量瓶中。
適于注射的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性情況下)或分散劑和用于臨時制備無菌注射液或分散劑的無菌粉末。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸緩沖鹽液(PBS)。在所有的情況下，組合物必須是無菌的，其其流動性程度應為方便用注射器注射。在制備和儲存的條件下必須是穩(wěn)定的，并必須保存防止諸如細菌和真菌的微生物的污染。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，比如其包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，可通過使用諸如卵磷脂的包衣、在分散劑的情況下通過保持所需的粒徑、以及通過使用表面活性劑來保持適當?shù)牧鲃有?。通過大量抗細菌和抗真菌劑可實現(xiàn)防止微生物作用，如用對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，組合物中優(yōu)選納入等滲劑，如糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇、氯化鈉?？稍诮M合物中納入諸如單硬脂酸鋁和明膠的延緩吸收的試劑，以此延遲注射組合物的吸收。
無菌注射液可通過將所需量的活性化合物(如多肽或抗體)摻入到合適的溶劑中來制備，所述溶劑視需要具有以上列舉的成份之一或其組合，接著進行過濾滅菌。通常分散劑通過將活性化合物摻入到無菌載體中來制備，所述載休包含基本的分散介質(zhì)和以上列舉的其他所需成份。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，這產(chǎn)生活性成分加上其前面無菌過濾液中任何所需的附加成分的粉末。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。它們可封裝于明膠膠囊中或壓成片劑。對于口服治療性給藥的目的，活性化合物可與賦形劑合并，制成片劑、錠劑或膠囊的形式。可包括藥學上相容的粘結劑和/或佐劑材料以作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可包含任何以下成分或相似性質(zhì)的化合物粘結劑，如微晶體纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，如二氧化硅膠；增甜劑，如蔗糖或糖精；或風味劑，如薄荷、水楊酸甲酯、或橙味香料。
對于吸入給藥，化合物以氣霧噴劑的形式從壓力容器或分配器或噴霧器中遞送出來，所述壓力容器或分配器含有合適的推進劑，如諸如二氧化碳的氣體。
也可通過經(jīng)粘粘膜或經(jīng)皮方式全身給藥。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，在制劑中使用了適于穿透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常是本領域已知的，并包括諸如用于經(jīng)皮給藥的去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物?？赏ㄟ^使用鼻噴劑或栓劑實現(xiàn)經(jīng)粘膜給藥。對于經(jīng)皮給藥，將活性化合物配制到本領域公知的油膏、藥膏、膠或乳油中?；衔镆部芍瞥伤▌┑男问?如，用常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可油和其他甘油酯)或用于直腸遞送的留置灌腸劑。
在一個實施方案中，活性化合物用載體制造，所述載體會使化合物抵抗體內(nèi)的迅速降解，如控釋制劑，包括植入和微膠囊遞送系統(tǒng)?？墒秤谩⑸锝到?、生物相容的多聚物，如醋酸乙烯、聚酸酐、聚羥基乙酸、膠原質(zhì)、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法對所屬領域技術人員來說是顯而易見的。原料也可由商業(yè)途徑從Alza公司和Nova制藥公司獲得。脂質(zhì)體懸液(包括帶有針對病毒抗原的單抗、靶向感染細胞的脂質(zhì)體)也可用作藥學上可接受的載體?？筛鶕?jù)所屬領域技術人員已知的方法來制備這些材料，如美國專利No.4,522,811所述。
將口服或腸胃外組合物配制成劑量單位形式以方便給藥和劑量統(tǒng)一是特別有利的。文中所用的劑量單位形式指物理上離散的單位，其適于作為待治療個體的單位劑量；每個單位包含預定量的活性化合物和所需的藥物載體，所述活性化合物經(jīng)計算能產(chǎn)生期望的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格是由活性化合物的特性和欲達的特定治療效果、以及本領域配伍該活性化合物治療個體中所固有的局限性決定的且直接取決于此。
如本文所定義的，治療有效量的蛋白質(zhì)或多肽(即，有效劑量)約為0.001至30mg/kg體重，優(yōu)選約0.01至25mg/kg體重，更優(yōu)選約0.1至20mg/kg體重，并且甚至更優(yōu)選約1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg體重。
對于抗體，優(yōu)選劑量是0.1mg/kg至100mg/kg體重(通常10mg/kg至20mg/kg)。如果抗體作用于大腦，通常適合的劑量是50mg/kg至100mg/kg。通常，部分人抗體和完全人抗體在人體內(nèi)比其他抗體有更長的半衰期。由此，通?？赡苁褂幂^低的劑量和較低的給藥頻率。諸如脂化的修飾可用于穩(wěn)定抗體并增強攝取和組織滲透(如透入大腦)。脂化抗體的方法由Cruikshank等，1997，《過繼性免疫缺陷綜合癥和人類逆轉(zhuǎn)錄病毒學雜志》(J.Acquired Immune DeficiencySyndromes and Human Retrovirology)14193)所述。
藥物組合物可以和給藥說明一起裝在容器、包裹或分配器中。
本發(fā)明進一步提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明的肽或多肽或模擬本發(fā)明多肽的抗體或其片段，優(yōu)選和使用說明一起例如用于治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情。
本發(fā)明提供了鑒定(或篩選)調(diào)節(jié)分子即候選或測試化合物或試劑(如，肽、擬肽、小分子或其他藥物)的方法，它們模擬本發(fā)明的多肽或具有刺激或抑制例如本發(fā)明多肽活性的效果。尤其，本發(fā)明提供了一種篩選治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的化合物或組合物的方法，其包括提供TREM-1肽；在盲腸結扎穿孔模型(或使用文中描述的或本領域已知的其他試驗或模型)中使動物與TREM-1肽接觸；確定是否存在對敗血癥的調(diào)節(jié)作用，例如其中存活率的增加顯示出TREM-1肽可用于治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情。
本發(fā)明進一步和上述篩選試驗鑒定的新試劑及其用于文中所述治療的用途有關。
特此將本說明書引用的所有公開文獻，包括但不限于專利和專利申請，都納入本文作為參考，就如同每一篇公開文獻從一開始就各自明確且分別地納入本文最為參考一樣。
本發(fā)明每一方面的優(yōu)選特征可作必要的修證而相互適用。
本發(fā)明現(xiàn)在將參照以下非限制性的實施例、參照附圖而描述，其中


圖1A顯示TREM-1和TREM-2家族成員的序列比對。用1.74版CLUSTALW將人TREM-1與小鼠TREM-1以及人和小鼠TREM-2進行了比對。二級結構分配與公開的人TREM-1結構相符(箭頭指β折疊，圓柱體指α螺旋)(Radaev等(2003)Structure(Camb).12月；11(12)1527-35)。參與同型-雜二聚體形成的殘基如黑色背景中的白色所示。形成V型Ig折疊保守的二硫鍵的半胱氨酸如粗體所示。空位用(-)，相同的殘基用(*)，相似的用(或.)表示。人和小鼠TREM1序列間相似的擴展區(qū)如灰背景上的盒所示。本文實施例中使用的TREM-1肽序列以下劃線表示。
圖1B顯示了公開的TREM-1同型二聚體結構的帶狀圖(Kelker等(2004)《分子生物學雜志》(J Mol Biol.)9月24日；342(4)1237-48)。推測的包含抗體等價互補決定區(qū)(CDR)的結合位點以紅色顯示。
圖2顯示了在LPS前1小時給藥TREM-1肽減少了內(nèi)毒素血癥誘導的死亡。用200μg LPS腹膜內(nèi)注射BALB/c小鼠(每組10只)。在LPS前1小時腹膜內(nèi)注射TREM-1肽P1、P2、P3或P5(每只小鼠200μl 300μM溶液)。每天兩次監(jiān)測小鼠的生存能力，進行7天。用Logrank測驗進行統(tǒng)計學分析。對照小鼠的數(shù)據(jù)代表在相同條件下進行的兩個獨立實驗的累積存活曲線。
圖3顯示在LPS后4小時注射TREM-1肽P1能有效減少內(nèi)毒素血癥誘導的死亡。用200μg LPS腹膜內(nèi)注射BALB/c小鼠(每組10只)。在LPS前1小時或后4小時腹膜內(nèi)注射TREM-1肽P1，每只小鼠200μl 300μM溶液。每天兩次監(jiān)測小鼠的生存能力，進行7天。用Logrank測驗進行統(tǒng)計學分析。對照小鼠的數(shù)據(jù)代表在相同條件下進行的兩個獨立實驗的累積存活曲線。
圖4顯示了在LPS后4小時給藥TREM-1肽減少了內(nèi)毒素血癥誘導的死亡。用200μg LPS腹膜內(nèi)注射BALB/c小鼠(每組10只)。在LPS后4小時腹膜內(nèi)注射P1肽，每只小鼠200μl 150、300和600μM溶液(點)，或注射P3，每只小鼠200μl 600μM溶液(實心方塊)。每天兩次監(jiān)測小鼠的生存能力，進行7天。用Logrank測驗進行統(tǒng)計學分析。
圖5顯示了TREM-1肽P1防御盲腸結扎穿孔(CLP)。如材料和方法所述，在C57BL/6小鼠(每組15只)中誘導CLP。在CLP誘導后5和24小時腹膜內(nèi)注射P1肽(空心點)或P3肽(實心方塊)(每只小鼠200μl 600μM溶液)。每天兩次監(jiān)測小鼠的生存能力，進行10天。用Logrank測驗進行統(tǒng)計學分析。
圖6顯示了P1、P2和P5肽能抑制可溶性TREM-1/IgG1與TREM-1配體陽性的腹膜滲出細胞的結合，而P3肽不能。在存在每只小鼠500μM溶液(細線)、每只小鼠100μM溶液(點線)或不存在肽(粗線)的情況下，顯示了用2μg/ml小鼠TREM-1/hIgG進行的腹膜滲出細胞的細胞熒光分析?；疑鶢顖D代表用人IgG1作對照的免疫印跡。
圖7A顯示了有和沒有蛋白酶抑制劑的情況下用LPS刺激后從培養(yǎng)的單核細胞中釋放的sTREM-1。LPS刺激誘導出現(xiàn)了27-kD蛋白質(zhì)，其為抗TREM-1mAb(插圖)所特異性識別。條件培養(yǎng)基中的sTREM-1由免疫斑點反射率來衡量。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD(n＝3)。
圖7B顯示了單核細胞中TREM-1mRNA的表達。如圖所示，用LPS(1μg/mL)刺激培養(yǎng)的單核細胞0、1和16小時。LPS在1小時內(nèi)誘導產(chǎn)生TREM-1mRNA。
圖8A顯示了培養(yǎng)的單核細胞中釋放的細胞因子和sTREM-1。對于細胞活化，在LPS(1μg/mL)存在的情況下，在24孔平底組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)初級單核細胞。在一些實驗中，刺激物和P5(10至100ng/mL)、對照肽(10至100ng/mL)或rIL-10(500U/mL)一起使用。如圖所示，為通過TREM-1活化單核細胞，加入了激動劑抗TREM-1mAb(10μg/mL)。通過ELISA或免疫斑點來分析無細胞的上清液中TNF-α、IL-1β和sTREM-1的產(chǎn)生。所有實驗進行三次，數(shù)據(jù)用平均值(SEM)表示。
a培養(yǎng)基bP510ng/mLc抗TREM-1dLPSeLPS+抗TREM-1fLPS+P510ng/mL
gLPS+P550ng/mLhLPS+P5100ng/mLiLPS+IL 10圖8B顯示了P5對NFκB活化的影響。如圖所示，在大腸桿菌LPS(O111B4，1μg/mL)、抗TREM-1mAb(10μg/mL)和/或P5(100ng/mL)存在的情況下，培養(yǎng)單核細胞24小時，用利用ELISA試驗確定NFκB p50和p65的水平。實驗進行三次，數(shù)據(jù)用光密度平均值(SEM)表示。
圖9顯示了LPS處理的小鼠血清中sTREM-1的積累。用LPS(LD50，腹膜內(nèi))處理雄性Balb/C小鼠(20至23g)。通過免疫斑點測試血清的sTREM-1。血清sTREM-1在LPS給藥后1小時可容易地檢測，其在4至6小時間保持在平臺水平。
圖10A顯示了P5預處理能防御小鼠的LPS致命性。隨機分組(每組10只小鼠)雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用LD100的LPS處理。P5(50μg或100μg)或?qū)φ蛰d體在LPS前60分鐘給藥。
圖10B顯示了P5的延遲給藥能防止小鼠中的LPS致命性。隨機分組(每組8只小鼠)雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用LD100的LPS處理。P5(75μg)或?qū)φ蛰d體在LPS后4或6小時給藥。
圖10C顯示了TREM-1mAb激動劑的給藥對小鼠是致命的。如圖所示，隨機分組(每組8只小鼠)雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用LD50的LPS+對照載體、LD50的LPS+抗TREM-1mAb(5μg)或LD100的LPS+對照載體組合處理。對照載體和抗TREM-1mAb在LPS注射后1小時給藥。
圖11A顯示了P5部分地防止小鼠CLP誘導的致死。隨機分組雄性Balb/C小鼠(20至23g)并用生理鹽水(n＝14)或?qū)φ针?n＝14，100μg)或用P5(100μg)在H0(n＝18)、H+4(n＝18)或H+24(n＝18)時單次注射處理。最后一組小鼠(n＝18)用P5(100μg)在H+4、H+8和H+24時重復注射處理。
圖11B顯示了P5對存活的劑量效應。CLP后，小鼠(每組n＝15)用生理鹽水或10μg、20μg、50μg、100μg或200μg的P5在H0時單次注射處理并監(jiān)測存活情況。
圖12顯示了P5在CLP期間對細菌數(shù)沒有影響。CLP后24小時麻醉殺死小鼠(每組5只)。確定腹膜灌洗液和血中的細菌數(shù)，結果用每mL血的CFU或每只小鼠腹膜灌洗液的CFU表示。
圖13顯示了大鼠給藥LPS(15mg/kg)后TNF-α和IL-1β血漿濃度的發(fā)展。
*p＜0.05P5處理的vs對照動物§p＜0.05P5處理的vs P1處理的動物圖14顯示了大鼠給藥LPS(15mg/kg)后亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度的發(fā)展。*p＜0.05P5處理的vs對照動物和P1處理的動物圖15顯示了大鼠在盲腸結扎穿孔誘導的腹膜炎期間的平均動脈壓的發(fā)展。
*p＜0.05vs對照動物圖16顯示了大鼠在盲腸結扎穿孔誘導的腹膜炎期間的TNF-α血漿濃度的發(fā)展。
*p＜0.05P5處理的vs對照動物§p＜0.05P1處理的vs對照動物$p＜0.05P5vs P1處理的動物圖17顯示了大鼠在盲腸結扎穿孔誘導的腹膜炎期間的亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度的發(fā)展。
*p＜0.05P5和P1處理的vs對照動物實施例1TREM-1肽防止小鼠死于膿毒性休克TREM-1肽按照以下標準合成i)在人和小鼠TREM-1間有最高的同源性而與TREM-2有最低同源性。ii)肽跨越TREM-1的互補決定區(qū)(CDR)。根據(jù)公開的TREM-1的晶體結構，與抗體類似，這些殘基可能參與同源配體識別(Radaev等2003Structure(Camb.)12月11(12)1527-35&Kelker等(2004)《分子生物學雜志》(J Mol Biol.)9月24日；342(4)1237-48)(參見圖1)。在CDR2區(qū)中設計一個肽(P1)，而在CDR3區(qū)中設計三個肽(P2、P3和P5)。在連接V型免疫球蛋白(Ig)樣結構域(Ig-V)與跨膜結構域的頸狀區(qū)中設計第四個肽(P3)。由于CDR1區(qū)TREM-1和TREM-2間的高序列同源性，沒有在此區(qū)設計肽。
因此，如下TREM-1蛋白的肽由洛桑大學生物化學研究所的蛋白質(zhì)和肽化學研究室定購、合成并純化P1(CDR267-89) LVVTQRPFTRPSEVHMGKFTLKH [SEQ ID NO3]P2(CDR3114-136) VIYHPPNDPVVLFHPVRLVVTKG [SEQ ID NO4]P3(頸狀區(qū)168-184) TTTRSLPKPTAVVSSPG[SEQ ID NO5]P4(CDR3103-123) LQVTDSGLYRCVIYHPPNDPV[SEQ ID NO6]P5(CDR3103-119) LQVTDSGLYRCVIYHPP[SEQ ID NO7]P1sc*(P1雜亂序列) LTPKHGQRSTHVTKFRVFEPVML [SEQ ID NO8]P5sc*(P5雜亂序列) TDSRCVIGLYHPPLQVY [SEQ ID NO9]*這是對照肽，事實上并不起保護作用在該實施例的實驗中，以200μl體積的所示摩爾量的溶液給藥所述肽。為了評估TREM-1肽防止小鼠LPS誘導的內(nèi)毒素血癥的能力，在使用致死劑量的脂多糖(LPS)前1小時，本發(fā)明人給藥了肽P1、P2、P3和P5(300μM)(圖2)。隨時監(jiān)測致死率并與只接受載體對照注射的動物做比較。P5注射賦予了最大的保護，相對于對照小鼠的10％，有90％的動物在LPS注射后7天仍活著(p＜0.0001)。相對于對照小鼠的10％，60％P1處理的小鼠和50％P2處理的小鼠在內(nèi)毒素血癥中活了下來(分別為p＜0.01和p＜0.05)。有趣的是，所有P3處理的小鼠在LPS注射后4天內(nèi)都死了。這些結果顯示含有對應于推測的配體結合位點(CDR2和CDR3)的TREM-1胞外部分序列的肽能防止小鼠死于休克。
為了研究TREM-1肽治療是否能推遲到給藥LPS后，本發(fā)明人在LPS注射后4小時注射了肽。僅僅在P1的情況下，這種延遲治療賦予了顯著的抗致死劑量LPS的保護作用(圖3)。相對于在LPS前1小時處理的60％的小鼠和只用載體處理的10％的小鼠，在LPS后4小時有80％的注射了P1的小鼠在內(nèi)毒素血癥中活了下來(分別為p＜0.001和p＜0.01)。因此，P1即使在內(nèi)毒素血癥爆發(fā)后注射也是有效的。過了一周沒有再發(fā)生死亡，這顯示P1不僅僅延緩了LPS致死的發(fā)生，而且提供了持久的保護作用。相對于對照小鼠的20％，以600μM給藥時，P1給藥賦予了最大的保護作用(80％)(p＜0.01)，而在300μM時則保護水平降到了50％(p＜0.05)并在150μM時進一步降到了30％，這顯示P1的劑量依賴性效應(圖4)。然后本發(fā)明人研究了P1是否在“CLP”模型(盲腸結扎穿孔被廣泛用作敗血癥的實驗模型)中防止膿毒性休克。相對于對照處理的小鼠，在CLP后5和24小時用2劑量的P1處理的小鼠免于死亡(p＝0.0791)，盡管所述差異不具有統(tǒng)計學意義。相對于用P3肽處理小鼠的5％，在CLP后5天用P1注射的小鼠有40％仍舊活著。在CLP后10天，所處理的小鼠仍舊活著，這顯示P1不僅僅延緩了死亡，而且提供了持久的保護作用(圖5)。
實施例2TREM-1肽P1抑制了可溶性小鼠TREM-1/IgG與TREM-1配體陽性細胞的結合在CLP中測試的TREM-1衍生肽中，肽P1、P2和P5證實有保護活性。該作用的可能機理可能是TREM-1衍生肽干擾TREM-1/TREM-1配體相互作用的能力。為了澄清該問題，本發(fā)明人對TREM-1配體陽性細胞來自CLP處理的小鼠的PEC(腹膜滲出細胞)進行了競爭性試驗。
來自患有盲腸結扎穿孔(CLP)所誘導的腹膜炎的小鼠的腹膜滲出細胞(PEC)在與PE綴合的抗人IgG1(Jackson Immunoresearch，Bar Harbor，美國)一起孵育后進行流式細胞儀分析。在加入mTREM-1-IgG1之前，通過將細胞與所示濃度的肽在冰上一起預孵育45分鐘，由此進行與TREM-1肽的競爭。
如圖6所示，衍生自mTREM-1的CDR2區(qū)的P1肽和跨越CDR3區(qū)的P2和P5肽以劑量依賴性的方式抑制了TREM-1與其配體的相互作用。相反，衍生自連接IgG樣部分和跨膜結構域的TREM-1的頸狀區(qū)的P3肽，卻是無效的。
實施例3其他有關TREM-1肽P5調(diào)節(jié)鼠敗血癥中炎癥反應的研究方法從外周血中制備單核細胞從5位實驗室員工的健康志愿供者中收集10ml外周血樣品于EDTA-K上。用RPMI(LifeTechnologies，Grand Island，NY)v/v稀釋后，于室溫以水溶性聚蔗糖(Ficoll)(Amershan Phamacia，Uppsala，瑞典)梯度離心血30分鐘從而分離PBMC。洗滌梯度上獲得的細胞并計數(shù)。然后為了去除淋巴細胞懸液，將濃度為5×106/ml的細胞涂布于24孔平底細胞培養(yǎng)板(Corning，Corning，NY)中，使之在37℃貼壁2小時。棄去所得的淋巴細胞懸液，并于37℃在5％CO2溫箱中，將貼壁的單核細胞保持在添加了10％FCS(Invitrogen，Cergy，法國)的完全培養(yǎng)基(RPMI 1640，0.1mM丙酮酸鈉，2mM青霉素，50μg/ml鏈霉素；LifeTechnologies)中。
TREM-1肽利用Gen-Bank中登錄號#AF287008的人TREM-1序列和#AF241219的小鼠TREM-1序列，將肽“P5”(LQVTDSGLYRCVIYHPP；[SEQ ID NO7]；化學合成為C末端酰胺化的肽(Pepscan System，Lelystad，荷蘭)。以大于99％的產(chǎn)率獲得正確的肽，如用質(zhì)譜和解析反相高效液相色譜所確證的那樣，測得的質(zhì)量為1961Da，而計算的質(zhì)量為1962Da，經(jīng)制備純化后是均質(zhì)的。肽“P5sc”包含與P5相同的氨基酸但次序不同(TDSRCVIGLYHPPLQVY；[SEQ IDNO9])，相似地合成它并用作“對照肽”。
體外刺激單核細胞對于活化，在存在大腸桿菌LPS(O111B4，1μg/ml，Sigma-Aldrich，LaVerpillière，法國)的情況下培養(yǎng)單核細胞。通過錐蟲藍排除法并通過測量乳酸脫氫酶的釋放來評估細胞的存活能力。在一些實驗中，刺激物與TNF-α(5至100ng/ml，R & D System，里爾，法國)、IL-1β(5至100ng/ml，R & D System)、rIFN-γ(高達100U/ml，R & D System)、rIL-10(500U/ml，R & D System)或高達100ng/ml的P5和對照肽聯(lián)合施用。
為了通過TREM-1活化單核細胞，如下加入抗TREM-1激動劑單克隆抗體(R & D System)預先用每孔10μg/ml抗TREM-1包被平底板。在用磷酸緩沖鹽液(PBS)徹底洗滌后，以上述相似的濃度加入單核細胞懸液。一些實驗在存在蛋白酶抑制劑(PMSF和蛋白酶混合物抑制劑；Invitrogen)的情況下進行。根據(jù)生產(chǎn)商(BD Biosciences，San Diego，美國)的推薦通過ELISA測試無細胞的上清液的TNF-α和IL-1β的產(chǎn)量。為了測定P5對單核細胞中NF-κB活性的作用，進行基于ELISA的試驗(BD MercuryTM Transfactor試劑盒，BDBiosciences)。在存在大腸桿菌LPS(O111B4，1μg/ml)和/或激動劑抗TREM-1單克隆抗體(10μg/ml)和/或P5(100ng/mL)的情況下培養(yǎng)單核細胞24小時。然后制備全細胞提取物，按照生產(chǎn)商的推薦確定NF-κB p50和p65的水平。所有實驗進行三次，數(shù)據(jù)以平均值(SEM)表示。
sTREM-1釋放的鑒定和定量如上文所述培養(yǎng)初級單核細胞懸液。在37℃用大腸桿菌LPS(O111B4，1μg/ml)處理細胞24小時。對細胞條件化的培養(yǎng)基利用抗TREM-1單克隆抗體(R & D System)進行Western印跡從而證實抗TREM-1識別的27kDa物質(zhì)的存在。如別處所報道的(18)，用反射掃描儀和Quantity One Quantitation軟件(Bio-Rad，Cergy，法國)，通過評估免疫斑點上條帶的光強度來測量可溶性TREM-1水平。通過將樣品的光密度與純化的TREM-1產(chǎn)生的標準參考曲線作比較，來確定每個樣品中的可溶性TREM-1的濃度。所有測量進行三次。該技術的靈敏度可以檢測低至5pg/mL的sTREM-1水平。
TREM-1RT-PCR從存在LPS的情況下培養(yǎng)的初級單核細胞中用TRIzol試劑(Invitrogen)來提取總mRNA，并用Superscript RT II(Invitrogen)進行反轉(zhuǎn)錄從而產(chǎn)生cDNA。然后，所有反應所使用的RT-PCR條件是94℃、30s/65℃、30s/68℃、1分鐘，進行30個循環(huán)。用2.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，2.0U Taq聚合酶和20pM5’和3’寡核苷酸引物(Proligos，巴黎，法國)來進行擴增。
所用的5’和3’引物對序列如下對于TREM-1(17)TTGTCTCAGAACTCCGAGCTGC；[SEQ ID NO10]和
GAGACATCGGCAGTTGACTTGG；[SEQ ID NO11]對于TREM-1sv(19)GGACGGAGAGATGCCCAAGACC；[SEQ ID NO12]和ACCAGCCAGGAGAATGACAATG；[SEQ ID NO13]對于β-肌動蛋白(用作持家擴增子)GGACGACATGGAGAAGATCTGG；[SEQ ID NO14]和ATAGTAATGTCACGCACGArrTCC；[SEQ ID NO15]PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠并用溴化乙錠染色使之可見。
小鼠中的LPS誘導的內(nèi)毒素血癥在地方倫理委員會批準后，隨機分組雄性Balb/C小鼠(20至23g)，并在LPS刺激前后，用大腸桿菌LPS與P5(溶于500μl生理鹽水)或?qū)φ蛰d體進行腹膜內(nèi)(i.p.)聯(lián)合給藥。在一些實驗中，LPS注射后1小時i.p.給藥5μg抗TREM-1單克隆抗體。每小時檢查小鼠的生存能力，或以有規(guī)律的間隔處死動物。通過心臟穿刺收集血清樣品并通過ELISA(BD Biosciences)檢測TNF-α和IL-1β，通過免疫斑點檢測sTREM-1水平。
CLP多微生物敗血癥模型通過i.p.給藥溶于0.2mL無菌無熱原鹽水的氯胺酮和甲苯噻嗪來麻醉雄性Balb/C小鼠(7至9周齡，20至23g)。通過1.0cm腹部中線切開術來暴露出盲腸，結扎末梢的一半，接著用G21針兩次穿刺。穿刺排出少量糞便以保證開放性。將盲腸重置入腹腔內(nèi)并在兩層間封閉腹部切口。手術后，用0.5ml生理鹽水溶液s.c.注射所有小鼠使體液復蘇，并每12h用1.25mg(即50μg/g)丙咪嗪s.c.注射。隨機分組動物并用生理鹽水(n＝14)、對照肽(n＝14，100μg)或P5(100μg)在H0(n＝18)、H+4(n＝18)或H+24(n＝18)時單次注射處理。最后一組小鼠(n＝18)用P5(100μg)在H+4、H+8和H+24時重復注射處理。所有的處理液都用500μl生理鹽水稀釋并進行i.p.給藥。本發(fā)明人接著嘗試確定各種劑量的P5的效果。為此目的，CLP后，小鼠(每組n＝15)用生理鹽水或10μg、20μg、50μg、100μg或200μg P5在H0時單次注射處理，并監(jiān)測存活情況。CLP后24小時再麻醉處死每組5只動物以確定細菌數(shù)和細胞因子水平。用2mL RPMI1640(Life Technologies)獲得腹膜灌洗液，并通過心臟穿刺來收集血液。血清中TNF-α和IL-1β濃度用ELISA(BD Biosciences)來確定。為了評估細菌數(shù)，將血和腹膜灌洗液以系列對數(shù)稀釋度涂布于補充有5％羊血的大豆胰蛋白酶液的瓊脂板上。涂板后，將大豆胰蛋白酶液的瓊脂板在37℃需氧孵育24小時，并無氧進行48小時。結果用每mL血的CFU或每只小鼠腹膜灌洗液的CFU來表示。
統(tǒng)計學分析血清sTREM-1和細胞因子水平用平均值(±SD)來表示。P5的抗LPS致死的保護作用利用Log-Rank測驗通過比較存活曲線來測定。用Statview軟件(Abacus Concepts，伯克利，CA)來完成統(tǒng)計學分析，雙尾P＜0.05被認為是顯著的。
結果用大腸桿菌LPS刺激后，可溶性形式的TREM-1從培養(yǎng)的人單核細胞中釋放出來為了鑒定體外sTREM-1的潛在釋放，本發(fā)明人用LPS刺激人單核細胞并用SDS-PAGE分析條件培養(yǎng)基。LPS刺激以時間依賴性的方式誘導了27-kDa蛋白質(zhì)的出現(xiàn)(圖7A)。Western印跡分析揭示該蛋白質(zhì)由直接針對TREM-1胞外結構域的單克隆抗體所特異性識別(圖7A)。誘導條件培養(yǎng)基中sTREM-1出現(xiàn)的LPS的濃度不對細胞生存能力產(chǎn)生影響，這顯示TREM-1的釋放不是由于細胞死亡而造成的。類似的，用蛋白酶抑制劑處理單核細胞不影響TREM-1釋放(圖7A)。TREM-1mRNA水平由于LPS處理而增加了(圖7B)，而TREM-1sv mRNA水平仍舊未檢測到。這暗示TREM-1釋放很可能與基因增加轉(zhuǎn)錄有關而與TREM-1sv表達無關。用TNF-α(5至100ng/mL)或IL-1β(5至100ng/mL)刺激單核細胞16小時以細胞因子劑量依賴性的方式誘導出非常少的TREM-1釋放。即使在高達100U/mL濃度時，用IFN-γ刺激也不誘導TREM-1釋放。
P5減弱了與LPS相關的前炎性細胞因子的釋放在用LPS培養(yǎng)的單核細胞上清液中觀察到了顯著的TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。相對于單獨用mAb或LPS培養(yǎng)的，用TREM-1mAb和LPS兩者培養(yǎng)的細胞的TNF-α和IL-1β的產(chǎn)量甚至更高(圖8A)。若培養(yǎng)基補充了P5或IL-10的話，則LPS刺激后前炎性細胞因子的誘導釋放顯著更低。P5以濃度依賴性的方式，減少了用LPS或用LPS和mAb培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生的TNF-α和IL-1β，并同時增加了用LPS培養(yǎng)的細胞中sTREM-1的釋放。對照肽顯示出對細胞因子或sTREM-1的釋放沒有作用(未顯示數(shù)據(jù))。令人驚訝的，與之相反，IL-10完全抑制TREM-1和炎性細胞因子的釋放(圖8A)。LPS和TREM-1mAb都誘導了強烈活化的單細胞NF-κB p50和p65，而且聯(lián)合給藥LPS和TREM-1mAb產(chǎn)生了協(xié)同效應。P5抑制了由TREM-1結合誘導的NF-κB的活化但并不改變LPS的效果(圖8B)。
LPS處理的小鼠的血清sTREM-1水平增加了為了確定在小鼠內(nèi)毒素血癥期間sTREM-1是否是全身性釋放，本發(fā)明人測量了LPS給藥后的血清sTREM-1水平。在給藥LD50劑量的LPS后1小時就可容易地檢測到血清sTREM-1，而且其在LPS處理后4至6小時保持在峰值平臺水平(圖9)。
TREM-1肽“P5”防止內(nèi)毒素血癥小鼠死亡在致死劑量(LD100)的LPS前用單劑量P5處理60分鐘的小鼠以劑量依賴性的方式而免于死亡(圖10A)。為了研究P5處理是否能延遲至LPS給藥后，本發(fā)明人在LPS注射后4或6小時開始注射P5。這種延遲長達4小時的處理帶來了顯著抗LD100劑量的LPS的保護作用(圖10B)。一周后再沒有死亡發(fā)生，這顯示P5不僅僅延遲了LPS致死的發(fā)作，而是提供了持久的保護。對照小鼠全都在死亡前出現(xiàn)了嗜睡、豎毛和腹瀉。相反，P5處理的小鼠仍舊很整潔和活躍，沒有腹瀉，并活著。為了闡明P5防止小鼠死于LPS的機理，本發(fā)明人測定了在2和4小時時處毒素血癥小鼠的TNF-α、IL-1β和sTREM-1的血清水平。如表4所示，相對于對照，用100μg P5預處理能減少細胞因子水平30％并增加sTREM-1水平2倍表4.內(nèi)毒素血癥小鼠的TNF-α、IL-1β和sTREM-1的血清濃度

TREM-1的結合對小鼠是致死的為進一步突出TREM-1結合在LPS介導的死亡中的作用，用激動劑抗TREM-1mAb與LD50劑量的LPS聯(lián)合給藥來處理小鼠。這誘導了死亡率從50％顯著增加到了100％(圖10C)。
P5防止小鼠的CLP誘導的死亡為了研究P5在更相關的膿毒性休克模型中的作用，本發(fā)明人進行了CLP實驗(圖11A)。對照組包含用生理鹽水或用對照肽注射的小鼠。在該多微生物敗血癥模型中，即使在遲于敗血癥發(fā)生后24小時才給藥，P5仍舊賦予了顯著的抗致死的保護作用。有趣的是，P5重復注射具有對存活更有利的效果(P＜0.01)。P5對存活(圖11b)和細胞因子的產(chǎn)生(表5)存在劑量應答效應。P5對清除細菌無效(圖12)。
表5.CLP后24小時處的TNF-α、IL-1β和sTREM-1的血清濃度

敗血癥顯示出復雜的臨床綜合癥，這是由對嚴重感染的有害或破壞性的宿主應答而造成的。當最初合適的對全身感染的宿主應答變得擴大時，形成敗血癥，然后失調(diào)(4，5)。例如，暴露于LPS的嗜中性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞被活化了，并釋放出諸如TNF-α和IL-1β的前炎性細胞因子。普遍認為，這些細胞因子的過量產(chǎn)生促成了在敗血癥患者中所見到的多器官衰竭(20-23)。
TREM-1是最近鑒定的分子，其參與單核細胞活化和炎癥應答(12，14)。其屬于與NK細胞受體相關的家族，活化下游信號轉(zhuǎn)導事件。TREM-1在PNN和單核細胞/巨噬細胞上的表達已證明是由LPS所誘導的(16，17)。
如本文所述，本發(fā)明人證實了在用大腸桿菌LPS刺激后，可溶形式的TREM-1從培養(yǎng)的人單核細胞中釋放出來。早在LPS刺激后1小時，該可溶形式就也可在內(nèi)毒素血癥小鼠的血清中檢測到。這與TREM-1對感染的先天應答的極早階段的牽連是一致的(14，15，24)。sTREM-1釋放的機制雖沒有被清楚地闡釋，但似乎與TREM-1基因增加的轉(zhuǎn)錄有關。然而，盡管和蛋白酶抑制劑混合物一起孵育不改變sTREM-1的釋放，但是不能完全排除來自膜的表面TREM-1的裂解。有趣的是，除非加入LPS用作共刺激物，用諸如TNF-α、IL-1β或IFN-γ的前炎性細胞因子刺激人單核細胞只誘導非常少的sTREM-1釋放。在單核細胞中檢測到了備選的mRNA TREM-1剪接變體(TREM-1sv)的表達，其可能經(jīng)由牛分支桿菌BCG細胞壁片段而非LPS(25)的刺激而翻譯成可溶性受體(18)。這被本研究所證實i)LPS不增加單核細胞中的mRNA TREM-1sv水平，而且ii)由于LPS刺激，單核細胞僅僅釋放27-kDa蛋白質(zhì)，而非17.5-kDa變體。
盡管還沒鑒定到其天然配體(13，14)，在單核細胞上TREM-1和激動劑單克隆抗體的結合導致了進一步增強前炎性細胞因子的產(chǎn)生，而P5以濃度依賴性的方式誘導這些合成的減少，而IL-10則完全抑制它。
炎性細胞因子，尤其是TNF-α，被認為是有害的，然而如帶有受損TNF-α應答的動物中的致命腹膜炎問題所證明的那樣(9-11)，它們在敗血癥中也起有益的效果(5)。另外，在臨床試驗中，抑制TNF-α增加了死亡率(8)。最終，由于發(fā)現(xiàn)敗血癥是用TNF-α拮抗劑治療的類風濕性關節(jié)炎患者中常見的并發(fā)癥，由此突出了TNF-α清除感染的作用(26)。
P5調(diào)節(jié)細胞因子產(chǎn)生的機制還不清楚。P5包含互補決定區(qū)(CDR)-3和TREM-1胞外結構域的‘F’β鏈。后者含有介導二聚化的酪氨酸殘基。Radaev等推測TREM-1用其CDR等價環(huán)區(qū)域捕獲其配體(27)。P5因此可能損害TREM-1的二聚化和/或同TREM-1的天然配體競爭。而且，增加由P5介導的單核細胞釋放的sTREM-1，能阻止膜TREM-1的結合，sTREM-1作為誘騙受體起作用，如在TNF-α系統(tǒng)中那樣(28，29)。
在暴露于細菌刺激物如LPS后，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化是產(chǎn)生單核細胞炎性細胞因子中的關鍵步驟(30，31)。在各種NF-κB/Rel二聚體中，p65/p50雜二聚體是在單核細胞LPS誘導的NF-κB的原型形式(32)。P5阻止由TREM-1結合所誘導的p65/p50NF-κB的過度激活。這至少部分解釋了P5對產(chǎn)生細胞因子產(chǎn)生和在此所示的防止死亡的效果發(fā)生在LPS誘導的膿毒性休克前1小時或甚至長達4小時后才注射肽的時候。
內(nèi)毒素血癥能用實驗簡單地實現(xiàn)，但并不完美地適合再現(xiàn)人敗血癥的情況，而CLP誘導的多微生物敗血癥更為復雜但卻是更好的模型，其中包括了體液復蘇和抗生素的使用。因此后者也在本研究中使用，并證實了P5提供的劑量依賴性的保護作用，即使在遲至敗血癥發(fā)作后24小時給藥的時候。可是P5的有利效果與增加的細菌清除作用無關。
應用免疫調(diào)節(jié)療法的一個難點是不可能預測敗血癥的進展，因此接受這種治療的患者通常已經(jīng)得了完全確認的敗血癥(6)。由于P5顯示出即使在敗血癥爆發(fā)后注射也有效，因此其可構成現(xiàn)實的治療手段(24，33)。
相反，激動劑抗TREM-1單克隆抗體對TREM-1的結合會在LPS刺激的小鼠中介導出顯著增加的死亡率這進一步強調(diào)了在膿毒性休克期間TREM-1結合的有害效果。
實驗性膿毒性休克僅僅部分再現(xiàn)了人敗血癥。事實上，我們組最近揭示在敗血癥患者中的極病重患者的血清中釋放了顯著水平的sTREM-1(34)，在存活的患者中觀察到了最高的水平。這與我們的實驗發(fā)現(xiàn)一致，這顯示sTREM-1釋放越重大，結果就越有利，因此至少在理論上支持了可溶性TREM-1肽作為敗血癥發(fā)作后療法的潛在價值。
TREM-1似乎是在感染觸發(fā)的即刻免疫應答中的關鍵分子。在感染的早期階段，由于微生物產(chǎn)物對模式識別受體的結合，使得嗜中性粒細胞和單核細胞引發(fā)了炎癥反應(3，4)。同時，細菌產(chǎn)物誘導了sTREM-1的上調(diào)和釋放。未知配體一經(jīng)識別，TREM-1就激活擴大這些炎癥反應的信號轉(zhuǎn)導路徑，在單核細胞/巨噬細胞中尤為如此。盡管沒有完全抑制，但是TREM-1信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)減少了細胞因子的產(chǎn)生并防止敗血癥動物高反應性和死亡。用諸如P5的肽調(diào)節(jié)TREM-1的結合可能是治療敗血癥的合適的治療工具，尤其因為其甚至在感染侵入后的敗血癥發(fā)作之后還似乎是有活性的。
實施例4用P1和P5處理的經(jīng)LPS處理敗血癥大鼠中的血液動力學研究在進一步的膿毒性休克模型中，在大鼠中進行LPS和CLP(盲腸結扎穿孔)實驗來研究TREM-1肽的作用。
材料和方法
LPS誘導的內(nèi)毒素血癥隨機分組(n＝10-20)動物并用大腸桿菌LPS(O111B4，Sigma-Aldrich，里昂，法國)與TREM-1或雜亂的肽聯(lián)合i.p.處理。
CLP多微生物敗血癥模型操作如別處所詳細描述的那樣(參見Mansart，A等Shock 1938-44(2003))。簡而言之，i.p.給藥氯胺酮(150mg/kg)來麻醉大鼠(每組n＝6-10)。通過3.0-cm腹部中線切開來暴露盲腸，結扎末梢的一半，接著用G21針兩次穿刺。從穿刺中排出少量糞便，以保證開放性。將盲腸重置于腹腔內(nèi)并在兩層間封閉腹部切口。手術后，用50mL/kg生理鹽水s.c.注射所有大鼠以使體液復蘇。然后如上給藥TREM-1或雜亂的肽。
在大鼠中的血液動力學測定在LPS給藥后即刻以及在CLP后16小時，用別處描述的操作(參見Mansart，A等Shock 1938-44(2003))紀錄動脈BP(心臟收縮、心臟舒張和平均值)、心率、腹部大動脈血流和腸系膜血流。簡而言之，將PE-50管插入左頸動脈和左頸靜脈。用壓力傳感器和放大記錄系統(tǒng)(IOX EMKA Technologies，巴黎，法國)連續(xù)監(jiān)測動脈BP。血管周圍的探測器(Transonic Systems，Ithaca，NY)包住上腹大動脈和腸系膜動脈，通過流量計(Transonic Systems)監(jiān)測它們各自的流量。在最后一次測量(在LPS實驗中的第4小時和CLP后的第24小時)后，用過量戊硫代巴比妥鈉靜脈注射處死動物。
生物學測量隨后從頸動脈中抽血。在自動化血氣分析儀(ABL 735，Radiometer，哥本哈根，丹麥)上進行動脈乳酸濃度和血氣分析。根據(jù)廠商的推薦，血漿中的TNF-α和IL-1β濃度用ELISA試驗(Biosource，Nivelles，比利時)確定。用Griess反應(R & D System，Abingdon，英國)測量血漿的亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度。
統(tǒng)計學分析結果用平均值±SD表示。用學生t檢驗進行組間比較。用Statview軟件(Abacus Concepts，CA)完成所有的統(tǒng)計學分析，雙尾P＜0.05被認為是顯著的。結果內(nèi)毒素血癥模型LPS給藥后，動脈壓、大動脈和腸系膜血流在對照動物(雜亂的肽處理的大鼠)中迅速下降，而心律保持不變(表6)。在TREM-1肽處理的動物中，動脈壓和大動脈血流的下降延遲至第二小時，此時其數(shù)值顯著高于對照動物。P1和P5處理的組間沒有顯著的差異。相反，這兩個肽中的任何一個對降低腸系膜血流都沒有任何效果(表6)。
動脈pH隨時間保持穩(wěn)定，直至LPS注射后的第4小時，其只在對照組中嚴重降低(表6)。第三小時后出現(xiàn)在對照動物中的動脈乳酸水平顯著升高被TREM-1肽抑制了(表6)。對于pH、動脈碳酸氫鹽和乳酸濃度，P1和P5間沒有顯著的差異。
如預期的那樣，LPS在注射后30分鐘至1小時間誘導出TNF-α血漿濃度的峰值，接著漸次下降(圖13A)。P1肽的注射對該產(chǎn)量沒有效果，而P5能降低TNF-α產(chǎn)量～30％。
P1延遲IL-1β的峰值直至LPS注射后的第3小時，但并不降低。相反，P5強烈的降低IL-1β的釋放(圖13B)。
對照和P1處理的動物中，亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度在LPS給藥后迅速增加，但經(jīng)P5處理仍舊保持穩(wěn)定(圖14)。
表6.LPS誘導的內(nèi)毒素血癥期間的血液動力學參數(shù)


ap＜0.05P1vs對照bp＜0.05P5vs對照CLP模型由于本發(fā)明人的模型在完成CLP后16至20小時其嚴重程度達到最高值，因此本發(fā)明人選擇到第16小時的時候研究動物。重要的是，在該時間點前沒有死亡。盡管所有動物都經(jīng)體液復蘇，但為了嚴格考察肽的作用，沒有一只接受抗生素。
隨著時間對照動物中動脈壓出現(xiàn)極大下降，到H24時心臟收縮、心臟舒張和平均動脈壓各為58±7mmHg、25±4mmHg和38±2mmHg。該降低幾乎被P1或P5處理所完全抑制，在H16和H24間沒有顯著差異(圖15)。P1和P5處理的大鼠間沒有差異。
TREM-1肽也防止對照動物中所觀察到的大動脈和腸系膜血流下降(表7)。在P5處理下，對腸系膜血流改變的保護作用甚至更高。血流的相對維持與增加的心律無關，這是由于后者比對照動物更低(表7)。
對照大鼠中出現(xiàn)的漸進性代謝性酸中毒被P1肽降低，并幾乎被P5抑制。對于動脈乳酸升高，觀察到了相同的保護性趨勢，P5有更明顯的效果(表7)。
表7.CLP多微生物敗血癥期間的血液動力學和生化參數(shù)

ap＜0.05P1vs對照bp＜0.05P5vs對照cp＜0.05P5vsP1P1和P5都誘導降低TNF-α的產(chǎn)生，P5又有更強的效果。到H20時，在P5處理下，血漿TNF-α幾乎檢測不到，而在其他組動物中仍舊升高(圖16)。
在對照動物中亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度增加了，而在TREM-1肽治療的組中仍舊保持在低水平(圖17)。
因此在敗血癥大鼠中觀察到了P5和P1對血液動力學的保護作用。動脈壓和血流都得以獨立于心率而維持。而且，盡管不完全，但是TREM-1信號轉(zhuǎn)達的調(diào)節(jié)減少了細胞因子的產(chǎn)生并防止動物的高反應性。并不完全抑制細胞因子產(chǎn)生的事實是一個關鍵點。事實上，盡管諸如TNF-α的炎性細胞因子被認為是有害的，但它們也在敗血癥中顯示出有益的效果，正如帶有受損的TNF-α應答的動物腹膜炎模型中的致命問題所強調(diào)的的那樣。
在膿毒性休克期間觀察到的iNOS活化導致產(chǎn)生大量NO，這部分解釋了一些外周血管紊亂(顯著的血管舒張和血壓過低)。對于心肌本身，多數(shù)NO的作用是由可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的活化而介導的，鳥苷酸環(huán)化酶負責產(chǎn)生削弱胞質(zhì)鈣的收縮效應的cGMP。環(huán)GMP也能刺激一些磷酸二酯酶的活性。胞內(nèi)cAMP水平的隨之下降可以解釋NO能減輕beta腎上腺素刺激的作用。因此動脈壓的維持可以部分地由NO的產(chǎn)生的減少來解釋，正如在TREM-1肽處理的動物中更低濃度的血漿亞硝酸鹽/硝酸鹽所反映的那樣。
炎性細胞因子產(chǎn)量的減少能部分地解釋血流上所觀察到的效果。事實上，盡管心肌抑制的潛在細胞因子調(diào)節(jié)分子有很多，但是證明TNF-α和IL-1β是良好的候選分子。后兩個細胞因子都能在體外或離體抑制心肌收縮。而且，在體外和體內(nèi)中和或去除人敗血癥血清的TNF-α或IL-1β部分地消除了心肌抑制效應。盡管P1和P5在內(nèi)毒素血癥期間對血流和動脈壓有完全相同的作用，但是它們對細胞因子產(chǎn)生的活性有區(qū)別，其中P1對血漿TNF-α和IL-1β濃度僅有輕微的效果。所以TREM-1肽的這種保護作用僅僅部分地與它們對細胞因子釋放的作用有關，或者涉及冗余路徑。
通過小的合成肽調(diào)節(jié)TREM-1路徑在大鼠的實驗性膿毒性休克期間對血液動力學產(chǎn)生有益效果，減少了炎性細胞因子的產(chǎn)生。
總之，這些數(shù)據(jù)證明本發(fā)明的TREM-1肽1)有效地防止個體動物敗血癥相關的血液動力學惡化；2)減輕乳酸酸中毒的發(fā)展；3)調(diào)節(jié)諸如TNF-α和IL-1β的前炎性細胞因子的產(chǎn)生；以及4)減少一氧化氮的產(chǎn)生。所以，TREM-1肽潛在地可用于恢復敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的患者的血液動力學參數(shù)，并因此構成前述狀況的潛在治療方法。
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序列表<110> 拜奧克塞爾有限公司南錫第一大學(亨列·普安卡雷大學)<120> 治療性肽和方法<130> BXL-P037<150> GB 0426146.7<151> 2004-11-29<160> 23<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 234<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 1Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser1 5 10 15Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys20 25 30Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe35 40 45Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro50 55 60Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val65 70 75 80Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu
85 90 95Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln100 105 110Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg115 120 125Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn130 135 140Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr Thr Lys145 150 155 160Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro165 170 175Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu180 185 190Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile195 200 205Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu210 215 220Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro225 230<210> 2<211> 230<212> PRT<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2Met Arg Lys Ala Gly Leu Trp Gly Leu Leu Cys Val Phe Phe Val Ser1 5 10 15Glu Val Lys Ala Ala Ile Val Leu Glu Glu Glu Arg Tyr Asp Leu Val20 25 30Glu Gly Gln Thr Leu Thr Val Lys Cys Pro Phe Asn Ile Met Lys Tyr35 40 45Ala Asn Ser Gln Lys Ala Trp Gln Arg Leu Pro Asp Gly Lys Glu Pro50 55 60Leu Thr Leu Val Val Thr Gln Arg Pro Phe Thr Arg Pro Ser Glu Val65 70 75 80His Met Gly Lys Phe Thr Leu Lys His Asp Pro Ser Glu Ala Met Leu85 90 95Gln Val Gln Met Thr Asp Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg100 105 110Cys Val Ile Tyr His Pro Pro Asn Asp Pro Val Val Leu Phe His Pro115 120 125Val Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Val130 135 140Ile Ile Pro Ile Thr Arg Leu Thr Glu Arg Pro Ile Leu Ile Thr Thr145 150 155 160Lys Tyr Ser Pro Ser Asp Thr Thr Thr Thr Arg Ser Leu Pro Lys Pro165 170 175
Thr Ala Val Val Ser Ser Pro Gly Leu Gly Val Thr Ile Ile Asn Gly180 185 190Thr Asp Ala Asp Ser Val Ser Thr Ser Ser Val Thr Ile Ser Val Ile195 200 205Cys Gly Leu Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ile Ile Leu Phe Ile Val210 215 220Thr Lys Arg Thr Phe Gly225 230<210> 3<211> 23<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 結構域<222> (6)..(11)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)2<400> 3Leu Val Val Thr Gln Arg Pro Phe Thr Arg Pro Ser Glu Val His Met1 5 10 15Gly Lys Phe Thr Leu Lys His20<210> 4<211> 23<212> PRT<213> 小家鼠
<220>
<221> 結構域<222> (4)..(8)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 4Val Ile Tyr His Pro Pro Asn Asp Pro Val Val Leu Phe His Pro Val1 5 10 15Arg Leu Val Val Thr Lys Gly20<210> 5<211> 17<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 結構域<222> (1)..(17)<223> 連接V-型免疫球蛋白Ig-樣結構域和跨膜結構域的TREM-1頸狀區(qū)<400> 5Thr Thr Thr Arg Ser Leu Pro Lys Pro Thr Ala Val Val Ser Ser Pro1 5 10 15Gly<210> 6<211> 21<212> PRT<213> 小家鼠
<220>
<221> 結構域<222> (15)..(19)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 6Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Val Ile Tyr His Pro1 5 10 15Pro Asn Asp Pro Val20<210> 7<211> 17<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 結構域<222> (15)..(17)<223> 部分TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 7Leu Gln Val Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Val Ile Tyr His Pro1 5 10 15Pro<210> 8<211> 23<212> PRT<213> 人工<220>
<223> 合成的雜亂氨基酸序列SEQ ID NO3
<400> 8Leu Thr Pro Lys His Gly Gln Arg Ser Thr His Val Thr Lys Phe Arg1 5 10 15Val Phe Glu Pro Val Met Leu20<210> 9<211> 17<212> PRT<213> 人工<220>
<223> 合成的雜亂氨基酸序列SEQ ID NO7<400> 9Thr Asp Ser Arg Cys Val Ile Gly Leu Tyr His Pro Pro Leu Gln Val15 10 15Tyr<210> 10<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_結合<222> (1)..(22)<223> TREM-1的RT-PCR 5’引物<400> 10ttgtctcaga actccgagct gc 22
<210> 11<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_結合<222> (1)..(22)<223> TREM-1的RT-PCR 3’引物<400> 11gagacatcgg cagttgactt gg 22<210> 12<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_結合<222> (1)..(22)<223> TREM-1sv的RT-PCT 5’引物<400> 12ggacggagag atgcccaaga cc 22<210> 13<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_結合<222> (1)..(22)<223> TREM-1sv的RT-PCR 3’引物<400> 13accagccagg agaatgacaa tg 22<210> 14<211> 22<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_結合<222> (1)..(22)<223> β-肌動蛋白的RT-PCR 5’引物<400> 14ggacgacatg gagaagatct gg 22<210> 15<211> 24<212> DNA<213> 人工<220>
<223> RT-PCR引物<220>
<221> 引物_結合<222> (1)..(24)<223> β-肌動蛋白的RT-PCR 3’引物
<400> 15atagtaatgt cacgcacgat ttcc 24<210> 16<211> 23<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 結構域<222> (6)..(11)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)2<400> 16Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val Gln Val1 5 10 15Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp20<210> 17<211> 23<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 結構域<222> (4)..(8)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 17Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg Ile1 5 10 15Arg Leu Val Val Thr Lys Gly20
<210> 18<211> 21<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 結構域<222> (15)..(19)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 18Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ile Tyr Gln Pro1 5 10 15Pro Lys Glu Pro His20<210> 19<211> 17<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 結構域<222> (15)..(17)<223> 部分TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 19Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys Val Ile Tyr Gln Pro1 5 10 15Pro
<210> 20<211> 6<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 結構域<222> (1)..(6)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)2<400> 20Arg Pro Ser Lys Asn Ser1 5<210> 21<211> 5<212> PRT<213> 智人<220>
<221> 結構域<222> (1)..(5)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 21Gln Pro Pro Lys Glu1 5<210> 22<211> 6<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 結構域<222> (1)..(6)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)2
<400> 22Arg Pro Phe Thr Arg Pro1 5<210> 23<211> 5<212> PRT<213> 小家鼠<220>
<221> 結構域<222> (1)..(5)<223> TREM-1互補決定區(qū)(CDR)3<400> 23His Pro Pro Asn Asp1 權利要求
1.一種多肽，其包含源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的一個或多個序列，其特征在于能治療、改善、或減輕敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的癥狀。
2.權利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含所述TREM-1蛋白的少于30個連續(xù)的氨基酸。
3.一種具有抗敗血癥或抗膿毒性休克活性的TREM-1多肽，其由(i)對應于天然TREM-1蛋白序列的15-25個氨基酸的連續(xù)序列，該序列包括來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸；或(ii)其中一個或多個氨基酸由提供的其它氨基酸保守取代，可是來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸不被取代的這樣的序列；或(iii)在其N和C末端之一或兩端都連上異源多肽的(i)或(ii)的序列組成。
4.權利要求3所述的多肽，其中天然TREM-1蛋白序列是如SEQ ID NO1所標識的人序列，并且CDR2和CDR3序列分別為RPSKNS和QPPKE。
5.權利要求4所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是QPP。
6.權利要求4所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是QPPK。
7.權利要求4所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是QPPKE。
8.權利要求4所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是RPSKNS。
9.權利要求3所述的多肽，其中天然TREM-1蛋白序列是如SEQ ID NO2所標識的鼠序列，并且CDR2和CDR3序列分別為RPFTRP和HPPND。
10.權利要求9所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是HPP。
11.權利要求9所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是HPPN。
12.權利要求9所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是HPPND。
13.權利要求9所述的多肽，其中來自CDR2或CDR3序列的至少3個氨基酸是RPFTRP。
14.前述權利要求任一項所述的多肽，其中所述多肽特征在于能治療、改善、或減輕敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的癥狀。
15.與SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19之任一序列具有基本上的序列同一性的多肽，且其特征在于能治療、改善、或減輕敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的癥狀。
16.序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的多肽、其活性片段、類似物和衍生物，且其特征在于能治療、改善、或減輕敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的癥狀。
17.與序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少80％序列同一性的多肽，且其特征在于能治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情，并具有源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的至少2個連續(xù)的氨基酸。
18.與序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少80％序列同一性的多肽，且其特征在于能治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情，其中所述肽具有源自TREM-1蛋白CDR2或CDR3的至少3個連續(xù)的氨基酸。
19.一種分離的多核苷酸，其能編碼與序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有基本上的序列同一性、且其特征在于能治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的多肽。
20.一種包含多核苷酸的載體，所述多核苷酸能編碼與序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少約80％序列同一性、且其特征在于能治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的多肽。
21.權利要求15至20任一項所述的多肽，其中所述多肽包含天然TREM-1蛋白的至少30個連續(xù)的氨基酸。
22.包含前述權利要求任一項的肽或多肽的組合物。
23.用于治療的前述權利要求任一項的肽或多肽。
24.用于治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的療法的前述權利要求任一項的肽或多肽。
25.前述權利要求任一項的肽或多肽在制備治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的藥物中的用途。
26.治療或改善個體敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的方法，包括向個體給藥治療有效量的前述權利要求任一項的肽或多肽。
27.權利要求26的方法，其中所述肽或多肽與序列SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有基本上的序列同一性。
28.權利要求26的方法，其中所述肽或多肽是SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的多肽、或SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19的活性片段、類似物或衍生物。
29.權利要求26的方法，其中所述肽或多肽與SEQ ID NO3、4、6、7、16、17、18或19具有至少約80％的序列同一性。
30.篩選治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的化合物或組合物的方法，包括提供TREM-1肽或TREM-1多肽；將TREM-1肽與合適動物模型中的動物接觸；確定是否在敗血癥中存在調(diào)節(jié)作用，其中存活增加顯示TREM-1肽可用于治療敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情。
31.前述權利要求任一項所述的多肽、載體、用途、方法或組合物，其中適應癥是敗血癥或膿毒性休克。
全文摘要
(本發(fā)明提供了)一種多肽，其包含源自TREM－1蛋白CDR2或CDR3的一個或多個序列，其特征在于能治療、改善、或減輕敗血癥、膿毒性休克或敗血癥樣病情的癥狀。
文檔編號C12N15/63GK1817901SQ20051010469
公開日2006年8月16日 申請日期2005年11月21日 優(yōu)先權日2004年11月29日
發(fā)明者G·福雷, S·吉博, P·帕尼納, N·帕西尼 申請人:拜奧克塞爾有限公司, 南錫第一大學(亨列·普安卡雷大學)