專利名稱：水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物的檢驗方法，特別涉及一種分子生物學快速定量檢測水產(chǎn)品中的致病性副溶血弧菌的方法。
適用范圍該方法適用于任何具有特定增菌培養(yǎng)基、具有特異性強的特定基因片段、能設計出特異性引物的微生物的快速定量檢測。
背景技術：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，系在海洋及鹽湖分布極為廣泛的一種致病性嗜鹽菌。由于能引起人的食物中毒而被重視，尤其在夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，經(jīng)常由于食用含有大量副溶血弧菌的海產(chǎn)品，而引起爆發(fā)性食物中毒；在非沿海地區(qū)，食用被此菌污染的鹽漬食品亦常有中毒發(fā)生；是商品檢驗檢疫中的必檢項目。
現(xiàn)有技術中1.常規(guī)檢驗[1]為定性檢驗，其方法包括增菌培養(yǎng)——分離培養(yǎng)——涂片鏡檢——嗜鹽性試驗——生化試驗——動物試驗等等幾個環(huán)節(jié)。
其缺陷是檢測環(huán)節(jié)多，費時，只能定性檢測不能定量檢測。
2.PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)是一種在體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術，即無細胞分子克隆技術，是以待擴增的兩條DNA鏈為模板，由一對人工合成的寡核苷酸引物介導，通過DNA聚合酶酶促反應，快速體外擴增特異DNA序列。
PCR技術是1985年由美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室Mullis等人發(fā)明的。自這一技術問世以來，便以驚人的速度廣泛應用于生命科學研究的各個領域，成為分子生物學發(fā)展史上的一個里程碑。
PCR反應過程中，正向和反向引物分別與待擴增的DNA模板(稱為靶序列)的正鏈和負鏈的兩端互補，將引物片斷與待擴增的DNA片斷混合并加熱變性，然后退火，此時引物片斷就和相應的DNA模板互補雜交，加入的底物dNTPs和DNA聚合酶進行DNA擴增。經(jīng)過若干循環(huán)后，DNA的數(shù)量為(1+X)n(X為反應平均效率，n為循環(huán)次數(shù))，它可以使一小段DNA(通常少于3000個堿基對)擴增100萬倍，從而方便了微生物的鑒定。
從20世紀90年代開始國外相繼使用PCR來診斷多種病原。常規(guī)PCR法的診斷原理是根據(jù)所設計的引物對特異性片段進行PCR擴增，通過對產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，看是否能擴增出特異性條帶來檢測樣品中是否含有病原DNA。
對于核酸為RNA的病原體，則用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來進行檢測，一般過程為引物設計-RNA提純-cDNA的構建-PCR擴增以及產(chǎn)物電泳。在常規(guī)PCR的基礎上，現(xiàn)已發(fā)展了許多衍生技術，如原位PCR、套式PCR、熒光定量PCR以及real-time PCR等。
PCR檢測技術具有許多優(yōu)點。首先，PCR檢測技術特異性好，這是由于不同生物之間核苷酸的千差萬別所致。其二，PCR檢測技術對感染早期的檢測非常有效，而且還具有檢測速度快的特點。當知道待檢病原具有某一特定基因片段時，即可利用特異的引物對樣品中微量的目標DNA進行PCR擴增，通過電泳檢測擴增出的特定片斷，即可確定感染的病原，可以快速定性檢測某種病原微生物。DNA的檢測方法，繞過細菌生化特征表達的變異以及血清學抗原性的缺失而帶來的鑒定障礙，直接針對細菌的基因型進行檢測，方法快速且準確。
RQ-PCR(real-time quantitative PCR，實時定量PCR)是20世紀90年代中期發(fā)展起來的一種新型核酸定量技術，是近幾年廣泛采用的分子生物學檢測技術，在傳統(tǒng)意義上的PCR反應體系中加入了一條與擴增模板能特異性結合的、標記了2個熒光基團的探針，并在傳統(tǒng)的PCR儀上增加了熒光信號檢測系統(tǒng)[2]?？梢钥焖?、準確定量測出反應體系中高至1010、低至100拷貝數(shù)的病原體基因，目前該技術已經(jīng)用于細菌、支原體、衣原體、病毒、寄生蟲等多種病原體的檢測研究[3-7]。
實時熒光PCR法檢驗具有周期短、靈敏度高，同時通過光學系統(tǒng)檢測熒光信號而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，避免了實驗過程中EB等致癌物質(zhì)的污染，既減少了假陽性的發(fā)生率和對人、環(huán)境的潛在危害，又縮短了檢測時間。對污染較重的樣品，從樣品準備到檢出只需約4～5h。
但此檢測法只能對總病原菌進行檢測卻無法分別同時鑒別污染食品中死菌體、活菌體，給食品病原菌定量檢驗帶來一定的困難。此外，該定量實際上是對反應體系中的參與PCR反應的模板DNA進行定量，如果能夠成功地把待測樣品中含量甚微的待檢微生物的基因成功地提取出來，并成功地轉移到最終的反應體系中(10～25uL)，確定了一個細胞中該基因的拷貝數(shù)，才能夠實現(xiàn)真正意義的定量。在食品安全檢驗中，通常取樣量是25g，以避免含病原微生物較少的樣品漏檢。對這樣大的樣品量，對于含量甚微的待檢微生物，經(jīng)過一系列的處理過程，獲得的核酸樣品中，含量甚微的待檢微生物的核酸很容易丟失，而導致檢測結果假陰性。因此，在實際檢驗中，很難實現(xiàn)真正意義上的定量。
3.MPN法(most probable number最可能數(shù)法)[1]，主要用于食品中大腸菌群的檢測，即采用多管發(fā)酵法，通過幾率計算，實現(xiàn)對樣品中大腸菌群的含量進行定量，測得樣品中含有大腸菌群的最可能數(shù)。我國在大腸菌群檢驗中，對檢樣采用了三個不同的10倍遞減接種量，每個接種量各接種了3個乳糖膽鹽發(fā)酵管。根據(jù)乳糖陽性管在不同稀釋度管組內(nèi)出現(xiàn)的管數(shù)不同，查大腸菌群最可能數(shù)檢索表(附錄3)(系通過幾率計算的，見附錄4)，得出其MPN(mostprobable number)值。
參考文獻[1]蘇世彥.食品微生物檢驗手冊，1998，北京中國輕工業(yè)出版社。
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上述的水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是本發(fā)明所需特異性引物是指下述3對引物的序列(1)TL基因引物擴增片段大小450bpTL15′-AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG-3′；TL25′-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3′；(2)TDH基因引物擴增片段大小269bpTDH15′-GTA AAG GTC TCT GAC TTT TGG AC-3′；TDH25′-TGG AAT AGA ACC TTC ATC TTC ACC-3′；(3)TRH基因引物擴增片段大小500bpTRH15′-TTG GCT TCG ATA TTT TCA GTA TCT-3′；TRH25′-CAT AAC AAA CAT ATG CCC ATT TCC G-3′；(參考文獻Asim K.Bej，Donald P.Patterson，Cynthia W.Brasher et al.Journal ofMicrobiological Methods，1999，39，215-225)其制備方法是很多生物工程公司(如上海博亞生物技術公司、上海生物工程有限公司等)可以根據(jù)客戶提供的序列進行合成；其使用方法是進行PCR反應時，加入到PCR反應體系中，將模板中存在的TL基因、TDH基因、TLH基因特異性地擴增出來。
上述的水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是PCR擴增及檢測步驟如下(1)待檢樣品準備無菌操作定量取待檢樣品，以檢驗其鮮度質(zhì)量為目的時，其待檢樣品為食用水產(chǎn)魚類、甲殼類或貝殼類的肌肉；以檢驗是否污染某種致病菌為目的時，其檢驗部位為食用水產(chǎn)魚類、甲殼類或貝殼類的消化道或內(nèi)臟團和呼吸器官；一定量的待檢樣品(N)無菌條件下勻漿，獲得組織勻漿液，以無菌生理鹽水定容到一定體積(V)；(2)增菌培養(yǎng)及PCR檢測①三度稀釋法增菌培養(yǎng)按照三度稀釋法的接種原則，將(含待檢樣品)的定容勻漿樣品以3個連續(xù)10倍系列稀釋濃度加入到副溶血弧菌增菌液中，每個稀釋度接種3管如 管組 管數(shù)3 33接種勻漿液的量 10mL 1mL 0.1mL注意根據(jù)接種量的大小，準備增菌液的濃縮液，以保證接種后，培養(yǎng)液中各培養(yǎng)基成分的終濃度與培養(yǎng)基配方一致。
25～30℃下，增菌培養(yǎng)8～12h；離心或沉降，分取上清液，獲得增菌培養(yǎng)的樣品；②模板DNA制備于10000rpm離心10min，棄上清液，用5mL滅菌的生理鹽水重新懸浮沉淀，10000rpm離心10min，棄上清液，沉淀用1mLTE緩沖液重新懸浮，在100℃水浴中保持10～15min，冷卻后于4℃12000rpm離心10min，吸取上清液200μL，分別進行模板DNA的提取，作為PCR模板，或-20℃保存?zhèn)溆?；③PCR擴增在每一個PCR管內(nèi)加入1μL樣品模板DNA，9μL PCR反應液，1μL酶液，用滅菌的雙蒸餾水補足到50μL；94℃預變性3min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，30個循環(huán)，然后72℃延伸10min，獲得PCR產(chǎn)物；④結果判定取10μL PCR產(chǎn)物加于1.5％瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在紫外透射儀下觀察，出現(xiàn)引物擴增特異帶的樣品，為副溶血弧菌陽性的樣品管，即該樣品管中含有副溶血弧菌；當在269bp～500bp出現(xiàn)特異條帶時，即可判斷樣品中含致病性副溶血弧菌；根據(jù)陽性管出現(xiàn)的三種不同情況，根據(jù)公式求算出表中的最可能數(shù)(C′)，該值為定容勻漿液(V體積中含有的勻漿樣品為N)中待測菌株的含量；待檢樣品中待測菌株的含量(C)的計算公式為C＝C′V/N；計算公式為a.僅有一組管內(nèi)有陽性管存在時，用公式I計算Nλ=2.303×lgAB]]>
式中N——檢出陽性管所加的待測樣品量；λ——待測菌的最可能數(shù)，個/mL，或個/g；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量；b.兩個稀釋度管組內(nèi)有陽性管(記為陽性管組1、陽性管組2)存在時，用公式II計算N1λ=2.303×lg(A-N2γ-A×10-0.4343N2λ)[B-(A-N1P)×10-0.4343N2λ]]]>式中N1P——陽性管組1每管內(nèi)加入N1g(mL)樣品量，有P個陽性管；N2γ——陽性管組2每管內(nèi)加入N2g(mL)樣品量，有γ個陽性管；λ——待測菌在樣品中的最可能數(shù)(個/g，或個/mL)；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量；c.三個稀釋度管組內(nèi)都有陽性管存在時，用公式III計算N1λ=2.303×lg[(A-N2γ-N3t)-(A-N3t)×10-0.4343N2λ-(A-N2γ)×10-0.4343N3λ+A×10-0.4343(N2+N3)λ][B-(A-N1P-N3t)×10-0.4343N2λ-(A-N1P-N2γ)×10-0.4343N3λ+(A-N1P)×10-0.4343(N2+N3)λ]]]>式中N1P——管組 每管內(nèi)加入N1g(mL)樣品量，有P個陽性管；N2γ——管組 每管內(nèi)加入N2g(mL)樣品量，有γ個陽性管；N3t——管組 每管內(nèi)加入N3g(mL)樣品量，有t個陽性管；λ——待測菌在樣品中的最可能數(shù)(個/g，或個/mL)；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量。
上述的水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是所述的消化道是魚類的腸管，蝦類頭胸節(jié)內(nèi)的肝胰腺和消化盲囊、腹節(jié)外延處的腸管，蟹類的內(nèi)臟團，螺貝類腹足肌肉以下的部分或雙殼貝類覆蓋在斧足肌肉外層的內(nèi)臟；其特征是所述的呼吸器官是魚類的鰓，蝦類頭胸節(jié)內(nèi)的鰓條，蟹類的鰓條或貝類的瓣鰓。
本發(fā)明的優(yōu)點是PCR目前常用在微生物檢測方面，可用于定性檢測某種特定的微生物，或作為對微生物進行鑒定的輔助手段。目前所使用的定量PCR，也只能做到半定量，只能測出參加到PCR反應體系中的DNA拷貝數(shù)，而拷貝數(shù)不完全等于細菌細胞數(shù)，對于樣品中含量不占優(yōu)勢的待測菌種類，提取DNA的得率也直接影響定量結果。
MPN法為最大可能數(shù)法，常用于水體中大腸菌群數(shù)的測定，MPN法主要用于水體中大腸菌群數(shù)的測定，里面包含了符合大腸菌群定義的多種細菌，為多種類細菌的混合體，不能定量到某一個種類，而且試驗周期長。
本發(fā)明是以上述現(xiàn)有技術兩種方法的基本原理為理論依據(jù)，改進提出一種快速定量檢測樣品中某一種細菌的方法，在特定微生物種類、定量、快速、準確、高靈敏度、增菌培養(yǎng)基的制備……等方面有自己的獨特創(chuàng)造。以副溶血弧菌為例，進行了驗證，實踐證明是可行的。


圖1是本發(fā)明的增菌培養(yǎng)樣品(1.0mL接種量)和未增菌培養(yǎng)樣品PCR產(chǎn)物的電泳結果比較；圖2是定性檢驗副溶血弧菌常規(guī)檢驗程序。
具體實施例方式
圖1中，泳道1——蛤仔未增菌樣品，泳道2——蛤仔增菌樣品(接種量1.0mL)，泳道3-5——蝦肝胰腺增菌樣品(接種量1.0mL)泳道6——蝦肝胰腺未增菌樣品泳道7——三文魚未增菌樣品泳道8——三文魚增菌樣品(接種量1.0mL)泳道9——螃蟹內(nèi)臟增菌樣品(接種量1.0mL)泳道10——螃蟹內(nèi)臟未增菌樣品泳道11——Marker對于未增菌培養(yǎng)組和增菌培養(yǎng)的各管組的9個管，都取10uL PCR產(chǎn)物，在1.5％瓊脂糖凝膠中100V電壓下電泳20-30min。紫外透射儀下觀察，當在269bp和450bp出現(xiàn)特異條帶時(個別情況在500bp出現(xiàn)特異帶)，即可判斷樣品中含致病性副溶血弧(參見圖1)。其中泳道1、7、8、10的結果判定為陰性，泳道2、3、4、5、6、9的結果判定為陽性。
圖2中，顯示定性檢驗副溶血弧菌的常規(guī)檢驗程序。其方法包括增菌培養(yǎng)——分離培養(yǎng)——涂片鏡檢——嗜鹽性試驗——生化試驗——動物試驗等等幾個環(huán)節(jié)。
實施例1基本方法描述一、樣品處理1、無菌定量取待檢樣品(如養(yǎng)殖或野生的水產(chǎn)動物、海鮮食品、水產(chǎn)品成品或半成品等，或各種水樣)。
以檢驗其鮮度質(zhì)量為目的其檢驗部位為水產(chǎn)食品肌肉內(nèi)細菌含量，從而判斷其鮮度質(zhì)量。
以檢驗是否污染某種致病菌為目的其檢驗部位應為消化道(或內(nèi)臟團)和鰓等呼吸器官魚類剪取腸管和鰓；蝦類頭胸節(jié)內(nèi)肝胰腺和消化盲囊、腹節(jié)外延處的腸管；蟹類剪取內(nèi)臟團和鰓條；貝類中的螺類剪取腹足肌肉以下的部分，貝類中的雙殼類剪取覆蓋在斧足肌肉外層的內(nèi)臟和瓣鰓。
取樣量(Ng)以檢驗其鮮度質(zhì)量為目的——取肌肉25g；以檢驗是否污染某種致病菌為目的其檢驗部位應為消化道(或內(nèi)臟團)和鰓等呼吸器官0.2g-10g。放入滅菌的勻質(zhì)器中(或乳缽內(nèi))。
2、無菌條件下勻漿，獲得組織勻漿液，根據(jù)取樣量，用無菌生理鹽水將勻漿液定容到一定體積(V)，如5mL(取樣量N≤5g)、10mL(5g≤取樣量≤10g)、50mL、100mL等。
二、增菌培養(yǎng)及PCR檢測(三度稀釋法)以取樣量Ng的勻漿液定容體積(V)為5mL的待測樣品為例。
1、增菌培養(yǎng)按照MPN法的原則進行接種。
(1)分別取1.0mL勻漿液分別接種到三支含有4.0mL副溶血弧菌增菌液(1.25倍的濃縮液)的試管中；(2)分別取100uL勻漿液分別接種到三支含有4.9mL副溶血弧菌增菌液的試管中；(3)分別取10uL勻漿液分別接種到三支含有4.99mL副溶血弧菌增菌液的試管中；2、25～30℃溫度下，增菌培養(yǎng)8-12小時。水產(chǎn)品兼受海洋細菌和陸上細菌的污染，檢驗時細菌培養(yǎng)溫度應不超過30℃。
3、模板DNA制備對上述增菌培養(yǎng)的樣品，于10000rpm離心10min，棄上清液，用5mL滅菌的生理鹽水重新懸浮沉淀，10000rpm離心10min，棄上清液，沉淀用1mL TE緩沖液重新懸浮，于100℃水浴保持10-15min，冷卻后于4℃12000rpm離心10min，吸取上清液200μL作為PCR模板(或-20℃保存?zhèn)溆?。
4、PCR擴增(相關試劑見附錄1)a.在一個PCR管內(nèi)加入1μL樣品模板DNA，9μL PCR反應液，1μL酶液，用滅菌的雙蒸餾水補足到50μL。
b.PCR擴增條件94℃預變性3min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，30個循環(huán)，然后72℃延伸10min。
5、結果判定取10μL PCR產(chǎn)物加于1.5％瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在紫外透射儀下觀察。出現(xiàn)引物擴增特異帶的樣品，為副溶血弧菌陽性的樣品管，即該樣品管中含有副溶血弧菌。當在269bp和450bp出現(xiàn)特異條帶時(個別情況在500bp出現(xiàn)特異帶)，即可判斷樣品中含致病性副溶血弧菌。
6、根據(jù)各稀釋度陽性管數(shù)，查附錄3，即得勻漿定容液(V，內(nèi)含待檢樣品N)中致病性副溶血弧菌的含量C′為n個/10mL(n為在MPN表中查出的數(shù)值，最可能數(shù))。
對檢樣采用了三個不同的10倍遞減接種量，每個接種量各接種了3個增菌液管。因此，副溶血弧菌陽性管可能只出現(xiàn)在一個稀釋度的管組內(nèi)，也可能出現(xiàn)在兩個稀釋度的管組內(nèi)，或者三個稀釋度的管組內(nèi)都出現(xiàn)。為此，就陽性管出現(xiàn)的這三種不同情況，根據(jù)公式(附錄4)，求算出表1中的最可能數(shù)。
待檢樣品(N)中副溶血弧菌含量(C)的計算方法為C＝C′V/N。
7、計算方法舉例如果陽性管的分布是不同稀釋度管組(3管/稀釋度)接種量 10.0mL1.0mL0.1mL陽性管數(shù)3 10
MPN表(見附錄3)檢索結果接種樣品中副溶血弧菌的含量為43個/100mL。其含義是每100mL接種樣品中含副溶血弧菌的最可能數(shù)為43個。
實施例2 海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的快速定量檢測采用快速定量檢測法，對青島市某酒樓三文魚肉、水族箱中的活蝦、活蟹等樣品，增菌培養(yǎng)，通過設計的副溶血弧菌的三對特異性引物PCR擴增及電泳檢測，確定待測樣品中致病性副溶血弧菌的最可能數(shù)。
材料方法1、試驗材料青島市某酒樓水族箱中的活蝦、活蟹、蛤仔，以及三文魚肉。
樣品處理取出蝦肝胰腺0.234g，螃蟹內(nèi)臟0.221g，螃蟹鰓0.231g，三文魚肉0.216g，取蛤仔水管及裙邊組織0.286g，對蝦肌肉0.232g(組織對照)，螃蟹肌肉0.228g(組織對照)，分別組織勻漿，定容至10mL。
2、照試驗，不采用增菌培養(yǎng)的PCR直接定性檢測上述勻漿液取3.33mL，于10mL滅菌離心管中，離心(5000rpm/5min)，棄上清液，加3.33mL TE緩沖液，分別進行模板DNA的提取將各樣品于100℃水浴保持10-15min，冷卻后于4℃12000rpm離心10min，吸取上清液，沉淀DNA、洗滌、再溶解到200μL的TE緩沖液中，作為PCR模板；3、采用增菌培養(yǎng)法的定量檢測從步驟3剩余的勻漿液5.0mL中，按照MPN法的接種規(guī)則接種a)分別取1.0mL勻漿液 分別接種到三支含有4.0mL副溶血弧菌增菌液(1.25倍的濃縮液)的試管中；b)分別取100uL勻漿液 分別接種到三支含有4.9mL副溶血弧菌增菌液的試管中；分別取10uL勻漿液 分別接種到三支含有4.99mL副溶血弧菌增菌液的試管中；4、增菌培養(yǎng)30℃恒溫培養(yǎng)12h。于10000rpm離心10min，棄上清液，用5mL滅菌的生理鹽水重新懸浮沉淀，10000rpm離心10min，棄上清液，沉淀加1mL TE緩沖液重新懸浮，分別進行模板DNA的提取將各樣品于100℃水浴保持10-15min，冷卻后于4℃12000rpm離心10min，吸取上清200μL作為PCR模板。
5、PCR擴增(相關試劑見附錄1)a.在一個PCR管內(nèi)加入1μL樣品模板DNA，1μLPCR反應液，1μL酶液，用滅菌的雙蒸餾水補足到50μL。
b.PCR擴增條件94℃預變性3min，94℃/1min，58℃/1min鐘，72℃/1分鐘，30個循環(huán)，然后72℃延伸10min。
電泳取10μL PCR產(chǎn)物加于1.5％瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在紫外透射儀下觀察。
試驗結果對于未增菌培養(yǎng)組和增菌培養(yǎng)的各管組的9個管，都取10uL PCR產(chǎn)物，在1.5％瓊脂糖凝膠中100V電壓下電泳20-30min。紫外透射儀下觀察，當在269bp和450bp出現(xiàn)特異條帶時(個別情況在500bp出現(xiàn)特異帶)，即可判斷樣品中含致病性副溶血弧(參見圖1)。其中泳道1、7、8、10的結果判定為陰性，泳道2、3、4、5、6、9的結果判定為陽性。
通過對不同處理樣品的PCR產(chǎn)物進行電泳檢查，結果(參見表1)發(fā)現(xiàn)(1)未經(jīng)增菌培養(yǎng)的樣品，雖然其取樣量(3.33mL)與增菌培養(yǎng)的取樣總量(1.0mL×3+0.1mL×3+0.01mL×3＝3.33mL)一樣，但其PCR擴增產(chǎn)物的電泳結果多為陰性，而相應的增菌培養(yǎng)結果有的樣品(三文魚肉、蝦肌肉、螃蟹肌肉)為陰性，有的樣品(蝦肝胰腺、蟹內(nèi)臟及鰓、蛤仔水管及裙邊)為陽性，即定性檢驗中出現(xiàn)了假陰性結果(蟹內(nèi)臟及鰓、蛤仔水管及裙邊)。說明增菌培養(yǎng)后進行檢測，可以提高檢測靈敏度。
同時，通過增菌培養(yǎng)，也可以將活菌與死菌分開，而檢測出活菌的數(shù)量。
(2)取樣部位不同會直接影響檢測結果。蝦、蟹、蛤仔在烹飪加工、食用時，一般不去除內(nèi)臟、鰓，而這些部位是微生物分布種類和數(shù)量最多的部位，對于一個健康的動物，肌肉中一般不帶菌。因此，在本試驗中選擇了帶菌較多的部位進行研究，在取樣量很少(0.2g-0.3g)的情況下，通過增菌培養(yǎng)，檢測出了致病性副溶血弧菌。
(3)通過三度稀釋法，增菌培養(yǎng)，可借用MPN表實現(xiàn)對其進行定量研究；通過對增菌液進行DNA模板制備、特異性片段的PCR擴增及電泳檢測，實現(xiàn)對樣品中的特定菌進行快速定性確定其是否存在。以分子生物學方法為手段，以MPN法的基本原理為理論依據(jù)，實現(xiàn)了對待測樣品中特定微生物的快速定量檢測，采用增菌培養(yǎng)技術，提高了檢測的靈敏度。接種量和增菌時間會對檢測結果有一定的影響，在一定限度內(nèi)接種量加大，可以提高檢測的靈敏度，相應地可以適當縮短增菌培養(yǎng)時間，進而縮短檢測時間。
表1.不同海鮮樣品中致病性副溶血弧菌的定性、定量快速檢測結果

本試驗即采用致病性副溶血弧菌的三對特異性引物(通過大量試驗，已經(jīng)證實其特異性)，對三度稀釋法增菌培養(yǎng)的3個管組、9個樣品進行了DNA模板制備、特異性片段的PCR擴增及電泳檢測，不同來源的樣品實測結果見表1。
其中，三文魚肉中沒有檢測到致病性副溶血弧菌，檢測結果為致病性副溶血弧菌的含量為每克樣品最可能數(shù)小于3個。在蛤仔、螃蟹、蝦中，通過MPN-PCR法，都檢測到了致病性副溶血弧菌，其存在部位為蛤仔的水管及裙邊、螃蟹內(nèi)臟、螃蟹鰓、蝦肝胰腺，在這些樣品中，每克蛤仔的水管及裙邊樣品中致病性副溶血的最可能含量為32個，每克螃蟹內(nèi)臟樣品中致病性副溶血弧菌的最可能含量為195個，每克螃蟹鰓樣品中致病性副溶血弧菌的最可能含量為325個，每克蝦肝胰腺樣品中致病性副溶血弧菌的最可能含量為397個；通過該定量檢測方法，在與上述樣品取樣量相近的螃蟹、蝦的肌肉中，都沒有檢測到了致病性副溶血弧菌，即每克螃蟹肌肉樣品中致病性副溶血弧菌的最可能含量小于13個，每克蝦肌肉樣品中致病性副溶血弧菌的最可能含量小于13個。
與常規(guī)的副溶血弧菌檢驗方法相比，本發(fā)明檢測方法減少了繁瑣、費時的生化特征鑒定步驟，繞過微生物生化特征表達的變異以及血清學抗原性的缺失而帶來的鑒定障礙，直接針對樣品中微量的目標微生物的某一特定基因片段進行檢測，方法快速(用時最長的環(huán)節(jié)為增菌培養(yǎng)＜12h，電泳＜0.5h，而且準確，同時也克服了RQ-PCR檢測法無法鑒別污染食品中死、活菌體而給食品病原菌定量檢驗帶來的困難，從而實現(xiàn)了樣品中微量的活的目標微生物的真正意義上的快速定量檢測。
附錄1.相關試劑(中國海洋大學研制的試劑盒)

注(1)自備試劑無菌生理鹽水、TE緩沖液，常溫或4℃保存。
(2)該反應體系中，含有檢測副溶血弧菌的3對特異性引物，已經(jīng)加到試劑盒的試劑組成體系中。
注意事項1)試劑盒應在-20℃保存，有效期半年，所有試劑使用前均需離心，使試劑至管底再使用。
2)整個檢測過程中應避免交叉污染，各區(qū)物品均為專用，試驗結束后清潔工作臺。
3)用過的吸頭直接打入盛有15％次氯酸鈉溶液的廢液缸內(nèi)，并與其它廢棄物品一同滅菌后再丟棄。
4)所有器皿均需專用，離心管、吸頭等在試驗前應全部高壓蒸汽滅菌。
附錄2.副溶血弧菌增菌培養(yǎng)基——氯化鈉結晶紫增菌液1)配方蛋白胨20g氯化鈉40g0.01％結晶紫溶液 5mL蒸餾水1000mL1％待檢樣品的勻漿液pH9.02)制法除結晶紫外，其他按上述成分配好，加熱溶解，加30％氫氧化鉀溶液4.5mL，校正pH，加熱煮沸，過濾，再加入結晶紫溶液，混合后分裝于試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。
附錄3. 100mL(g)檢樣中最可能數(shù)(MPN)檢索表[使用三度稀釋法，接種量分別為10.0mL(g)、1.0mL(g)、0.1mL(g)]

注(1)本表采用3個稀釋度10mL(g)、1.0mL(g)、0.1mL(g)，每稀釋度3管；(2)表內(nèi)所用檢樣量如改用100mL(g)、10mL(g)、1.0mL(g)時，表內(nèi)數(shù)字應相應降低10倍，改用1.0mL(g)、0.1mL(g)、0.01mL(g)時，則表內(nèi)數(shù)字相應增加10倍，其余類推。
附錄4.最可能數(shù)(MPM)檢索表中數(shù)值的計算1.僅有一組管內(nèi)有陽性管存在時，用公式(1)計算Nλ=2.303×lgAB]]>式中N——檢出陽性管所加的待測樣品量；λ——待測菌的最可能數(shù)，個/mL，或個/g；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量。
例1管組 管數(shù) 3 3 3每管內(nèi)樣品量 10g 1g 0.1g陽性管數(shù) 3 0 0因此，N＝10，A＝10×3+1×3+0.1×3＝33.3，B＝1×3+0.1×3＝3.3代入公式(1)計算出表中“3”“0”“0”欄的結果。
2.兩個稀釋度管組內(nèi)有陽性管(記為陽性管組1、陽性管組2)存在時，用公式(2)計算N1λ=2.303×lg(A-N2γ-A×10-0.4343N2λ)[B-(A-N1P)×10-0.4343N2λ]]]>式中N1P——陽性管組1每管內(nèi)加入N1g(mL)樣品量，有P個陽性管；N2γ——陽性管組2每管內(nèi)加入N2g(mL)樣品量，有γ個陽性管；λ——待測菌在樣品中的最可能數(shù)(個/g，或個/mL)；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量。
應用公式(2)時，須先假定λ值，用試算法代進公式內(nèi)以計算出λ值，當代進公式的假定值與計算出的λ值相符(或最接近)時，則所假定的λ值為待測菌的最可能數(shù)。
3.三個稀釋度管組內(nèi)都有陽性管存在時，用公式(3)計算N1λ=2.303×lg[(A-N2γ-N3t)-(A-N3t)×10-0.4343N2λ-(A-N2γ)×10-0.4343N3λ+A×10-0.4343(N2+N3)λ][B-(A-N1P-N3t)×10-0.4343N2λ-(A-N1P-N2γ)×10-0.4343N3λ+(A-N1P)×10-0.4343(N2+N3)λ]]]>
式中N1P——管組 每管內(nèi)加入N1g(mL)樣品量，有P個陽性管；N2γ——管組 每管內(nèi)加入N2g(mL)樣品量，有γ個陽性管；N3t——管組 每管內(nèi)加入N3g(mL)樣品量，有t個陽性管；λ——待測菌在樣品中的最可能數(shù)(個/g，或個/mL)；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量。
應用公式(3)時，與應用公式(2)相同，也須先假定λ值，用試算法代進公式內(nèi)以計算出λ值，當代進公式的假定值與計算出的λ值相符(或最接近)時，則所假定的λ值為待測菌的最可能數(shù)。
權利要求
1.一種水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是(1)待測菌株的特異性引物的設計、篩選和制備；(2)PCR擴增及檢測；DNA提取，待測菌株特異性基因片段的PCR擴增，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，檢測出現(xiàn)的特異性片斷；(3)MPN法測定，按規(guī)定方法計算檢測結果。
2.按照權利要求1所述的水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是本發(fā)明所需特異性引物是指下述3對引物的序列(1)TL基因引物擴增片段大小450bpTL15′-AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG-3′；TL25′-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3′；(2)TDH基因引物擴增片段大小269bpTDH15′-GTA AAG GTC TCT GAC TTT TGG AC-3′；TDH25′-TGG AAT AGA ACC TTC ATC TTC ACC-3′；(3)TRH基因引物擴增片段大小500bpTRH15′-TTG GCT TCG ATA TTT TCA GTA TCT-3′；TRH25′-CAT AAC AAA CAT ATG CCC ATT TCC G-3′；其使用方法是進行PCR反應時，加入到PCR反應體系中，將模板中存在的待測基因，如副溶血弧菌的TL基因、TDH基因、TLH基因，特異性地擴增出來。
3.按照權利要求1所述的水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是PCR擴增及檢測步驟如下(1)待檢樣品準備無菌操作定量取待檢樣品，以檢驗其鮮度質(zhì)量為目的時，其待檢樣品為食用水產(chǎn)魚類、甲殼類或貝殼類的肌肉；以檢驗是否污染某種致病菌為目的時，其檢驗部位為食用水產(chǎn)魚類、甲殼類或貝殼類的內(nèi)臟團如消化道和呼吸器官；一定量的待檢樣品N無菌條件下勻漿，獲得組織勻漿液，以無菌生理鹽水定容到一定體積V；(2)增菌培養(yǎng)及PCR檢測①三度稀釋法增菌培養(yǎng)將含待檢樣品的定容勻漿樣品以3個連續(xù)10倍系列稀釋濃度加入到副溶血弧菌增菌液中，每個稀釋度接種3管，25～30℃下，增菌培養(yǎng)8～12h；離心或沉降，分取上清液，獲得增菌培養(yǎng)的樣品；②模板DNA制備上述增菌培養(yǎng)的樣品，于10000rpm離心10min，棄上清液，用5mL滅菌的生理鹽水重新懸浮沉淀，10000rpm離心10min，棄上清液，沉淀用1mLTE緩沖液重新懸浮，樣品于100℃水浴保持10～15min，冷卻后于4℃12000rpm離心10min，吸取上清液200μL，分別進行模板DNA的提取，作為PCR反應的模板，或-20℃保存?zhèn)溆?；③PCR擴增在每一個PCR管內(nèi)加入1μL樣品模板DNA，9μL PCR反應液，1μL酶液，用滅菌的雙蒸餾水補足到50μL；94℃預變性3min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，30個循環(huán)，然后72℃延伸10min，獲得PCR產(chǎn)物；④結果判定取10μL PCR產(chǎn)物加于1.5％瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在紫外透射儀下觀察，出現(xiàn)引物擴增特異帶的樣品，為副溶血弧菌陽性的樣品管，即該樣品管中含有副溶血弧菌；當在269bp～500bp出現(xiàn)特異條帶時，即可判斷樣品中含致病性副溶血弧菌；根據(jù)陽性管出現(xiàn)的三種不同情況，根據(jù)公式求算出表中的最可能數(shù)C′，該值為在含有的勻漿樣品為N的V體積定容勻漿液中待測菌株的含量；待檢樣品中待測菌株的含量C的計算公式為C＝C′V/N；計算公式為a.僅有一組稀釋度管組內(nèi)有陽性管存在時，用公式I計算Nλ=2.303×lgAB]]>式中N——檢出陽性管所加的待測樣品量；λ——待測菌的最可能數(shù)，個/mL，或個/g；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量；b.兩個稀釋度管組內(nèi)有陽性管存在時，用公式II計算N1λ=2.303×lg(A-N2γ-A×10-0.4343N2λ)[B-(A-N1P)×10-0.4343N2λ]]]>式中N1P——陽性管組1每管內(nèi)加入N1g或mL樣品量，有P個陽性管；N2γ——陽性管組2每管內(nèi)加入N2g或mL樣品量，有γ個陽性管；λ——待測菌在樣品中的最可能數(shù)，個/g或個/mL；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量；c.三個稀釋度管組內(nèi)都有陽性管存在時，用公式III計算N1λ=2.303×lg[(A-N2γ-N3t)-(A-N3t)×10-0.4343N2λ-(A-N2γ)×10-0.4343N3λ+A×10-0.4343(N2+N3)λ][B-(A-N1P-N3t)×10-0.4343N2λ-(A-N1P-N2γ)×10-0.4343N3λ+(A-N1P)×10-0.4343(N2+N3)λ]]]>式中N1P——管組 每管內(nèi)加入N1g或mL樣品量，有P個陽性管；N2γ——管組 每管內(nèi)加入N2g或mL樣品量，有γ個陽性管；N3t——管組 每管內(nèi)加入N3g或mL樣品量，有t個陽性管；λ——待測菌在樣品中的最可能數(shù)，個/g或個/mL；A——加進所有各管組的管內(nèi)樣品總量；B——所有各管組未檢出陽性管中加入的樣品的總量。
4.按照權利要求3所述的水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是所述的消化道是魚類的腸管，蝦類頭胸節(jié)內(nèi)的肝胰腺、消化盲囊和腹節(jié)外延處的腸管，蟹類的內(nèi)臟團，螺貝類腹足肌肉以下的部分或雙殼貝類覆蓋在斧足肌肉外層的內(nèi)臟；其特征是所述的呼吸器官是魚類的鰓，蝦類頭胸節(jié)內(nèi)的鰓條，蟹類的鰓條或貝類的瓣鰓。
5.按照權利要求2所述的水產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌的分子生物學定量檢測方法，其特征是所述的副溶血弧菌增菌培養(yǎng)基——氯化鈉結晶紫增菌液是(1)組成配方蛋白胨 20g氯化鈉 40g0.01％結晶紫溶液5mL蒸餾水 1000mL和1％體積的待檢樣品的組織勻漿液pH 9.0(2)制法除結晶紫外，其他按上述成分配好，加熱溶解，加30％氫氧化鉀溶液4.5mL，校正pH，加熱煮沸，過濾，再加入結晶紫溶液，混合后分裝于三度稀釋法增菌培養(yǎng)所用的9支試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min；(3)使用方法根據(jù)三度稀釋法接種量的大小，確定分裝入試管中增菌液的量；(4)使用范圍副溶血弧菌增菌培養(yǎng)適用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物的檢驗方法，特別涉及一種分子生物學快速定量檢測水產(chǎn)品中的致病性副溶血弧菌的方法。其特征是(1)待測菌株的特異性引物的設計、篩選和制備；(2)PCR擴增及檢測；DNA提取，待測菌株特異性基因片段的PCR擴增，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，檢測出現(xiàn)的特異性片斷；(3)MPN法測定，按規(guī)定方法計算檢測結果。本發(fā)明是以現(xiàn)有技術兩種方法的基本原理為理論依據(jù)，改進提出一種快速定量檢測樣品中某一種細菌的方法，在特定微生物種類、定量、快速、準確、高靈敏度、增菌培養(yǎng)基的制備……等方面有自己的獨特創(chuàng)造。以副溶血弧菌為例，進行了驗證，實踐證明是可行的。
文檔編號C12Q1/04GK1831139SQ20051010447
公開日2006年9月13日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權日2005年11月3日
發(fā)明者李筠, 陳吉祥, 欒曉燕, 楊慧, 魏鑒騰, 焦爽, 李洪鵬, 張曉華, 池政豪, 公衍軍, 李采風 申請人:中國海洋大學